КЛЕТКИ, ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНОМУ НЕЙРОТОКСИНУ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/33 G01N33/50 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к способу получения популяции клеток, высокочувствительных к клостридиальному нейротоксину, такому как ботулинический нейротоксин и столбнячный нейротоксин.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Анаэробная грамположительная бактерия Clostridium botulinum продуцирует различные типы нейротоксинов, в том числе ботулинические нейротоксины (BoNT) и столбнячный нейротоксин (TeNT).

BoNT являются наиболее сильнодействующими известными токсинами со значениями средней летальной дозы (LD₅₀) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг, в зависимости от серотипа. BoNT адсорбируются в желудочно-кишечном тракте и после попадания в общий кровоток связываются с пресинаптической мембраной холинергических нервных окончаний и препятствуют высвобождению нейромедиатора ацетилхолина.

BoNT хорошо известны своей способностью вызывать вялый мышечный паралич. Указанные расслабляющие мышцы свойства привели к тому, что BoNT используются в различных медицинских и косметических процедурах, включая лечение межбровных морщин или гиперкинетических морщин лица, головной боли, гемифациального спазма, гиперактивности мочевого пузыря, гипергидроза, носогубных складок, цервикальной дистонии, блефароспазма и спастичности.

В настоящее время существует по меньшей мере восемь различных классов BoNT, а именно: BoNT серотипов A, B, C, D, E, F, G и H (известных соответственно как BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G и BoNT/H), все из которых имеют схожие структуры и способы действия. Различные серотипы BoNT можно различать на основе инактивации специфическими нейтрализующими антисыворотками, при этом такая классификация по серотипу коррелирует с процентом идентичности последовательности на уровне аминокислот. Белки BoNT того или иного серотипа дополнительно подразделяются на различные подтипы на основе процента идентичности аминокислотной последовательности.

Разные серотипы BoNT отличаются у пораженных видов животных по тяжести и продолжительности вызванного паралича. Например, BoNT/A является наиболее смертоносным из всех известных биологических веществ и, в частности, у крыс в 500 раз сильнее, чем BoNT/B. Кроме того, продолжительность паралича после инъекции BoNT/A мышам в десять раз длиннее, чем продолжительность после инъекции BoNT/B.

В природе клостридиальные нейротоксины синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который подвергается посттрансляционной модификации в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных вместе дисульфидной связью. Расщепление происходит в специфическом сайте расщепления, часто называемом «сайтом активации», расположенном между остатками цистеина, которые обеспечивают межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепь), молекулярная масса которой составляет примерно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепь), молекулярная масса которой составляет примерно 50 кДа. Н-цепь содержит С-концевой нацеливающий компонент, известный как «нацеливающий фрагмент», и N-концевой компонент транслокации, известный как «домен транслокации». Сайт активации расположен между L-цепью и компонентом транслокации в экспонированной области петли. После связывания нацеливающего фрагмента со своим нейроном-мишенью и интернализации связанного токсина в клетку через эндосому домен транслокации перемещает L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль.

L-цепь содержит компонент с протеазной активностью (протеазный компонент), известный как «протеазный домен». Он обладает нецитотоксической протеазной функцией и действует путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE - см. Gerald K (2002) «Cell and Molecular Biology» (4-е издание) John Wiley & Sons, Inc. Аббревиатура SNARE происходит от термина «Soluble NSF Attachment Receptor» («растворимый рецептор белка прикрепления NSF», где NSF означает N-ethylmaleimide-Sensitive Factor (фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду). Протеазный домен обладает цинк-зависимой эндопептидазной активностью и проявляет высокую субстратную специфичность к белкам SNARE.

Посредством соответствующих протеазных доменов различные клостридиальные нейротоксины расщепляют разные белки SNARE. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G и TeNT расщепляют синаптобревин, также известный как ассоциированный с везикулами мембранный белок (VAMP). BoNT/A, BoNT/C и BoNT/E расщепляют синаптосомально-ассоциированный белок 25 кДа (SNAP-25). BoNT/C расщепляет синтаксин.

Белки SNARE связаны либо с мембраной секреторной везикулы, либо с клеточной мембраной и облегчают экзоцитоз молекул, опосредуя слияние секреторной везикулы с клеточной мембраной, что позволяет вытолкивать содержимое везикулы за пределы клетки. Расщепление таких белков SNARE ингибирует такой экзоцитоз и, таким образом, высвобождение нейротрансмиттера из клетки. В результате поперечнополосатые мышцы парализуются, а потовые железы прекращают свою секрецию.

Соответственно, после доставки в желаемую клетку-мишень, клостридиальные нейротоксины способны ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени.

В данной области известна модификация клостридиальных нейротоксинов для изменения их свойств. Модификации могут включать модификации аминокислот, такие как добавление, делеция и/или замена аминокислоты(аминокислот), и/или химические модификации, такие как добавление фосфата или углевода или образование дисульфидных связей. Модификация также может включать переупорядочение компонентов клостридиального нейротоксина, например, фланкирование протеазного компонента компонентом транслокации и нацеливающим компонентом. Модификация также может включать модификацию сайта активации нейротоксина (где нейротоксин расщепляется с образованием активной формы дицепи). Такая модификация может увеличивать или уменьшать способность нейротоксина к активации или обеспечивать активацию только в определенных средах (например, средах, в которых присутствует протеаза, расщепляющая модифицированный сайт активации). Кроме того, модификация может включать замену компонента нейротоксина компонентом другого нейротоксина (например, модификацию BoNT/A путем замены протеазного домена BoNT/A протеазным доменом из BoNT/E).

Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины продуцируются генетически. Они могут быть либо генетически идентичными клостридиальному нейротоксину дикого типа, либо отличаться от клостридиальных нейротоксинов дикого типа тем, что содержат дополнительные, меньшее количество или другие аминокислоты. Например, могут быть получены рекомбинантные клостридиальные нейротоксины, отражающие любой из вышеупомянутых модифицированных клостридиальных нейротоксинов. Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины также могут быть химически модифицированы, как описано выше.

Однако различия между модифицированными и рекомбинантными клостридиальными нейротоксинами и их аналогами дикого типа могут влиять на желаемую способность нейротоксина расщеплять белок SNARE. Таким образом, определение того, улучшают, уменьшают или устраняют эти различия такую активность, может быть важным аспектом.

Доступны различные традиционные анализы, позволяющие специалисту в данной области подтвердить, обладают ли указанные модифицированные или рекомбинантные клостридиальные нейротоксины желаемой активностью расщепления целевого белка SNARE. Эти анализы включают тестирование на наличие продуктов, образующихся в результате расщепления белка SNARE. Например, после контактирования клетки с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином клетка может быть подвергнута лизису и анализу с помощью SDS-PAGE для обнаружения присутствия продуктов расщепления. В качестве альтернативы продукты расщепления могут быть обнаружены путем контактирования клеточного лизата с антителами.

Хотя и известно использование в таких анализах клеток из типичной популяции, но, поскольку такие клетки могут иметь лишь ограниченную чувствительность к клостридиальному нейротоксину, в анализах часто требуется использование высокой концентрации клеток.

Поэтому существует потребность в популяции клеток, обладающих повышенной чувствительностью к клостридиальным нейротоксинам, для использования в таких анализах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в частности, относится к способу получения популяции клеток, обладающих высокой чувствительностью к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение рекомбинантных клеток, экспрессирующих индикаторный белок, в контакт с клостридиальным нейротоксином; и

(b) после этого отбор клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка.

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющей чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином; где указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации указанных последовательных этапов (а)-(с), где популяция клеток, используемых на этапе (а), содержит или состоит из клеток, выделенных на этапе (с), и/или их дочерних клеток;

(e) причем необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющей чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином; где указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации указанных последовательных этапов (а)-(с), где популяция клеток, используемых на этапе (а), содержит или состоит из клеток, выделенных на этапе (с), и/или их дочерних клеток;

(e) причем необязательно перед каждой итерацией клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Термин «дочерние клетки» означает потомство (например, клетки-предшественники) клеток, выделенных на этапе с), и соответственно включает мутантов и/или разделенные во времени варианты клеток, выделенных на этапе с (например, которые могут быть повторно введены обратно в цикл). Термин «дочерние клетки» предпочтительно означает, что клетки происходят из той же клеточной линии, что и клеточная линия на этапе с).

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющей чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение клеточной линии в контакт с клостридиальным нейротоксином; где указанная клеточная линия содержит (или состоит из) клеток, экспрессирующих:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации указанных последовательных этапов (а)-(с), где клеточная линия, используемая на этапе (а), содержит или состоит из клеток, выделенных на этапе (с), и/или их дочерние клетки;

(e) причем необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией (предпочтительно перед каждой итерацией) клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющей чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином; где указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации этапов а)-с);

где в указанной по меньшей мере одной итерации клетки этапа а) содержат (или состоят из) клетки-предшественники, выделенные на предыдущем этапе с);

причем необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией (предпочтительно перед каждой итерацией) клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение популяции клеток (предпочтительно популяции рекомбинантных клеток) в контакт с клостридиальным нейротоксином; где указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации этапов а)-с), где клетки, выделенные на предыдущей итерации этапа с), предоставляют в качестве популяции клеток для последующей итерации этапа а).

(e) причем необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией этапов а)-с) (предпочтительно перед каждой итерацией) клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Последующую итерацию можно выполнять, если считается, что количество клеток, в которых наблюдается расщепление индикаторного белка, ниже порогового значения, например, для применения давления отбора для (дальнейшей) концентрации чувствительных клеток.

В одном из вариантов осуществления указанную по меньшей мере одну итерация можно выполнять, когда количество клеток, выделенных на этапе с), составляет менее 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60% (предпочтительно менее 20%) от количества клеток на этапе а).

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающему:

(а) приведение популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином; где указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) когда количество клеток, выделенных на этапе c), составляет менее 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60% (предпочтительно менее 20%) от количества клеток на этапе а):

i. выполнение по меньшей мере одной итерации указанных последовательных этапов (а)-(с), где популяция клеток, используемых на этапе (а), содержит или состоит из клеток, выделенных на этапе (с), и/или их дочерние клетки; причем необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Термин «по существу эквивалентный» (например, в контексте термина «клетки, выделенные на предыдущем этапе с) культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а») может означать, что клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не составит по меньшей мере примерно 80%, 90% или 95% (предпочтительно по меньшей мере примерно 90%) от количества клеток на предыдущем этапе а). В предпочтительном варианте осуществления «по существу эквивалентный» означает, что клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет таким же, как количество клеток на предыдущем этапе а).

Предпочтительно клетки (например, на этапе а)) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином. Предпочтительно клетки (например, на этапе а)) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный рецептор, обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином. Предпочтительно клетки (например, на этапе а)) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, обеспечивающую экспрессию указанного ганглиозида, обладающего сродством связывания с клостридиальным нейротоксином. В предпочтительном варианте осуществления клетки (например, на этапе а)) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный индикаторный белок, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный рецептор, экзогенную нуклеиновую кислоту, обеспечивающую экспрессию указанного ганглиозида.

Ганглиозид представляет собой, например, молекулу, состоящую из гликосфинголипида с одной или более сиаловыми кислотами, связанными в сахарной цепи. Ганглиозиды, как правило, не являются полипептидами, поэтому не кодируются непосредственно нуклеиновой кислотой.

Термин «нуклеиновая кислота (предпочтительно экзогенная нуклеиновая кислота), обеспечивающая экспрессию указанного ганглиозида, обладающего сродством связывания с клостридиальным нейротоксином», означает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который влияет или катализирует продуцирование (например, экспрессию) ганглиозида в клетке. Пептид может представлять собой фермент пути синтеза ганглиозидов или его вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью фермента. Предпочтительные ферменты пути синтеза ганглиозидов описаны ниже.

В тексте настоящего описания ссылка на «экспрессию ганглиозида» означает, что клетки продуцируют или синтезируют ганглиозид (предпочтительно с помощью фермента, фермента пути синтеза ганглиозида или его варианта или фрагмента, который обладает каталитической активностью фермента).

Индикаторный белок представляет собой белок, содержащий домен SNARE (например, аминокислотную последовательность синтаксина, синаптобревина или SNAP-25, или их вариантов или фрагментов, которые подвержены протеолизу под действием протеазного компонента клостридиального нейротоксина дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления отбор клеток, демонстрирующих расщепление индикаторного белка, включает определение того, произошло ли расщепление индикаторного белка.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение рекомбинантной клетки, например, путем введения в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей индикаторный белок.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка генетически сконструирована для экспрессии: рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта или фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин; и/или фермента пути синтеза ганглиозидов или его варианта или фрагмента, обладающего каталитической активностью фермента.

Настоящее изобретение, в частности, также относится к клетке из популяции, полученной с помощью вышеупомянутого способа. Другими словами, один из аспектов изобретения относится к клеточной популяции, которую можно получить вышеупомянутым способом.

Преимущественно, клеточная популяция, полученная (например, выведенная) способом получения, представленным в настоящем описании, может быть использована в способе определения активности клостридиального нейротоксина, или для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина, или идентификации состава клостридиального нейротоксина, который подходит для терапевтического (и/или косметического) применения.

Настоящее изобретение, в частности, также относится к анализу для определения активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина. Анализ включает приведение клетки из популяции, полученной указанным выше способом, в контакт с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином в условиях и в течение периода времени, достаточных для расщепления в клетке индикаторного белка протеазным доменом клостридиального нейротоксина дикого типа и определения наличия продукта, полученного в результате расщепления индикаторного белка.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина или идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического (и/или косметического) применения, где указанный способ включает:

а. предоставление клеточной популяции, полученной вышеупомянутым способом по изобретению (например, способом получения популяции клеток, которые являются высокочувствительными к клостридиальному нейротоксину, или способом выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину);

b. приведение указанной популяции клеток в контакт с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификацию (i) состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается, или идентификацию (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается; или

е. идентификацию (i) состава клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается, или идентификацию (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепление индикаторного белка после контакта не увеличивается.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина или идентификации состава клостридиального нейротоксина, подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, где указанный способ включает:

а. предоставление клеточной популяции, полученной вышеупомянутым способом по изобретению (например, способом получения популяции клеток, которые являются высокочувствительными к клостридиальному нейротоксину, или способом выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину);

b. приведение указанной клетки в контакт с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификацию (i) состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается или является эквивалентным уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или идентификацию (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается или является эквивалентным уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина; или

е. идентификацию (i) клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или идентификацию (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина.

Термин «когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается» означает, что уровень расщепления по существу не увеличивается. Термин «по существу», используемый в настоящем описании в контексте термина «когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается», предпочтительно означает отсутствие статистически значимого увеличения. Упомянутое увеличение (которое не является существенным) может составлять менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1%, предпочтительно менее 20%. Упомянутое увеличение (которое не является существенным) может составлять менее 5%, 2%, 1% или 0,5%, предпочтительно менее 0,1%. Более предпочтительно, термин «когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается», используемый в настоящем описании, означает, что уровень расщепления индикаторного белка после контакта вообще не снижается (т.е. увеличение уровня расщепления составляет 0%).

Рецептор и/или ганглиозид могут сверхэкспрессироваться в клетках.

Преимущественно, обеспечивая экспрессию или сверхэкспрессию рецептора и/или ганглиозида, обладающего сродством связывания с клостридиальным нейротоксином, способы и клетки по изобретению позволяют уменьшить количество ложноотрицательных результатов (например, когда низкая расщепляющая активность могла бы быть неверно детектирована из-за низкого сродства клостридиального нейротоксина к связыванию и транслокации в клетку, используемую в анализе, а не из-за низкой активности протеазного домена). Кроме того, изобретение обеспечивает более широкий спектр типов клеток, которые можно использовать в таких анализах, уменьшая зависимость, например, от нервных клеток (например, естественно экспрессирующих достаточные уровни рецептора/ганглиозида), культивирование которых in vitro может быть затруднено. Эти преимущества обеспечиваются в контексте клеточного анализа (позволяющего характеризовать связывание, транслокацию и протеазную активность) в отличие от бесклеточной системы (которая характеризует только протеазную активность).

Уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в клетке, представленной в настоящем описании, предпочтительно равен или превышает уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в природной мишени (например, нервной клетке) для клостридиального нейротоксина. Например, уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в раскрытой в настоящем описании клетке, может составлять ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% или ≥100% относительно уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в естественной мишени (например, нервной клетке) для клостридиального нейротоксина.

Уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в клетке, раскрытой в настоящем описании, предпочтительно может быть больше уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в клетке, в которой отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота. Например, уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в раскрытой в настоящем описании клетке, может составлять ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% или ≥100% по отношению к уровню рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемому в клетке (например, в другой эквивалентной клетке), в которой отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления термин «сверхэкспрессия», используемый в контексте любого аспекта или варианта осуществления, раскрытого в настоящем описании, предпочтительно означает ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% или ≥100% экспрессии относительно уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в природной мишени (например, нервной клетке) для клостридиального нейротоксина. В одном из вариантов осуществления термин «сверхэкспрессия», используемый в контексте любого аспекта или варианта осуществления, раскрытого в настоящем описании, предпочтительно означает ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% или ≥100% экспрессии относительно уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), экспрессируемого в клетке (например, в другой эквивалентной клетке), в которой отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/A (или BoNT, содержащий домен HCC BoNT/A), и предпочтительно рецептор может представлять собой SV2A, SV2B и/или SV2C (предпочтительно SV2A).

Дополнительно или альтернативно, клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/B (или BoNT, содержащий домен HCC BoNT/B), и предпочтительно рецептор может представлять собой Syt-I и/или Syt-II.

Дополнительно или альтернативно, клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/E (или BoNT, содержащий домен HCC BoNT/E), и предпочтительно рецептор может представлять собой SV2A и/или SV2B (предпочтительно SV2A).

Дополнительно или альтернативно клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/G (или BoNT, содержащий домен HCC BoNT/G), и предпочтительно рецептор может представлять собой Syt-I и/или Syt-II.

Дополнительную информацию о подходящих рецепторах/ганглиозидах см. в Binz and Rummel (Journal of Neurochemistry, Volume 109, Issue 6, June 2009, Pages 1584-1595), включенную в настоящее описание посредством ссылки.

Клостридиальные нейротоксины представляют собой нейротоксины, продуцируемые в природе бактериями Clostridium botulinum.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клостридиальный нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин (BoNT) или столбнячный нейротоксин (TeNT). Используемые в настоящем описании термины «клостридиальный нейротоксин», «BoNT» и «TeNT», соответственно, относятся к клостридиальным нейротоксинам дикого типа, включая нейротоксины, которые продуцируются штаммами, отличными от Clostridium botulinum, а также к модифицированным и рекомбинантным клостридиальным нейротоксинам.

Модифицированные клостридиальные нейротоксины могут содержать одну или более модификаций по сравнению с клостридиальными нейротоксинами дикого типа, включая аминокислотные модификации и/или химические модификации. Модификации аминокислот включают делеции, замены или добавления одного или более аминокислотных остатков. Химические модификации включают модификации одного или более аминокислотных остатков, такие как добавление фосфата или углевода или образование дисульфидных связей.

В некоторых вариантах осуществления модификации могут быть введены для изменения свойств клостридиального нейротоксина. Модификации клостридиального нейротоксина могут увеличивать или уменьшать его биологическую активность.

Биологическая активность клостридиального нейротоксина включает по меньшей мере три отдельных действия: первое действие представляет собой «протеолитическую активность», присущую протеазному компоненту нейротоксина, и отвечает за гидролиз пептидной связи одного или более белков SNARE, участвующих в регуляции слияния с клеточной мембраной. Второй активностью является «транслокационная активность», присущая компоненту транслокации нейротоксина и участвующая в транспорте нейротоксина через эндосомальную мембрану в цитоплазму. Третьей активностью является «рецептор-связывающая активность», присущая нацеливающему компоненту нейротоксина и задействованная при связывании нейротоксина с рецептором на клетке-мишени.

В некоторых вариантах осуществления модификация нейротоксина может включать усечение компонента(ов) клостридиального нейротоксина с сохранением активности такого(их) компонента(ов). Например, нейротоксин может быть модифицирован таким образом, чтобы он включал только часть(и) протеазного компонента, которая необходима для протеолитической активности, только часть(и) компонента транслокации, которая необходима для транслокационной активности, и/или только часть(и) нацеливающего компонента, которая необходима для рецептор-связывающей активности.

Клостридиальный нейротоксин изначально продуцируется в виде неактивного одноцепочечного полипептида и превращается в активную двухцепочечную форму после расщепления нейротоксина в сайте активации. Такое расщепление дает в результате двухцепочечный белок с тяжелой цепью (Н-цепь), содержащей компонент транслокации и нацеливающий компонент, и легкой цепью (L-цепь), содержащей протеазный компонент.

В некоторых вариантах осуществления биологическую активность клостридиального нейротоксина модифицируют путем модификации сайта активации нейротоксина. Таким образом, способность нейротоксина к активации может быть увеличена, уменьшена или оставлена без изменений. В некоторых вариантах осуществления биологическая активность клостридиального нейротоксина увеличивается или запускается путем модификации сайта активации таким образом, чтобы он легче расщеплялся, тем самым активируя нейротоксин. В вариантах осуществления, в которых активация желательна только в определенных средах или клетках, сайт активации может быть модифицирован таким образом, чтобы он расщеплялся только протеазами, присутствующими в таких средах или клетках. В некоторых других средах биологическая активность нейротоксина снижается или инактивируется путем модификации сайта активации таким образом, чтобы его расщепление осуществлялось менее легко.

В некоторых вариантах осуществления биологическую активность клостридиального нейротоксина модифицируют путем модификации протеазного компонента нейротоксина. Таким образом, протеолитическая активность нейротоксина может быть увеличена, уменьшена или оставлена без изменений. В некоторых вариантах осуществления протеазный компонент может быть заменен протеазным компонентом другого клостридиального нейротоксина или его варианта или фрагмента. Например, BoNT/A можно модифицировать, заменив его протеазный компонент протеазным компонентом BoNT/E.

В некоторых вариантах осуществления биологическую активность клостридиального нейротоксина модифицируют путем модификации компонента транслокации нейротоксина. Таким образом, транслокационная активность нейротоксина может быть увеличена, уменьшена или оставлена без изменений. В некоторых вариантах осуществления компонент транслокации может быть заменен компонентом транслокации из другого клостридиального нейротоксина или его варианта или фрагмента. Например, BoNT/A можно модифицировать, заменив его компонент транслокации компонентом транслокации BoNT/E.

В некоторых вариантах осуществления биологическую активность клостридиального нейротоксина модифицируют путем модификации нацеливающего компонента нейротоксина. Таким образом, способность нейротоксина к нацеливанию может быть увеличена, уменьшена или оставлена без изменений. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий компонент может быть заменен нацеливающим компонентом из другого клостридиального нейротоксина или его варианта или фрагмента. Например, BoNT/A можно модифицировать, заменив его нацеливающий компонент нацеливающим компонентом BoNT/E. В некоторых других вариантах осуществления нацеливающий компонент может быть заменен неклостридиальным полипептидом, например антителом.

Кроме того, модификация может включать переупорядочение компонентов клостридиального нейротоксина, например, фланкирование протеазного компонента компонентом транслокации и нацеливающим компонентом.

Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины продуцируют генетически. Они могут быть либо генетически идентичными клостридиальному нейротоксину дикого типа, либо отличаться от клостридиальных нейротоксинов дикого типа тем, что содержат дополнительные, меньшее количество или другие аминокислоты. Например, могут быть получены рекомбинантные клостридиальные нейротоксины, отражающие любой из вышеупомянутых модифицированных клостридиальных нейротоксинов. Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины также могут содержать компоненты, расположенные в другом порядке, отличном от порядка их расположения в клостридиальных нейротоксинах дикого типа. Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины также могут быть химически модифицированы, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный или рекомбинантный клостридиальный нейротоксин представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности клостридиального нейротоксина дикого типа, например, BoNT серотипа A, B, C, D, E, F, G или H или TeNT.

Специалисту доступен ряд программ, основанных на различных алгоритмах, для сравнения различных последовательностей. В этом контексте алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Уотермана дают особенно надежные результаты. Для выравнивания последовательностей и вычисления значений идентичности приведенных в настоящем описании последовательностей использовалась коммерчески доступная программа DNASTAR Lasergene MegAlign версии 7.1.0, основанная на алгоритме Clustal W, для всей области последовательности со следующими настройками: параметры попарного выравнивания: штраф за пропуск: 10,00, штраф за удлинение пропуска: 0,10, матрица массы белка Gonnet 250, которая, если не указано иное, всегда должна использоваться в качестве стандартных настроек для выравнивания последовательностей.

Серотип BoNT/A делится как минимум на шесть подсеротипов (также известных как подтипы) BoNT/A1 - BoNT/A6 с идентичностью аминокислотных последовательнойстей, составляющей по меньшей мере 84%, вплоть до 98%. Белки BoNT/A в пределах данного подтипа имеют более высокий процент идентичности аминокислотной последовательности.

Клостридиальные нейротоксины нацелены на нейроны путем связывания с рецепторами. Рецепторы клостридиального нейротоксина включают белковые рецепторы и ганглиозиды плазматической мембраны.

В контексте настоящего описания термин «приведение в контакт» относится к физическому сближению клетки (например, популяции клеток) и клостридиального нейротоксина с обеспечением физического и/или химического взаимодействия. Приведение в контакт (контактирование) осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения взаимодействия полипептида и белка, восприимчивого к протеолизу клостридиальным нейротоксином дикого типа (например, белком SNARE).

В некоторых вариантах осуществления такое контактирование может осуществляться путем культивирования клетки в среде, содержащей полипептид. Полипептид обычно присутствует в среде в концентрации от 0,0001 до 10000 нМ, от 0,0001 до 1000 нМ, от 0,0001 до 100 нМ, от 0,0001 до 10 нМ, от 0,0001 до 1 нМ, от 0,0001 до 0,1 нМ, от 0,0001 до 0,01 нМ, от 0,0001 до 0,001 нМ. Такое культивирование может, например, продолжаться в течение 2 часов или более, 4 часов или более, 6 часов или более, 12 часов или более, 18 часов или более, 24 часов или более, 30 часов или более, 36 часов или более, 40 часов и более или 48 часов и более.

В некоторых других вариантах осуществления такое контактирование может осуществляться путем трансфекции клетки (например, временной трансфекции) экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид.

Для возможности использования в таком анализе, клетка содержит белок, восприимчивый к протеолизу клостридиальным нейротоксином дикого типа. Эти белки упоминаются в настоящем описании как «индикаторный белок(белки)». Индикаторный белок может быть эндогенным (например, эндогенным белком SNARE), или клетка может быть генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка.

Как обсуждалось выше, известно, что белки SNARE, такие как SNAP-25, синаптобревин и синтаксин, подвержены протеолизу клостридиальными нейротоксинами. Например, известно, что BoNT/A, BoNT/C и BoNT/E расщепляют SNAP-25, BoNT/C также расщепляет синтаксин, а другие серотипы BoNT и TeNT расщепляют синаптобревин. Следовательно, настоящее изобретение предполагает, что такой индикаторный белок может содержать аминокислотную последовательность такого белка SNARE. Изобретение также предполагает, что индикаторный белок вместо этого может содержать аминокислотную последовательность варианта или фрагмента такого белка SNARE, при условии, что указанный вариант или фрагмент подвержен протеолизу клостридиальным нейротоксином дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант может быть на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичным последовательности белка SNARE. Часть индикаторного белка с аминокислотной последовательностью белка SNARE или его варианта или фрагмента в настоящем описании называется «доменом SNARE» индикаторного белка.

Термин «восприимчивый к протеолизу» означает, что белок протеолитически расщепляется протеазным компонентом клостридиального нейротоксина дикого типа. Другими словами, такой белок содержит сайт узнавания и расщепления протеазой, позволяющий протеазному компоненту клостридиального нейротоксина дикого типа распознавать его и расщеплять.

В некоторых вариантах осуществления индикаторный белок является меченным. Например, в патенте США №8940482, выданном Oyler et al., описан клеточный анализ для оценки активности клостридиального нейротоксина, где клетка сконструирована для экспрессии меченого слитого белка, содержащего домен флуоресцентного белка, слитый с SNAP-25. Домен флуоресцентного белка является С-концевым по отношению к домену SNAP-25 и становится частью С-концевого фрагмента, который образуется после расщепления SNAP-25 клостридиальным нейротоксином. В анализе, описанном Oyler, полноразмерный слитый белок не является деградируемым в клетке, но полученный С-концевой фрагмент является легко деградируемым, приводя к деградации флуоресцентного белка. Это связано с наличием в SNAP-25 остатка, который действует в качестве дегрона только тогда, когда он обнажается на N-конце образующегося фрагмента в результате расщепления. Такие «N-дегроны» метят убиквитинлигазами, и, таким образом, фрагмент становится мишенью для протеасом для деградации.

Следовательно, в настоящем изобретении предусмотрены варианты осуществления, такие как вариант, описанный Oyler, где клетка сконструирована с возможностью экспрессировать меченый индикаторный белок, который будучи полноразмерным не является легко деградируемым. В таких вариантах осуществления в результате расщепления образуется меченый фрагмент, который легко деградирует в клетке (например, благодаря присутствию N-дегрона). Индикаторный белок метят в той части, которая образует легко деградируемый фрагмент, и метка деградирует вместе с фрагментом. В таких вариантах осуществления способность полипептида расщеплять белок SNARE в клетке можно определять по наличию (или отсутствию) сигнала от метки после контакта клетки с полипептидом.

В некоторых таких вариантах осуществления индикаторный белок также включает метку в той части индикаторного белка, которая после расщепления образует фрагмент, который не деградирует так же легко, как другой фрагмент. Например, индикаторный белок может представлять собой слитый белок, содержащий две метки и домен SNARE, при этом метки фланкируют домен SNARE. В вариантах осуществления, где полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления один из полученных фрагментов является легко деградируемым, расщепление белка SNARE можно определить путем сравнения сигнала, полученного от метки, в легко деградируемом фрагменте с сигналом от метки в менее легко деградируемом фрагменте. Например, в вариантах осуществления, подобных варианту Oyler, где С-концевой фрагмент, полученный в результате расщепления, является легко деградируемым в отличие от N-концевого фрагмента, расщепление можно определить путем сравнения сигнала, полученного от метки на С-концевом фрагменте, с сигналом от метки на N-концевом фрагменте. В таких вариантах осуществления могут быть выбраны метки, испускающие флуоресцентные сигналы, более четко отличимые друг от друга (например, красный и зеленый или красный и голубой).

