РАЗРУШАЕМЫЕ КЛОСТРИДИАЛЬНЫЕ ТОКСИНЫ Российский патент 2015 года по МПК A61K35/74 

Разрушаемые клостридиальные токсины

[01] Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/346,578, поданной 20 мая 2010 года, полное раскрытие которой включено здесь путем данной конкретной ссылки.

[02] Способность клостридиальных токсинов, таких, как, например, ботулинических нейротоксинов (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G, и нейротоксина столбняка (TeNT), ингибировать нейрональную трансмиссию использовалась в широком спектре терапевтических и косметических применений, см., например, William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004). Клостридиальные токсины, коммерчески доступные как фармацевтические композиции, включают препараты BoNT/A, такие, как, например, ВОТОХ^® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT^®/RELOXIN^®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Англия), NEURONOX^® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Южная Корея), ВТХ-А (Lanzhou Institute Biological Products, Китай) и XEOMIN^® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Германия); и препараты BoNT/B, такие, как, например, MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Как пример, ВОТОХ^® в настоящее время утвержден в одной или более странах для следующих показаний: ахалазия, спастичность у взрослых, анальная трещина, боль в спине, блефароспазм, бруксизм, цервикальная дистония, эссенциальный тремор, межбровные морщины или гиперкинетические, лицевые морщины, головная боль, гемифациальный спазм, гиперактивность мочевого пузыря, гипергидроз, ювенильный церебральный паралич, множественный склероз, миоклонические расстройства, носогубные морщины, спастическая дисфония, косоглазие и нарушение VII нерва.

[03] Лечение клостридиальным токсином ингибирует высвобождение нейротоксина путем нарушения процесса экзоцитоза, который используется для выделения нейромедиатора в синаптическую щель. У фармацевтической индустрии имеется большое желание расширить применение терапий клостридиальным токсином за рамки его текущих миорелаксантных применений для лечения сенсорных неврологических расстройств, таких, как, например, различные виды хронической боли, неврогенное воспаление и урогенитальные расстройства, наряду с другими расстройствами, такими, как, например, панкреатит. Один подход, использующийся в настоящее время для расширения применения терапий, основанных на клостридиальном токсине, включает такую модификацию клостридиального токсина, при которой токсин приобретает измененную способность к клеточному таргетингу клеток-мишеней, отличных от мишеней клостридиального токсина. Данная способность к изменению таргетинга достигается путем замещения природного таргетингового домена клостридиального токсина таргетинговым доменом, демонстрирующим преимущественную связывающую активность с рецептором, отличным от рецептора клостридиального токсина, присутствующим в клетках-мишенях, не являющихся клетками-мишенями клостридиального токсина. Такие модификации домена таргетинга, в результате, приводят к гибриду клостридиального токсина, который называется белок, модулирующий целевой везикулярный экзоцитоз (Targeted Vesicular Exocytosis Modulating Protein - VEMP), способному селективно связывается с рецептором, не являющимся рецептором клостридиального токсина (рецептор - мишень), присутствующим на клетке-мишени, не являющейся клеткой-мишенью клостридиального токсина, который перемещается в цитоплазму и оказывает протеолитическое действие на комплекс SNARE клеток, отличных от клеток-мишеней клостридиального токсина.

[04] Терапия клостридиальным токсином и гибридом клостридиального токсина успешно используются для многих показаний. В общем, введение клостридиального токсина и гибрида клостридиального токсина хорошо переносится. Однако введение при некоторых применениях может оказаться сложным, так как для достижения благоприятного эффекта потребуются большие дозы. Большие дозы могут увеличить вероятность того, что клостиридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина смогут двигаться во внутритканевых жидкостях и лимфатической системе организма, приводя в результате к нежелательной дисперсии токсина или гибрида клеостридиального токсина на зоны, не являющиеся мишенями лечения. Такая дисперсия может приводить к нежелательным побочным эффектам, таким, как, например, ингибирование высвобождения нейромедиатора из нейронов, не являющихся мишенями лечения токсином, или паралич мышцы, не являющейся мишенью лечения. Для примера, у пациента, которому вводили терапевтически эффективное количество лечения BoNT/A в мышцу шеи по поводу кривошеи, может развиться дисфагия из-за дисперсии токсина в ротоглотку. Таким образом, остается потребность в улучшенных клостридиальных токсинах и/или гибридах клостридиального токсина, которые эффективны в месте лечения, однако имеют эффекты от незначительных до минимальных в зонах, не являющихся мишенями лечения токсином.