В контексте настоящего описания термин «метка» означает детектируемый маркер и включает, например, радиоактивную метку, антитело и/или флуоресцентную метку. Количество тестируемого субстрата и/или продукта расщепления можно определить, например, методами авторадиографии или спектрометрии, включая методы, основанные на резонансном переносе энергии между по меньшей мере двумя метками, такими как анализ FRET (подробнее обсуждается ниже). В качестве альтернативы для обнаружения можно использовать иммунологические методы, такие как вестерн-блоттинг или ELISA.

Примеры меток, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, включают: радиоизотопы; флуоресцентные метки; фосфоресцирующие метки; люминесцентные метки; и соединения, способные связываться с меченым партнером по связыванию. Примеры флуоресцентных меток включают: желтый флуоресцентный белок (YFP); синий флуоресцентный белок (BFP); зеленый флуоресцентный белок (GFP), такой как NeonGreen; красный флуоресцентный белок (RFP), такой как mScarlet; голубой флуоресцентный белок (CFP); и их флуоресцирующие мутанты. Примеры люминесцентных меток включают: фотопротеины; люциферазы, такие как люциферазы светлячка, люциферазы Renilla и Gaussia; хемилюминесцентные соединения; и электрохемилюминесцентные (ECL) соединения. В рассмотренных выше вариантах осуществления, в которых N-концевую метку и С-концевую метку выбирают таким образом, чтобы испускаемые сигналы было легче отличить друг от друга, примеры таких пар меток могут включать RFP и GFP и RFP и CFP. Например, RFP, такой как mScarlet, может служить N-концевой меткой, а GFP, такой как NeonGreen или CFP, может служить C-концевой меткой.

В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой белковую метку, такую как антитело, флуоресцентный белок, фотопротеин и люцифераза.

В контексте настоящего описания термин «N-концевая метка» относится к метке, независимо от того, является она белковой или нет, расположенной в части индикаторного белка, которая является N-концевой по отношению к сайту расщепления клостридиальным нейротоксином, а «С-концевая метка» относится к метке, независимо от того, является она белковой или нет, расположенной в части индикаторного белка, которая является С-концевой по отношению к сайту расщепления клостридиальным нейротоксином. Метка не обязательно должна находиться на N-конце или С-конце индикаторного белка, чтобы называться N-концевой или С-концевой меткой. Скорее, эти термины относятся к положению метки относительно сайта расщепления клостридиальным нейротоксином. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения RFP, такой как mScarlet, используется в качестве N-концевой метки, а GFP, такой как NeonGreen, или CFP используется в качестве C-концевой метки.

Другой анализ представляет собой анализ резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). В таком анализе индикаторный белок содержит донорную метку на одной стороне сайта расщепления и акцепторную метку на другой стороне. Донорная метка поглощает энергию и впоследствии передает ее акцепторной метке. Перенос энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донорного хромофора и увеличению интенсивности излучения акцепторного хромофора. Расщепление субстрата приводит к менее успешной передаче энергии. Таким образом, успешное расщепление можно определить по пониженной способности осуществления этого переноса. В таких вариантах осуществления YFP и CFP, а также RFP и GFP, могут быть объединены в пару в качестве пары FRET.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индикаторный белок представляет собой слитый белок, содержащий домен SNARE. Слитый белок также может содержать дополнительные домены, такие как домен метки. Домен метки может иметь аминокислотную последовательность белковой метки. Пример такого слитого белка включает: N-концевой домен метки, такой как аминокислотная последовательность mScarlet; домен SNARE, такой как аминокислотная последовательность SNAP-25; и С-концевой домен метки, такой как аминокислотная последовательность NeonGreen.

Слитый белок также может содержать другие домены, такие как селективный маркер (подробнее обсуждается ниже). В таких вариантах осуществления домен селективного маркера может быть отделен от части слитого белка, содержащей остальные домены (например, домен SNARE и домен(ы) метки) линкером, который может быть расщеплен для возможности отделения селективного маркера и остатка индикаторного белка после трансляции. Линкер может быть, например, саморасщепляющимся (например, саморасщепляющимся пептидом 2А).

Такие анализы обычно также включают этап определения степени превращения индикаторного белка в продукт(ы) его расщепления. Наблюдение одного или более продуктов расщепления, образующихся после контактирования полипептида с индикаторным белком, или наблюдение увеличения количества продукта(ов) расщепления свидетельствует о протеолитической активности полипептида.

Этап определения может включать сравнение полноразмерного индикаторного белка и продукта(ов) расщепления. Сравнение может включать определение количества полноразмерного индикаторного белка и/или количества одного или более продуктов расщепления, а также может включать вычисление соотношения полноразмерного индикаторного белка к продукту(ам) расщепления. Кроме того, анализ для определения протеолитической активности может включать этап сравнения продукта(ов) расщепления, который(ые) появляется(ются) после контакта анализируемого полипептида с индикаторным белком, с контролем. Контролем может быть, например, продукт(ы) расщепления, который(ые) появляется(ются) после контакта с клостридиальным нейротоксином, о котором известно, что он способен расщеплять тот же самый индикаторный белок.

Способы и методы, используемые для лизиса клеток-хозяев, таких как бактериальные клетки, известны в данной области. Примеры включают ультразвуковую обработку или использование Френч-пресса (French press).

В некоторых вариантах осуществления полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления один из образующихся фрагментов является легко деградируемым. Это может быть связано, например, с наличием остатка, который действует в качестве дегрона только тогда, когда он обнажается N-конце образующегося фрагмента в результате расщепления.

В таких вариантах осуществления индикаторный белок может быть меченным в той его части, которая является легче деградируемой после расщепления. Метку следует выбирать таким образом, чтобы при деградации фрагмента метка также деградировала. В таких вариантах осуществления факт расщепления можно определить по измеренному сигналу от метки.

Полученный сигнал можно сравнить с контрольным.

В некоторых таких вариантах осуществления, где другой фрагмент, образованный после расщепления, не является легко деградируемым, индикаторный белок также может включать метку в той части индикаторного белка, которая после расщепления образует такой фрагмент. Таким образом, в таких вариантах осуществления можно определить, происходит ли расщепление, путем сравнения сигнала, поступающего от метки на более легко деградируемом фрагменте, с сигналом, поступающим от метки на менее легко деградируемом фрагменте, который служит контролем.

Сигнал(ы) от метки(меток) можно анализировать путем сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Например, в варианте осуществления, где полноразмерный индикаторный белок и его N-концевой фрагмент, образованный после расщепления, не являются легко деградируемыми внутри клетки, а С-концевой фрагмент, полученный в результате расщепления, является легко деградируемым, и где N-концевая метка представляют собой mScarlet, а С-концевая метка представляет собой NeonGreen, FACS-анализ клеток после успешного расщепления покажет более слабое зеленое излучение по сравнению с красным излучением. Напротив, если расщепление не происходит, красная и зеленая флуоресценции должны одинаково преобладать.

В качестве альтернативы можно сделать флуоресцентные микрофотографии клеток. В варианте осуществления, таком как описанный выше, успешное расщепление будет приводить к менее интенсивной зеленой флуоресценции, испускаемой клетками, по сравнению с контрольными клетками, которые не подвергались воздействию протеазы. Напротив, интенсивность красной флуоресценция должна оставаться такой же, как в контроле.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления анализ может представлять собой анализ FRET. Как обсуждалось ранее, в таком анализе индикаторный белок содержит N-концевую метку и С-концевую метку, причем одна метка является донорной меткой, а другая является акцепторной меткой. Перенос энергии между донорной меткой и акцепторной меткой приводит к снижению интенсивности флуоресценции донорной метки и увеличению интенсивности излучения акцепторной метки. Успех такой передачи зависит от меток, остающихся в непосредственной близости. Расщепление индикаторного белка приводит к отдалению этих меток друг от друга и, как следствие, к менее успешному переносу. Таким образом, успешное расщепление можно определить по сниженной способности к передаче энергии.

В дополнение к вышеизложенному, при практическом применении настоящего изобретения можно использовать любые другие известные в данной области способы анализа флуоресценции индикаторных белков для определения того, произошло ли расщепление.

В некоторых вариантах осуществления полипептид считается протеолитически активным, если 20% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более индикаторного белка превращается в продукт(ы) расщепления менее чем за 1 минуту, менее чем за 5 минут, менее чем за 20 минут, менее чем за 40 минут, менее чем за 60 минут или менее чем за 120 минут.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1А показан вестерн-блоттинг с использованием анти-SNAP-25 антитела после обработки клеток N2a BoNT/A в дозах 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ в течение 8 часов или в дозах 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ в течение 24 часов. Наличие нижней полосы указывает на присутствие продукта расщепления.

На фиг. 1B показан вестерн-блоттинг с использованием анти-SNAP-25 антитела после обработки клеток M17 BoNT/A в дозах 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ в течение 8 часов или в дозах 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ в течение 24 часов. Наличие нижней полосы указывает на присутствие продукта расщепления.

На фиг. 1C показан вестерн-блоттинг с использованием анти-SNAP-25 антитела после обработки клеток IMR-32 BoNT/A в дозах 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ в течение 8 часов или в дозах 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ в течение 24 часов. Наличие нижней полосы указывает на присутствие продукта расщепления.

На фиг. 1D показан вестерн-блоттинг с использованием анти-SNAP-25 антитела после обработки клеток NG108 BoNT/A в дозах 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ в течение 8 часов или в дозах 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ в течение 24 часов. Наличие нижней полосы указывает на присутствие продукта расщепления.

На фиг. 2А представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108 через 1 день после трансфекции плазмидой, содержащей конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг. 2В представлены флуоресцентные микрофотографии клеток М17 через 1 день после трансфекции плазмидой, содержащей конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг. 3 представлены флуоресцентные микрофотографии устойчивых к пуромицину клеток N108, стабильно трансфицированных плазмидой, содержащей конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг. 4 представлена гистограмма, показывающая среднее количество клеток в расчете на HPF, которые флуоресцируют зеленым цветом после обработки 0, 0,1 нМ или 1 нМ BoNT/A.

На фиг. 5A представлена диаграмма рассеяния по данным проточной цитометрии для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc, показывающая гранулярность/сложность по оси x и размер клеток по оси y.

На фиг. 5В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм, для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5C представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 585 нм, для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5D представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 617 нм, для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5Е представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 665 нм, для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5F представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм, для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5G показана диаграмма рассеяния по данным проточной цитометрии для клеток NG108, стабильно трансфицированных mScarlet-SNAP-25-GeNluc, измеренная при 665 нм по оси x и боковом рассеянии (SS) по оси y.

На фиг. 6A представлена диаграмма рассеяния по данным проточной цитометрии для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc, показывающая гранулярность/сложность по оси x и размер клеток по оси y.

На фиг. 6В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм, для клеток М17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6C представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 585 нм, для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6D представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 617 нм, для клеток М17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6Е представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 665 нм, для клеток М17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6F представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм, для клеток М17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6G показана диаграмма рассеяния по данным проточной цитометрии для клеток M17, стабильно трансфицированных mScarlet-SNAP-25-GeNluc, измеренная при 665 нм по оси x и боковом рассеянии (SS) по оси y.

На фиг. 7А представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм, для контрольных клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг. 7В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм, в клетках NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A.

На фиг. 7C представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм, в клетках NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 1,0 нМ BoNT/A.

На фиг. 8А представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм, для контрольных клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг.8В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм, для клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A.

На фиг. 8C представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм, для клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 1,0 нМ BoNT/A.

На фиг. 9 показан вестерн-блоттинг, выполненный на клетках NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных без токсина (контроль), 1 нМ или 8 нМ BoNT/A, или 0 (контроль), 1 нМ, 10 нМ, или 100 нМ BoNT/E.

На фиг. 10А представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и не обработанных токсином.

На фиг. 10В представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10C представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10D представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10E представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/E в течение 72 часов.

На фиг. 10F представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и не обработанных токсином.

На фиг. 10G представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10H представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10I представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10J представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/E в течение 72 часов.

Для фиг. 10A-E метка оси X=площадь neonGreen 525/50 B; метка оси Y=площадь mScarlet 585/40 Y.

На фиг. 11А представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108 дикого типа.

На фиг. 11В представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 1000 пМ и не подвергались дальнейшей обработке BoNT/A.

На фиг. 11C представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 1000 пМ и которые были обработаны 100 пМ BoNT/A в течение 48 часов.

На фиг. 11D представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 1000 пМ и которые были обработаны 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

На фиг. 11E представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка, но не по чувствительности к BoNT/A, и не подвергались дальнейшей обработке BoNT/A.

На фиг. 11F представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка, но не по чувствительности к BoNT/A, и которые были обработаны 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

Для фиг. 11A-f метка оси X=площадь neonGreen 525/50 B; Метка оси Y=площадь mScarlet 585/40 Y.

На фиг. 12А представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 100 пМ и не подвергались дальнейшей обработке BoNT/A.

На фиг. 12В представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 100 пМ и которые были обработаны 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

Для фиг. 12A-b метка оси X=площадь neonGreen B 525/50 525/50 B; Метка оси Y=площадь mScarlet Y 585/40 585/40 Y.

Фиг. 13А представляет собой график выраженного в процентах количества индикаторного белка, расщепленного после обработки клеток NG108, генетически сконструированных для экспрессии индикаторного белка и SV2A или SV2C, различными концентрациями BoNT/A в разное время.

Фиг. 13B представляет собой график выраженного в процентах количества индикаторного белка, расщепленного после обработки клеток NG108, генетически сконструированных для экспрессии индикаторного белка и SV2A или SV2C, различными концентрациями BoNT/E в разное время.

На фиг. 14А представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, экспрессирующих индикатор mScarlet-SNAP-25-GeNluc и конструкцию рецептора GD3-SV2C-Syt, которые не были обработаны токсином. Интенсивность излучения зеленой и красной флуоресценции измеряли при 517 нм и 594 нм, соответственно. Гейт показывает клетки с красной флуоресценцией, но сравнительно более слабой зеленой флуоресценцией.

На фиг. 14В представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, экспрессирующих индикатор mScarlet-SNAP-25-GeNluc и конструкцию рецептора GD3-SV2C-Syt, которые были обработаны 50 пМ BoNT/A. Интенсивность излучения зеленой и красной флуоресценции измеряли при 517 нм и 594 нм, соответственно. Гейт показывает клетки с красной флуоресценцией, но сравнительно более слабой зеленой флуоресценцией.

На фиг. 14C представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, экспрессирующих индикатор mScarlet-SNAP-25-GeNluc и конструкцию рецептора GD3-SV2C-Syt, которые были обработаны 250 пМ BoNT/A. Интенсивность излучения зеленой и красной флуоресценции измеряли при 517 нм и 594 нм, соответственно. Гейт показывает клетки с красной флуоресценцией, но сравнительно более слабой зеленой флуоресценцией.

На фиг. 14D представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, выбранных из клеток, которые появлялись внутри гейта на фиг. 14С, которые были извлечены и размножены, но не были дополнительно обработаны токсином. Интенсивность излучения зеленой и красной флуоресценции измеряли при 517 нм и 594 нм, соответственно. Гейт показывает клетки с красной флуоресценцией, но сравнительно более слабой зеленой флуоресценцией.

На фиг. 14E представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, выбранных из тех, которые появились внутри гейта на фиг. 14C, которые были извлечены, размножены и подвергнуты обработке вторым циклом BoNT/A при 50 пМ. Интенсивность излучения зеленой и красной флуоресценции измеряли при 517 нм и 594 нм, соответственно. Гейт показывает клетки с красной флуоресценцией, но сравнительно более слабой зеленой флуоресценцией.

На фиг. 14F представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, выбранных из тех, которые появлялись внутри гейта на фиг. 14C, которые были извлечены, размножены и подвергнуты обработке вторым циклом BoNT/A при 250 пМ. Интенсивность излучения зеленой и красной флуоресценции измеряли при 517 нм и 594 нм, соответственно. Гейт показывают клетки с красной флуоресценцией, но сравнительно более слабой зеленой флуоресценцией.

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий N-концевую метку mScarlet, SNAP-25, С-концевую метку NeonGreen и С-концевую люциферазу.

SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий N-концевую метку mScarlet, SNAP-25, С-концевую метку CFP и С-концевую люциферазу.

SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, содержащий N-концевой CFP и легкую цепь BoNT/A.

SEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий домены с аминокислотными последовательностями GD3-синтазы, SV2C, синтаксина и аминогликозид-3'-фосфотрансферазы. В слитом белке все домены отделены друг от друга саморасщепляющимся пептидом 2А.

SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий домены с аминокислотными последовательностями GD3-синтазы, SV2A, синтаксина и аминогликозид-3'-фосфотрансферазы. В слитом белке все домены отделены друг от друга саморасщепляющимся пептидом 2А.

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность GD3-синтазы.

SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность саморасщепляющегося пептида 2A, кодируемого SEQ ID NO: 4 и 5.

SEQ ID NO:8 представляет собой аминокислотную последовательность SV2A.

SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность SV2B.

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность SV2C.

SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность четвертого люминального домена SV2A.

SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность четвертого люминального домена SV2B.

SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность четвертого люминального домена SV2C.

SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность синаптотагмина I.

SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность синаптотагмина II.

SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность MScarlet.

SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность NeonGreen.

SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность CFP.

SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность SNAP-25.

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность аминогликозид-3'-фосфотрансферазы (Neo).

SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность пуромицин-N-ацетилтрансферазы (PuroR).

SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность люциферазы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение не ограничено раскрытыми в настоящем описании вариантами осуществления. Действительно, специалистам в данной области техники будут очевидны многочисленные вариации, изменения и замены, не выходящие за объем изобретения. При практическом применении изобретения могут быть использованы различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, раскрытым в настоящем описании.

При описании изобретения, где указан диапазон значений в отношении варианта осуществления, вариант осуществления включает каждое промежуточное значение.

В контексте настоящего описания термин «вариант» белка или полипептида относится к белку или полипептиду с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентична аминокислотной последовательности эталонного белка или полипептида.

«Идентичность последовательности» в контексте настоящего описания относится к идентичности между эталонной аминокислотной или нуклеотидной последовательностью и запрашиваемой аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, где последовательности выровнены таким образом, чтобы было достигнуто наивысшее совпадение, что может быть вычислено с помощью опубликованных методов или способов, кодифицированных в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215:403).

В контексте настоящего описания термин «фрагмент» белка или полипептида относится к укороченным формам белка или полипептида или к укороченным формам варианта белка или полипептида.

В контексте настоящего описания термин «приведение в контакт» относится к физическому сближению клетки и полипептида (например, дикого типа, модифицированного или рекомбинантного клостридиального нейротоксина), чтобы обеспечить физическое и/или химическое взаимодействие. Приведение в контакт (контактирование) осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения в клетке взаимодействия полипептида с индикаторным белком (обсуждаемым далее в настоящем описании).

«Индикаторный белок» представляет собой белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином. Соответственно, индикаторный белок не расщепляется в отсутствие клостридиального нейротоксина или его протеолитически активного домена. Термин «индикаторный белок не расщепляется в отсутствие клостридиального нейротоксина» предпочтительно означает, что индикаторный белок по существу не расщепляется в отсутствие клостридиального нейротоксина. Термин «по существу не расщепляется» может означать, что в отсутствие клостридиального нейротоксина расщепляется ≤5%, ≤2% или ≤1% (предпочтительно ≤1%) присутствующего в клетке индикаторного белка. В предпочтительном варианте осуществления «по существу не расщепляется» означает, что ни один индикаторный белок, присутствующий в клетке, не расщепляется в отсутствие клостридиального нейротоксина. Соответственно, индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления один из образующихся фрагментов является легко деградируемым (предпочтительно деградирует С-концевой фрагмент). В отсутствие клостридиального нейротоксина в клетке может деградировать, например, ≤5%, ≤2% или ≤1% (предпочтительно ≤1%, более предпочтительно, например, не 0%).

Настоящее изобретение, в частности, относится к способу получения популяции рекомбинантных клеток, высокочувствительных к клостридиальному нейротоксину. Клетка может быть использована в анализе для определения активности полипептида (например, модифицированного или рекомбинантного клостридиального нейротоксина). В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению включает:

(а) приведение рекомбинантных клеток, экспрессирующих индикаторный белок, в контакт с клостридиальным нейротоксином; и

(b) после этого отбор клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка.

Один из аспектов изобретения основан на неожиданном открытии того, что может быть выведена популяция клеток, демонстрирующая повышенную чувствительность к клостридиальному нейротоксину, путем выделения клеток (из популяции), которые проявляют чувствительность к клостридиальному нейротоксину, и последующего отбора из указанных «выделенных клеток» только тех клеток, которые остаются чувствительными. Этот процесс можно повторять (итерировать) необходимое количество раз, «концентрируя» при каждой итерации те клетки, которые обладают длительной/высокой чувствительностью к клостридиальному нейротоксину.

Например, если (исходная) популяция клеток стала чувствительной к клостридиальному нейротоксину в результате применения метода генной инженерии (например, путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор клостридиального нейротоксина, или обеспечения экспрессии ганглиозида клостридиального нейротоксина), итеративная селекция позволяет отбирать клетки-предшественники, которые сохраняют чувствительность (например, сохраняют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор клостридиального нейротоксина, или обеспечивают экспрессию ганглиозида клостридиального нейротоксина), при этом допуская отбраковку клеток, которые проявляют только временную чувствительность (например, временную экспрессию).

В одном из аспектов изобретение относится к способу выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину, причем способ включает:

(а) приведение популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином; при этом указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации этапов а)-с);

где в указанной по меньшей мере одной итерации клетки этапа а) содержат (или состоят из) клетки-предшественники, выделенные на предыдущем этапе с);

при этом необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией (предпочтительно перед каждой итерацией) клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Один из аспектов изобретения относится к способу выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину, причем способ включает:

(а) приведение популяции клеток (предпочтительно популяции рекомбинантных клеток) в контакт с клостридиальным нейротоксином; при этом указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i. индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii. рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно рецептор и ганглиозид), обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации этапов а)-с), при этом клетки, выделенные на предыдущей итерации этапа с), предоставляют в качестве популяции клеток для последующей итерации этапа а);

(e) при этом необязательно перед указанной по меньшей мере одной итерацией этапов а)-с) (предпочтительно перед каждой итерацией) клетки, выделенные на предыдущем этапе с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе а).

Термин «по меньшей мере одна итерация» может означать по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть (предпочтительно по меньшей мере две) итераций. В одном из вариантов осуществления «по меньшей мере одна итерация» означает одну, две, три, четыре, пять или шесть итераций, например, две итерации. Предпочтительно «по меньшей мере одна итерация» означает одну итерацию.

Преимущественно, во время этапа приведения в контакт при каждой итерации концентрация клостридиального нейротоксина может быть меньше, чем концентрация клостридиального нейротоксина, использованная на предыдущем этапе приведения в контакт (например, на предыдущей итерации). Применяется давление отбора, и, таким образом, осуществляется отбор (например, концентрирование) клеток, обладающих особенно высокой чувствительностью к клостридиальному нейротоксину.

В одном из вариантов осуществления при каждой итерации этапа (а) клетки контактируют с меньшим количеством (например, по меньшей мере в два раза, по меньшей мере в пять раз или по меньшей мере в десять раз) клостридиального нейротоксина по сравнению с количеством, с которым они контактировали на предыдущем этапе (а) (например, на предыдущей итерации этапа (а)). В одном из вариантов осуществления в указанной по меньшей мере одной итерации клетки контактируют с меньшим количеством клостридиального нейротоксина по сравнению с количеством, с которым они контактировали на предыдущем этапе (а) (например, на предыдущей итерации этапа (а)).

В одном из вариантов осуществления в указанной по меньшей мере одной итерации клетки контактируют с по меньшей мере в два раза, по меньшей мере в пять раз или по меньшей мере в десять раз меньшим количеством клостридиального нейротоксина по сравнению с количеством, с которым они контактировали на предыдущем этапе (а) (например, на предыдущей итерации этапа (а)). В предпочтительном варианте осуществления в указанной по меньшей мере одной итерации клетки контактируют с по меньшей мере в пять раз меньшим количеством клостридиального нейротоксина по сравнению с количеством, с которым они контактировали на предыдущем этапе (а) (например, на предыдущей итерации этапа (а)).

В некоторых вариантах осуществления такое контактирование может включать культивирование клеток в среде, содержащей клостридиальный нейротоксин. Клостридиальный нейротоксин обычно присутствует в средах в концентрациях от примерно 0,0001 до примерно 100000 пМ, от 0,0001 до примерно 10000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 1000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 500 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 300 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 100 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 10 пМ или от примерно 0,0001 до примерно 1 пМ. Такое культивирование может, например, длиться примерно 2 часа или более, примерно 4 часа или более, примерно 6 часов или более, примерно 12 часов или более, примерно 24 часа или более, примерно 36 часов или более, примерно 48 часов или более, примерно 60 часов или более, примерно 72 часа или более, примерно 84 часов или более, примерно 96 часов или более, примерно 108 часов или более или примерно 120 часов или более.

В одном из вариантов осуществления на этапе а) (например, при контактировании популяции клеток с клостридиальным нейротоксином или при контактировании рекомбинантных клеток, экспрессирующих индикаторный белок, с клостридиальным нейротоксином) клостридиальный нейротоксин присутствует в концентрации от примерно 0,0001 до примерно 100000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 50000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 20000 пМ, от 0,0001 до примерно 10000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 1000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 500 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 300 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 100 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 10 пМ или от примерно 0,0001 до примерно 1 пМ. Например, клостридиальный нейротоксин присутствует в концентрации от примерно 0,0001 до примерно 100000 пМ.

Предпочтительно концентрации клостридиального нейротоксина на этапе а) (например, при контактировании популяции клеток с клостридиальным нейротоксином или контактировании рекомбинантных клеток, экспрессирующих индикаторный белок, с клостридиальным нейротоксином) индивидуализируют следующим образом:

- от 0,0001 до примерно 100000 пМ

- от 0,0001 до примерно 1000 пМ

- от примерно 1 до примерно 500 пМ

- примерно от 45 до примерно 300 пМ

- примерно от 50 до примерно 250 пМ.

Указанные концентрации предпочтительно относятся к концентрации во время первого выполнения этапа а) (например, перед по меньшей мере одной итерацией). Концентрация в каждой итерации этапа а) может быть уменьшена, например, на 1/2, 1/5, 1/10, предпочтительно на примерно 1/5.

В некоторых других вариантах осуществления такое контактирование может осуществляться путем трансфекции клетки (например, временной трансфекции) экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид.

Этап отбора клеток, демонстрирующих расщепление индикаторного белка, включает определение того, произошло ли расщепление индикаторного белка (обсуждается далее в настоящем описании). Это может быть достигнуто любыми средствами, известными в данной области техники. Например, можно использовать любой метод, позволяющий определить, превратился ли полноразмерный индикаторный белок в продукты его расщепления.

В некоторых вариантах осуществления полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления один из образующихся фрагментов является легко деградируемым. Это может быть, например, связано с наличием остатка, который действует в качестве дегрона только тогда, когда он обнажается на N-конце образующегося фрагмента в результате расщепления.

В таких вариантах осуществления индикаторный белок может быть меченным в той его части, которая легче деградирует после расщепления. Метку следует выбрать таким образом, чтобы при деградации фрагмента метка также деградировала. В таких вариантах осуществления можно определить факт расщепления и уровень такого расщепления (т.е. количество расщепленного индикаторного белка) по измеренному сигналу от метки.

В некоторых таких вариантах осуществления, в которых другой фрагмент, образованный после расщепления, не является легко деградируемым, индикаторный белок также может включать метку в той части, которая после расщепления образует указанный фрагмент. В таких вариантах осуществления факт расщепления и уровень такого расщепления можно определить путем сравнения сигнала от метки на более легко деградируемом фрагменте с сигналом от метки на менее легко деградируемом фрагменте, который служит контролем.

В одном из вариантов осуществления индикаторный белок содержит С-концевую метку, и С-концевая метка не высвобождается (например, не отщепляется) от индикаторного белка в отсутствие клостридии.

В одном из вариантов осуществления индикаторный белок содержит С-концевую метку, и полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления образующийся С-концевой фрагмент является легко деградируемым, и деградация С-концевого фрагмента приводит к деградации С-концевой метки.

В одном из вариантов осуществления индикаторный белок содержит С-концевую метку, и полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления С-концевой фрагмент является легко деградируемым, и деградация С-концевого фрагмента приводит к деградации С-концевой метки, и расщепление индикаторного белка определяют путем измерения сигнала от С-концевой метки после контактирования клетки с клостридиальным нейротоксином; причем предпочтительно уменьшение уровня С-концевой метки во время или после контакта с клостридиальным нейротоксином (например, во время или после этапа а)) указывает на расщепление индикаторного белка.

Сигнал(ы) от метки(меток) можно анализировать путем сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS®). Например, в варианте осуществления, в котором полноразмерный индикаторный белок и его N-концевой фрагмент, образованный после расщепления, не являются легко деградируемыми в клетке, но С-концевой фрагмент, полученный в результате расщепления, является легко деградируемым, FACS®-анализ клеток после успешного расщепления покажет, что излучение N-концевой метки в целом не изменилось по сравнению с излучением до расщепления, в то время как излучение C-концевой метки будет более слабым. Напротив, если расщепление не происходит, излучение обеих меток должно оставаться относительно неизменненным.

В качестве альтернативы можно сделать флуоресцентные микрофотографии клеток. В варианте осуществления, таком как описанный выше, успешное расщепление будет приводить к более слабой зеленой флуоресценции, испускаемой клетками, по сравнению с контрольными клетками, которые не подвергались воздействию протеазы. Напротив, красная флуоресценция должна оставаться такой же, как в контроле.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления анализ может представлять собой анализ FRET. Как обсуждалось ранее, в таком анализе индикаторный белок содержит N-концевую метку и С-концевую метку, причем одна метка является донорной меткой, а другая является акцепторной меткой. Перенос энергии между донорной меткой и акцепторной меткой приводит к снижению интенсивности флуоресценции донорной метки и увеличению интенсивности излучения акцепторной метки. Успех такой передачи зависит от меток, остающихся в непосредственной близости. Расщепление индикаторного белка приводит к отдалению этих меток друг от друга и, как следствие, к менее успешному переносу. Таким образом, успешное расщепление и уровень такого расщепления можно определить по сниженной способности к передаче энергии

В дополнение к вышеизложенному, при осуществлении настоящего изобретения для определения факта расщепления и уровня такого расщепления могут быть использованы любые другие способы, известные в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления выбранные клетки представляют собой клетки, которые демонстрируют более высокий уровень расщепления, измеряемый количеством расщепленного индикаторного белка. Например, в некоторых вариантах осуществления выбирают клетки, в которых 20% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более индикаторного белка, присутствующего в клетках, превращается в продукт(ы) расщепления.

Процент индикаторного белка, который расщепляется (например, превращается в продукт(ы) расщепления), может быть определен с помощью вестерн-блоттинга. Способ по изобретению может включать этап подтверждения того, что расщепляется 20% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более (предпочтительно по меньшей мере 20%) индикаторного белка.

В одном из вариантов осуществления после контактирования с клостридиальным нейротоксином клетки могут быть лизированы, а полученный клеточный лизат может быть приведен в контакт по меньшей мере с антителом, которое связывается с продуктом расщепления (предпочтительно дополнительно с антителом, которое связывается с нерасщепленным индикаторным белком), и может быть выполнен вестерн-блоттинг; например, для подтверждения того, что расщепляется 20% или более, 50% или более, 75% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более, 98% более или 99% или более (предпочтительно не менее 20%) индикаторного белка.

Отбор клеток может включать отделение выбранных клеток для формирования популяции клеток, в которой средняя чувствительность клеток к клостридиальному нейротоксину выше по сравнению со средней чувствительностью клеток исходной популяции. Это может быть достигнуто с помощью средств, известных в данной области техники. Например, методы сортировки с помощью проточной цитометрии, используемые для анализа клеток, также приводят к сортировке клеток исходя из того, произошло ли расщепление, и/или измеренного уровня расщепления (и, следовательно, чувствительности клеток к клостридиальному нейротоксину).

В некоторых вариантах осуществления этапы (а) и (b) повторяют по меньшей мере один раз с клетками, выбранными на этапе (b). Эти этапы можно повторять необходимое колличество раз, например, два или более, пока не будет создана популяция клеток с требуемой средней чувствительностью к клостридиальному нейротоксину. Ожидается, что при каждой итерации клетки, отобранные на этапе (b), должны иметь повышенную среднюю чувствительность к клостридиальному нейротоксину.

В некоторых вариантах осуществления при повторении этапа (а) клетки контактируют с меньшим количеством клостридиального нейротоксина (например, с более низкой концентрацией клостридиального нейротоксина) по сравнению с количеством, с которым они контактировали во время предыдущего повторения этапа (а). Предполагая, что на этапе (b) используется та же квалификация для отбора (например, клетки, в которых расщепляется 20% или более индикаторного белка), что и на предыдущей итерации, клетки, отобранные после воздействия на них более низкой концентрации клостридиального нейротоксина, должны иметь повышенную среднюю чувствительность к клостридиальному нейротоксину по сравнению с клетками, отобранными на предыдущей итерации, на которой было оказано воздействие более высоким уровнем клостридиального нейротоксина.

В некоторых вариантах осуществления перед повторением этапов (а) и (b) клетки, отобранные на этапе (b), размножают, например, примерно до количества клеток в исходной популяции клеток. Этого можно достичь способами, известными в данной области, например, путем культивирования клеток.

Рекомбинантные клетки, используемые в способе по настоящему изобретению, генетически сконструированы для экспрессии экзогенного индикаторного белка. В контексте настоящего описания термин «индикаторный белок» относится к белку, который содержит белок SNARE или его вариант или фрагмент, который подвержен протеолизу клостридиальным нейротоксином дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант может быть идентичным на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% последовательности белка SNARE. Часть индикаторного белка, имеющая аминокислотную последовательность белка SNARE или его варианта или фрагмента, называется в настоящем описании «доменом SNARE» индикаторного белка.

Термин «восприимчивый к протеолизу» означает, что белок протеолитически расщепляется протеазным компонентом клостридиального нейротоксина дикого типа. Другими словами, такой белок содержит сайт узнавания и расщепления протеазой, позволяющий протеазному компоненту клостридиального нейротоксина дикого типа распознавать его и расщеплять.

Как описано ранее, настоящее изобретение предусматривает варианты осуществления, такие как вариант осуществления, описанный в патенте США № 8940482, выданном Oyler et al., где клетка сконструирована для экспрессии индикаторного белка, который будучи полноразмерным, не является легко деградируемым в клетке, но после расщепления полученный фрагмент является легко деградируемым в клетке (например, благодаря присутствию N-дегрона). Индикаторный белок является меченным в той части, которая образует легко деградируемый фрагмент, и метка деградирут вместе с фрагментом. В таких вариантах осуществления способность полипептида расщеплять белок SNARE в клетке может определяться наличием (или его отсутствием) сигнала от метки после контактирования клетки с клостридиальным нейротоксином.

В некоторых таких вариантах осуществления, в которых расщепление также приводит к образованию фрагмента, который является относительно менее деградируемым (по сравнению с вышеупомянутым легко деградируемым фрагментом), индикаторный белок также может быть меченным в той части, которая образует менее легко деградируемый фрагмент. В таких вариантах осуществления расщепление белка SNARE можно определить путем сравнения сигнала, полученного от метки на легко деградируемом фрагменте, с сигналом от метки на менее легко деградируемом фрагменте. Например, в вариантах осуществления, где С-концевой фрагмент, полученный в результате расщепления, является легко деградируемым, а N-концевой фрагмент является менее деградируемым, расщепление можно определить путем сравнения сигнала, полученного от метки на С-концевом фрагменте, с сигналом от метки на N-концевом фрагменте. Если сигнал от метки на N-концевом фрагменте сильнее сигнала от С-концевого фрагмента, то расщепление произошло. В таких вариантах осуществления могут быть выбраны метки, испускающие флуоресцентные сигналы, которые являются более четко отличимыми друг от друга (например, красный и зеленый или красный и голубой).

В контексте настоящего описания термин «метка» означает детектируемый маркер и включает, например, радиоактивную метку, антитело и/или флуоресцентную метку. Количество тестируемого индикаторного белка и/или продукта расщепления можно определить, например, методами авторадиографии или спектрометрии, включая методы, основанные на переносе энергии резонанса между по меньшей мере двумя метками, такие как анализ FRET (подробнее обсуждается ниже). В качестве альтернативы для детектирования можно использовать иммунологические методы, такие как вестерн-блоттинг или ELISA.

Примеры меток, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, включают: радиоизотопы; флуоресцентные метки; фосфоресцирующие метки; люминесцентные метки; и соединения, способные связываться с меченным партнером по связыванию. Примеры флуоресцентных меток включают: желтый флуоресцентный белок (YFP); синий флуоресцентный белок (BFP); зеленый флуоресцентный белок (GFP), такой как NeonGreen; красный флуоресцентный белок (RFP), такой как mScarlet; голубой флуоресцентный белок (CFP); и их флуоресцирующие мутанты. Примеры люминесцентных меток включают: фотопротеины; люциферазы, такие как люциферазы светлячка, люциферазы Renilla и Gaussia; хемилюминесцентные соединения; и электрохемилюминесцентные (ECL) соединения. В рассмотренных выше вариантах осуществления, в которых N-концевую метку и С-концевую метку выбирают таким образом, чтобы испускаемые сигналы было легче отличить друг от друга, примеры таких пар меток могут включать RFP и GFP и RFP и CFP. Например, RFP, такой как mScarlet, может служить N-концевой меткой, а GFP, такой как NeonGreen или CFP, может служить C-концевой меткой.

В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой белковую метку, такую как антитело, флуоресцентный белок, фотопротеин и люцифераза.

В контексте настоящего описания термин «N-концевая метка» относится к метке, независимо от того, является она белковой или нет, расположенной в части индикаторного белка, которая является N-концевой по отношению к сайту расщепления клостридиальным нейротоксином, а «С-концевая метка» относится к метке, независимо от того, является она белковой или нет, расположенной в части индикаторного белка, которая является С-концевой по отношению к сайту расщепления клостридиальным нейротоксином. Метка не обязательно должна находиться на N-конце или С-конце индикаторного белка, чтобы называться N-концевой или С-концевой меткой. Скорее, эти термины относятся к положению метки относительно сайта расщепления клостридиальным нейротоксином. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения RFP, такой как mScarlet, используется в качестве N-концевой метки, а GFP, такой как NeonGreen, или CFP используется в качестве C-концевой метки.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индикаторный белок представляет собой слитый белок, который содержит домен SNARE и дополнительный(ые) домен(ы), такой как домен метки. Домен метки может иметь аминокислотную последовательность белковой метки. Пример такого слитого белка включает: N-концевой домен метки, такой как аминокислотная последовательность mScarlet; домен SNARE, такой как аминокислотная последовательность SNAP-25; и С-концевой домен метки, такой как аминокислотная последовательность NeonGreen.

В одном из вариантов осуществления индикаторный белок является меченным аминокислотной последовательностью mScarlet и аминокислотной последовательностью NeonGreen.

В одном из вариантов осуществления индикаторный белок является меченным аминокислотной последовательностью mScarlet в качестве N-концевой метки и NeonGreen в качестве С-концевой метки.

В одном из вариантов осуществления расщепление индикаторного белка детектируют путем измерения сигнала от С-концевой метки; причем предпочтительно уменьшение С-концевой метки во время или после контакта с клостридиальным нейротоксином (например, во время или после этапа а)) указывает на расщепление индикаторного белка.

Способы, раскрытые в настоящем описании, могут включать введение нуклеиновой кислоты, кодирующей индикаторный белок, в рекомбинантные клетки или популяцию клеток (например, на этапе а).

Слитый белок также может содержать другие домены, такие как селективный маркер (подробнее обсуждается ниже). В таких вариантах осуществления домен селективного маркера может быть отделен от части слитого белка, содержащей остальные домены (например, домен SNARE и домен(ы) метки), линкером, который может быть расщеплен для возможности отделения селективного маркера и остатка индикаторного белка после трансляции. Линкер может быть, например, саморасщепляющимся (например, саморасщепляющимся пептидом 2А).

В некоторых вариантах осуществления для использования в исходной популяции рекомбинантных клеток в способе по настоящему изобретению отбирают рекомбинантные клетки, имеющие более высокий уровень экспрессии индикаторного белка. Отбор таких клеток может быть осуществлен способами, известными в данной области. Например, в вариантах осуществления, в которых индикаторный белок является меченным, могут быть отобраны клетки с более высоким уровнем сигнала от метки(меток). Этого можно достичь, например, путем сортировки таких клеток методом FACS®. Такую сортировку можно повторять необходимое количество раз для отбора клеток с повышенной экспрессией индикаторного белка.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные клетки также генетически сконструированы таким образом, чтобы они обладали повышенной чувствительностью к клостридиальному нейротоксину. Это достигается путем увеличения экспрессии рецепторов клостридиального нейротоксина на таких клетках. Рецепторы клостридиального нейротоксина включают белковые рецепторы и ганглиозиды плазматической мембраны.

Ганглиозиды представляют собой олигогликозилцерамиды, полученные из лактозилцерамида и содержащие остаток сиаловой кислоты, такой как N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac), N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc) или 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нонулозоновая кислота (KDN). Ганглиозиды присутствуют и концентрируются на клеточных поверхностях, при этом две углеводородные цепи церамидного фрагмента встроены в плазматическую мембрану, а олигосахариды расположены на внеклеточной поверхности, где они представляют собой точки распознавания внеклеточных молекул или поверхностей соседних клеток. Ганглиозиды также специфически связываются с вирусами и бактериальными токсинами, такими как клостридиальные нейротоксины.

Ганглиозиды определяются системой номенклатуры, в которой M, D, T и Q относятся к моно-, ди-, три- и тетрасиалоганглиозидам соответственно, а числа 1, 2, 3 и т.д. относятся к порядку миграции ганглиозидов на тонкослойной хроматографии. Например, порядок миграции моносиалоганглиозидов является следующим: GM3 > GM2 > GM1. Для обозначения вариаций в базовых структурах добавляют дополнительные термины, например GM1a, GD1b и т.д. Гликосфинголипиды, имеющие 0, 1, 2 и 3 остатка сиаловой кислоты, связанные с внутренним звеном галактозы, называются ганглиозидами асиало- (или 0-), a-, b- и c-ряда, соответственно, в то время как ганглиозиды имеющие остатки сиаловой кислоты, связанные с внутренним остатком N-галактозамина, классифицируются как ганглиозиды а-ряда. Пути биосинтеза 0-, а-, b- и с-ряда ганглиозидов включают последовательную активность сиалилтрансфераз и гликозилтрансфераз, как показано, например, в Ledeen et al., Trends in Biochemical Sciences, 40:407-418 (2015). Может происходить дальнейшая сиализация каждого ряда и в разных положениях углеводной цепи с образованием все более сложного и гетерогенного ряда продуктов, таких как ганглиозиды ряда a с остатком(и) сиаловой кислоты, связанным с внутренним остатком N-ацетилгалактозамина. Ганглиозиды переносятся на внешний листок плазматической мембраны с помощью транспортной системы, включающей образование везикул.

На сегодняшний день в тканях позвоночных идентифицировано примерно 200 ганглиозидов. Общие ганглиозиды включают: GM1; GM2; GM3; GD1a; GD1b; GD2; GD3; GT1b; GT3; и GQ1.

В одном из вариантов осуществления клостридиальный нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин (например, BoNT). Клостридиальный нейротоксин может быть выбран из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G и BoNT/H. Например, клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/A. Клостридиальный нейротоксин может представлять собой BoNT/E.

Клостридиальные нейротоксины имеют два независимых участка связывания в домене H_CC для ганглиозидов и рецепторов нейрональных белков. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G имеют консервативный сайт связывания ганглиозидов в домене H_CC, состоящем из мотива «E(Q)… H(K)… SXWY… G», тогда как BoNT/C и BoNT/D демонстрируют два независимых сайта связывания ганглиозидов. Lam et al., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 117:225-231 (2015). Большинство BoNT связываются только с ганглиозидами, имеющими 2,3-связанный остаток N-ацетилнейраминовой кислоты (обозначаемый Sia5), присоединенный к Gal4 олигосахаридного ядра, тогда как соответствующий ганглиозид-связывающий карман на TeNT также может связываться с GM1a, ганглиозидом, лишенным остатка сахара Sia5. Было обнаружено, что BoNT/D связывается с GM1a и GD1a. См. Kroken et al., Journal of Biological Chemistry, 286:26828-26837 (2011). Комбинируя данные, полученные от мышей с дефицитом ганглиозидов, и биохимические анализы, BoNT/A, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G демонстрируют предпочтение терминальной части NAcGal-Gal-NAcNeu, присутствующей в GD1a и GT1b, тогда как BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D и TeNT требует присутствия дисиалилового мотива в GD1b, GT1b и GQ1b. Таким образом, избыточное количество сложных полисиалоганглиозидов, таких как GD1a, GD1b и GT1b, по-видимому, необходимо для специфического накопления всех серотипов BoNT и TeNT на поверхности нейронных клеток в качестве первой стадии интоксикации. См. Rummel, Andreas, «Double receptor anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity», Botulinum Neurotoxins, Springer Berlin Heidelberg (2012) 61-90.

Ввиду вышеизложенного, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии ганглиозида. В конкретных вариантах осуществления клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GM1a, GD1a, GD1b, GT1b и/или GQ1b. В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD1a, GD1b и/или GT1b. В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD1b и/или GT1b.

В одном из вариантов осуществления ганглиозид выбирают из GM1a, GD1a, GD1b, GT1b и GQ1b; предпочтительно клетки (например, на этапе а) генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии GM1a, GD1a, GD1b, GT1b и/или GQ1b.

В одном из вариантов осуществления ганглиозид выбирают из GD1a, GD1b и GT1b; предпочтительно клетки (например, на этапе а)) генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии GD1a, GD1b и/или GT1b.

В одном из вариантов осуществления ганглиозид выбирают из GD1b и GT1b; предпочтительно клетки (например, на этапе а)) генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии GD1b и/или GT1b.

Клетки этапа а) могут содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент пути синтеза ганглиозидов (или его вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента).

Ганглиозиды синтезируют, начиная с церамида. В случае церамида, один путь включает добавление единицы глюкозы при участии глюкозилцерамидсинтазы с образованием глюкозилцерамида (GlcCer). Затем β1,4-галактозилтрансфераза I (GalT-I) катализирует присоединение галактозной единицы к GlcCer с образованием лактозилцерамида (LacCer). GalNAc-трансфераза (GalNAcT) обеспечивает добавление N-ацетилгалактозамина к LacCer с образованием GA1, или GM3-синтаза обеспечивает добавление сиаловой кислоты с образованием GM3. GD3 может быть образован из GM3 путем добавления дополнительной сиаловой кислоты с участием GD3-синтазы. GT3 может быть образован из GD3 путем добавления еще большего количества сиаловой кислоты с участием GT3-синтазы. Другой путь включает добавление галактозной единицы к LacCer с участием галактозилцерамидсинтазы с образованием галактозилцерамида (GalCer). Затем с участием GM4-синтазы добавляют дополнительную углеводную группу с образованием GM4. После этого GM3, GD3 и GT3 могут быть модифицированы с образованием более сложных ганглиозидов ряда «a», «b» или «c», соответственно. Такие реакции катализируются GalNAcT, β1,3-галактозилтрансферазой II (GalT-II), α2,3-сиалилтрансферазой IV (ST-IV) или α2,8-сиалилтрансферазой V (ST-V). Например, из GD3 образуются ганглиозиды ряда «b» - GD1b, GT1b и GQ1b.

Таким образом, клетки по настоящему изобретению могут быть сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии желаемого ганглиозида путем генетический модификации для экспрессии или сверхэкспрессии фермента пути биосинтеза, который приводит к ганглиозиду. Например, клетка может быть генетически сконструирована (т.е. путем трансфекции) с тем, чтобы она содержала экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую такой фермент. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии глюкозилцерамидсинтазы, GalT-I, GalNAcT, GM3-синтазы, GD3-синтазы, GT3-синтазы, галактозилцерамидсинтазы, GM4-синтазы, GalT-II, ST-IV и/или СТ-В.

Клетки на этапе а) могут содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую глюкозилцерамидсинтазу, GalT-I, GalNAcT, GM3-синтазу, GD3-синтазу, GT3-синтазу, галактозилцерамидсинтазу, GM4-синтазу, GalT-II, ST-IV или ST-V, или ее вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента; предпочтительно GD3-синтазу или ее вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью GD3-синтазы; более предпочтительно GD3-синтазы.

В одном из вариантов осуществления уровень экспрессии рецептора и/или ганглиозида (например, за счет фермента пути синтеза ганглиозида или его варианта или фрагмента, обладающего каталитической активностью такого фермента) в клетках (например, на этапе а)) выше по сравнению с клеткой, в которой отсутствует указанная нуклеиновая кислота (предпочтительно отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота).

Специалисту в данной области должно быть понятно, что варианты или фрагменты таких ферментов, которые сохраняют желаемую каталитическую активность, также могут играть роль в синтезе представляющих интерес ганглиозидов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетку генетически конструируют для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента фермента пути синтеза ганглиозидов, который сохраняет способность этого фермента. Например, в некоторых вариантах осуществления клетку генетически конструируют для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента глюкозилцерамидсинтазы, обладающего способностью присоединять глюкозу к церамиду, варианта или фрагмента GalT-I, обладающего способностью добавлять галактозную единицу к GlcCer, варианта или фрагмента GalNAcT, обладающего способностью добавлять N-ацетилгалактозамин к LacCer, варианта или фрагмента GM3-синтазы, обладающего способностью добавлять сиаловую кислоту к LacCer, варианта или фрагмента GD3-синтазы, обладающего способностью добавлять сиаловую кислоту к GM3, варианта или фрагмента GT3-синтазы, обладающего способностью добавлять сиаловую кислоту к GD3, варианта или фрагмента галактозилцерамидсинтазы, обладающего способностью добавлять галактозную единицу к LacCer, и/или варианта GM4-синтазы, обладающего способностью добавлять углеводную группу к GalCer.

В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности фермента пути биосинтеза, приводящего к ганглиозиду, и которая сохраняет желаемую каталитическую активность такого фермента. В некоторых таких вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности глюкозилцерамидсинтазы, GalT-I, LacCer, GalNAcT, GD3-синтазы, GT3-синтазы, галактозилцерамида, GM4-синтазы, GalT-II, ST-IV и/или ST-V и которая сохраняет желаемую каталитическую активность этого фермента.

Фрагмент может иметь, например, 50 аминокислот или меньше, 40 аминокислот или меньше, 30 аминокислот или меньше, 20 аминокислот или меньше или 10 аминокислот или меньше.

В данной области известны анализы, которые можно использовать для определения того, какие варианты или фрагменты обладают желаемой каталитической активностью. Например, специалисту в данной области известны анализы, которые можно использовать для определения, обладает ли вариант или фрагмент GD3-синтазы способностью добавлять сиаловую кислоту к GM3.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что вышеупомянутые ферменты также могут кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые отличаются от вышеупомянутой экзогенной нуклеиновой кислоты консервативными заменами, известными в данной области. Специалисту в данной области также понятно, что варианты ферментов могут, например, кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичны последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент дикого типа. Таким образом, изобретение также относится к клетке, генетически сконструированной таким образом, чтобы она содержала экзогенную нуклеиновую кислоту, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один из вышеупомянутых ферментов, и/или нуклеиновую кислоту, которая отличается от нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующей такой фермент, только консервативными заменами, причем кодируемый белок представляет собой фермент дикого типа или его вариант, сохраняющий каталитическую активность фермента дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии фермента, который служит для катализа того, что было определено как являющееся лимитирующей стадией биосинтеза желаемого ганглиозида или его варианта или фрагмента, обладающего желаемой каталитической активностью такого фермента. Например, GD3-синтаза представляет собой фермент, который катализирует лимитирующую стадию биосинтеза ганглиозидов ряда «b», в частности, присоединение сиаловой кислоты к GM3. Таким образом, в вариантах осуществления, в которых желательна экспрессия или сверхэкспрессия GD1b, GT1b и/или GQ1b, клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD3-синтазы или ее варианта или фрагмента, обладающего способностью добавлять сиаловую кислоту к GM3.

Например, клетка может быть трансфицирована нуклеиновой кислотой, кодирующей GD3-синтазу, или описанной выше нуклеиновой кислотой, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности такой нуклеиновой кислоты, например кислотой, кодирующей вариант GD3-синтазы, сохранивший ее каталитическую активность или отличающийся от GD3-синтазы дикого типа только консервативными заменами.

Связывание некоторых клостридиальных нейротоксинов с клетками также может зависеть от связывания с белковыми рецепторами. BoNT/A, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и TeNT связываются с белком синаптических везикул 2 (SV2), при этом BoNT/A способен связываться со всеми тремя его изоформами (SV2A, SV2B и SV2C), а BoNT/E способен связываться только с изоформами SV2A и SV2B. BoNT/B и BoNT/G связываются с обеими изоформами (I и II) синаптотагмина. Синаптотагмин и SV2 локализованы на синаптических везикулах и становятся доступными для среды внеклеточного пространства, когда везикулы сливаются с пресинаптической мембраной. Именно в этот период клостридиальные нейротоксины связываются со своими белковыми рецепторами.

Таким образом, клетки по настоящему изобретению могут быть сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии желаемого белкового рецептора, например, SV2 (например, SV2A, SV2B и SV2C) или синаптотагмина (например, синаптотагмина I и синаптотагмина II). Например, клетка может быть модифицирована (например, путем трансфекции) таким образом, чтобы она содержала экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую такой белковый рецептор.

В одном из вариантов осуществления рецептор представляет собой SV2 (например, SV2A, SV2B и SV2C) или синаптотагмин (например, синаптотагмин I и синаптотагмин II); или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином. В одном из вариантов осуществления рецептор представляет собой SV2 (или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином). Рецептор может представлять собой SV2A или SV2C, предпочтительно SV2A (или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином). В одном из вариантов осуществления рецептор представляет собой четвертый люминальный домен SV2A или SV2C.

Настоящее изобретение также относится к белкам, которые отличаются от таких белковых рецепторов, но все еще сохраняют способность связываться с клостридиальным нейротоксином. Такие белки могут быть вариантом или фрагментом такого белкового рецептора, сохранившим способность рецептора связываться с клостридиальным нейротоксином. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента SV2, который связывается с BoNT/A, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и/или TeNT. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента синаптотагмина, который связывается с BoNT/B и/или BoNT/G.

В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности белкового рецептора, связывающегося с клостридиальным нейротоксином. В некоторых таких вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности SV2 (например, SV2A (SEQ ID NO: 8), SV2B (SEQ ID NO: 9) и SV2C (SEQ ID NO: 10)) или синаптотагмина (например, синаптотагмина I (SEQ ID NO: 14) и синаптотагмина II (SEQ ID NO: 15)).

Фрагмент может иметь, например, 50 аминокислот или меньше, 40 аминокислот или меньше, 30 аминокислот или меньше, 20 аминокислот или меньше или 10 аминокислот или меньше.

В некоторых вариантах осуществления вариант или фрагмент содержит домены белковых рецепторов дикого типа, которые связываются с нейротоксином. Например, вариант или фрагмент может содержать люминальный(е) домен(ы) SV2 дикого типа (например, SV2A, SV2B и SV2C) или синаптотагмина дикого типа (например, синаптотагмин I и синаптотагмин II). В некоторых таких вариантах осуществления вариант или фрагмент может содержать четвертый люминальный домен SV2 дикого типа, например, четвертый люминальный домен SV2A (SEQ ID NO: 11), четвертый люминальный домен SV2B (SEQ ID NO: 12) или четвертый люминальный домен SV2C (SEQ ID NO: 13).

В данной области известны анализы, которые можно использовать для определения того, какие варианты или фрагменты обладают желаемой активностью связывания клостридиального нейротоксина. Например, специалисту в данной области должно быть известно, что для определения, обладает ли вариант или фрагмент SV2C способностью связываться с BoNT/A, можно использовать анализ.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что вышеупомянутые ферменты также могут кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые отличаются от вышеупомянутой экзогенной нуклеиновой кислоты консервативными заменами, известными в данной области. Специалисту в данной области также понятно, что варианты белкового рецептора могут, например, кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичны последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующий белковый рецептор дикого типа. Таким образом, изобретение также относится к клетке, которая генетически сконструирована таким образом, чтобы она содержала экзогенную нуклеиновую кислоту, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один из вышеупомянутых белковых рецепторов, и/или нуклеиновую кислоту, которая отличается от нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующей такой белковый рецептор, только консервативными заменами, где кодируемый белок представляет собой белковый рецептор дикого типа или его вариант, сохранивший способность связываться с клостридиальным нейротоксином.

SV2C является наиболее чувствительным к BoNT/A. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, в которых желательна чувствительность к BoNT/A, клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии SV2C или его варианта или фрагмента, который способен связываться с BoNT/A. Однако SV2C не связывается с BoNT/E, который вместо этого связывается с SV2A и SV2B. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, в которых желательна чувствительность к BoNT/E, клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии SV2A и/или SV2B или их вариантов или фрагментов, которые способны связываться с BoNT/E.

В настоящем изобретении предусмотрено, что клетка может быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии двух или более белковых рецепторов, двух или более ферментов пути синтеза ганглиозидов или белкового(ых) рецептора(ов) и фермента(ов) пути синтеза ганглиозидов. Например, клетка может быть сконструирована таким образом, чтобы она экспрессировала или сверхэкспрессировала SV2A и SV2C. Такая клетка может иметь, например, повышенную чувствительность к BoNT/A и BoNT/E. Кроме того, клетка может быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD3-синтазы и SV2A и/или SV2C.

Кроме того, известно, что химерные рецепторы способны связывать нейротоксины. Например, известно, что химерные рецепторы, содержащие домен вышеупомянутого белкового рецептора, который связывается с нейротоксином (например, четвертый люминальный домен SV2), слитым с трансмембранным доменом другого рецептора, такого как рецептор ЛПНП, связываются с BoNT и обеспечивают его интернализацию в клетку. Таким образом, настоящее изобретение также относится к конструированию клеток для экспрессии таких химерных рецепторов.

Клеткой, используемой в настоящем изобретении, может быть любая клетка, прокариотическая или эукариотическая, способная экспрессировать ганглиозид и/или белковый рецептор, как описано выше. Примеры таких клеток включают нейрональные клетки, нейроэндокринные клетки (например, PC12), эмбриональные клетки почки (например, клетки HEK293), клетки рака молочной железы (например, MC7), клетки нейробластомы (например, клетки Neuro2a (N2a), M17, IMR-32, N18 и LA-N-2) и гибридные клетки нейробластомы и глиомы (например, клетки NG108). В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку нейробластомы или клетку нейробластомы-глиомы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку NG108, M17 или IMR-32. В конкретном варианте осуществления клетка представляет собой клетку NG108.

Настоящее изобретение также, в частности, относится к способу получения вышеупомянутой рекомбинантной клетки.

Способ включает введение в клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей индикаторный белок. Квалифицированному специалисту известно, какие нуклеиновые кислоты следует использовать для экспрессии экзогенного(ых) индикаторного(ых) белка(ов). Примером такой нуклеиновой кислоты является SEQ ID NO: 1, которая экспрессирует слитый белок, содержащий mScarlet в качестве N-концевой метки, SNAP-25 в качестве домена SNARE, NeonGreen в качестве С-концевой метки, люциферазу в качестве дополнительного домена метки, пуромицин-N-ацетилтрансферазу в качестве селектируемого маркера и саморасщепляющийся пептид 2А. Другим примером такой нуклеиновой кислоты является SEQ ID NO: 2, которая экспрессирует слитый белок, содержащий mScarlet в качестве N-концевой метки, SNAP-25 в качестве домена SNARE, CFP в качестве С-концевой метки, люциферазу в качестве дополнительного домена метки, пуромицин-N-ацетилтрансферазу в качестве селектируемого маркера и саморасщепляющийся пептид 2А.