[05] Растущее клиническое, терапевтическое и косметическое использование клостридиальных токсинов и гибридов клостридиальных токсинов в терапиях, требующих больших доз, вынуждает фармацевтическую индустрию разрабатывать модифицированные клостридиальные токсины и гибриды клостридиальных токсинов, эффективные в участках-мишенях применения, однако снижать или предотвращать возможные побочные эффекты, ассоциированные с дисперсией токсинов в нежелательные локализации. Настоящее описание предоставляет новые модифицированные клостридиальные токсины и гибриды клостридиальных токсинов, которые снижают или предотвращают нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с дисперсией токсина в нецелевые зоны. Данные и связанные с ними преимущества полезны для различных клинических, терапевтических и косметических применений, таких, как, например, лечение нейромышечных расстройств, глазных расстройств, боли, повреждений мышц, головной боли, сердечнососудистых заболеваний, нейропсихиатрических расстройств, эндокринных расстройств, раков, ушных расстройств и гиперкинетических лицевых морщин, наряду с другими расстройствами, где введение клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина млекопитающим может вызвать благоприятный эффект.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[06] ФИГ.1 демонстрирует схему текущей парадигмы о высвобождении нейромедиатора и интоксикации клостридиальным токсином в центральном и периферическом нейроне. ФИГ.1А демонстрирует схему механизма высвобождения нейромедиатора центрального и периферического нейрона. Процесс высвобождения может быть описан как процесс, состоящий из двух этапов: 1) докинг везикулы, белок SNARE, связанный с везикулой, содержащей молекулы нейромедиатора, связывается с мембрано-связанными белками SNARE, расположенными на плазматической мембране; и 2) высвобождение нейромедиатора, где везикула сливается с плазматической мембраной и молекулы нейромедиатора подвергаются экзоцитозу. ФИГ.1В демонстрирует схему механизма интоксикации для активности столбняка и ботулинического токсина в центральном и периферическом нейроне. Этот процесс интоксикации может быть описан как процесс, состоящий из четырех этапов: 1) связывание рецептора, где клостридиальный токсин связывается с системой клостридиального рецептора и инициирует процесс интоксикации; 2) интернализация комплекса, где после связывания токсина везикула, содержащая комплекс токсин/система рецептора, подвергается эндоцитозу внутрь клетки; 3) транслокация легкой цепи, где, как предполагается, происходят многие события, включая, например, изменения внутреннего рН везикулы, образование перового канала, включающего домен UN тяжелой цепи клостридиального токсина, отделение легкой цепи клостридиального токсина от тяжелой цепи и высвобождение активной легкой цепи и 4) энзиматическая модификация мишени, где активированная легкая цепь клостридиального токсина протеолитически расщепляет свой целевый субстрат SNARE, такой, как, например, SNAP-25, VAMP или Syntaxin, тем самым предотвращая докинг везикулы и высвобождение нейромедиатора..

[07] ФИГ.2 демонстрирует организацию доменов природных клостридиальных токсинов. Одноцепочечная форма описывает линейную организацию от амино- до карбоксильных групп, включающую энзиматический домен, транслокационный домен и домен связывания. Двухцепочечный участок петли, расположенный между транслокационным и энзиматическим доменами, описывается двойной SS вилкой. Этот участок включает двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой, который в результате протеолитического расщепления под действием природной протеазы, такой, как, например, эндогенная протеаза клостридиального токсина или природная протеаза, вырабатываемая в окружении, конвертирует одноцепочечную форму токсина в двухцепочечную форму. Над одноцепочечной формой изображен участок Нес связывающего домена клостридиального токсина. Этот участок содержит домен в форме β-трилистника, который включает линейную организацию от амино- до карбоксильных групп α-складку, β4/β5 «шпильку», β-складку, β8/β9 «шпильку» и γ-складку.

[08] ФИГ.3 демонстрирует клостридиальные токсины или гибриды клостридиальных токсинов со связывающим доменом, расположенным на амино- конце токсина. ФИГ.3А изображает одноцепочечную полипептидную форму токсина или гибрида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающую связывающий элемент, транслокационный элемент, энзиматический домен, транслокационный домен и домен связывания, двухцепочечный участок петли, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой (Р) и терапевтический элемент. После протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.3В изображает форму токсина или гибрида из одного полипептида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающую связывающий элемент, терапевтический элемент, двухцепочечный участок петли, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой (Р), и транслокационный элемент.После протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму.

[09] ФИГ.4 демонстрирует клостридиальные токсины или гибриды клостридиального токсина со связывающим доменом, расположенным на амино- конце токсина. ФИГ.4А изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего терапевтический компонент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), связывающий элемент и транслокационный элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.4 В изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающую транслокационный элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), связывающий элемент и терапевтический элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.4С изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего терапевтический элемент, связывающий элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), и транслокационный элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.4D изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего транслокационный элемент, связывающий элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), и терапевтический элемент. Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму.

[010] ФИГ.5 демонстрирует клостридиальные токсины или гибриды клостридиального токсина со связывающим доменом, расположенным на амино- конце токсина. ФИГ.5А изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего терапевтический элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), транслокационный элемент и связывающий элемент.Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму. ФИГ.5 В изображает токсин или гибрид в форме единичного полинуклеотида с линейной организацией от амино- до карбоксильных групп, включающего транслокационный элемент, двухцепочечный участок петли, состоящий из сайта расщепления экзогенной протеазой (Р), терапевтический элемент и связывающий элемент.Под действием протеолитического расщепления протеазой Р одноцепочечная форма токсина или гибрида конвертируется в двухцепочечную форму.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[011] Настоящее описание раскрывает модифицированные клостридиальные токсины и модифицированные гибриды клостридиального токсина, которые могут быть быстро инактивированы из нежелательной локализации или локализаций путем использования наличия протеаз, присутствующих в межтканевой жидкости и в циркуляторных системах, таких как, например, сердечнососудистая система и лимфатическая система. Это происходит потому, то клостридиальные токсины и гибриды клостридиального токсина, раскрываемые в настоящем описании, содержат сайт расщепления протеазой для протеазы, присутствующей в межтканевой жидкости и/или циркуляторной системе. Наличие такого сайта расщепления протеазой делает модифицированный клостридиальный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина чувствительным к протеолитическому расщеплению распознающей его протеазой, которая делает такие модифицированные токсины неактивными. Например, в ситуации, где клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, модифицированный с тем, чтобы содержать сайт расщепления для протеазы внеклеточного матрикса, проник благодаря диффузии в межтканевую жидкость, это модифицированный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина может быть эффективно расщеплен распознающей его протеазой внеклеточного матрикса. Приведем другой пример, в ситуациях, где клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина модифицирован с тем, чтобы включить сайт расщеплении для протеазы крови, проник благодаря диффузии в сердечнососудистую систему, этот модифицированный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина может быть эффективно расщеплен распознающей его протеазой крови. Приведем еще один пример, в ситуации, где клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, модифицированный с тем, чтобы содержать сайт расщепления для лимфатической протеазы, проникает благодаря диффузии в лимфатическую систему, этот модифицированный токсин или модифицированный гибрид клостридиального токсина может быть эффективно расщеплен распознающими его лимфатическими протеазами. Таким образом, использование клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, включающего сайт(ы) расщепления для протеаз, присутствующих в межтканевой жидкости и/или циркуляторной системе, уменьшит или удалит такой клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина из нежелательной локализации, тем самым снижая или предотвращая нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с диффузией клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина в нежелательную локализацию.

[012] Таким образом, аспекты настоящего описания предоставляют клостридиальный токсин, включающий инактивационный сайт расщепления, расположенный на участке инактивационного расщепления, где участок инактивационного расщепления расположен в транслокационном домене или связывающем H_CN субдомене. Такие раскрываемые токсины могут включать энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен клостридиального токсина, двухцепочечный петлевой участок, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления. Не имеющие ограничительного характера примеры инактивационных сайтов расщепления включают сайты расщепления тромбином, сайты расщепления плазмином, сайты расщепления фактором коагуляции VIIa, сайты расщепления фактором коагуляции IXa, сайты расщепления фактором коагуляции Ха, сайты расщепления фактором коагуляции XIa, сайты расщепления фактором коагуляции XIIa, сайты расщепления калликреином плазмы, сайты расщепления активируемым протеазой рецептором 1, сопряженным с G протеином (PAR1), сайты расщепления PAR 2, сайты расщепления PAR3, сайты расщепления PAR4, сайты расщепления матричной металлопротеиназой-2 (ММР-2), сайты расщепления матричной металлопротеиназой-9 (ММР-9), сайты расщепления фурином, сайты расщепления активатором плазминогена типа урокиназы (uPA), сайты расщепления активатором плазминогена тканевого типа (tPA), сайты расщепления триптазой-е, сайты расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7), сайты расщепления эндотелин-конвертирующим ферментом-1 (ЕСЕ-1), сайты расщепления группой крови Келла, сайты расщепления ингибитором дипептидазы-IV (DPPIV), сайты расщепления металлопептидазой ADAM с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS13) и сайты расщепления катепсином L. Добавление инактивационного сайта расщепления увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, однако, без дополнительного инактивационного сайта расщепления.