Кроме того, в клетку может быть введена нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) дополнительный(ые) представляющий(ие) интерес белок(ки). Например, нуклеиновая кислота(ы) может(могут) кодировать: рецептор клостридиального нейротоксина или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином; и/или фермент пути синтеза ганглиозидов или его вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента.

В некоторых вариантах осуществления способ включает трансформацию клетки такой нуклеиновой(ыми) кислотой(ами). Такая трансформация может осуществляться путем трансфекции.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует слитый белок, содержащий два или более доменов, причем каждый домен имеет аминокислотную последовательность представляющего интерес белка (например, индикаторного белка, рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта или фрагмента, или фермента пути синтеза ганглиозидов или его варианта или фрагмента). Например, нуклеиновая кислота может кодировать слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность белкового рецептора (например, SV2A или SV2C) и аминокислотную последовательность фермента пути синтеза ганглиозидов (например, GD3-синтазы). В другом примере нуклеиновая кислота может кодировать слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность белкового рецептора, аминокислотную последовательность фермента пути синтеза ганглиозидов и аминокислотную последовательность селективного маркера. В еще одном примере нуклеиновая кислота может кодировать слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность белкового рецептора, аминокислотную последовательность фермента пути синтеза ганглиозидов, аминокислотную последовательность индикаторного белка и аминокислотную последовательность селективного маркера.

В таких вариантах осуществления домены могут быть отделены друг от друга линкерами. Линкеры могут расщепляться, например, ферментами в клетке или содержать саморасщепляющийся пептид (например, саморасщепляющийся пептид 2А), позволяющий отдельным доменам образовывать отдельные белки в клетке.

Нуклеиновая кислота необязательно может содержать регуляторные элементы. Термин «регуляторные элементы», используемый в настоящем описании, относится к регуляторным элементам экспрессии генов, включая транскрипцию и трансляцию, и включает такие элементы, как ТАТА-боксы, промоторы, энхансеры, сайты связывания рибосом, последовательности Шайна-Дальгарно, участки IRES, сигналы полиаденилирования, терминальные кэпирующие структуры и т.п. Регуляторный элемент может содержать один или более гетерологичных регуляторных элементов или один или более гомологичных регуляторных элементов. «Гомологичный регуляторный элемент» представляет собой регуляторный элемент клетки дикого типа, из которого происходит молекула нуклеиновой кислоты, который участвует в регуляции экспрессии гена молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке дикого типа. «Гетерологичный регуляторный элемент» представляет собой регуляторный элемент, который не участвует в регуляции экспрессии гена молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке дикого типа. Также можно использовать регуляторные элементы для индуцибельной экспрессии, такие как индуцибельные промоторы.

Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой, например, гяРНК, мРНК, РНК, ДНК, ПНК, ЗНК и/или модифицированные молекулы нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть кольцевой, линейной, интегрированной в геном или эписомальной. Также включены конкатемеры, кодирующие слитые белки, содержащие три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять полипептидов. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательности, кодирующие сигнальные последовательности для внутриклеточного транспорта, такие как сигналы для транспорта во внутриклеточный компартмент или для транспорта через клеточную мембрану.

Нуклеиновая кислота может быть сконструирована для обеспечения высоких уровней экспрессии в клетке-хозяине. Способы конструирования молекул нуклеиновых кислот для увеличения экспрессии белка в клетках-хозяевах известны в данной области и включают уменьшение частоты (количества вхождений) «медленных кодонов» в кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновая кислота может быть введена с помощью любых средств, известных в данной области. Например, она может быть включена в вектор (например, плазмиду), используемый для введения нуклеиновой кислоты в клетку.

Можно использовать любой вектор, известный в данной области техники для обеспечения экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. Вектор может подходить для экспрессии представляющего интерес белка in vitro и/или in vivo. Вектор может быть вектором для транзиторной и/или стабильной экспрессии генов. Вектор может дополнительно содержать регуляторные элементы и/или селективные маркеры. Вектор может быть, например, искусственным или иметь вирусное, фаговое или бактериальное происхождение. Примеры векторов для использования в настоящем изобретении включают аденовирусные векторы, векторы коровьей оспы, векторы на основе вируса SV-40, ретровирусные векторы, λ-производные и плазмиды. Примеры плазмид для использования в настоящем изобретении включают плазмиды, имеющие остов pD2500 или pcDNA3.1.

Способы использования векторов для введения нуклеиновой кислоты в клетку известны в данной области. См. Laura Bonneta, «The Inside Scoop-Evaluating Gene Delivery Methods», Nature Methods 2:875-883 (2005).

Клетка-хозяин может содержать индуктор экспрессии представляющего интерес белка. Такой индуктор экспрессии может быть молекулой нуклеиновой кислоты или полипептидом, или химическим соединением, включая малое химическое соединение. Индуктор экспрессии может, например, усиливать транскрипцию или трансляцию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок. Индуктор может быть, например, экспрессирован рекомбинантными способами, известными специалисту в данной области. Альтернативно, индуктор может быть выделен из клетки, например, из клостридиальной клетки.

В некоторых вариантах осуществления успешно трансформированные клетки можно определить по наличию селективного маркера. В таких вариантах осуществления вектор, содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый белок, также может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер.

В некоторых вариантах осуществления селективный маркер представляет собой детектируемый тэг (метку). Примеры таких тэгов включают His-тэг, тэг GST, тэг Strep и тэг SBP. Тэг может быть экспрессирован как часть слитого белка, который также содержит представляющий интерес белок. В таких вариантах осуществления тэг может быть фланкирован одним или более сайтами расщепления протеазами или саморасщепляющимися пептидами. Это обеспечивает отщепление тэга от белка после трансляции.

В некоторых других вариантах осуществления селективный маркер придает устойчивость к антибиотику. Примеры таких селективных маркеров включают: пуромицин-N-ацетилтрансферазу (устойчивость к пуромицину), аминогликозид-3'f3-фосфотрансферазу (устойчивость к G418), бластицидин-S-дезаминазу (устойчивость к бластицидину S) и гигромицин-В-фосфотрансферазу (устойчивость к гигромицину В). Таким образом, успешная трансформация клетки может быть определена путем воздействия на клетку соответствующим антибиотиком.

В некоторых вариантах осуществления успешная трансформация клеток, генетически сконструированных для экспрессии или сверхэкспрессии ганглиозида и/или белкового рецептора, связывающегося с клостридиальным нейротоксином, может быть определена путем приведения таких клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином и определения, произошло ли в них расщепление индикаторного белка.

Настоящее изобретение также, в частности, относится к клетке из популяции, полученной с помощью вышеописанного способа. Как обсуждалось ранее, клетка по настоящему изобретению может быть использована в анализе для определения активности полипептида (например, модифицированного или рекомбинантного клостридиального нейротоксин). Такой анализ включает приведение клетки в контакт с полипептидом в условиях и в течение периода времени, достаточных для расщепления в клетке индикаторного белка протеазным доменом клостридиального нейротоксина и определения, произошло ли расщепление индикаторного белка.

Кроме того, изобретение относится к способам тестирования/оценки активности партии клостридиального нейротоксина для терапевтического/косметического применения. Такие способы преимущественно находят применение при мониторинге активности токсинов во время хранения и отслеживании активности в зависимости от времени. Еще одним преимуществом является возможность определения оптимальных условий хранения (например, не снижающих уровень активности). Эти способы особенно полезны для характеристики активности (например, способности связываться с клетками/расщеплять SNARE) рекомбинантных клостридиальных нейротоксинов.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина или идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического (и/или косметического) применения, причем указанный способ включает:

а. предоставление клеточной популяции, полученной вышеупомянутым способом по изобретению (например, способом получения популяции клеток, которые являются высокочувствительными к клостридиальному нейротоксину, или способом выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину);

b. приведение указанной популяции клеток в контакт с составом клостридиального нейротоксина;

с. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификацию (i) состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается, или идентификацию (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается; или

е. идентификацию (i) состава клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается, или идентификацию (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепление индикаторного белка после контакта не увеличивается.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина или идентификации состава клостридиального нейротоксина, подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, причем указанный способ включает:

а. предоставление клеточной популяции, полученной вышеупомянутым способом по изобретению (например, способом получения клеточной популяции, которые являются высокочувствительными к клостридиальному нейротоксину, или способом выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину);

b. приведение указанной клетки в контакт с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификацию (i) состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается или эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или идентификацию (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается или эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина; или

е. идентификацию (i) клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или идентификацию (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина.

Контактирование клетки с полипептидом может быть достигнуто путем культивирования клетки в среде, содержащей полипептид. Полипептид может, например, присутствовать в среде в концентрации от примерно 0,0001 нМ до примерно 1000 нМ, от примерно 0,0001 нМ до примерно 100 нМ, от примерно 0,0001 нМ до примерно 10 нМ, от примерно 0,0001 нМ до примерно 1 нМ, от примерно 0,0001 нМ до примерно 1 нМ, от примерно 0,0001 нМ до примерно 0,1 нМ, от примерно 0,0001 нМ до примерно 0,01 нМ или от примерно 0,0001 нМ до примерно 0,001 нМ. Клетку можно, например, культивировать до 120 часов, до 96 часов, до 72 часов, до 48 часов, до 24 часов, до 12 часов или до 6 часов.

Определение, произошло ли расщепление, может быть выполнено описанными ранее способами (например, с использованием меченого индикаторного белка и путем измерения сигнала от метки на полученном легко деградируемом фрагменте). Если жизнеспособность клеток после анализа не важна, в данной области техники хорошо известны дополнительные способы определения расщепления. Например, после контактирования клетки с полипептидом клетка может быть подвергнута лизису и анализу методами гель-электрофореза и вестерн-блоттинга. Анти-SNAP-25 антитело, которое связывается с N-концом SNAP-25, можно, например, использовать в вестерн-блоттинге для определения наличия полноразмерного SNAP-25 и расщепленного SNAP-25 (который может мигрировать в отдельную полосу от полноразмерной SNAP-25).

В некоторых вариантах осуществления полипептид считается протеолитически активным, если более 20%, более 50%, более 75%, более 80%, более 90%, более 95%, более 97%, более 98% или более 99% индикаторного белка превращается в продукт(ы) расщепления.

Расщепление можно измерять через определенные промежутки времени для отслеживания каталитической активности с течением времени.

В одном из вариантов осуществления клетки (например, на этапе а) представляют собой нейрональные клетки, не являющиеся нейрональными клетки, нейроэндокринные клетки, эмбриональные клетки почки, клетки рака молочной железы, клетки нейробластомы или гибридные клетки нейробластомы-глиомы; предпочтительно не являющиеся нейрональными клетки. Например, клетки (например, на этапе а) могут представлять собой клетки нейробластомы или клетки нейробластомы-глиомы. Предпочтительно клетки (например, на этапе а) представляют собой клетки нейробластомы-глиомы. В одном из вариантов осуществления клетки (например, на этапе а) могут представлять собой клетки NG108.

Все ссылки, процитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Выбор оптимальной родительской клеточной линии для создания индикаторной клеточной линии

Клетки Neuro2A (N2a; ATCC CCL-131), BE(2)-M17 (M17; ATCC CRL-2267), IMR-32 (ATCC CCL-127) и NG108-15 [108CC15] (ATCC HB-12317) изучали с целью выбора оптимальной родительской клеточной линии для получения стабильной трансфицированной клеточной линии.

После доставки клеткам давали возможность восстановиться и размножиться. Затем запасы клеток замораживали и хранили в жидком азоте. После получения достаточного количества пробирок с запасами клеток, клетки анализировали на чувствительность к BoNT/A.

Клетки культивировали в среде, содержащей BoNT/A (Metabiologics, Inc.), в течение 8 или 24 часов. Клетки, культивированные в течение 8 часов, культивировали в среде, содержащей 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ BoNT/A. Клетки, культивированные в течение 24 часов, культивировали в среде, содержащей 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ BoNT/A.

Расщепление эндогенного SNAP-25 анализировали вестерн-блоттингом с использованием анти-SNAP-25 антитела (Sigma # S9684) по стандартным протоколам (фиг. 1). Клетки NG108 показали более высокую чувствительность к BoNT/A, чем другие клетки, при этом клетки N2a были наименее чувствительными. Таким образом, в качестве основного кандидата для создания линии стабильно трансфицированных индикаторных клеток была выбрана клеточная линия NG108. Клеточные линии M17 и IMR-32 показали одинаковую чувствительность к BoNT/A в тестируемых концентрациях и временных пределах. В качестве резервной копии NG108 были выбраны клетки M17, поскольку их легко культивировать и они являются хорошо изученными.

Пример 2 - Трансфекция клеток плазмидой, содержащей индикаторную конструкцию

Определяли чувствительность клеток NG108 и клеток M17 к пуромицину (InvivoGen #ANT-PR) и G418 (VWR #97064-358). Клетки выращивали до ~50% слияния и затем культивировали с различными концентрациями пуромицина и G418. Обе клеточные линии показали одинаковую чувствительность к пуромицину и G418.

Плазмиды (pD2500; Atum) конструировали таким образом, чтобы они содержали последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие пуромицин-N-ацетилтрансферазу (PuroR), химерный белок и саморасщепляющийся пептид 2А. В экспрессируемом продукте саморасщепляющийся пептид 2А располагали между PuroR и химерным белком. Химерный белок содержал SNAP-25, фланкированный N-концевым, с одной стороны, и С-концевым, с другой стороны, флуоресцентными белками, и люциферазу (расположенную на С-конце). PuroR придавал устойчивость к пуромицину. Люцифераза позволяла выполнять люминесцентные измерения деградации в дополнение к флуоресцентным измерениям деградации, осуществляемым при помощи флуоресцентных белков. N-концевой флуоресцентный белок представлял собой mScarlet, а С-концевой флуоресцентный белок представлял собой либо NeonGreen, зеленый флуоресцентный белок, либо голубой флуоресцентный белок (CFP). Плазмидная вставка, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие PuroR, саморасщепляющийся пептид 2А, и конструкцию, содержащую mScarlet, SNAP-25, NeonGreen и люциферазу (mScarlet-SNAP25-GeNluc), имела нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. Плазмидная вставка, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие PuroR, саморасщепляющийся пептид 2A, и конструкцию, содержащую mScarlet, SNAP-25, CFP и люциферазу (mScarlet-SNAP25-CyanNluc), имели нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

NeonGreen был выбран из-за его спектра возбуждения/излучения и интенсивности. В случае, если NeonGreen плохо деградирует при расщеплении индикаторного белка, в качестве резервного был выбран CFP, поскольку ранее полученные данные, указывали на то, что он легко деградирует при расщеплении индикаторного белка.

Клетки NG108 и клетки M17 трансфицировали плазмидами, содержащими либо конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc, либо конструкцию mScarlet-SNAP25-CyanNluc. Трансфекцию проводили липофектамином 3000 (ThermoFisher) или полиэтиленимином по стандартным протоколам.

Через 24 часа после трансфекции клетки анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы установить эффективность трансфекции и правильную экспрессию индикаторного белка (фиг. 2 A-B, показаны примеры клеток, экспрессирующих индикаторный белок, содержащий NeonGreen). Из-за сверхэкспрессии большая часть индикаторного белка была цитозольной. Красный и зеленый цвета, представляющие, соответственно, N- и С-концы индикаторного белка, были легко детектируемыми и указывали на совместную локализацию терминальных концов. Высокая транзиторная экспрессия наблюдалась в клетках обоих типов с эффективностью трансфекции >70%.

После подтверждения того, что клетки эффективно трансфицированы и индикаторные белки экспрессируются правильно, трансфицированные клетки отбирали либо с помощью 2,5 мкг/мл пуромицина, либо «шокировали» начальной высокой дозой 20 мкг/мл пуромицина в течение 1 дня, а затем культивировали в 5-10 мкг/мл пуромицина. Обе обработки дали пул флуоресцентных, устойчивых к пуромицину клеток.

Параллельно с этим был проведен ряд дополнительных трансфекций обеими индикаторными конструкциями и проведена селекция на устойчивость к пуромицину с получением дополнительных пулов флуоресцентных, устойчивых к пуромицину клеток. В итоге это дало примерно 6 независимых пулов флуоресцентных, устойчивых к пуромицину клеток NG108 и 2 независимых пула устойчивых к пуромицину, флуоресцентных клеток M17. Пулы размножали, а запасы замораживали и проверяли на жизнеспособность при оттаивании.

Устойчивые к пуромицину клетки анализировали для подтверждения стабильной трансфекции индикаторной конструкции (фиг. 3). Клетки NG108, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией, содержащей NeonGreen, содержали как mScarlet (красный), так и NeonGreen (зеленый). Это служило указанием на образование полноразмерного интактного белка и его распределение внутри клетки. Кроме того, флуоресценция преимущественно наблюдалась на клеточной мембране, что указывало на правильную локализацию белка (благодаря присутствию SNAP-25).

Пример 3 - Подтверждение расщепления индикаторного белка

Плазмиды (pcDNA3.1) конструировали таким образом, чтобы они содержали SEQ ID NO: 3, кодирующую легкую цепь BoNT/A, CFP и N-концевую метку SBP. Нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь BoNT/A, синтезировали с использованием DNA2.0 (Atum).

Клетки из примера 2, стабильно трансфицированные индикаторными конструкциями (mScarlet-SNAP25-GeNluc или mScarlet-SNAP25-CyanNluc), временно трансфицировали экспрессионным вектором, содержащим конструкцию CFP-BoNT/A. Через 24 и 48 часов после трансфекции наблюдали многочисленные красные, но не зеленые или голубые клетки, что указывало на то, что индикаторный белок был расщеплен, а С-концевой фрагмент подвергся деградации.

Пример 4 - Подтверждение расщепления индикаторного белка

Клетки NG108 из примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, высевали в 96-луночные оптические планшеты (ThermoFisher #165305) (20-30 тыс. клеток на лунку) в полной среде DMEM (Corning #50-013-PB) и оставляли для прикрепления на 4 часа. Затем среду заменяли средой Neurobasal Plus (ThermoFisher #A35829), и клетки культивировали еще в течение 20 часов, после чего среду заменяли средой Neurobasal Plus, содержащей BoNT/A в концентрации 0 (контроль), 0,1 или 1,0 нМ. Клетки культивировали еще 24 часа. Затем клетки обрабатывали трипсином, один раз промывали средой и ресуспендировали в среде DMEM/FBS или DPBS с 10 единицами бензоназы/мл при ~2×10⁶ клеток/мл. Затем клетки анализировали на сортировщике клеток SY3200 (Sony Biotechnologies) с использованием соответствующих лазеров/фильтров для NeonGreen и mScarlet.

На фиг. 4 показано количество зеленых клеток в расчете на HPF для клеток NG108, экспрессирующих mScarlet-SNAP25-GeNluc, после обработки BoNT/A в течение 24 часов. В пуле клеток, обработанных 1 нМ BoNT/A, было отмечено приблизительно 25-процентное снижение числа зелено-положительных клеток в расчете на HPF.

Пример 5 - Подтверждение расщепления индикаторного белка

Репрезентативные клетки NG108 и M17 из примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, обрабатывали трипсином, один раз промывали средой и ресуспендировали в среде DMEM/FBS или DPBS с 10 единицами бензоназы/мл при ~2×10⁶ клеток/мл. Затем клетки анализировали на сортировщике клеток SY3200 (Sony Biotechnologies) с использованием соответствующих лазеров/фильтров для NeonGreen и mScarlet.

Клетки NG108 возбуждали при 488 нм для прямого возбуждения NeonGreen при минимальном возбуждении mScarlet. Излучение флуоресценции измеряли при различных длинах волн. Кроме того, измеряли интенсивность бокового и прямого рассеяния света для идентификации субпопуляций клеток. На фиг. 5A показан график рассеяния, показывающий боковое рассеяние (SS) по оси x и прямое рассеяние (FS) по оси y: распределение иллюстрирует изменение степени гранулярности/сложности клеток (SS) и размера клеток (FS). На фиг. 5В представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм (фильтр FITC). На фиг. 5С представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 585 нм (PE-фильтр). На фиг. 5D представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 617 нм (фильтр PE-Texas Red). На фиг. 5Е представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 665 нм (фильтр 7AAD). На фиг. 5F представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм (фильтр PE-Cy7). На фиг. 5G показана диаграмма рассеяния, демонстрирующая излучение флуоресценции клеток, измеренное при 665 нм (фильтр 7AAD), по оси x и боковое рассеяние (SS) по оси y. Гистограммы показывают два отчетливых пика флуоресценции, при этом пик с более слабой флуоресценцией соответствует неэкспрессирующим клеткам, а пик с более высокой флуоресценцией соответствует клеткам, экспрессирующим индикаторный белок. При всех длинах волн регистрации излучения флуоресценция остается высокой. Это включает измерение излучения при 785 нм (фиг. 5F), при котором большая часть излучаемого света обусловлена FRET, подтверждением чему является FRET между NeonGreen и mScarlet. Процентная доля клеток с высокой флуоресценцией в пуле N108 колебалась от 61% до 93%.

Клетки M17 возбуждали при 488 нм для прямого возбуждения NeonGreen при минимальном возбуждении mScarlet. Излучение флуоресценции измеряли при различных длинах волн. Кроме того, для идентификации субпопуляции клеток измеряли интенсивность бокового и прямого рассеяния света. На фиг. 6A показана диаграмма рассеяния, показывающая боковое рассеяние (SS) по оси x и прямое рассеяние (FS) по оси y: распределение иллюстрирует изменение степени гранулярности/сложности клеток (SS) и размера клеток (FS). На фиг. 6В представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм (фильтр FITC). На фиг.6С представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 585 нм (PE-фильтр). На фиг. 6D представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 617 нм (фильтр PE-Texas Red). На фиг. 6Е представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 665 нм (фильтр 7AAD). На фиг. 6F представлена гистограмма, показывающая распределение клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм (фильтр PE-Cy7). На фиг. 6G показана диаграмма рассеяния, демонстрирующая излучение флуоресценции клеток, измеренное при 665 нм (фильтр 7AAD), по оси x и боковое рассеяние (SS) по оси y. Гистограммы показывают два отчетливых пика флуоресценции, при этом пик с более слабой флуоресценцией соответствует неэкспрессирующим клеткам, а пик с более высокой флуоресценцией соответствует клеткам, экспрессирующим индикаторный белок. При всех длинах волн излучения флуоресценция остается высокой. Это включало измерение излучения при 785 нм (фиг. 6F), при котором большая часть излучаемого света обусловлена FRET, подтверждением чему является FRET между NeonGreen и mScarlet. Процентная доля высоко флуоресцентных клеток в пуле М17 колебалась от 14% до 24%, т.е. доля клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки, в пуле клеток М17 была меньше по сравнению с пулом клеток NG108.

Клетки NG108 из примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, обрабатывали BoNT/A при 0 (контроль), 0,1 или 1,0 нМ способом, описанным в примере 4.

Флуоресценцию стабильно трансфицированных пулов клеток NG108 измеряли с помощью анализатора SY3200 (Sony Biotechnologies). Клетки возбуждали при 488 нм для прямого возбуждения NeonGreen при минимальном возбуждении mScarlet. Излучение флуоресценции измеряли при 530 нм (фильтр FITC), длине волны, позволяющей детектировать флуоресценцию NeonGreen, но не флуоресценцию mScarlet. На фиг.7А представлена гистограмма, показывающая распределение необработанных (контрольных) клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм. На фиг. 7В представлена гистограмма, показывающая распределение клеток, обработанных 0,1 нМ BoNT/A, по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм. На фиг. 7C представлена гистограмма, показывающая распределение клеток, обработанных 1 нМ BoNT/A, по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм. Флуоресценция NeonGreen уменьшилась в клеточном пуле (средняя флуоресценция клеток в гейте R2) примерно на 15% после обработки 1 нМ BoNT/A (фиг. 7C) по сравнению с необработанным контролем (фиг. 7A), что позволяет предположить, что полученный C-терминальный фрагмент, содержащий NeonGreen, деградирует после расщепления.

Методом проточной цитометрии также определяли потерю излучения FRET. Флуоресценцию стабильно трансфицированных пулов клеток NG108 измеряли с помощью анализатора SY3200 (Sony Biotechnologies). Клетки возбуждали при 488 нм для прямого возбуждения NeonGreen при минимальном возбуждении mScarlet. Излучение флуоресценции измеряли при 785 нм (фильтр Cy7), который позволяет детектировать флуоресценцию mScarlet, но не флуоресценцию NeonGreen. На фиг.8А представлена гистограмма, показывающая распределение необработанных (контрольных) клеток по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм. На фиг. 8В представлена гистограмма, показывающая распределение клеток, обработанных 0,1 нМ BoNT/A, по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм. На фиг. 8С представлена гистограмма, показывающая распределение клеток, обработанных 1 нМ BoNT/A, по интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм. Интенсивность FRET снизилась на 16% (средняя флуоресценция клеток в гейте R6) после обработки 1 нМ BoNT/A (фиг. 8C) по сравнению с необработанным контролем (фиг. 8A), что соответствует деградации NeonGreen.

Пример 6 - Подтверждение расщепления

Вестерн-блоттинг выполняли на клетках NG108 из примера 2, стабильно трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных без токсина (контроль), BoNT/A в концентрации 1 нМ или 8 нМ или BoNT/Е в концентрации 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ способом, описанным в примере 4 (фиг. 9).

Линии клеток тестировали на расщепление SNAP-25 (либо эндогенного, либо экзогенного) с помощью стандартных методов блоттинга и кроличьих первичных анти-SNAP25 антител.

Клетки лизировали с помощью реагента M-PER (ThermoFisher #78501) в соответствии с рекомендациями производителя. Лизат осветляли при 15 кг в течение 10 минут, и образец объемом 10 мкл пропускали через гель NuPage 12% Bis-Tris (ThermoFisher #NP0341BOX) в буфере MOPS (ThermoFisher #NP0001) при 200 В. Белки переносили на мембрану PVDF (ThermoFisher # LC2005) с помощью системы блоттинга XCell II и протокола переноса Nu-Page. Полученный блот блокировали в 1% BSA/0,05% Tween20/PBS, первичное анти-SNAP-25 антитело 1:3000, вторичное козье антикроличье антитело, конъюгированное с щелочной фосфатазой, 1:5000 (ThermoFisher # 31340) и проявляли в NBT/субстрат BCIP (ThermoFisher #34042). Проявленный блот сканировали, денситометрию рассчитывали с помощью ImageJ и наносили на график в MS Excel.

Индикаторный белок был детектирован во всех лизатах. В контрольных образцах не было обнаружено явных продуктов расщепления. Клетки, обработанные BoNT/A или BoNT/E, продуцировали продукты расщепления, количество которых увеличивалось с увеличением дозы. Интересно, что чувствительность клеток к BoNT/E оказалась примерно такой же как и к BoNT/A.

Пример 7. Трансфекция конструкцией рецептора

Плазмиды (pD2500; Atum) конструировали так, чтобы они содержали нуклеиновую кислоту, кодирующую конструкцию рецептора GD3-SV2C-Syt, и аминогликозид-3'-фосфотрансферазу (Neo) (SEQ ID NO: 4). Нуклеиновая кислота экспрессировала слитый белок, содержащий GD3-синтазу, SV2C, синтаксин и Neo, причем каждый домен был отделен друг от друга саморасщепляющимися пептидами 2А. Синтаксин был встроен в слитый белок для использования с другими изоформами BoNT. Neo оказался устойчивым к G418.

Клетки NG108 из примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, выращивали в колбах T75 до ~60% слияния. Затем их трансфицировали плазмидой, содержащей конструкцию рецептора (2 мкг/мл), в 5 мл OptiMem/полиэтиленимина в течение ночи в соответствии со стандартным протоколом. Утром клетки промывали 1X свежей полной средой DMEM и культивировали еще от 24 до 48 часов в полной среде DMEM. Затем среду заменяли полной средой DMEM с 500 мкг/мл G418, и клетки культивировали в течение еще 1-2 недель с заменой среды/G418 по мере необходимости. Наблюдали начало гибели клеток через 3 дня после добавления G418 и продолжение гибели в течение ~1 недели (~60% гибели клеток). Клетки, оставшиеся примерно через 2 недели, были устойчивыми к G418.

Пример 8 - Направленная эволюция клеток

Клетки из примера 7 подвергали двум этапам сортировки для выделения тех клеток, которые имели самую высокую флуоресценцию и, таким образом, самую высокую экспрессию индикаторного белка.

Пример 9 - Направленная эволюция клеток

Клетки, отобранные для высокой экспрессии индикаторного белка в примере 8, обрабатывали способом, описанным в примере 4, при 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ для BoNT/A или 10 нМ BoNT/E в течение 72 часов. После обработки клетки трижды промывали, трипсинизировали, ресуспендировали в свежих средах и сортировали. Скрининг клеток показал четкую дозозависимую реакцию на BoNT/A (фиг. 10А). Флуоресцентная микроскопия также показала уменьшение зеленой флуоресценции клеток при обработке дозой, при этом красная флуоресценция оставалась на том же уровне (фиг. 10В). В то время как результаты ясно показали увеличение чувствительности к BoNT/A, было отмечено, что аналогичное увеличение чувствительности к BoNT/E не наблюдалось.

Отбирали клетки, которые были чувствительны к BoNT/A в концентрации 1000 пМ (1 нМ).

Пример 10 - Направленная эволюция клеток

Сортировали клетки NG108 дикого типа (т.е. не трансфицированные репортерными конструкциями или конструкциями рецептора) (фиг. 11А). Эти клетки не имели ни зеленой, ни красной флуоресценции.

Клетки из примера 9, которые были чувствительны к BoNT/A в концентрации 1000 пМ (1 нМ), размножали и обрабатывали 100 пМ BoNT/A ранее описанным способом или не обрабатывали (контроль). После обработки в течение 48 или 96 часов клетки трижды промывали, трипсинизировали, ресуспендировали в свежих средах и сортировали. На фиг. 11B-D показаны данные проточной цитометрии для контроля, клеток, обработанных 100 пМ BoNT/A в течение 48 часов, и клеток, обработанных 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов, соответственно.