[013] Другие аспекты настоящего описания предоставляют гибрид клостридиального токсина, включающий энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся в клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, где участок инактивационного участка расщепления расположен в транслокационном домене или в H_CN связывающем субдомене. Такие раскрываемые токсины могут включать энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся в клостридиальному токсину, двухцепочечный петлевой участок, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления. Не имеющие ограничительного характера примеры инактивационных сайтов расщепления включают сайты расщепления тромбином, сайты расщепления плазмином, сайты расщепления фактором коагуляции Вила, сайты расщепления фактором коагуляции IXa, сайты расщепления фактором коагуляции Ха, сайты расщепления фактором коагуляции XIa, сайты расщепления фактором коагуляции XIIa, сайты расщепления калликреином плазмы, сайты расщепления активируемым протеазой рецептором 1, сопряженным с G протеином (PAR1), сайты расщепления PAR 2, сайты расщепления PAR3, сайты расщепления PAR4, сайты расщепления матричной металлопротеиназой-2 (ММР-2), сайты расщепления матричной металлопротеиназой-9 (ММР-9), сайты расщепления фурином, сайты расщепления активатором плазминогена типа урокиназы (иРА), сайты расщепления активатором плазминогена тканевого типа (tPA), сайты расщепления триптазой-е, сайты расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7), сайты расщепления эндотелин-конвертирующим ферментом-1 (ЕСЕ-1), сайты расщепления группой крови Келла, сайты расщепления DPPIV, сайты расщепления металлопептидазой ADAM с мотивом-13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS13) и сайты расщепления катепсином L. Добавление инактивационного сайта расщепления увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, однако, без дополнительного инактивационного сайта расщепления.

[014] Другие аспекты настоящего описания предоставляют полипептидные молекулы, кодирующие клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. Полинуклеотидная молекула, кодирующая такой клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, может далее включать экспрессирующий вектор.

[015] Другие аспекты настоящего описания предоставляют композицию, включающую клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. Композиция, включающая такой клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, может быть фармацевтической композицией. Такая фармацевтическая композиция, в добавление к модифицированному клостридиальному токсину, раскрываемому в настоящем описании, может включать фармацевтический носитель, фармацевтический компонент или оба.

[016] Другие аспекты настоящего описания предоставляют способ получения клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, способ, включающий этап экспрессии в клетке полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, где экспрессии полинуклеотидной молекулы производит кодируемый клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина. В других аспектах способ включает этапы внедрения в клетку полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина в настоящем описании, и экспрессию полинуклеотидной молекулы, где экспрессия от полинуклеотидной молекулы производит кодируемый клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина.