Клетки из примера 8, которые были дважды отсортированы на высокую экспрессию индикаторной конструкции, но которые не подверглись сортировке в примере 9 на чувствительность к BoNT/A при 1000 пМ, обрабатывали 100 пМ BoNT/A описанным выше способом в течение 96 часов или не обрабатывали (контроль). На фиг. 11E-F представлены данные проточной цитометрии для контроля и клеток, обработанных 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов, соответственно.

На фиг. 11A-F примерно круглый гейт выделяет клетки, которые не имеют ни красной, ни зеленой флуоресценции (т.е. клетки, которые не экспрессируют индикаторный белок), примерно овальный гейт выделяет клетки, которые демонстрируют как красную, так и зеленую флуоресценцию (т.е. клетки, которые экспрессируют индикаторный белок и в которых индикаторный белок не расщеплен), а четырехугольный гейт выделяет клетки, которые демонстрируют красную флуоресценцию, но сравнительно более слабую зеленую флуоресценцию (т.е. клетки, которые экспрессируют индикаторный белок и в которых индикаторный белок расщеплен).

Клетки, ранее отобранные по чувствительности к 1 нМ BoNT/A (фиг. 11D), показали значительно более высокую чувствительность к BoNT/A при 100 пМ (более высокое расщепление), чем клетки, которые не были отобраны таким образом (фиг. 11F).

Отбирали клетки, которые были чувствительны к BoNT/A в концентрации 100 пМ после 96 часов обработки (>2 log более чувствительны, чем NG108 дикого типа).

Пример 11 - Направленная эволюция клеток

Клетки из примера 10, чувствительные к BoNT/A в концентрации 100 пМ после 96 часов обработки, размножали и обрабатывали 10 пМ BoNT/A в течение 96 часов ранее описанным способом или не обрабатывали (контроль). После обработки клетки трижды промывали, трипсинизировали, ресуспендировали в свежих средах и сортировали.

На фиг. 12A-B представлены данные проточной цитометрии для контроля и клеток, обработанных 10 пМ BoNT/A, соответственно. Наблюдали заметный сдвиг флуоресценции обработанных клеток, хотя и не такой сильный, как при более высоких концентрациях токсина.

Пример 12 - Конструкция рецептора для BoNT/E

Для придания чувствительности к BoNT/E клетки NG108 из примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, трансфицировали плазмидой, содержащей конструкцию рецептора GD3-SV2A-Syt (SEQ ID NO: 5), используя процедуру трансфекцию, описанную в примере 2. Эту плазмиду конструировали путем модификации плазмиды, содержащей конструкцию рецептора GD2-SV2C-Syt, с помощью набора HiFi Kit (New England Biolabs), олигонуклеотидов из IDT и последовательности SV2A, синтезированной GeneArt.

Эти клетки и клетки из примера 7, которые экспрессировали конструкцию рецептора GD3-SV2C-Syt, культивировали в среде, содержащей либо BoNT/A в концентрации 0 (контроль), 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 0,001 нМ или 0 (контроль) BoNT/A, либо BoNT/E в концентрации 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или 0 нМ (контроль). Клетки обрабатывали в течение 16, 40, 64 или 88 часов. После обработки клетки лизировали и выполняли анти-SNAP-25 вестерн-блот с использованием анти-SNAP-25 антитела. Данные денситометрии из блота наносили на график в виде процента расщепленного SNAP-25 (фиг. 13). Наблюдали заметное повышение чувствительности клеток, экспрессирующих SV2A, как к BoNT/A, так и к BoNT/E, по сравнению с клетками, экспрессирующими SV2C, что подтверждает необходимость SV2A для придания чувствительности к BoNT/E.

Пример 13 - Направленная эволюция клеток

Клетки NG108, экспрессирующие индикатор mScarlet-SNAP-25-GeNluc и конструкцию рецептора GD3-SV2C-Syt, получали с помощью протоколов, описанных в примерах 2 и 7.

Затем эти клетки высевали в колбы T75 или T150 (Corning #430641U и #430825) (1-2 млн клеток на колбу) в среде DMEM с добавками (90% (об./об.) DMEM: Gibco 11960-044; 2% (об./об.) HAT: Fisher Scientific 21060-017, 5% (об./об.) FBS: Fisher Scientific 10099-141, 2% (об./об.) раствор бикарбоната натрия: Fisher Scientific 25080-094, 1% (об./об.) Glutamax: Fisher Scientific 35050-038), и выращивали в течение 3-4 дней. Затем среду заменили средой Neurobasal Plus с добавками (95% (об./об.) Neurobasal Plus: ThermoFisher A35829-01; 2% (об./об.) B27 Plus: ThermoFisher A35828-01; 2% (об./об.) HAT: Fisher Scientific 21060-017; 1% (об./об.) Glutamax: Fisher Scientific 35050-038), и клетки культивировали в течение еще 1-2 дней, после чего среду заменяли средой с добавками Neurobasal Plus, содержащей BoNT/A в концентрации 0 (контроль), 50 пМ или 250 пМ. Клетки культивировали еще 3 дня. Затем клетки обрабатывали трипсином и ресуспендировали в среде DMEM с добавками. Затем клетки центрифугировали в течение 6 минут при 150×g и ресуспендировали в среде Neurobasal Plus с добавками, содержащей 10 ед. бензоназы/мл при концентрации приблизительно 2×10⁶ клеток/мл.

Затем клетки анализировали на сортировщике клеток BD Influx (BD Biosciences). Клетки возбуждали при 506 нм для возбуждения NeonGreen и при 569 нм для возбуждения mScarlet. Флуоресценцию измеряли при 517 нм (флуоресценция NeonGreen) и при 594 нм (флуоресценция mScarlet).

Полученные данные показаны на фиг. 14 А-В. Гейт выделял клетки, которые демонстрировали красную флуоресценцию, но сравнительно более слабую зеленую флуоресценцию, что указывает на то, что в этих клетках произошло расщепление индикаторного белка. В гейт попало только 0,7% от общего числа клеток, которые не были обработаны токсином, при этом туда попали 14,2% клеток, обработанных 50 пМ BoNT/A, и 35,5% клеток, обработанных 250 пМ BoNT/A.

Клетки с ответом на обработку 250 мкМ BoNT/A (как показано гейтом на фиг. 14C), сортировали и извлекали. Этот подпул клеток затем размножали и подвергали второму раунду обработки токсинами и анализу методом проточной цитометрии с использованием того же протокола, который использовали для первоначальной обработки.

Полученные данные показаны на фиг. 14D-F. Гейт выделяет клетки, которые проявляли красную флуоресценцию, но сравнительно более слабую зеленую флуоресценцию, что указывает на то, что в этих клетках произошло расщепление индикаторного белка. В гейт попало только 0,2% от общего числа клеток, которые не были обработаны токсином, при этом попали 26,1% клеток, обработанных 50 пМ BoNT/A, и 65,6% клеток, обработанных 250 пМ BoNT/A. Как было показано, большая часть пула, обработанного токсином, имела ответ после второго раунда обработки токсином, и ответ был более выраженным по сравнению с ответом после первоначальной обработки токсином.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1

ATGGTGTCGAAGGGGGAAGCGGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTTAAAGTGCATATGGAGGGATCTATGAACGGACACGAGTTTGAGATCGAAGGGGAAGGAGAGGGGCGCCCATACGAAGGCACCCAGACTGCCAAGCTGAAAGTCACAAAGGGTGGACCCTTGCCCTTCTCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAATTCATGTACGGGTCCCGGGCCTTCACCAAGCACCCTGCTGACATTCCGGATTACTATAAGCAGAGCTTCCCGGAAGGCTTCAAATGGGAGCGAGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGCGCCGTGACCGTGACTCAGGACACTTCACTGGAAGATGGCACTCTGATCTACAAGGTCAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCACCGGACGGACCGGTCATGCAGAAAAAGACCATGGGATGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCGAAGATGGAGTCCTCAAGGGGGACATCAAGATGGCCCTGCGGCTCAAGGATGGTGGAAGATACCTGGCTGACTTCAAGACCACGTACAAGGCCAAGAAGCCAGTCCAGATGCCCGGCGCGTACAATGTGGATCGCAAGCTGGACATCACTTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAACGGTCCGAGGGTCGGCACTCCACTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAAATGGCCGAGGATGCAGACATGAGAAACGAACTGGAAGAAATGCAGCGGAGAGCAGACCAGCTCGCGGACGAATCACTGGAATCGACCCGCCGGATGCTTCAACTGGTCGAGGAATCAAAGGACGCGGGTATCCGGACCCTTGTGATGCTGGACGAACAGGGAGAGCAGCTGGAGAGGATCGAAGAGGGAATGGACCAGATTAACAAGGACATGAAGGAAGCGGAAAAGAACCTCACCGACCTTGGAAAGTTCTGCGGGTTGTGCGTGTGTCCGTGCAACAAGCTGAAGTCCTCCGACGCCTACAAGAAGGCCTGGGGAAACAACCAGGACGGTGTCGTGGCTTCCCAACCCGCACGGGTGGTGGATGAGCGGGAACAGATGGCGATTTCCGGAGGCTTCATTAGACGCGTGACCAACGACGCCCGCGAAAACGAGATGGACGAAAACCTGGAACAAGTGTCGGGAATCATCGGAAACTTGAGACACATGGCCCTCGACATGGGCAACGAAATTGATACACAGAACCGGCAGATTGACCGGATCATGGAAAAGGCAGACTCAAACAAGACTCGGATTGACGAAGCGAACCAGAGGGCCACTAAGATGTTGGGTTCCGGGATGGTGTCAAAGGGAGAAGAAGACAACATGGCATCACTGCCCGCCACCCACGAGCTGCACATCTTCGGTTCCATCAACGGGGTCGACTTCGACATGGTCGGCCAGGGAACTGGAAACCCGAATGACGGTTATGAAGAACTGAACCTTAAATCAACCAAGGGGGACCTTCAGTTCTCGCCCTGGATTTTGGTCCCTCACATTGGATACGGATTCCATCAGTATCTGCCGTACCCCGACGGAATGAGCCCGTTCCAGGCTGCCATGGTGGACGGATCGGGATACCAGGTCCACCGCACCATGCAGTTTGAAGATGGCGCAAGCCTGACCGTGAACTACCGGTATACCTACGAGGGCTCACACATCAAGGGGGAAGCCCAAGTCAAGGGTACCGGCTTCCCGGCCGACGGACCAGTGATGACCAACTCCTTGACCGCCGCCGACTGGTGCCGCAGCAAGAAAACTTACCCCAACGATAAGACAATCATCTCCACTTTCAAGTGGTCCTACACCACGGGCAACGGCAAACGCTACCGAAGCACTGCACGGACCACCTACACTTTCGCGAAGCCTATGGCCGCCAACTACCTGAAGAACCAGCCGATGTACGTGTTCAGAAAGACGGAACTCAAGCACTCCAAAACCGAACTGAACTTTAAGGAGTGGCAGAAGGCTTTCACTGGATTCGAGGACTTTGTCGGCGACTGGCGCCAGACTGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTGCTCGAACAGGGGGGTGTCTCCAGCCTCTTCCAAAATCTGGGCGTGTCCGTGACCCCGATCCAGCGGATCGTGCTCAGCGGGGAAAACGGCCTGAAGATCGATATCCACGTCATCATCCCGTACGAGGGACTGAGCGGCGACCAGATGGGTCAGATCGAAAAGATTTTCAAGGTGGTCTATCCCGTGGATGACCACCACTTCAAAGTGATCCTGCATTACGGGACCCTCGTGATCGACGGCGTCACCCCGAACATGATTGATTACTTCGGACGGCCTTATGAAGGGATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACCGTGACTGGCACCCTGTGGAACGGAAATAAGATCATTGACGAGCGGCTGATCAACCCAGACGGGTCGCTGCTGTTCCGCGTGACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAGCGCATCCTCGCCTGATAG

SEQ ID NO: 2

ATGGTGTCGAAGGGGGAAGCGGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTTAAAGTGCATATGGAGGGATCTATGAACGGACACGAGTTTGAGATCGAAGGGGAAGGAGAGGGGCGCCCATACGAAGGCACCCAGACTGCCAAGCTGAAAGTCACAAAGGGTGGACCCTTGCCCTTCTCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAATTCATGTACGGGTCCCGGGCCTTCACCAAGCACCCTGCTGACATTCCGGATTACTATAAGCAGAGCTTCCCGGAAGGCTTCAAATGGGAGCGAGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGCGCCGTGACCGTGACTCAGGACACTTCACTGGAAGATGGCACTCTGATCTACAAGGTCAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCACCGGACGGACCGGTCATGCAGAAAAAGACCATGGGATGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCGAAGATGGAGTCCTCAAGGGGGACATCAAGATGGCCCTGCGGCTCAAGGATGGTGGAAGATACCTGGCTGACTTCAAGACCACGTACAAGGCCAAGAAGCCAGTCCAGATGCCCGGCGCGTACAATGTGGATCGCAAGCTGGACATCACTTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAACGGTCCGAGGGTCGGCACTCCACTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAAATGGCCGAGGATGCAGACATGAGAAACGAACTGGAAGAAATGCAGCGGAGAGCAGACCAGCTCGCGGACGAATCACTGGAATCGACCCGCCGGATGCTTCAACTGGTCGAGGAATCAAAGGACGCGGGTATCCGGACCCTTGTGATGCTGGACGAACAGGGAGAGCAGCTGGAGAGGATCGAAGAGGGAATGGACCAGATTAACAAGGACATGAAGGAAGCGGAAAAGAACCTCACCGACCTTGGAAAGTTCTGCGGGTTGTGCGTGTGTCCGTGCAACAAGCTGAAGTCCTCCGACGCCTACAAGAAGGCCTGGGGAAACAACCAGGACGGTGTCGTGGCTTCCCAACCCGCACGGGTGGTGGATGAGCGGGAACAGATGGCGATTTCCGGAGGCTTCATTAGACGCGTGACCAACGACGCCCGCGAAAACGAGATGGACGAAAACCTGGAACAAGTGTCGGGAATCATCGGAAACTTGAGACACATGGCCCTCGACATGGGCAACGAAATTGATACACAGAACCGGCAGATTGACCGGATCATGGAAAAGGCAGACTCAAACAAGACTCGGATTGACGAAGCGAACCAGAGGGCCACTAAGATGTTGGGTTCCGGGATGGTGTCAAAGGGAGAAGAACTGTTCACTGGAGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTCTCAGTCAGCGGAGAGGGAGAGGGCGATGCGACTTACGGAAAGCTGACTTTGAAGTTTATCTGCACTACCGGAAAGCTGCCTGTGCCATGGCCTACCCTCGTGACCACCCTGTCCTGGGGCGTCCAATGTTTCGCACGCTACCCTGACCATATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAACGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAAACCAGGGCTGAAGTGAAGTTCGAGGGAGACACCCTGGTCAATCGGATTGAATTGAAGGGAATCGATTTCAAGGAAGATGGAAACATCCTGGGACATAAGCTTGAGTACAACTACTTCTCCGACAACGTGTACATCACGGCCGATAAGCAGAAGAACGGAATCAAAGCTAACTTCAAGATTCGGCACAACATTGAGGACGGCGGCGTCCAGCTGGCGGACCATTATCAGCAGAATACCCCTATTGGGGATGGACCGGTGCTGCTCCCGGACAACCATTACCTGTCCACCCAATCTAAGCTGAGCAAGGACCCAAACGAGAAGCGCGATCACATGGTGCTGCTCGAGTTCGTGACTGCCGCCGGGCTTCACACACTTGAGGACTTTGTCGGCGACTGGCGCCAGACTGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTGCTCGAACAGGGGGGTGTCTCCAGCCTCTTCCAAAATCTGGGCGTGTCCGTGACCCCGATCCAGCGGATCGTGCTCAGCGGGGAAAACGGCCTGAAGATCGATATCCACGTCATCATCCCGTACGAGGGACTGAGCGGCGACCAGATGGGTCAGATCGAAAAGATTTTCAAGGTGGTCTATCCCGTGGATGACCACCACTTCAAAGTGATCCTGCATTACGGGACCCTCGTGATCGACGGCGTCACCCCGAACATGATTGATTACTTCGGACGGCCTTATGAAGGGATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACCGTGACTGGCACCCTGTGGAACGGAAATAAGATCATTGACGAGCGGCTGATCAACCCAGACGGGTCGCTGCTGTTCCGCGTGACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAGCGCATCCTCGCCTGATAG

SEQ ID NO: 3

ATGACCATGGATGAGCAGCAATCGCAGGCTGTAGCCCCGGTATATGTCGGTGGTATGGATGAGAAAACGACTGGGTGGCGGGGTGGACACGTCGTCGAGGGCCTGGCAGGCGAACTTGAACAACTGCGGGCTCGCTTGGAGCACCACCCGCAAGGACAGCGCGAGCCGTCCATGGTGTCAAAGGGGGAGGAACTGTTTACTGGGGTCGTCCCTATCTTGGTGGAACTCGACGGGGATGTGAACGGACACAAGTTTTCGGTATCCGGGGAAGGCGAGGGGGATGCCACgTATGGAAAGCTCACACTTAAGTTCATCTGCACGACAGGGAAGCTCCCAGTGCCTTGGCCCACGTTGGTGACTACGCTCACATGGGGTGTCCAGTGCTTCGCACGGTATCCCGACCAcATGAAGCAGCATGATTTCTTTAAGTCAGCCATGCCGGAGGGATATGTACAAGAAAGGACCATCTTCTTCAAAGATGACGGTAACTACAAGACCAGAGCCGAGGTAAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTGAACAGGATTGAGCTGAAGGGAATTGATTTCAAAGAGGATGGGAACATCCTTGGTCACAAATTGGAGTACAATGCCATTTCGGATAACGTGTACATTACAGCGGATAAGCAGAAGAATGGGATCAAAGCGAATTTCAAAATCAGGCATAACATCGAGGACGGGTCGGTGCAGCTCGCCGACCATTACCAGCAGAATACGCCCATCGGAGATGGACCCGTACTTCTGCCCGACAATCATTATCTGTCAACGCAATCAGCGCTTAGCAAAGATCCCAATGAGAAAAGGGACCACATGGTGCTCCTCGAATTtGTGACGGCAGCGGGAATTACCCTCGGGATGGACGAACTGTACAAAAGCGGGTTGAGACTCGAGCGCTGAACTCGAGATGCCTTTTGTCAACAAGCAGTTTAACTATAAGGATCCCGTGAATGGTGTGGACATTGCCTACATCAAGATTCCAAACGCTGGACAAATGCAGCCCGTCAAGGCTTTCAAAATTCACAACAAGATCTGGGTGATCCCGGAGAGGGACACCTTTACCAATCCAGAAGAGGGCGACCTTAACCCTCCGCCAGAGGCCAAACAGGTGCCCGTGAGCTATTACGACTCAACTTATCTCTCCACCGACAACGAAAAGGACAATTACCTCAAGGGAGTCACCAAGCTGTTCGAACGGATCTACTCTACCGATCTCGGCAGGATGCTCCTGACTTCTATCGTGCGGGGCATCCCCTTCTGGGGTGGGAGCACCATTGACACCGAACTGAAGGTGATTGATACCAATTGCATCAACGTCATCCAGCCAGACGGTTCCTACCGGTCTGAGGAGCTCAATCTTGTGATTATTGGCCCGTCAGCTGATATCATCCAGTTCGAATGCAAGTCTTTCGGACACGACGTGCTTAATCTCACCCGCAATGGTTACGGAAGCACCCAGTACATCAGATTCTCTCCGGACTTTACTTTCGGATTTGAAGAGTCACTGGAAGTCGACACCAATCCTCTGCTCGGAGCCGGAAAGTTCGCCACCGACCCTGCAGTGACCCTTGCTCACGAGCTGATTCATGCAGAGCATCGCCTGTACGGGATCGCCATCAATCCTAACCGCGTGTTTAAGGTCAATACCAACGCTTACTATGAAATGAGCGGACTGGAGGTGTCCTTCGAGGAACTGCGCACCTTCGGAGGTCATGACGCTAAGTTCATCGACTCACTGCAAGAGAATGAGTTCCGGCTGTACTATTACAACAAGTTTAAGGATGTCGCCTCAACTCTGAACAAGGCCAAAAGCATCATCGGCACCACCGCCAGCCTGCAATACATGAAAAACGTGTTCAAGGAAAAGTACCTTCTTAGCGAAGATACTTCCGGGAAGTTTTCAGTCGACAAACTGAAGTTCGACAAGCTGTACAAGATGCTCACCGAAATCTACACCGAGGACAATTTTGTGAACTTCTTCAAAGTGATTAACAGAAAGACCTATCTGAACTTCGACAAAGCCGTGTTCCGGATTAACATTGTGCCCGATGAGAACTACACTATCAAGGACGGGTTCAACCTTAAGGGTGCAAATCTTTCAACTAATTTCAACGGACAGAATACTGAGATCAATTCAAGGAACTTCACTAGACTCAAGAATTTCACTGGGCTTTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGTGTCCGCGGAATTATCCCCTTCAAGTGAAGCTTCGTCAATGA

SEQ ID NO: 4

ATGTCCCCATGTGGACGAGCGCGCAGACAGACCTCAAGAGGAGCGATGGCCGTGCTGGCCTGGAAGTTCCCGAGGACTCGCCTGCCCATGGGAGCCTCTGCTCTGTGTGTGGTCGTGCTGTGTTGGCTGTACATCTTCCCGGTGTACCGGCTGCCTAACGAAAAGGAAATTGTGCAGGGCGTGCTCCAGCAGGGGACCGCTTGGCGGCGCAACCAGACCGCTGCGAGGGCTTTTCGGAAGCAGATGGAAGATTGTTGCGACCCCGCCCATCTTTTCGCGATGACCAAGATGAACAGCCCGATGGGAAAGTCCATGTGGTACGACGGAGAGTTCCTGTATTCCTTCACCATTGACAACAGCACTTACTCACTGTTCCCGCAAGCCACCCCCTTCCAACTGCCGCTTAAGAAGTGCGCCGTCGTGGGGAACGGCGGCATCCTCAAGAAGTCCGGATGCGGGCGCCAGATTGATGAAGCCAACTTCGTGATGCGGTGCAATCTCCCGCCACTCTCGTCCGAGTACACCAAGGACGTGGGGTCAAAGTCGCAGCTCGTCACCGCCAACCCTTCGATCATCAGACAACGGTTCCAGAACCTTCTGTGGAGCCGGAAAACATTTGTGGATAACATGAAGATCTACAACCATTCCTACATCTATATGCCTGCCTTCTCCATGAAAACTGGAACCGAACCCTCCCTGAGAGTGTACTACACCCTGTCCGACGTGGGCGCAAACCAGACCGTCCTTTTCGCCAACCCCAACTTCCTGCGCTCCATCGGAAAGTTCTGGAAGTCCAGAGGCATTCACGCGAAACGCTTGTCCACTGGATTGTTCTTGGTGTCCGCCGCTCTGGGCCTGTGCGAGGAAGTGGCCATATACGGATTCTGGCCTTTCTCCGTCAACATGCACGAGCAGCCCATCTCCCACCATTATTACGACAATGTCCTGCCTTTCTCGGGATTTCACGCGATGCCCGAGGAGTTCTTGCAACTGTGGTACCTTCACAAGATCGGTGCCCTGCGGATGCAGCTGGACCCTTGCGAGGACACCTCGCTGCAACCCACCTCGGAGCAGAAACTCATTTCCGAAGAGGATCTGAACGGGGAGCAGAAGCTCATCTCCGAGGAGGACCTGAACGGAGAACAGAAGCTGATTAGCGAAGAGGACCTGGGCAGCGGTGCCACCAATTTTTCTCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCGGGTCCCATGGAGGACTCCTACAAAGATCGGACTTCTCTGATGAAGGGAGCCAAGGACATCGCCAGGGAAGTGAAGAAGCAAACCGTCAAGAAGGTCAACCAGGCCGTGGACAGAGCCCAGGACGAGTACACCCAGCGGTCGTACTCGCGGTTCCAGGATGAAGAGGATGACGACGACTACTACCCTGCCGGCGAAACCTATAATGGGGAAGCCAACGATGACGAAGGCTCCAGCGAAGCCACTGAAGGACACGACGAGGACGACGAAATCTACGAAGGAGAATACCAGGGCATCCCTTCGATGAATCAGGCCAAAGATTCAATTGTGTCAGTGGGACAGCCTAAGGGCGACGAGTACAAGGACCGGAGAGAGCTCGAAAGCGAGCGGAGGGCCGACGAAGAGGAACTGGCACAACAGTACGAGCTGATCATCCAGGAGTGTGGGCACGGCCGGTTCCAGTGGGCGCTGTTCTTCGTGCTCGGAATGGCACTGATGGCCGACGGCGTGGAAGTGTTCGTGGTCGGATTCGTGCTGCCCTCGGCCGAAACCGACCTCTGCATTCCCAACTCCGGCTCGGGATGGCTGGGGTCCATCGTGTACCTGGGAATGATGGTCGGCGCCTTCTTCTGGGGTGGCCTGGCAGACAAGGTCGGCCGGAAGCAGTCCCTCTTGATCTGCATGAGCGTCAACGGATTTTTCGCCTTCCTGTCATCATTCGTGCAAGGTTACGGGTTCTTCCTTTTCTGCCGCCTGCTGTCCGGCTTTGGGATCGGCGGGGCTATTCCGACTGTGTTCTCCTACTTTGCCGAAGTGCTGGCTCGCGAAAAACGGGGCGAACACCTTTCCTGGCTGTGTATGTTCTGGATGATCGGCGGCATCTACGCCTCGGCCATGGCCTGGGCTATTATCCCGCATTATGGGTGGTCCTTCTCAATGGGAAGCGCATACCAGTTCCATTCGTGGCGGGTGTTCGTGATCGTGTGCGCCCTCCCGTGTGTGTCCTCCGTGGTGGCTCTGACATTCATGCCGGAGTCACCTCGGTTCTTGTTGGAAGTCGGGAAGCACGACGAAGCCTGGATGATTCTGAAGCTGATCCACGACACTAATATGCGGGCCCGGGGACAGCCTGAGAAAGTGTTCACCGTCAACAAGATTAAGACCCCGAAGCAAATCGATGAACTGATTGAAATTGAGTCCGACACCGGAACTTGGTACCGCCGGTGCTTCGTGCGGATTCGCACCGAGCTGTACGGAATCTGGCTCACCTTCATGCGCTGCTTCAACTACCCCGTGCGCGACAACACCATCAAGCTGACCATCGTGTGGTTCACTCTGTCTTTCGGCTACTATGGGCTGTCAGTGTGGTTCCCGGATGTCATCAAGCCGCTCCAATCCGATGAATACGCCCTGCTGACCCGCAATGTGGAGAGAGACAAATACGCCAACTTCACCATCAATTTCACCATGGAAAACCAGATTCACACCGGAATGGAGTACGACAATGGACGATTCATCGGAGTGAAGTTCAAGAGCGTGACCTTCAAGGACTCGGTGTTCAAGTCCTGTACCTTCGAGGACGTGACCAGCGTGAACACTTATTTTAAGAATTGCACCTTCATCGATACTGTGTTCGATAACACCGACTTCGAGCCCTATAAGTTCATTGACTCGGAGTTCAAGAACTGTTCATTCTTCCACAACAAGACTGGTTGCCAGATCACCTTCGATGACGACTACAGCGCCTACTGGATCTACTTTGTGAACTTTTTGGGAACTCTCGCAGTGCTTCCTGGCAACATTGTGTCCGCACTCCTGATGGATCGGATTGGCAGGCTCACGATGCTTGGGGGGTCCATGGTCCTCTCCGGGATCTCGTGCTTCTTCCTGTGGTTCGGCACCTCGGAGTCCATGATGATCGGAATGTTGTGCCTGTACAACGGTCTGACCATCAGCGCCTGGAACAGCCTCGACGTGGTCACCGTCGAGCTGTATCCTACCGACCGGCGCGCGACAGGCTTCGGATTCCTGAACGCACTGTGCAAGGCAGCCGCGGTCCTGGGAAATCTGATCTTTGGTTCGCTGGTGTCCATCACTAAGAGCATCCCTATTCTGCTCGCCTCCACGGTGCTCGTGTGTGGTGGCCTGGTCGGGCTGTGCCTGCCCGACACTCGCACCCAAGTGCTCATGGACTACAAGGATGACGATGATAAGGGAGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGGGATTACAAGGACGACGATGACAAAGGAAGCGGCGCCACTAACTTTTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCCGGGCCAATGCGCAACATTTTCAAGCGGAATCAGGAGCCTATCGTGGCCCCGGCCACCACTACCGCCACTATGCCTATTGGACCTGTCGACAACTCCACGGAATCAGGCGGCGCCGGCGAATCCCAAGAGGACATGTTCGCCAAGCTGAAGGAGAAACTGTTCAACGAAATCAACAAGATTCCCCTCCCGCCGTGGGCCCTGATCGCTATCGCTGTCGTCGCCGGACTGCTGCTGCTTACTTGCTGCTTCTGCATTTGCAAGAAGTGTTGTTGCAAGAAAAAGAAAAACAAGAAGGAAAAGGGGAAGGGAATGAAGAACGCCATGAATATGAAGGACATGAAGGGCGGACAGGATGATGATGATGCTGAAACTGGGCTGACTGAGGGCGAAGGAGAGGGCGAAGAGGAGAAGGAACCTGAGAACCTGGGAAAGCTCCAATTCTCCCTGGATTACGACTTCCAAGCCAACCAGCTGACTGTGGGAGTGTTGCAAGCCGCCGAGCTGCCAGCCCTGGACATGGGCGGCACCTCCGACCCCTATGTGAAGGTGTTCTTGCTGCCTGACAAGAAGAAGAAGTACGAAACCAAGGTGCACCGCAAGACCCTGAACCCCGCTTTCAACGAAACCTTCACTTTCAAAGTGCCCTACCAAGAGCTCGGGGGAAAGACTCTCGTGATGGCGATCTACGACTTCGACCGGTTCAGCAAGCACGATATCATCGGGGAGGTCAAGGTCCCGATGAACACCGTGGACCTTGGCCAACCGATTGAAGAATGGCGCGATCTCCAGGGTGGCGAAAAGGAGGAGCCCGAGAAACTGGGTGACATCTGTACATCACTGCGCTACGTGCCGACCGCCGGGAAGCTCACTGTCTGCATCCTGGAGGCCAAGAACCTGAAGAAAATGGACGTGGGCGGGCTCTCCGACCCTTACGTGAAGATCCACCTGATGCAGAACGGAAAGCGGCTGAAGAAGAAGAAAACCACTGTGAAGAAAAAGACTCTGAACCCCTACTTCAACGAGTCGTTCTCCTTCGAAATCCCGTTTGAGCAAATCCAGAAGGTCCAAGTGGTCGTGACTGTGCTTGACTACGACAAGCTCGGAAAGAACGAGGCCATTGGCAAAATCTTCGTGGGATCGAACGCAACTGGCACCGAGCTGAGACACTGGTCTGACATGCTCGCCAACCCAAGGCGGCCGATTGCTCAGTGGCACTCCTTGAAACCTGAGGAAGAAGTGGATGCCCTTCTTGGAAAGAACAAGATGTACCCCTACGACGTCCCTGATTACGCGGGATACCCGTACGATGTGCCTGACTATGCCGGCTACCCGTACGATGTGCCAGACTACGCTGGCTCCGGAGCCACGAACTTTTCGCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCTGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACATGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAGGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAGGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGATAG

SEQ ID NO: 5

ATGTCCCCATGTGGACGAGCGCGCAGACAGACCTCAAGAGGAGCGATGGCCGTGCTGGCCTGGAAGTTCCCGAGGACTCGCCTGCCCATGGGAGCCTCTGCTCTGTGTGTGGTCGTGCTGTGTTGGCTGTACATCTTCCCGGTGTACCGGCTGCCTAACGAAAAGGAAATTGTGCAGGGCGTGCTCCAGCAGGGGACCGCTTGGCGGCGCAACCAGACCGCTGCGAGGGCTTTTCGGAAGCAGATGGAAGATTGTTGCGACCCCGCCCATCTTTTCGCGATGACCAAGATGAACAGCCCGATGGGAAAGTCCATGTGGTACGACGGAGAGTTCCTGTATTCCTTCACCATTGACAACAGCACTTACTCACTGTTCCCGCAAGCCACCCCCTTCCAACTGCCGCTTAAGAAGTGCGCCGTCGTGGGGAACGGCGGCATCCTCAAGAAGTCCGGATGCGGGCGCCAGATTGATGAAGCCAACTTCGTGATGCGGTGCAATCTCCCGCCACTCTCGTCCGAGTACACCAAGGACGTGGGGTCAAAGTCGCAGCTCGTCACCGCCAACCCTTCGATCATCAGACAACGGTTCCAGAACCTTCTGTGGAGCCGGAAAACATTTGTGGATAACATGAAGATCTACAACCATTCCTACATCTATATGCCTGCCTTCTCCATGAAAACTGGAACCGAACCCTCCCTGAGAGTGTACTACACCCTGTCCGACGTGGGCGCAAACCAGACCGTCCTTTTCGCCAACCCCAACTTCCTGCGCTCCATCGGAAAGTTCTGGAAGTCCAGAGGCATTCACGCGAAACGCTTGTCCACTGGATTGTTCTTGGTGTCCGCCGCTCTGGGCCTGTGCGAGGAAGTGGCCATATACGGATTCTGGCCTTTCTCCGTCAACATGCACGAGCAGCCCATCTCCCACCATTATTACGACAATGTCCTGCCTTTCTCGGGATTTCACGCGATGCCCGAGGAGTTCTTGCAACTGTGGTACCTTCACAAGATCGGTGCCCTGCGGATGCAGCTGGACCCTTGCGAGGACACCTCGCTGCAACCCACCTCGGAGCAGAAACTCATTTCCGAAGAGGATCTGAACGGGGAGCAGAAGCTCATCTCCGAGGAGGACCTGAACGGAGAACAGAAGCTGATTAGCGAAGAGGACCTGGGCAGCGGTGCCACCAATTTTTCTCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCGGGTCCCATGGAGGACTCCTACAAAGATCGGACTTCTCTGATGAAGGGAGCCAAGGACATCGCCAGGGAAGTGAAGAAGCAAACCGTCAAGAAGGTCAACCAGGCCGTGGACAGAGCCCAGGACGAGTACACCCAGCGGTCGTACTCGCGGTTCCAGGATGAAGAGGATGACGACGACTACTACCCTGCCGGCGAAACCTATAATGGGGAAGCCAACGATGACGAAGGCTCCAGCGAAGCCACTGAAGGACACGACGAGGACGACGAAATCTACGAAGGAGAATACCAGGGCATCCCTTCGATGAATCAGGCCAAAGATTCAATTGTGTCAGTGGGACAGCCTAAGGGCGACGAGTACAAGGACCGGAGAGAGCTCGAAAGCGAGCGGAGGGCCGACGAAGAGGAACTGGCACAACAGTACGAGCTGATCATCCAGGAGTGTGGGCACGGCCGGTTCCAGTGGGCGCTGTTCTTCGTGCTCGGAATGGCACTGATGGCCGACGGCGTGGAAGTGTTCGTGGTCGGATTCGTGCTGCCCTCGGCCGAAACCGACCTCTGCATTCCCAACTCCGGCTCGGGATGGCTGGGGTCCATCGTGTACCTGGGAATGATGGTCGGCGCCTTCTTCTGGGGTGGCCTGGCAGACAAGGTCGGCCGGAAGCAGTCCCTCTTGATCTGCATGAGCGTCAACGGATTTTTCGCCTTCCTGTCATCATTCGTGCAAGGTTACGGGTTCTTCCTTTTCTGCCGCCTGCTGTCCGGCTTTGGGATCGGCGGGGCTATTCCGACTGTGTTCTCCTACTTTGCCGAAGTGCTGGCTCGCGAAAAACGGGGCGAACACCTTTCCTGGCTGTGTATGTTCTGGATGATCGGCGGCATCTACGCCTCGGCCATGGCCTGGGCTATTATCCCGCATTATGGGTGGTCCTTCTCAATGGGAAGCGCATACCAGTTCCATTCGTGGCGGGTGTTCGTGATCGTGTGCGCCCTCCCGTGTGTGTCCTCCGTGGTGGCTCTGACATTCATGCCGGAGTCACCTCGGTTCTTGTTGGAAGTCGGGAAGCACGACGAAGCCTGGATGATTCTGAAGCTGATCCACGACACTAATATGCGGGCCCGGGGACAGCCTGAGAAAGTGTTCACCGTCAACAAGATTAAGACCCCGAAGCAAATCGATGAACTGATTGAAATTGAGTCCGACACCGGAACTTGGTACCGCCGGTGCTTCGTGCGGATTCGCACCGAGCTGTACGGAATCTGGCTCACCTTCATGCGCTGCTTCAACTACCCCGTGCGCGACAACACCATCAAGCTGACCATCGTGTGGTTCACTCTGTCTTTCGGCTACTATGGGCTGTCAGTGTGGTTCCCGGATGTCATCAAGCCGCTCCAATCCGATGAATACGCCCTGCTGACCCGCAATGTGGAGAGAGACAAATACGCCAACTTCACCATCAATTTCACCATGGAAAACCAGATTCACACCGGAATGGAGTACGACAATGGACGATTCATCGGAGTGAAGTTCAAGAGCGTGACCTTCAAGGACTCGGTGTTCAAGTCCTGTACCTTCGAGGACGTGACCAGCGTGAACACTTATTTTAAGAATTGCACCTTCATCGATACTGTGTTCGATAACACCGACTTCGAGCCCTATAAGTTCATTGACTCGGAGTTCAAGAACTGTTCATTCTTCCACAACAAGACTGGTTGCCAGATCACCTTCGATGACGACTACAGCGCCTACTGGATCTACTTTGTGAACTTTTTGGGAACTCTCGCAGTGCTTCCTGGCAACATTGTGTCCGCACTCCTGATGGATCGGATTGGCAGGCTCACGATGCTTGGGGGGTCCATGGTCCTCTCCGGGATCTCGTGCTTCTTCCTGTGGTTCGGCACCTCGGAGTCCATGATGATCGGAATGTTGTGCCTGTACAACGGTCTGACCATCAGCGCCTGGAACAGCCTCGACGTGGTCACCGTCGAGCTGTATCCTACCGACCGGCGCGCGACAGGCTTCGGATTCCTGAACGCACTGTGCAAGGCAGCCGCGGTCCTGGGAAATCTGATCTTTGGTTCGCTGGTGTCCATCACTAAGAGCATCCCTATTCTGCTCGCCTCCACGGTGCTCGTGTGTGGTGGCCTGGTCGGGCTGTGCCTGCCCGACACTCGCACCCAAGTGCTCATGGACTACAAGGATGACGATGATAAGGGAGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGGGATTACAAGGACGACGATGACAAAGGAAGCGGCGCCACTAACTTTTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCCGGGCCAATGCGCAACATTTTCAAGCGGAATCAGGAGCCTATCGTGGCCCCGGCCACCACTACCGCCACTATGCCTATTGGACCTGTCGACAACTCCACGGAATCAGGCGGCGCCGGCGAATCCCAAGAGGACATGTTCGCCAAGCTGAAGGAGAAACTGTTCAACGAAATCAACAAGATTCCCCTCCCGCCGTGGGCCCTGATCGCTATCGCTGTCGTCGCCGGACTGCTGCTGCTTACTTGCTGCTTCTGCATTTGCAAGAAGTGTTGTTGCAAGAAAAAGAAAAACAAGAAGGAAAAGGGGAAGGGAATGAAGAACGCCATGAATATGAAGGACATGAAGGGCGGACAGGATGATGATGATGCTGAAACTGGGCTGACTGAGGGCGAAGGAGAGGGCGAAGAGGAGAAGGAACCTGAGAACCTGGGAAAGCTCCAATTCTCCCTGGATTACGACTTCCAAGCCAACCAGCTGACTGTGGGAGTGTTGCAAGCCGCCGAGCTGCCAGCCCTGGACATGGGCGGCACCTCCGACCCCTATGTGAAGGTGTTCTTGCTGCCTGACAAGAAGAAGAAGTACGAAACCAAGGTGCACCGCAAGACCCTGAACCCCGCTTTCAACGAAACCTTCACTTTCAAAGTGCCCTACCAAGAGCTCGGGGGAAAGACTCTCGTGATGGCGATCTACGACTTCGACCGGTTCAGCAAGCACGATATCATCGGGGAGGTCAAGGTCCCGATGAACACCGTGGACCTTGGCCAACCGATTGAAGAATGGCGCGATCTCCAGGGTGGCGAAAAGGAGGAGCCCGAGAAACTGGGTGACATCTGTACATCACTGCGCTACGTGCCGACCGCCGGGAAGCTCACTGTCTGCATCCTGGAGGCCAAGAACCTGAAGAAAATGGACGTGGGCGGGCTCTCCGACCCTTACGTGAAGATCCACCTGATGCAGAACGGAAAGCGGCTGAAGAAGAAGAAAACCACTGTGAAGAAAAAGACTCTGAACCCCTACTTCAACGAGTCGTTCTCCTTCGAAATCCCGTTTGAGCAAATCCAGAAGGTCCAAGTGGTCGTGACTGTGCTTGACTACGACAAGCTCGGAAAGAACGAGGCCATTGGCAAAATCTTCGTGGGATCGAACGCAACTGGCACCGAGCTGAGACACTGGTCTGACATGCTCGCCAACCCAAGGCGGCCGATTGCTCAGTGGCACTCCTTGAAACCTGAGGAAGAAGTGGATGCCCTTCTTGGAAAGAACAAGATGTACCCCTACGACGTCCCTGATTACGCGGGATACCCGTACGATGTGCCTGACTATGCCGGCTACCCGTACGATGTGCCAGACTACGCTGGCTCCGGAGCCACGAACTTTTCGCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCTGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACATGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAGGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAGGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGATAG

SEQ ID NO: 6

MSPCGRARRQTSRGAMAVLAWKFPRTRLPMGASALCVVVLCWLYIFPVYRLPNEKEIVQGVLQQGTAWRRNQTAARAFRKQMEDCCDPAHLFAMTKMNSPMGKSMWYDGEFLYSFTIDNSTYSLFPQATPFQLPLKKCAVVGNGGILKKSGCGRQIDEANFVMRCNLPPLSSEYTKDVGSKSQLVTANPSIIRQRFQNLLWSRKTFVDNMKIYNHSYIYMPAFSMKTGTEPSLRVYYTLSDVGANQTVLFANPNFLRSIGKFWKSRGIHAKRLSTGLFLVSAALGLCEEVAIYGFWPFSVNMHEQPISHHYYDNVLPFSGFHAMPEEFLQLWYLHKIGALRMQLDPCEDTSLQPTS

SEQ ID NO: 7

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

SEQ ID NO: 8

MEEGFRDRAAFIRGAKDIAKEVKKHAAKKVVKGLDRVQDEYSRRSYSRFEEEDDDDDFPAPSDGYYRGEGTQDEEEGGASSDATEGHDEDDEIYEGEYQGIPRAESGGKGERMADGAPLAGVRGGLSDGEGPPGGRGEAQRRKEREELAQQYEAILRECGHGRFQWTLYFVLGLALMADGVEVFVVGFVLPSAEKDMCLSDSNKGMLGLIVYLGMMVGAFLWGGLADRLGRRQCLLISLSVNSVFAFFSSFVQGYGTFLFCRLLSGVGIGGSIPIVFSYFSEFLAQEKRGEHLSWLCMFWMIGGVYAAAMAWAIIPHYGWSFQMGSAYQFHSWRVFVLVCAFPSVFAIGALTTQPESPRFFLENGKHDEAWMVLKQVHDTNMRAKGHPERVFSVTHIKTIHQEDELIEIQSDTGTWYQRWGVRALSLGGQVWGNFLSCFGPEYRRITLMMMGVWFTMSFSYYGLTVWFPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAYMVYFVSFLGTLAVLPGNIVSALLMDKIGRLRMLAGSSVMSCVSCFFLSFGNSESAMIALLCLFGGVSIASWNALDVLTVELYPSDKRTTAFGFLNALCKLAAVLGISIFTSFVGITKAAPILFASAALALGSSLALKLPETRGQVLQ

SEQ ID NO: 9

MEDSYKDRTSLMKGAKDIAREVKKQTVKKVNQAVDRAQDEYTQRSYSRFQDEEDDDDYYPAGETYNGEANDDEGSSEATEGHDEDDEIYEGEYQGIPSMNQAKDSIVSVGQPKGDEYKDRRELESERRADEEELAQQYELIIQECGHGRFQWALFFVLGMALMADGVEVFVVGFVLPSAETDLCIPNSGSGWLGSIVYLGMMVGAFFWGGLADKVGRKQSLLICMSVNGFFAFLSSFVQGYGFFLFCRLLSGFGIGGAIPTVFSYFAEVLAREKRGEHLSWLCMFWMIGGIYASAMAWAIIPHYGWSFSMGSAYQFHSWRVFVIVCALPCVSSVVALTFMPESPRFLLEVGKHDEAWMILKLIHDTNMRARGQPEKVFTVNKIKTPKQIDELIEIESDTGTWYRRCFVRIRTELYGIWLTFMRCFNYPVRDNTIKLTIVWFTLSFGYYGLSVWFPDVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYSAYWIYFVNFLGTLAVLPGNIVSALLMDRIGRLTMLGGSMVLSGISCFFLWFGTSESMMIGMLCLYNGLTISAWNSLDVVTVELYPTDRRATGFGFLNALCKAAAVLGNLIFGSLVSITKSIPILLASTVLVCGGLVGLCLPDTRTQVLM

SEQ ID NO: 10

MDDYKYQDNYGGYAPSDGYYRGNESNPEEDAQSDVTEGHDEEDEIYEGEYQGIPHPDDVKAKQAKMAPSRMDSLRGQTDLMAERLEDEEQLAHQYETIMDECGHGRFQWILFFVLGLALMADGVEVFVVSFALPSAEKDMCLSSSKKGMLGMIVYLGMMAGAFILGGLADKLGRKRVLSMSLAVNASFASLSSFVQGYGAFLFCRLISGIGIGGALPIVFAYFSEFLSREKRGEHLSWLGIFWMTGGLYASAMAWSIIPHYGWGFSMGTNYHFHSWRVFVIVCALPCTVSMVALKFMPESPRFLLEMGKHDEAWMILKQVHDTNMRAKGTPEKVFTVSNIKTPKQMDEFIEIQSSTGTWYQRWLVRFKTIFKQVWDNALYCVMGPYRMNTLILAVVWFAMAFSYYGLTVWFPDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDNDFLIYLVSFLGSLSVLPGNIISALLMDRIGRLKMIGGSMLISAVCCFFLFFGNSESAMIGWQCLFCGTSIAAWNALDVITVELYPTNQRATAFGILNGLCKFGAILGNTIFASFVGITKVVPILLAAASLVGGGLIALRLPETREQVLM

SEQ ID NO: 11

FPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAY

SEQ ID NO: 12

WFPDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDNDFLIY

SEQ ID NO: 13

WFPDVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYSAY

SEQ ID NO: 14

MVSESHHEALAAPPVTTVATVLPSNATEPASPGEGKEDAFSKLKEKFMNELHKIPLPPWALIAIAIVAVLLVLTCCFCICKKCLFKKKNKKKGKEKGGKNAINMKDVKDLGKTMKDQALKDDDAETGLTDGEEKEEPKEEEKLGKLQYSLDYDFQNNQLLVGIIQAAELPALDMGGTSDPYVKVFLLPDKKKKFETKVHRKTLNPVFNEQFTFKVPYSELGGKTLVMAVYDFDRFSKHDIIGEFKVPMNTVDFGHVTEEWRDLQSAEKEEQEKLGDICFSLRYVPTAGKLTVVILEAKNLKKMDVGGLSDPYVKIHLMQNGKRLKKKKTTIKKNTLNPYYNESFSFEVPFEQIQKVQVVVTVLDYDKIGKNDAIGKVFVGYNSTGAELRHWSDMLANPRRPIAQWHTLQVEEEVDAMLAVKK

SEQ ID NO: 15

MRNIFKRNQEPIVAPATTTATMPIGPVDNSTESGGAGESQEDMFAKLKEKLFNEINKIPLPPWALIAIAVVAGLLLLTCCFCICKKCCCKKKKNKKEKGKGMKNAMNMKDMKGGQDDDDAETGLTEGEGEGEEEKEPENLGKLQFSLDYDFQANQLTVGVLQAAELPALDMGGTSDPYVKVFLLPDKKKKYETKVHRKTLNPAFNETFTFKVPYQELGGKTLVMAIYDFDRFSKHDIIGEVKVPMNTVDLGQPIEEWRDLQGGEKEEPEKLGDICTSLRYVPTAGKLTVCILEAKNLKKMDVGGLSDPYVKIHLMQNGKRLKKKKTTVKKKTLNPYFNESFSFEIPFEQIQKVQVVVTVLDYDKLGKNEAIGKIFVGSNATGTELRHWSDMLANPRRPIAQWHSLKPEEEVDALLGKNK

SEQ ID NO: 16

MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTGGMDELYK

SEQ ID NO: 17

MASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTGFEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQ

SEQ ID NO: 18

LFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSWGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYFSDNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGL

SEQ ID NO: 19

MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG

SEQ ID NO: 20

MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF

SEQ ID NO: 21

MTEYKPTVRLATRDDVPRAVRTLAAAFADYPATRHTVDPDRHIERVTELQELFLTRVGLDIGKVWVADDGAAVAVWTTPESVEAGAVFAEIGPRMAELSGSRLAAQQQMEGLLAPHRPKEPAWFLATVGVSPDHQGKGLGSAVVLPGVEAAERAGVPAFLETSAPRNLPFYERLGFTVTADVEVPEGPRTWCMTRKPGA

SEQ ID NO: 22

HTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СИНАПТИК РИСЕРЧ, ЭлЭлСи

<120> КЛЕТКИ, ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНОМУ НЕЙРОТОКСИНУ

<130> P67748WO

<150> US 62/885,853

<151> 2019-08-13

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2502

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 1

atggtgtcga agggggaagc ggtgatcaag gagttcatga ggtttaaagt gcatatggag 60

ggatctatga acggacacga gtttgagatc gaaggggaag gagaggggcg cccatacgaa 120

ggcacccaga ctgccaagct gaaagtcaca aagggtggac ccttgccctt ctcgtgggat 180

attctgagcc cgcaattcat gtacgggtcc cgggccttca ccaagcaccc tgctgacatt 240

ccggattact ataagcagag cttcccggaa ggcttcaaat gggagcgagt gatgaacttc 300

gaggatggag gcgccgtgac cgtgactcag gacacttcac tggaagatgg cactctgatc 360

tacaaggtca agctgcgggg caccaacttc ccaccggacg gaccggtcat gcagaaaaag 420

accatgggat gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccg aagatggagt cctcaagggg 480

gacatcaaga tggccctgcg gctcaaggat ggtggaagat acctggctga cttcaagacc 540

acgtacaagg ccaagaagcc agtccagatg cccggcgcgt acaatgtgga tcgcaagctg 600

gacatcactt cccacaacga ggactacacc gtggtggagc agtacgaacg gtccgagggt 660

cggcactcca ctggtggcat ggacgagctg tacaaaatgg ccgaggatgc agacatgaga 720

aacgaactgg aagaaatgca gcggagagca gaccagctcg cggacgaatc actggaatcg 780

acccgccgga tgcttcaact ggtcgaggaa tcaaaggacg cgggtatccg gacccttgtg 840

atgctggacg aacagggaga gcagctggag aggatcgaag agggaatgga ccagattaac 900

aaggacatga aggaagcgga aaagaacctc accgaccttg gaaagttctg cgggttgtgc 960

gtgtgtccgt gcaacaagct gaagtcctcc gacgcctaca agaaggcctg gggaaacaac 1020

caggacggtg tcgtggcttc ccaacccgca cgggtggtgg atgagcggga acagatggcg 1080

atttccggag gcttcattag acgcgtgacc aacgacgccc gcgaaaacga gatggacgaa 1140

aacctggaac aagtgtcggg aatcatcgga aacttgagac acatggccct cgacatgggc 1200

aacgaaattg atacacagaa ccggcagatt gaccggatca tggaaaaggc agactcaaac 1260

aagactcgga ttgacgaagc gaaccagagg gccactaaga tgttgggttc cgggatggtg 1320

tcaaagggag aagaagacaa catggcatca ctgcccgcca cccacgagct gcacatcttc 1380

ggttccatca acggggtcga cttcgacatg gtcggccagg gaactggaaa cccgaatgac 1440

ggttatgaag aactgaacct taaatcaacc aagggggacc ttcagttctc gccctggatt 1500

ttggtccctc acattggata cggattccat cagtatctgc cgtaccccga cggaatgagc 1560

ccgttccagg ctgccatggt ggacggatcg ggataccagg tccaccgcac catgcagttt 1620

gaagatggcg caagcctgac cgtgaactac cggtatacct acgagggctc acacatcaag 1680

ggggaagccc aagtcaaggg taccggcttc ccggccgacg gaccagtgat gaccaactcc 1740

ttgaccgccg ccgactggtg ccgcagcaag aaaacttacc ccaacgataa gacaatcatc 1800

tccactttca agtggtccta caccacgggc aacggcaaac gctaccgaag cactgcacgg 1860

accacctaca ctttcgcgaa gcctatggcc gccaactacc tgaagaacca gccgatgtac 1920

gtgttcagaa agacggaact caagcactcc aaaaccgaac tgaactttaa ggagtggcag 1980

aaggctttca ctggattcga ggactttgtc ggcgactggc gccagactgc cggctacaac 2040

ctggaccaag tgctcgaaca ggggggtgtc tccagcctct tccaaaatct gggcgtgtcc 2100

gtgaccccga tccagcggat cgtgctcagc ggggaaaacg gcctgaagat cgatatccac 2160

gtcatcatcc cgtacgaggg actgagcggc gaccagatgg gtcagatcga aaagattttc 2220

aaggtggtct atcccgtgga tgaccaccac ttcaaagtga tcctgcatta cgggaccctc 2280

gtgatcgacg gcgtcacccc gaacatgatt gattacttcg gacggcctta tgaagggatc 2340

gccgtgttcg acggcaaaaa gatcaccgtg actggcaccc tgtggaacgg aaataagatc 2400

attgacgagc ggctgatcaa cccagacggg tcgctgctgt tccgcgtgac catcaacgga 2460

gtgaccggct ggcggctgtg cgagcgcatc ctcgcctgat ag 2502

<210> 2

<211> 2517

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 2

atggtgtcga agggggaagc ggtgatcaag gagttcatga ggtttaaagt gcatatggag 60

ggatctatga acggacacga gtttgagatc gaaggggaag gagaggggcg cccatacgaa 120

ggcacccaga ctgccaagct gaaagtcaca aagggtggac ccttgccctt ctcgtgggat 180

attctgagcc cgcaattcat gtacgggtcc cgggccttca ccaagcaccc tgctgacatt 240

ccggattact ataagcagag cttcccggaa ggcttcaaat gggagcgagt gatgaacttc 300

gaggatggag gcgccgtgac cgtgactcag gacacttcac tggaagatgg cactctgatc 360

tacaaggtca agctgcgggg caccaacttc ccaccggacg gaccggtcat gcagaaaaag 420

accatgggat gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccg aagatggagt cctcaagggg 480

gacatcaaga tggccctgcg gctcaaggat ggtggaagat acctggctga cttcaagacc 540

acgtacaagg ccaagaagcc agtccagatg cccggcgcgt acaatgtgga tcgcaagctg 600

gacatcactt cccacaacga ggactacacc gtggtggagc agtacgaacg gtccgagggt 660

cggcactcca ctggtggcat ggacgagctg tacaaaatgg ccgaggatgc agacatgaga 720

aacgaactgg aagaaatgca gcggagagca gaccagctcg cggacgaatc actggaatcg 780

acccgccgga tgcttcaact ggtcgaggaa tcaaaggacg cgggtatccg gacccttgtg 840

atgctggacg aacagggaga gcagctggag aggatcgaag agggaatgga ccagattaac 900

aaggacatga aggaagcgga aaagaacctc accgaccttg gaaagttctg cgggttgtgc 960

gtgtgtccgt gcaacaagct gaagtcctcc gacgcctaca agaaggcctg gggaaacaac 1020

caggacggtg tcgtggcttc ccaacccgca cgggtggtgg atgagcggga acagatggcg 1080

atttccggag gcttcattag acgcgtgacc aacgacgccc gcgaaaacga gatggacgaa 1140

aacctggaac aagtgtcggg aatcatcgga aacttgagac acatggccct cgacatgggc 1200

aacgaaattg atacacagaa ccggcagatt gaccggatca tggaaaaggc agactcaaac 1260

aagactcgga ttgacgaagc gaaccagagg gccactaaga tgttgggttc cgggatggtg 1320

tcaaagggag aagaactgtt cactggagtg gtgcccatcc tggtggagct ggatggcgat 1380

gtgaacggcc ataaattctc agtcagcgga gagggagagg gcgatgcgac ttacggaaag 1440

ctgactttga agtttatctg cactaccgga aagctgcctg tgccatggcc taccctcgtg 1500

accaccctgt cctggggcgt ccaatgtttc gcacgctacc ctgaccatat gaagcagcac 1560

gacttcttca agtccgccat gcccgagggc tacgtgcagg aacgcaccat cttcttcaag 1620

gacgacggga actacaaaac cagggctgaa gtgaagttcg agggagacac cctggtcaat 1680

cggattgaat tgaagggaat cgatttcaag gaagatggaa acatcctggg acataagctt 1740

gagtacaact acttctccga caacgtgtac atcacggccg ataagcagaa gaacggaatc 1800

aaagctaact tcaagattcg gcacaacatt gaggacggcg gcgtccagct ggcggaccat 1860

tatcagcaga atacccctat tggggatgga ccggtgctgc tcccggacaa ccattacctg 1920

tccacccaat ctaagctgag caaggaccca aacgagaagc gcgatcacat ggtgctgctc 1980

gagttcgtga ctgccgccgg gcttcacaca cttgaggact ttgtcggcga ctggcgccag 2040

actgccggct acaacctgga ccaagtgctc gaacaggggg gtgtctccag cctcttccaa 2100

aatctgggcg tgtccgtgac cccgatccag cggatcgtgc tcagcgggga aaacggcctg 2160

aagatcgata tccacgtcat catcccgtac gagggactga gcggcgacca gatgggtcag 2220

atcgaaaaga ttttcaaggt ggtctatccc gtggatgacc accacttcaa agtgatcctg 2280

cattacggga ccctcgtgat cgacggcgtc accccgaaca tgattgatta cttcggacgg 2340

ccttatgaag ggatcgccgt gttcgacggc aaaaagatca ccgtgactgg caccctgtgg 2400

aacggaaata agatcattga cgagcggctg atcaacccag acgggtcgct gctgttccgc 2460

gtgaccatca acggagtgac cggctggcgg ctgtgcgagc gcatcctcgc ctgatag 2517

<210> 3

<211> 2250

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 3

atgaccatgg atgagcagca atcgcaggct gtagccccgg tatatgtcgg tggtatggat 60

gagaaaacga ctgggtggcg gggtggacac gtcgtcgagg gcctggcagg cgaacttgaa 120

caactgcggg ctcgcttgga gcaccacccg caaggacagc gcgagccgtc catggtgtca 180

aagggggagg aactgtttac tggggtcgtc cctatcttgg tggaactcga cggggatgtg 240

aacggacaca agttttcggt atccggggaa ggcgaggggg atgccacgta tggaaagctc 300

acacttaagt tcatctgcac gacagggaag ctcccagtgc cttggcccac gttggtgact 360

acgctcacat ggggtgtcca gtgcttcgca cggtatcccg accacatgaa gcagcatgat 420

ttctttaagt cagccatgcc ggagggatat gtacaagaaa ggaccatctt cttcaaagat 480

gacggtaact acaagaccag agccgaggta aagtttgaag gcgacactct cgtgaacagg 540

attgagctga agggaattga tttcaaagag gatgggaaca tccttggtca caaattggag 600

tacaatgcca tttcggataa cgtgtacatt acagcggata agcagaagaa tgggatcaaa 660

gcgaatttca aaatcaggca taacatcgag gacgggtcgg tgcagctcgc cgaccattac 720

cagcagaata cgcccatcgg agatggaccc gtacttctgc ccgacaatca ttatctgtca 780

acgcaatcag cgcttagcaa agatcccaat gagaaaaggg accacatggt gctcctcgaa 840

tttgtgacgg cagcgggaat taccctcggg atggacgaac tgtacaaaag cgggttgaga 900

ctcgagcgct gaactcgaga tgccttttgt caacaagcag tttaactata aggatcccgt 960

gaatggtgtg gacattgcct acatcaagat tccaaacgct ggacaaatgc agcccgtcaa 1020

ggctttcaaa attcacaaca agatctgggt gatcccggag agggacacct ttaccaatcc 1080

agaagagggc gaccttaacc ctccgccaga ggccaaacag gtgcccgtga gctattacga 1140

ctcaacttat ctctccaccg acaacgaaaa ggacaattac ctcaagggag tcaccaagct 1200

gttcgaacgg atctactcta ccgatctcgg caggatgctc ctgacttcta tcgtgcgggg 1260

catccccttc tggggtggga gcaccattga caccgaactg aaggtgattg ataccaattg 1320

catcaacgtc atccagccag acggttccta ccggtctgag gagctcaatc ttgtgattat 1380

tggcccgtca gctgatatca tccagttcga atgcaagtct ttcggacacg acgtgcttaa 1440

tctcacccgc aatggttacg gaagcaccca gtacatcaga ttctctccgg actttacttt 1500

cggatttgaa gagtcactgg aagtcgacac caatcctctg ctcggagccg gaaagttcgc 1560

caccgaccct gcagtgaccc ttgctcacga gctgattcat gcagagcatc gcctgtacgg 1620

gatcgccatc aatcctaacc gcgtgtttaa ggtcaatacc aacgcttact atgaaatgag 1680

cggactggag gtgtccttcg aggaactgcg caccttcgga ggtcatgacg ctaagttcat 1740

cgactcactg caagagaatg agttccggct gtactattac aacaagttta aggatgtcgc 1800

ctcaactctg aacaaggcca aaagcatcat cggcaccacc gccagcctgc aatacatgaa 1860

aaacgtgttc aaggaaaagt accttcttag cgaagatact tccgggaagt tttcagtcga 1920

caaactgaag ttcgacaagc tgtacaagat gctcaccgaa atctacaccg aggacaattt 1980

tgtgaacttc ttcaaagtga ttaacagaaa gacctatctg aacttcgaca aagccgtgtt 2040

ccggattaac attgtgcccg atgagaacta cactatcaag gacgggttca accttaaggg 2100

tgcaaatctt tcaactaatt tcaacggaca gaatactgag atcaattcaa ggaacttcac 2160

tagactcaag aatttcactg ggcttttcga gttctataag ctgctgtgtg tccgcggaat 2220

tatccccttc aagtgaagct tcgtcaatga 2250

<210> 4

<211> 5772

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 4

atgtccccat gtggacgagc gcgcagacag acctcaagag gagcgatggc cgtgctggcc 60

tggaagttcc cgaggactcg cctgcccatg ggagcctctg ctctgtgtgt ggtcgtgctg 120

tgttggctgt acatcttccc ggtgtaccgg ctgcctaacg aaaaggaaat tgtgcagggc 180

gtgctccagc aggggaccgc ttggcggcgc aaccagaccg ctgcgagggc ttttcggaag 240

cagatggaag attgttgcga ccccgcccat cttttcgcga tgaccaagat gaacagcccg 300

atgggaaagt ccatgtggta cgacggagag ttcctgtatt ccttcaccat tgacaacagc 360

acttactcac tgttcccgca agccaccccc ttccaactgc cgcttaagaa gtgcgccgtc 420

gtggggaacg gcggcatcct caagaagtcc ggatgcgggc gccagattga tgaagccaac 480

ttcgtgatgc ggtgcaatct cccgccactc tcgtccgagt acaccaagga cgtggggtca 540

aagtcgcagc tcgtcaccgc caacccttcg atcatcagac aacggttcca gaaccttctg 600

tggagccgga aaacatttgt ggataacatg aagatctaca accattccta catctatatg 660

cctgccttct ccatgaaaac tggaaccgaa ccctccctga gagtgtacta caccctgtcc 720

gacgtgggcg caaaccagac cgtccttttc gccaacccca acttcctgcg ctccatcgga 780

aagttctgga agtccagagg cattcacgcg aaacgcttgt ccactggatt gttcttggtg 840

tccgccgctc tgggcctgtg cgaggaagtg gccatatacg gattctggcc tttctccgtc 900

aacatgcacg agcagcccat ctcccaccat tattacgaca atgtcctgcc tttctcggga 960

tttcacgcga tgcccgagga gttcttgcaa ctgtggtacc ttcacaagat cggtgccctg 1020

cggatgcagc tggacccttg cgaggacacc tcgctgcaac ccacctcgga gcagaaactc 1080

atttccgaag aggatctgaa cggggagcag aagctcatct ccgaggagga cctgaacgga 1140

gaacagaagc tgattagcga agaggacctg ggcagcggtg ccaccaattt ttctctgctc 1200

aagcaggccg gagatgtgga agagaacccg ggtcccatgg aggactccta caaagatcgg 1260

acttctctga tgaagggagc caaggacatc gccagggaag tgaagaagca aaccgtcaag 1320

aaggtcaacc aggccgtgga cagagcccag gacgagtaca cccagcggtc gtactcgcgg 1380

ttccaggatg aagaggatga cgacgactac taccctgccg gcgaaaccta taatggggaa 1440

gccaacgatg acgaaggctc cagcgaagcc actgaaggac acgacgagga cgacgaaatc 1500

tacgaaggag aataccaggg catcccttcg atgaatcagg ccaaagattc aattgtgtca 1560

gtgggacagc ctaagggcga cgagtacaag gaccggagag agctcgaaag cgagcggagg 1620

gccgacgaag aggaactggc acaacagtac gagctgatca tccaggagtg tgggcacggc 1680

cggttccagt gggcgctgtt cttcgtgctc ggaatggcac tgatggccga cggcgtggaa 1740

gtgttcgtgg tcggattcgt gctgccctcg gccgaaaccg acctctgcat tcccaactcc 1800

ggctcgggat ggctggggtc catcgtgtac ctgggaatga tggtcggcgc cttcttctgg 1860

ggtggcctgg cagacaaggt cggccggaag cagtccctct tgatctgcat gagcgtcaac 1920

ggatttttcg ccttcctgtc atcattcgtg caaggttacg ggttcttcct tttctgccgc 1980

ctgctgtccg gctttgggat cggcggggct attccgactg tgttctccta ctttgccgaa 2040

gtgctggctc gcgaaaaacg gggcgaacac ctttcctggc tgtgtatgtt ctggatgatc 2100

ggcggcatct acgcctcggc catggcctgg gctattatcc cgcattatgg gtggtccttc 2160

tcaatgggaa gcgcatacca gttccattcg tggcgggtgt tcgtgatcgt gtgcgccctc 2220

ccgtgtgtgt cctccgtggt ggctctgaca ttcatgccgg agtcacctcg gttcttgttg 2280

gaagtcggga agcacgacga agcctggatg attctgaagc tgatccacga cactaatatg 2340

cgggcccggg gacagcctga gaaagtgttc accgtcaaca agattaagac cccgaagcaa 2400

atcgatgaac tgattgaaat tgagtccgac accggaactt ggtaccgccg gtgcttcgtg 2460

cggattcgca ccgagctgta cggaatctgg ctcaccttca tgcgctgctt caactacccc 2520

gtgcgcgaca acaccatcaa gctgaccatc gtgtggttca ctctgtcttt cggctactat 2580

gggctgtcag tgtggttccc ggatgtcatc aagccgctcc aatccgatga atacgccctg 2640

ctgacccgca atgtggagag agacaaatac gccaacttca ccatcaattt caccatggaa 2700

aaccagattc acaccggaat ggagtacgac aatggacgat tcatcggagt gaagttcaag 2760

agcgtgacct tcaaggactc ggtgttcaag tcctgtacct tcgaggacgt gaccagcgtg 2820

aacacttatt ttaagaattg caccttcatc gatactgtgt tcgataacac cgacttcgag 2880

ccctataagt tcattgactc ggagttcaag aactgttcat tcttccacaa caagactggt 2940

tgccagatca ccttcgatga cgactacagc gcctactgga tctactttgt gaactttttg 3000

ggaactctcg cagtgcttcc tggcaacatt gtgtccgcac tcctgatgga tcggattggc 3060

aggctcacga tgcttggggg gtccatggtc ctctccggga tctcgtgctt cttcctgtgg 3120

ttcggcacct cggagtccat gatgatcgga atgttgtgcc tgtacaacgg tctgaccatc 3180

agcgcctgga acagcctcga cgtggtcacc gtcgagctgt atcctaccga ccggcgcgcg 3240

acaggcttcg gattcctgaa cgcactgtgc aaggcagccg cggtcctggg aaatctgatc 3300

tttggttcgc tggtgtccat cactaagagc atccctattc tgctcgcctc cacggtgctc 3360

gtgtgtggtg gcctggtcgg gctgtgcctg cccgacactc gcacccaagt gctcatggac 3420

tacaaggatg acgatgataa gggagactac aaggacgatg acgacaaggg ggattacaag 3480

gacgacgatg acaaaggaag cggcgccact aacttttccc tgctgaagca ggccggggac 3540

gtcgaagaaa accccgggcc aatgcgcaac attttcaagc ggaatcagga gcctatcgtg 3600

gccccggcca ccactaccgc cactatgcct attggacctg tcgacaactc cacggaatca 3660

ggcggcgccg gcgaatccca agaggacatg ttcgccaagc tgaaggagaa actgttcaac 3720

gaaatcaaca agattcccct cccgccgtgg gccctgatcg ctatcgctgt cgtcgccgga 3780

ctgctgctgc ttacttgctg cttctgcatt tgcaagaagt gttgttgcaa gaaaaagaaa 3840

aacaagaagg aaaaggggaa gggaatgaag aacgccatga atatgaagga catgaagggc 3900

ggacaggatg atgatgatgc tgaaactggg ctgactgagg gcgaaggaga gggcgaagag 3960

gagaaggaac ctgagaacct gggaaagctc caattctccc tggattacga cttccaagcc 4020

aaccagctga ctgtgggagt gttgcaagcc gccgagctgc cagccctgga catgggcggc 4080

acctccgacc cctatgtgaa ggtgttcttg ctgcctgaca agaagaagaa gtacgaaacc 4140

aaggtgcacc gcaagaccct gaaccccgct ttcaacgaaa ccttcacttt caaagtgccc 4200

taccaagagc tcgggggaaa gactctcgtg atggcgatct acgacttcga ccggttcagc 4260

aagcacgata tcatcgggga ggtcaaggtc ccgatgaaca ccgtggacct tggccaaccg 4320

attgaagaat ggcgcgatct ccagggtggc gaaaaggagg agcccgagaa actgggtgac 4380

atctgtacat cactgcgcta cgtgccgacc gccgggaagc tcactgtctg catcctggag 4440

gccaagaacc tgaagaaaat ggacgtgggc gggctctccg acccttacgt gaagatccac 4500

ctgatgcaga acggaaagcg gctgaagaag aagaaaacca ctgtgaagaa aaagactctg 4560

aacccctact tcaacgagtc gttctccttc gaaatcccgt ttgagcaaat ccagaaggtc 4620

caagtggtcg tgactgtgct tgactacgac aagctcggaa agaacgaggc cattggcaaa 4680

atcttcgtgg gatcgaacgc aactggcacc gagctgagac actggtctga catgctcgcc 4740

aacccaaggc ggccgattgc tcagtggcac tccttgaaac ctgaggaaga agtggatgcc 4800

cttcttggaa agaacaagat gtacccctac gacgtccctg attacgcggg atacccgtac 4860

gatgtgcctg actatgccgg ctacccgtac gatgtgccag actacgctgg ctccggagcc 4920

acgaactttt cgctgctgaa acaggccggc gacgtggaag aaaatcccgg tccaatgatt 4980

gaacaagatg gattgcacgc tggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 5040

gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 5100

gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 5160

gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 5220

gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 5280

ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 5340

ctgcatacgc ttgatccggc tacatgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 5400

cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaggaacat 5460

caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 5520

gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 5580

ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 5640

ttggctaccc gtgatattgc tgaggaactt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 5700

ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 5760

ttcttctgat ag 5772

<210> 5

<211> 5772

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 5

atgtccccat gtggacgagc gcgcagacag acctcaagag gagcgatggc cgtgctggcc 60

tggaagttcc cgaggactcg cctgcccatg ggagcctctg ctctgtgtgt ggtcgtgctg 120

tgttggctgt acatcttccc ggtgtaccgg ctgcctaacg aaaaggaaat tgtgcagggc 180

gtgctccagc aggggaccgc ttggcggcgc aaccagaccg ctgcgagggc ttttcggaag 240

cagatggaag attgttgcga ccccgcccat cttttcgcga tgaccaagat gaacagcccg 300

atgggaaagt ccatgtggta cgacggagag ttcctgtatt ccttcaccat tgacaacagc 360

acttactcac tgttcccgca agccaccccc ttccaactgc cgcttaagaa gtgcgccgtc 420

gtggggaacg gcggcatcct caagaagtcc ggatgcgggc gccagattga tgaagccaac 480

ttcgtgatgc ggtgcaatct cccgccactc tcgtccgagt acaccaagga cgtggggtca 540

aagtcgcagc tcgtcaccgc caacccttcg atcatcagac aacggttcca gaaccttctg 600

tggagccgga aaacatttgt ggataacatg aagatctaca accattccta catctatatg 660

cctgccttct ccatgaaaac tggaaccgaa ccctccctga gagtgtacta caccctgtcc 720

gacgtgggcg caaaccagac cgtccttttc gccaacccca acttcctgcg ctccatcgga 780

aagttctgga agtccagagg cattcacgcg aaacgcttgt ccactggatt gttcttggtg 840

tccgccgctc tgggcctgtg cgaggaagtg gccatatacg gattctggcc tttctccgtc 900

aacatgcacg agcagcccat ctcccaccat tattacgaca atgtcctgcc tttctcggga 960

tttcacgcga tgcccgagga gttcttgcaa ctgtggtacc ttcacaagat cggtgccctg 1020

cggatgcagc tggacccttg cgaggacacc tcgctgcaac ccacctcgga gcagaaactc 1080

atttccgaag aggatctgaa cggggagcag aagctcatct ccgaggagga cctgaacgga 1140

gaacagaagc tgattagcga agaggacctg ggcagcggtg ccaccaattt ttctctgctc 1200

aagcaggccg gagatgtgga agagaacccg ggtcccatgg aggactccta caaagatcgg 1260

acttctctga tgaagggagc caaggacatc gccagggaag tgaagaagca aaccgtcaag 1320

aaggtcaacc aggccgtgga cagagcccag gacgagtaca cccagcggtc gtactcgcgg 1380

ttccaggatg aagaggatga cgacgactac taccctgccg gcgaaaccta taatggggaa 1440

gccaacgatg acgaaggctc cagcgaagcc actgaaggac acgacgagga cgacgaaatc 1500

tacgaaggag aataccaggg catcccttcg atgaatcagg ccaaagattc aattgtgtca 1560

gtgggacagc ctaagggcga cgagtacaag gaccggagag agctcgaaag cgagcggagg 1620

gccgacgaag aggaactggc acaacagtac gagctgatca tccaggagtg tgggcacggc 1680

cggttccagt gggcgctgtt cttcgtgctc ggaatggcac tgatggccga cggcgtggaa 1740

gtgttcgtgg tcggattcgt gctgccctcg gccgaaaccg acctctgcat tcccaactcc 1800

ggctcgggat ggctggggtc catcgtgtac ctgggaatga tggtcggcgc cttcttctgg 1860

ggtggcctgg cagacaaggt cggccggaag cagtccctct tgatctgcat gagcgtcaac 1920

ggatttttcg ccttcctgtc atcattcgtg caaggttacg ggttcttcct tttctgccgc 1980

ctgctgtccg gctttgggat cggcggggct attccgactg tgttctccta ctttgccgaa 2040

gtgctggctc gcgaaaaacg gggcgaacac ctttcctggc tgtgtatgtt ctggatgatc 2100

ggcggcatct acgcctcggc catggcctgg gctattatcc cgcattatgg gtggtccttc 2160

tcaatgggaa gcgcatacca gttccattcg tggcgggtgt tcgtgatcgt gtgcgccctc 2220

ccgtgtgtgt cctccgtggt ggctctgaca ttcatgccgg agtcacctcg gttcttgttg 2280

gaagtcggga agcacgacga agcctggatg attctgaagc tgatccacga cactaatatg 2340

cgggcccggg gacagcctga gaaagtgttc accgtcaaca agattaagac cccgaagcaa 2400

atcgatgaac tgattgaaat tgagtccgac accggaactt ggtaccgccg gtgcttcgtg 2460

cggattcgca ccgagctgta cggaatctgg ctcaccttca tgcgctgctt caactacccc 2520

gtgcgcgaca acaccatcaa gctgaccatc gtgtggttca ctctgtcttt cggctactat 2580

gggctgtcag tgtggttccc ggatgtcatc aagccgctcc aatccgatga atacgccctg 2640

ctgacccgca atgtggagag agacaaatac gccaacttca ccatcaattt caccatggaa 2700

aaccagattc acaccggaat ggagtacgac aatggacgat tcatcggagt gaagttcaag 2760

agcgtgacct tcaaggactc ggtgttcaag tcctgtacct tcgaggacgt gaccagcgtg 2820

aacacttatt ttaagaattg caccttcatc gatactgtgt tcgataacac cgacttcgag 2880

ccctataagt tcattgactc ggagttcaag aactgttcat tcttccacaa caagactggt 2940

tgccagatca ccttcgatga cgactacagc gcctactgga tctactttgt gaactttttg 3000

ggaactctcg cagtgcttcc tggcaacatt gtgtccgcac tcctgatgga tcggattggc 3060

aggctcacga tgcttggggg gtccatggtc ctctccggga tctcgtgctt cttcctgtgg 3120

ttcggcacct cggagtccat gatgatcgga atgttgtgcc tgtacaacgg tctgaccatc 3180

agcgcctgga acagcctcga cgtggtcacc gtcgagctgt atcctaccga ccggcgcgcg 3240

acaggcttcg gattcctgaa cgcactgtgc aaggcagccg cggtcctggg aaatctgatc 3300

tttggttcgc tggtgtccat cactaagagc atccctattc tgctcgcctc cacggtgctc 3360

gtgtgtggtg gcctggtcgg gctgtgcctg cccgacactc gcacccaagt gctcatggac 3420

tacaaggatg acgatgataa gggagactac aaggacgatg acgacaaggg ggattacaag 3480

gacgacgatg acaaaggaag cggcgccact aacttttccc tgctgaagca ggccggggac 3540

gtcgaagaaa accccgggcc aatgcgcaac attttcaagc ggaatcagga gcctatcgtg 3600

gccccggcca ccactaccgc cactatgcct attggacctg tcgacaactc cacggaatca 3660

ggcggcgccg gcgaatccca agaggacatg ttcgccaagc tgaaggagaa actgttcaac 3720

gaaatcaaca agattcccct cccgccgtgg gccctgatcg ctatcgctgt cgtcgccgga 3780

ctgctgctgc ttacttgctg cttctgcatt tgcaagaagt gttgttgcaa gaaaaagaaa 3840

aacaagaagg aaaaggggaa gggaatgaag aacgccatga atatgaagga catgaagggc 3900

ggacaggatg atgatgatgc tgaaactggg ctgactgagg gcgaaggaga gggcgaagag 3960

gagaaggaac ctgagaacct gggaaagctc caattctccc tggattacga cttccaagcc 4020

aaccagctga ctgtgggagt gttgcaagcc gccgagctgc cagccctgga catgggcggc 4080

acctccgacc cctatgtgaa ggtgttcttg ctgcctgaca agaagaagaa gtacgaaacc 4140

aaggtgcacc gcaagaccct gaaccccgct ttcaacgaaa ccttcacttt caaagtgccc 4200

taccaagagc tcgggggaaa gactctcgtg atggcgatct acgacttcga ccggttcagc 4260

aagcacgata tcatcgggga ggtcaaggtc ccgatgaaca ccgtggacct tggccaaccg 4320

attgaagaat ggcgcgatct ccagggtggc gaaaaggagg agcccgagaa actgggtgac 4380

atctgtacat cactgcgcta cgtgccgacc gccgggaagc tcactgtctg catcctggag 4440

gccaagaacc tgaagaaaat ggacgtgggc gggctctccg acccttacgt gaagatccac 4500

ctgatgcaga acggaaagcg gctgaagaag aagaaaacca ctgtgaagaa aaagactctg 4560

aacccctact tcaacgagtc gttctccttc gaaatcccgt ttgagcaaat ccagaaggtc 4620

caagtggtcg tgactgtgct tgactacgac aagctcggaa agaacgaggc cattggcaaa 4680

atcttcgtgg gatcgaacgc aactggcacc gagctgagac actggtctga catgctcgcc 4740

aacccaaggc ggccgattgc tcagtggcac tccttgaaac ctgaggaaga agtggatgcc 4800

cttcttggaa agaacaagat gtacccctac gacgtccctg attacgcggg atacccgtac 4860

gatgtgcctg actatgccgg ctacccgtac gatgtgccag actacgctgg ctccggagcc 4920

acgaactttt cgctgctgaa acaggccggc gacgtggaag aaaatcccgg tccaatgatt 4980

gaacaagatg gattgcacgc tggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 5040

gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 5100

gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 5160

gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 5220

gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 5280

ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 5340

ctgcatacgc ttgatccggc tacatgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 5400

cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaggaacat 5460

caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 5520

gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 5580

ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 5640

ttggctaccc gtgatattgc tgaggaactt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 5700

ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 5760

ttcttctgat ag 5772

<210> 6

<211> 356

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 6

Met Ser Pro Cys Gly Arg Ala Arg Arg Gln Thr Ser Arg Gly Ala Met

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Trp Lys Phe Pro Arg Thr Arg Leu Pro Met Gly Ala

20 25 30

Ser Ala Leu Cys Val Val Val Leu Cys Trp Leu Tyr Ile Phe Pro Val

35 40 45

Tyr Arg Leu Pro Asn Glu Lys Glu Ile Val Gln Gly Val Leu Gln Gln

50 55 60

Gly Thr Ala Trp Arg Arg Asn Gln Thr Ala Ala Arg Ala Phe Arg Lys

65 70 75 80

Gln Met Glu Asp Cys Cys Asp Pro Ala His Leu Phe Ala Met Thr Lys

85 90 95

Met Asn Ser Pro Met Gly Lys Ser Met Trp Tyr Asp Gly Glu Phe Leu

100 105 110

Tyr Ser Phe Thr Ile Asp Asn Ser Thr Tyr Ser Leu Phe Pro Gln Ala

115 120 125

Thr Pro Phe Gln Leu Pro Leu Lys Lys Cys Ala Val Val Gly Asn Gly

130 135 140

Gly Ile Leu Lys Lys Ser Gly Cys Gly Arg Gln Ile Asp Glu Ala Asn

145 150 155 160

Phe Val Met Arg Cys Asn Leu Pro Pro Leu Ser Ser Glu Tyr Thr Lys

165 170 175

Asp Val Gly Ser Lys Ser Gln Leu Val Thr Ala Asn Pro Ser Ile Ile

180 185 190

Arg Gln Arg Phe Gln Asn Leu Leu Trp Ser Arg Lys Thr Phe Val Asp

195 200 205

Asn Met Lys Ile Tyr Asn His Ser Tyr Ile Tyr Met Pro Ala Phe Ser

210 215 220

Met Lys Thr Gly Thr Glu Pro Ser Leu Arg Val Tyr Tyr Thr Leu Ser

225 230 235 240

Asp Val Gly Ala Asn Gln Thr Val Leu Phe Ala Asn Pro Asn Phe Leu

245 250 255

Arg Ser Ile Gly Lys Phe Trp Lys Ser Arg Gly Ile His Ala Lys Arg

260 265 270

Leu Ser Thr Gly Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Leu Gly Leu Cys Glu

275 280 285

Glu Val Ala Ile Tyr Gly Phe Trp Pro Phe Ser Val Asn Met His Glu

290 295 300

Gln Pro Ile Ser His His Tyr Tyr Asp Asn Val Leu Pro Phe Ser Gly

305 310 315 320

Phe His Ala Met Pro Glu Glu Phe Leu Gln Leu Trp Tyr Leu His Lys

325 330 335

Ile Gly Ala Leu Arg Met Gln Leu Asp Pro Cys Glu Asp Thr Ser Leu

340 345 350

Gln Pro Thr Ser

355

<210> 7

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 7

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 742

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 8

Met Glu Glu Gly Phe Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ile Arg Gly Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys Lys His Ala Ala Lys Lys Val Val Lys

20 25 30

Gly Leu Asp Arg Val Gln Asp Glu Tyr Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

Phe Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Phe Pro Ala Pro Ser Asp Gly

50 55 60

Tyr Tyr Arg Gly Glu Gly Thr Gln Asp Glu Glu Glu Gly Gly Ala Ser

65 70 75 80

Ser Asp Ala Thr Glu Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

85 90 95

Glu Tyr Gln Gly Ile Pro Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Gly Glu Arg

100 105 110

Met Ala Asp Gly Ala Pro Leu Ala Gly Val Arg Gly Gly Leu Ser Asp

115 120 125

Gly Glu Gly Pro Pro Gly Gly Arg Gly Glu Ala Gln Arg Arg Lys Glu

130 135 140

Arg Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Ala Ile Leu Arg Glu Cys Gly

145 150 155 160

His Gly Arg Phe Gln Trp Thr Leu Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu Pro Ser

180 185 190

Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Asp Ser Asn Lys Gly Met Leu Gly

195 200 205

Leu Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Leu Trp Gly Gly

210 215 220

Leu Ala Asp Arg Leu Gly Arg Arg Gln Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ser

225 230 235 240

Val Asn Ser Val Phe Ala Phe Phe Ser Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly

245 250 255

Thr Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser

260 265 270

Ile Pro Ile Val Phe Ser Tyr Phe Ser Glu Phe Leu Ala Gln Glu Lys

275 280 285

Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile Gly Gly

290 295 300

Val Tyr Ala Ala Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp

305 310 315 320

Ser Phe Gln Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg Val Phe

325 330 335

Val Leu Val Cys Ala Phe Pro Ser Val Phe Ala Ile Gly Ala Leu Thr

340 345 350

Thr Gln Pro Glu Ser Pro Arg Phe Phe Leu Glu Asn Gly Lys His Asp

355 360 365

Glu Ala Trp Met Val Leu Lys Gln Val His Asp Thr Asn Met Arg Ala

370 375 380

Lys Gly His Pro Glu Arg Val Phe Ser Val Thr His Ile Lys Thr Ile

385 390 395 400

His Gln Glu Asp Glu Leu Ile Glu Ile Gln Ser Asp Thr Gly Thr Trp

405 410 415

Tyr Gln Arg Trp Gly Val Arg Ala Leu Ser Leu Gly Gly Gln Val Trp

420 425 430

Gly Asn Phe Leu Ser Cys Phe Gly Pro Glu Tyr Arg Arg Ile Thr Leu

435 440 445

Met Met Met Gly Val Trp Phe Thr Met Ser Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu

450 455 460

Thr Val Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg His Leu Gln Ala Val Asp Tyr

465 470 475 480

Ala Ser Arg Thr Lys Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr

485 490 495

Phe Asn Phe Thr Leu Glu Asn Gln Ile His Arg Gly Gly Gln Tyr Phe

500 505 510

Asn Asp Lys Phe Ile Gly Leu Arg Leu Lys Ser Val Ser Phe Glu Asp

515 520 525

Ser Leu Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Ser Asn Thr

530 535 540

Phe Phe Arg Asn Cys Thr Phe Ile Asn Thr Val Phe Tyr Asn Thr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Glu Tyr Lys Phe Val Asn Ser Arg Leu Ile Asn Ser Thr Phe

565 570 575

Leu His Asn Lys Glu Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu

580 585 590

Gly Ala Tyr Met Val Tyr Phe Val Ser Phe Leu Gly Thr Leu Ala Val

595 600 605

Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Lys Ile Gly Arg

610 615 620

Leu Arg Met Leu Ala Gly Ser Ser Val Met Ser Cys Val Ser Cys Phe

625 630 635 640

Phe Leu Ser Phe Gly Asn Ser Glu Ser Ala Met Ile Ala Leu Leu Cys

645 650 655

Leu Phe Gly Gly Val Ser Ile Ala Ser Trp Asn Ala Leu Asp Val Leu

660 665 670

Thr Val Glu Leu Tyr Pro Ser Asp Lys Arg Thr Thr Ala Phe Gly Phe

675 680 685

Leu Asn Ala Leu Cys Lys Leu Ala Ala Val Leu Gly Ile Ser Ile Phe

690 695 700

Thr Ser Phe Val Gly Ile Thr Lys Ala Ala Pro Ile Leu Phe Ala Ser

705 710 715 720

Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Lys Leu Pro Glu Thr

725 730 735

Arg Gly Gln Val Leu Gln

740

<210> 9

<211> 727

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 9

Met Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Arg Thr Ser Leu Met Lys Gly Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Ala Arg Glu Val Lys Lys Gln Thr Val Lys Lys Val Asn Gln

20 25 30

Ala Val Asp Arg Ala Gln Asp Glu Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

Phe Gln Asp Glu Glu Asp Asp Asp Asp Tyr Tyr Pro Ala Gly Glu Thr

50 55 60

Tyr Asn Gly Glu Ala Asn Asp Asp Glu Gly Ser Ser Glu Ala Thr Glu

65 70 75 80

Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Gly Ile

85 90 95

Pro Ser Met Asn Gln Ala Lys Asp Ser Ile Val Ser Val Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Gly Asp Glu Tyr Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Ser Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Asp Glu Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Leu Ile Ile Gln Glu

130 135 140

Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Ala Leu Phe Phe Val Leu Gly Met

145 150 155 160

Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu

165 170 175

Pro Ser Ala Glu Thr Asp Leu Cys Ile Pro Asn Ser Gly Ser Gly Trp

180 185 190

Leu Gly Ser Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Phe Trp

195 200 205

Gly Gly Leu Ala Asp Lys Val Gly Arg Lys Gln Ser Leu Leu Ile Cys

210 215 220

Met Ser Val Asn Gly Phe Phe Ala Phe Leu Ser Ser Phe Val Gln Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Phe Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Phe Gly Ile Gly

245 250 255

Gly Ala Ile Pro Thr Val Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Val Leu Ala Arg

260 265 270

Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile

275 280 285

Gly Gly Ile Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr

290 295 300

Gly Trp Ser Phe Ser Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg

305 310 315 320

Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Cys Val Ser Ser Val Val Ala

325 330 335

Leu Thr Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Glu Val Gly Lys

340 345 350

His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Leu Ile His Asp Thr Asn Met

355 360 365

Arg Ala Arg Gly Gln Pro Glu Lys Val Phe Thr Val Asn Lys Ile Lys

370 375 380

Thr Pro Lys Gln Ile Asp Glu Leu Ile Glu Ile Glu Ser Asp Thr Gly

385 390 395 400

Thr Trp Tyr Arg Arg Cys Phe Val Arg Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Gly

405 410 415

Ile Trp Leu Thr Phe Met Arg Cys Phe Asn Tyr Pro Val Arg Asp Asn

420 425 430

Thr Ile Lys Leu Thr Ile Val Trp Phe Thr Leu Ser Phe Gly Tyr Tyr

435 440 445

Gly Leu Ser Val Trp Phe Pro Asp Val Ile Lys Pro Leu Gln Ser Asp

450 455 460

Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Arg Asn Val Glu Arg Asp Lys Tyr Ala Asn

465 470 475 480

Phe Thr Ile Asn Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile His Thr Gly Met Glu

485 490 495

Tyr Asp Asn Gly Arg Phe Ile Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe

500 505 510

Lys Asp Ser Val Phe Lys Ser Cys Thr Phe Glu Asp Val Thr Ser Val

515 520 525

Asn Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Phe Ile Asp Thr Val Phe Asp Asn

530 535 540

Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Lys Asn Cys

545 550 555 560

Ser Phe Phe His Asn Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp

565 570 575

Tyr Ser Ala Tyr Trp Ile Tyr Phe Val Asn Phe Leu Gly Thr Leu Ala

580 585 590

Val Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Arg Ile Gly

595 600 605

Arg Leu Thr Met Leu Gly Gly Ser Met Val Leu Ser Gly Ile Ser Cys

610 615 620

Phe Phe Leu Trp Phe Gly Thr Ser Glu Ser Met Met Ile Gly Met Leu

625 630 635 640

Cys Leu Tyr Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ala Trp Asn Ser Leu Asp Val

645 650 655

Val Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asp Arg Arg Ala Thr Gly Phe Gly

660 665 670

Phe Leu Asn Ala Leu Cys Lys Ala Ala Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile

675 680 685

Phe Gly Ser Leu Val Ser Ile Thr Lys Ser Ile Pro Ile Leu Leu Ala

690 695 700

Ser Thr Val Leu Val Cys Gly Gly Leu Val Gly Leu Cys Leu Pro Asp

705 710 715 720

Thr Arg Thr Gln Val Leu Met

725

<210> 10

<211> 683

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 10

Met Asp Asp Tyr Lys Tyr Gln Asp Asn Tyr Gly Gly Tyr Ala Pro Ser

1 5 10 15

Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Asn Glu Ser Asn Pro Glu Glu Asp Ala Gln

20 25 30

Ser Asp Val Thr Glu Gly His Asp Glu Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Ile Pro His Pro Asp Asp Val Lys Ala Lys Gln Ala

50 55 60

Lys Met Ala Pro Ser Arg Met Asp Ser Leu Arg Gly Gln Thr Asp Leu

65 70 75 80

Met Ala Glu Arg Leu Glu Asp Glu Glu Gln Leu Ala His Gln Tyr Glu

85 90 95

Thr Ile Met Asp Glu Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Ile Leu Phe

100 105 110

Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val

115 120 125

Val Ser Phe Ala Leu Pro Ser Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Ser

130 135 140

Ser Lys Lys Gly Met Leu Gly Met Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Ala

145 150 155 160

Gly Ala Phe Ile Leu Gly Gly Leu Ala Asp Lys Leu Gly Arg Lys Arg

165 170 175

Val Leu Ser Met Ser Leu Ala Val Asn Ala Ser Phe Ala Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly Ala Phe Leu Phe Cys Arg Leu Ile Ser

195 200 205

Gly Ile Gly Ile Gly Gly Ala Leu Pro Ile Val Phe Ala Tyr Phe Ser

210 215 220

Glu Phe Leu Ser Arg Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Gly

225 230 235 240

Ile Phe Trp Met Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ser

245 250 255

Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp Gly Phe Ser Met Gly Thr Asn Tyr His

260 265 270

Phe His Ser Trp Arg Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Cys Thr

275 280 285

Val Ser Met Val Ala Leu Lys Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Met Gly Lys His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Gln Val

305 310 315 320

His Asp Thr Asn Met Arg Ala Lys Gly Thr Pro Glu Lys Val Phe Thr

325 330 335

Val Ser Asn Ile Lys Thr Pro Lys Gln Met Asp Glu Phe Ile Glu Ile

340 345 350

Gln Ser Ser Thr Gly Thr Trp Tyr Gln Arg Trp Leu Val Arg Phe Lys

355 360 365

Thr Ile Phe Lys Gln Val Trp Asp Asn Ala Leu Tyr Cys Val Met Gly

370 375 380

Pro Tyr Arg Met Asn Thr Leu Ile Leu Ala Val Val Trp Phe Ala Met

385 390 395 400

Ala Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Thr Val Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg

405 410 415

Tyr Phe Gln Asp Glu Glu Tyr Lys Ser Lys Met Lys Val Phe Phe Gly

420 425 430

Glu His Val Tyr Gly Ala Thr Ile Asn Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile

435 440 445

His Gln His Gly Lys Leu Val Asn Asp Lys Phe Thr Arg Met Tyr Phe

450 455 460

Lys His Val Leu Phe Glu Asp Thr Phe Phe Asp Glu Cys Tyr Phe Glu

465 470 475 480

Asp Val Thr Ser Thr Asp Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ile Glu Ser

485 490 495

Thr Ile Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Tyr Glu His Lys Phe Ile Asn Cys

500 505 510

Arg Phe Ile Asn Ser Thr Phe Leu Glu Gln Lys Glu Gly Cys His Met

515 520 525

Asp Leu Glu Gln Asp Asn Asp Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Phe Leu

530 535 540

Gly Ser Leu Ser Val Leu Pro Gly Asn Ile Ile Ser Ala Leu Leu Met

545 550 555 560

Asp Arg Ile Gly Arg Leu Lys Met Ile Gly Gly Ser Met Leu Ile Ser

565 570 575

Ala Val Cys Cys Phe Phe Leu Phe Phe Gly Asn Ser Glu Ser Ala Met

580 585 590

Ile Gly Trp Gln Cys Leu Phe Cys Gly Thr Ser Ile Ala Ala Trp Asn

595 600 605

Ala Leu Asp Val Ile Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asn Gln Arg Ala

610 615 620

Thr Ala Phe Gly Ile Leu Asn Gly Leu Cys Lys Phe Gly Ala Ile Leu

625 630 635 640

Gly Asn Thr Ile Phe Ala Ser Phe Val Gly Ile Thr Lys Val Val Pro

645 650 655

Ile Leu Leu Ala Ala Ala Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu Ile Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Pro Glu Thr Arg Glu Gln Val Leu Met

675 680

<210> 11

<211> 128

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 11

Phe Pro Asp Met Ile Arg His Leu Gln Ala Val Asp Tyr Ala Ser Arg

1 5 10 15

Thr Lys Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr Phe Asn Phe

20 25 30

Thr Leu Glu Asn Gln Ile His Arg Gly Gly Gln Tyr Phe Asn Asp Lys

35 40 45

Phe Ile Gly Leu Arg Leu Lys Ser Val Ser Phe Glu Asp Ser Leu Phe

50 55 60

Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Ser Asn Thr Phe Phe Arg

65 70 75 80

Asn Cys Thr Phe Ile Asn Thr Val Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Glu

85 90 95

Tyr Lys Phe Val Asn Ser Arg Leu Ile Asn Ser Thr Phe Leu His Asn

100 105 110

Lys Glu Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu Gly Ala Tyr

115 120 125

<210> 12

<211> 130

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 12

Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg Tyr Phe Gln Asp Glu Glu Tyr Lys Ser

1 5 10 15

Lys Met Lys Val Phe Phe Gly Glu His Val Tyr Gly Ala Thr Ile Asn

20 25 30

Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile His Gln His Gly Lys Leu Val Asn Asp

35 40 45

Lys Phe Thr Arg Met Tyr Phe Lys His Val Leu Phe Glu Asp Thr Phe

50 55 60

Phe Asp Glu Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Thr Asp Thr Tyr Phe

65 70 75 80

Lys Asn Cys Thr Ile Glu Ser Thr Ile Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Tyr

85 90 95

Glu His Lys Phe Ile Asn Cys Arg Phe Ile Asn Ser Thr Phe Leu Glu

100 105 110

Gln Lys Glu Gly Cys His Met Asp Leu Glu Gln Asp Asn Asp Phe Leu

115 120 125

Ile Tyr

130

<210> 13

<211> 128

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 13

Trp Phe Pro Asp Val Ile Lys Pro Leu Gln Ser Asp Glu Tyr Ala Leu

1 5 10 15

Leu Thr Arg Asn Val Glu Arg Asp Lys Tyr Ala Asn Phe Thr Ile Asn

20 25 30

Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile His Thr Gly Met Glu Tyr Asp Asn Gly

35 40 45

Arg Phe Ile Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe Lys Asp Ser Val

50 55 60

Phe Lys Ser Cys Thr Phe Glu Asp Val Thr Ser Val Asn Thr Tyr Phe

65 70 75 80

Lys Asn Cys Thr Phe Ile Asp Thr Val Phe Asp Asn Thr Asp Phe Glu

85 90 95

Pro Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Lys Asn Cys Ser Phe Phe His

100 105 110

Asn Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp Tyr Ser Ala Tyr

115 120 125

<210> 14

<211> 422

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 14

Met Val Ser Glu Ser His His Glu Ala Leu Ala Ala Pro Pro Val Thr

1 5 10 15

Thr Val Ala Thr Val Leu Pro Ser Asn Ala Thr Glu Pro Ala Ser Pro

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met

35 40 45

Asn Glu Leu His Lys Ile Pro Leu Pro Pro Trp Ala Leu Ile Ala Ile

50 55 60

Ala Ile Val Ala Val Leu Leu Val Leu Thr Cys Cys Phe Cys Ile Cys

65 70 75 80

Lys Lys Cys Leu Phe Lys Lys Lys Asn Lys Lys Lys Gly Lys Glu Lys

85 90 95

Gly Gly Lys Asn Ala Ile Asn Met Lys Asp Val Lys Asp Leu Gly Lys

100 105 110

Thr Met Lys Asp Gln Ala Leu Lys Asp Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu

115 120 125

Thr Asp Gly Glu Glu Lys Glu Glu Pro Lys Glu Glu Glu Lys Leu Gly

130 135 140

Lys Leu Gln Tyr Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Gln Asn Asn Gln Leu Leu

145 150 155 160

Val Gly Ile Ile Gln Ala Ala Glu Leu Pro Ala Leu Asp Met Gly Gly

165 170 175

Thr Ser Asp Pro Tyr Val Lys Val Phe Leu Leu Pro Asp Lys Lys Lys

180 185 190

Lys Phe Glu Thr Lys Val His Arg Lys Thr Leu Asn Pro Val Phe Asn

195 200 205

Glu Gln Phe Thr Phe Lys Val Pro Tyr Ser Glu Leu Gly Gly Lys Thr

210 215 220

Leu Val Met Ala Val Tyr Asp Phe Asp Arg Phe Ser Lys His Asp Ile

225 230 235 240

Ile Gly Glu Phe Lys Val Pro Met Asn Thr Val Asp Phe Gly His Val

245 250 255

Thr Glu Glu Trp Arg Asp Leu Gln Ser Ala Glu Lys Glu Glu Gln Glu

260 265 270

Lys Leu Gly Asp Ile Cys Phe Ser Leu Arg Tyr Val Pro Thr Ala Gly

275 280 285

Lys Leu Thr Val Val Ile Leu Glu Ala Lys Asn Leu Lys Lys Met Asp

290 295 300

Val Gly Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Ile His Leu Met Gln Asn

305 310 315 320

Gly Lys Arg Leu Lys Lys Lys Lys Thr Thr Ile Lys Lys Asn Thr Leu

325 330 335

Asn Pro Tyr Tyr Asn Glu Ser Phe Ser Phe Glu Val Pro Phe Glu Gln

340 345 350

Ile Gln Lys Val Gln Val Val Val Thr Val Leu Asp Tyr Asp Lys Ile

355 360 365

Gly Lys Asn Asp Ala Ile Gly Lys Val Phe Val Gly Tyr Asn Ser Thr

370 375 380

Gly Ala Glu Leu Arg His Trp Ser Asp Met Leu Ala Asn Pro Arg Arg

385 390 395 400

Pro Ile Ala Gln Trp His Thr Leu Gln Val Glu Glu Glu Val Asp Ala

405 410 415

Met Leu Ala Val Lys Lys

420

<210> 15

<211> 419

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 15

Met Arg Asn Ile Phe Lys Arg Asn Gln Glu Pro Ile Val Ala Pro Ala

1 5 10 15

Thr Thr Thr Ala Thr Met Pro Ile Gly Pro Val Asp Asn Ser Thr Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Ala Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Glu Lys Leu Phe Asn Glu Ile Asn Lys Ile Pro Leu Pro Pro Trp Ala

50 55 60

Leu Ile Ala Ile Ala Val Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Thr Cys Cys

65 70 75 80

Phe Cys Ile Cys Lys Lys Cys Cys Cys Lys Lys Lys Lys Asn Lys Lys

85 90 95

Glu Lys Gly Lys Gly Met Lys Asn Ala Met Asn Met Lys Asp Met Lys

100 105 110

Gly Gly Gln Asp Asp Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu Thr Glu Gly Glu

115 120 125

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Lys Glu Pro Glu Asn Leu Gly Lys Leu Gln

130 135 140

Phe Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Gln Ala Asn Gln Leu Thr Val Gly Val

145 150 155 160

Leu Gln Ala Ala Glu Leu Pro Ala Leu Asp Met Gly Gly Thr Ser Asp

165 170 175

Pro Tyr Val Lys Val Phe Leu Leu Pro Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Glu

180 185 190

Thr Lys Val His Arg Lys Thr Leu Asn Pro Ala Phe Asn Glu Thr Phe

195 200 205

Thr Phe Lys Val Pro Tyr Gln Glu Leu Gly Gly Lys Thr Leu Val Met

210 215 220

Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Arg Phe Ser Lys His Asp Ile Ile Gly Glu

225 230 235 240

Val Lys Val Pro Met Asn Thr Val Asp Leu Gly Gln Pro Ile Glu Glu

245 250 255

Trp Arg Asp Leu Gln Gly Gly Glu Lys Glu Glu Pro Glu Lys Leu Gly

260 265 270

Asp Ile Cys Thr Ser Leu Arg Tyr Val Pro Thr Ala Gly Lys Leu Thr

275 280 285

Val Cys Ile Leu Glu Ala Lys Asn Leu Lys Lys Met Asp Val Gly Gly

290 295 300

Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Ile His Leu Met Gln Asn Gly Lys Arg

305 310 315 320

Leu Lys Lys Lys Lys Thr Thr Val Lys Lys Lys Thr Leu Asn Pro Tyr

325 330 335

Phe Asn Glu Ser Phe Ser Phe Glu Ile Pro Phe Glu Gln Ile Gln Lys

340 345 350

Val Gln Val Val Val Thr Val Leu Asp Tyr Asp Lys Leu Gly Lys Asn

355 360 365

Glu Ala Ile Gly Lys Ile Phe Val Gly Ser Asn Ala Thr Gly Thr Glu

370 375 380

Leu Arg His Trp Ser Asp Met Leu Ala Asn Pro Arg Arg Pro Ile Ala

385 390 395 400

Gln Trp His Ser Leu Lys Pro Glu Glu Glu Val Asp Ala Leu Leu Gly

405 410 415

Lys Asn Lys

<210> 16

<211> 232

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 16

Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr

115 120 125

Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala

165 170 175

Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly

180 185 190

Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Ser Thr

210 215 220

Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230

<210> 17

<211> 248

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 17

Met Ala Ser Leu Pro Ala Thr His Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile

1 5 10 15

Asn Gly Val Asp Phe Asp Met Val Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn

20 25 30

Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Leu Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln

35 40 45

Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val Pro His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln

50 55 60

Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly Met Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val

65 70 75 80

Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val His Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly

85 90 95

Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile

100 105 110

Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys Gly Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro

115 120 125

Val Met Thr Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys

130 135 140

Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr Ile Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr

145 150 155 160

Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr

165 170 175

Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala Ala Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met

180 185 190

Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu Leu Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn

195 200 205

Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala Phe Thr Gly Phe Glu Asp Phe Val Gly

210 215 220

Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln

225 230 235 240

Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln

245

<210> 18

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 18

Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val

1 5 10 15

Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr

20 25 30

Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro

35 40 45

Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser Trp Gly Val Gln Cys

50 55 60

Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser

65 70 75 80

Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp

85 90 95

Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr

100 105 110

Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly

115 120 125

Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Phe Ser Asp Asn Val

130 135 140

Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys

145 150 155 160

Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr

165 170 175

Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

180 185 190

His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

195 200 205

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Leu

210 215 220

<210> 19

<211> 206

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 19

Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg

1 5 10 15

Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met

20 25 30

Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val

35 40 45

Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met

50 55 60

Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp

65 70 75 80

Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys

85 90 95

Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val

100 105 110

Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala

115 120 125

Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn

130 135 140

Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu

145 150 155 160

Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg

165 170 175

Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile

180 185 190

Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly

195 200 205

<210> 20

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 20

Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val

1 5 10 15

Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser

20 25 30

Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe

35 40 45

Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala

50 55 60

Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val

65 70 75 80

Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu

85 90 95

Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys

100 105 110

Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro

115 120 125

Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu

145 150 155 160

Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala

165 170 175

Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys

180 185 190

Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp

195 200 205

Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala

210 215 220

Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe

225 230 235 240

Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe

245 250 255

Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe

260

<210> 21

<211> 199

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 21

Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val

1 5 10 15

Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala

20 25 30

Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu

35 40 45

Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val

50 55 60

Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu

65 70 75 80

Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala

85 90 95

Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu

100 105 110

Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val

130 135 140

Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe

165 170 175

Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys

180 185 190

Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala

195

<210> 22

<211> 169

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная

<400> 22

His Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr

1 5 10 15

Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln

20 25 30

Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly

35 40 45

Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly

50 55 60

Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val

65 70 75 80

Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr

85 90 95

Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg

100 105 110

Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr

115 120 125

Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn

130 135 140

Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly

145 150 155 160

Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala

165

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения популяции клеток, высокочувствительных к клостридиальному нейротоксину, а также определения активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина и идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического и/или косметического применения. Изобретение позволяет получать популяции клеток, обладающих повышенной чувствительностью к клостридиальным нейротоксинам, для использования в анализах. 5 н. и 49 з.п. ф-лы, 14 ил., 13 пр.

1. Способ выведения популяции клеток, проявляющих чувствительность к клостридиальному нейротоксину, включающий:

(а) приведение популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином; при этом указанная популяция содержит клетки, экспрессирующие:

i) индикаторный белок, расщепляемый клостридиальным нейротоксином; и

ii) рецептор, обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином, и/или фермент пути синтеза ганглиозидов или его вариант или фрагмент, который обладает каталитической активностью такого фермента, причем ганглиозид обладает сродством связывания с клостридиальным нейротоксином;

(b) идентификацию клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка;

(c) выделение клеток, идентифицированных на этапе (b); и

(d) выполнение по меньшей мере одной итерации указанных последовательных этапов (а)-(с), где популяция клеток, используемых на этапе (а), содержит или состоит из клеток, выделенных на этапе (с), и/или их дочерних клеток;

причем необязательно перед каждой итерацией клетки, выделенные на предыдущем этапе (с), культивируют до тех пор, пока количество указанных клеток не станет по существу эквивалентным количеству клеток на предыдущем этапе (а).

2. Способ получения популяции клеток, высокочувствительных к клостридиальному нейротоксину, включающий:

(а) приведение рекомбинантных клеток, экспрессирующих индикаторный белок, в контакт с клостридиальным нейротоксином; и

(b) после этого отбор клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка.

3. Способ по п. 1 или 2, где этап (а) включает культивирование клеток в среде, содержащей клостридиальный нейротоксин.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где этап (а) включает культивирование клеток в среде, содержащей клостридиальный нейротоксин в концентрации от примерно 0,0001 до примерно 10000 пМ.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где этап (а) включает культивирование клеток в среде, содержащей клостридиальный нейротоксин, в течение примерно 2 часов или более.

6. Способ по любому из пп. 2-5, где этап (b) включает определение, произошло ли расщепление индикаторного белка.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит домен SNARE.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит аминокислотную последовательность (i) синтаксина, (ii) синаптобревина, (iii) SNAP-25 или (iv) его варианта или фрагмента, который подвержен протеолизу протеазным компонентом клостридиального нейротоксина дикого типа; предпочтительно SNAP-25.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок является меченым; предпочтительно меченным аминокислотной последовательностью одной или более флуоресцентных белковых меток.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит С-концевую метку; предпочтительно N-концевую метку и С-концевую метку; причем N-концевая метка и С-концевая метка предпочтительно являются разными.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит аминокислотную последовательность (i) SNAP-25 или его варианта или фрагмента, (ii) N-концевой метки и (iii) С-концевой метки.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок является меченным аминокислотной последовательностью mScarlet и аминокислотной последовательностью NeonGreen.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок метят аминокислотной последовательностью mScarlet в качестве N-концевой метки и NeonGreen в качестве С-концевой метки.

14. Способ по любому из пп. 10-13, где расщепление индикаторного белка анализируют путем измерения сигнала от С-концевой метки; причем предпочтительно уменьшение С-концевой метки во время или после контакта с клостридиальным нейротоксином, необязательно, во время или после этапа (а), указывает на расщепление индикаторного белка; при этом предпочтительно уменьшение С-концевой метки во время или после контакта с клостридиальным нейротоксином, необязательно, во время или после этапа (а), подтверждает расщепление индикаторного белка.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где популяцию клеток или рекомбинантную клетку, необязательно, на этапе (а), получают путем введения в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей индикаторный белок.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий введение в рекомбинантную клетку или популяцию клеток, необязательно, на этапе (а), нуклеиновой кислоты, кодирующей индикаторный белок.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок не расщепляется в отсутствие клостридиального нейротоксина или его протеолитически активного домена.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления один из образующихся фрагментов, предпочтительно С-концевой фрагмент, является легко деградируемым.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит С-концевую метку и С-концевая метка не высвобождается, необязательно, не отщепляется, от индикаторного белка в отсутствие клостридиального нейротоксина или его протеолитически активного домена.

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит С-концевую метку и полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления полученный С-концевой фрагмент является легко деградируемым и деградация С-концевого фрагмента приводит к деградации С-концевой метки.

22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где индикаторный белок содержит С-концевую метку и полноразмерный индикаторный белок не является легко деградируемым в клетке, но после его расщепления полученный С-концевой фрагмент является легко деградируемым и деградация С-концевого фрагмента приводит к деградации С-концевой метки, причем расщепление индикаторного белка определяют путем измерения сигнала от С-концевой метки после приведения клетки (клеток) в контакт с клостридиальным нейротоксином; причем предпочтительно уменьшение С-концевой метки во время или после контакта с клостридиальным нейротоксином, необязательно, во время или после этапа (а), указывает на расщепление индикаторного белка; более предпочтительно уменьшение С-концевой метки во время или после контакта с клостридиальным нейротоксином, необязательно, во время или после этапа (а), подтверждает расщепление индикаторного белка.

23. Способ по любому из предшествующих пунктов, где после контакта клетку лизируют и полученный клеточный лизат приводят в контакт с антителами и выполняют вестерн-блоттинг.

24. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки на этапе (а) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор, обладающий сродством связывания с клостридиальным нейротоксином, и/или экзогенную нуклеиновую кислоту, обеспечивающую экспрессию фермента пути синтеза ганглиозидов или его варианта или фрагмента, обладающего каталитической активностью такого фермента; предпочтительно экзогенная нуклеиновая кислота кодирует указанный рецептор и экзогенная нуклеиновая кислота обеспечивает экспрессию указанного фермента.

25. Способ по любому из предшествующих пунктов, где перед первым этапом приведения в контакт, необязательно, этапом (а), в клетки вводят экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую: рецептор клостридиального нейротоксина или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином; и/или фермент пути синтеза ганглиозидов или его вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента.

26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки на этапе (а) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент пути синтеза ганглиозидов или его вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента.

27. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки на этапе (а) содержат экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую глюкозилцерамидсинтазу, GalT-I, GalNAcT, GM3-синтазу, GD3-синтазу, GT3-синтазу, галактозилцерамидсинтазу, GM4-синтазу, GalT-II, ST-IV или ST-V, или их вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента; предпочтительно GD3-синтазу или ее вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью GD3-синтазы; более предпочтительно GD3-синтазу.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки, необязательно, на этапе (а), экспрессируют больше рецептора и/или фермента пути синтеза ганглиозида или его вариант или фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента, по сравнению с клеткой, в которой отсутствует указанная нуклеиновая кислота, предпочтительно отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота.

29. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии белкового рецептора или его варианта или фрагмента, обладающего способностью связываться с клостридиальным нейротоксином.

30. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рецептор представляет собой SV2 или синаптотагмин или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рецептор представляет собой SV2 или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином.

32. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рецептор представляет собой SV2A или SV2C, предпочтительно SV2A или его вариант или фрагмент, обладающий способностью связываться с клостридиальным нейротоксином.

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рецептор представляет собой четвертый люминальный домен SV2A или SV2C.

34. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нуклеиновую кислоту, предпочтительно экзогенную нуклеиновую кислоту, вводят путем трансфекции.

35. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантную клетку получают методом генной инженерии для экспрессии: (i) рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта или фрагмента, обладающего способностью связываться с клостридиальным нейротоксином; и/или (ii) фермента пути синтеза ганглиозидов или его варианта или фрагмента, обладающего каталитической активностью такого фермента.

36. Способ по любому из предшествующих пунктов, где отбирают или выделяют клетки, в которых 20% или более индикаторного белка, присутствующего в клетке, превращено в продукты расщепления.

37. Способ по любому из пп. 2-36, где этапы (а) и (b) повторяют по меньшей мере один раз с использованием клеток, отобранных на предыдущей итерации этапа (b).

38. Способ по любому из предшествующих пунктов, где при каждой итерации этапа (а) клетки приводят в контакт с меньшим количеством клостридиального нейротоксина по сравнению с количеством, с которым они контактировали во время предыдущей итерации этапа (а).

39. Способ по п. 37 или 38, где перед повторением этапов (а) и (b) клетки, отобранные на предыдущей итерации этапа (b), культивируют до тех пор, пока количество таких клеток не станет примерно таким же, как количество в исходной популяции рекомбинантных клеток; и/или где перед каждой из указанных по меньшей мере одной итерации клетки, отобранные на предыдущем этапе выделения клеток, которые демонстрируют расщепление индикаторного белка, культивируют до тех пор, пока количество таких клеток не станет примерно таким же, как количество в исходной популяция клеток.

40. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки, необязательно, на этапе (а), представляют собой нейрональные клетки, не являющиеся нейрональными клетки, нейроэндокринные клетки, эмбриональные клетки почки, клетки рака молочной железы, клетки нейробластомы или гибридные клетки нейробластомы-глиомы; предпочтительно не являющиеся нейрональными клетки.

41. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки, необязательно, на этапе (а), представляют собой клетки нейробластомы или клетки нейробластомы-глиомы.

42. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки, необязательно, на этапе (а), представляют собой клетки нейробластомы-глиомы.

43. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки, необязательно, на этапе (а), представляют собой клетки NG108.

44. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ганглиозид выбирают из GM1a, GD1a, GD1b, GT1b и GQ1b; причем предпочтительно клетки, необязательно, на этапе (а), генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии GM1a, GD1a, GD1b, GT1b и/или GQ1b.

45. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ганглиозид выбирают из GD1a, GD1b и GT1b; причем предпочтительно клетки, необязательно, на этапе (а), генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии GD1a, GD1b и/или GT1b.

46. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ганглиозид выбирают из GD1b и GT1b; причем предпочтительно клетки, необязательно, на этапе (а) генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии GD1b и/или GT1b.

47. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клостридиальный нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин.

48. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клостридиальный нейротоксин выбирают из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G и BoNT/H.

49. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клостридиальный нейротоксин представляет собой BoNT/A.

50. Способ по любому из пп. 1-48, где клостридиальный нейротоксин представляет собой BoNT/E.

51. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на этапе (а), необязательно, при приведении популяции клеток в контакт с клостридиальным нейротоксином или при приведении рекомбинантных клеток, экспрессирующих индикаторный белок, в контакт с клостридиальным нейротоксином клостридиальный нейротоксин присутствует в концентрации от примерно 0,0001 до примерно 100000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 50000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 20000 пМ, от 0,0001 до примерно 10000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 1000 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 500 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 300 пМ, от примерно 0,0001 пМ до примерно 100 пМ, от примерно 0,0001 до примерно 10 пМ или от примерно 0,0001 до примерно 1 пМ.

52. Способ определения активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина, включающий:

(a) приведение популяции клеток, полученной способом по любому из пп. 1-51 в контакт с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином в условиях и в течение периода времени, достаточных для того, чтобы протеазный домен клостридиального нейротоксина дикого типа расщепил индикаторный белок в клетке; и

(b) определение наличия продукта, полученного в результате расщепления индикаторного белка.

53. Способ in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина, включающий:

а) предоставление популяции клеток, полученной способом по любому из пп. 1-51;

b) приведение указанной популяции клеток в контакт с составом клостридиального нейротоксина;

c) сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d) идентификацию наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается; или

е) идентификацию отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается.

54. Способ in vitro для идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического и/или косметического применения, включающий:

а) предоставление популяции клеток, полученной способом по любому из пп. 1-51;

b) приведение указанной популяции клеток в контакт с составом клостридиального нейротоксина;

c) сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d) идентификацию состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического и/или косметического применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта увеличивается; или

е) идентификацию состава клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического и/или косметического применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не увеличивается.