[017] Клостридиальные токсины, вырабатываемые Clostridium botuiimim, Clostridium tetani, Clostridium baratiiand Clostridium butyricum, являются наиболее широко используемыми в терапевтических и косметических лечениях людей и других млекопитающих. Штаммы С.botulinum вырабатывают семь антигенно различающихся типов ботулинических токсинов (BoNT), которые были идентифицированы путем исследования вспышек ботулизма у людей (BoNT/A, /В, /Е и/F), животных (BoNT/Cl и 7D), или выделены из почвы (BoNT/G). BoNT имеют, приблизительно, 35% аминокислотную идентичность друг с другом, и имеют одну и ту же функциональную доменную организацию и общее структурное построение. Специалистами в области техники признается, что среди каждого типа клостридиальных токсинов могут быть подтипы, несколько различающиеся по своей аминокислотной последовательности и также нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки. Например, в настоящее время существуют пять подтипов BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5, отдельные подтипы демонстрируют, приблизительно, от 84% до 93% идентичности аминокислот по сравнению с подтипом BoNT/A с SEQ ID NO:1. Как другой пример, в настоящее время существует пять подтипов BoNT/B, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/В3, BoNT/Bnp и BoNT/Bbv, отдельные подтипы демонстрируют, приблизительно, от 93% до 96% идентичности аминокислот по сравнению с подтипом BoNT/B с SEQ ID NO:6. Как еще другой пример, в настоящее время существует три подтипа BoNT/E, BoNT/E1, BoNT/E2, и BoNT/ЕЗ, отдельные подтипы демонстрируют, приблизительно, от 95% до 99% идентичности аминокислот по сравнению с подтипом BoNT/E с SEQ ID NO:15. В то время, как все семь серотипов BoNT имеют одинаковую структуру и фармакологические свойства, каждый также проявляет гетерологические бактериологические характеристики. В отличие от этого, токсин столбняка (TeNT) вырабатывается однородной группой С.tetani. Два других вида клостридии, С.baratii и С.butyricum, вырабатывают токсины BaNT и BuNT, которые подобны, соответственно, BoNT/F и BoNT/E.

[018] Каждый из клостридиальных токсинов транслируется в виде одноцепочечного полипептида, весом, приблизительно, 150 кДа, который в дальнейшем расщепляется путем протеолитического разрезания природной протеазой в дисульфидной петле (ФИГ.1). Это расщепление происходит в определенном двухцепочечном участке петли, созданном между двумя цистеиновыми остатками, формирующими дисульфидный мостик. Этот посттрансляционный процессинг приводит к двухцепочечной молекуле, включающий, приблизительно, 50 кДа легкую цепь (LC) и, приблизительно, 100 кДа тяжелую цепь (НС), удерживаемыми вместе единичной дисульфидной связью и не-ковалентным взаимодействием между двумя цепями. Природные протеазы, используемые для конвертирования одноцепочечной молекулы в двухцепочечную, в настоящее время неизвестны. В некоторых серотипах, таких, как, например, BoNT/A, природные протеазы вырабатываются эндогенно серотипом бактерии, и расщепление происходит в клетке перед тем, как токсин высвобождается в окружающую среду. Однако в других серотипах, таких, как, например, BoNT/E, бактериальный штамм, как оказывается, не продуцирует эндогенную протеазу, способную конвертировать одноцепочечную форму токсина в двухцепочечную форму. В этих ситуациях токсин высвобождается из клетки в виде одноцепочечного токсина, который в дальнейшем конвертируется в двухцепочечную форму природными протеазами, находящимися в окружении.

[019] Каждая зрелая двухцепочечная молекула включает три функционально различных домена: 1) энзиматический домен, расположенный на LC, который включает участок металлопротеиназы, имеющий цинк-зависимую эндопептидазную активность, которая специфически направлена в отношении ключевых компонентов аппарата высвобождения нейромедиатора; 2) транслокационный домен, находящийся в амино-терминальной половине НС (H_N), которые способствует высвобождению LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени; и 3) связывающий домен, находящийся в карбокси-терминальной половине НС (H_c), который определяет связывающую активность и связывающую специфичность токсина по отношению к рецепторному комплексу, расположенному на поверхности клетки-мишени. D. В. Lacy and R. С.Stevens, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, J. Mol. Biol. 291: 1091-1104 (1999). Домен Не включает два различных структурных компонента приблизительно равного размера, разделенные α-спиралью, носящие названия субдомены H_CN и H_CC. В Таблице 1 даны приблизительные пограничные участки для каждого домена и субдомена, обнаруживаемых в примерных клостридиальных токсинах.

Таблица 1. Референтные последовательности и участки клостридиального токсина Токсин SEQ ID NO: LC Цвухцепо чечная H_N H_c H_CN α-линкер H_cc BoNT/A 1 M1/P2-L429 С430-С454 I455-I873 I874-N1080 E1081-Q1091 S1092-L1296 BoNT/B 6 M1/P2-M436 С437-С446 I447-I860 L861-S1067 Q1068-Q1078 S1079-E1291 BoNT/C 1 11 M1/P2-F436 С437-С453 R454-I868 N869-D1081 G1082-L1092 Q1093-E1291 BoNT/D 13 M1/T2-V436 С437-С450 1451-1864 N865-S1069 N1069-Q1079 11080-Е1276 BoNT/E 15 M1/P2-F411 С412-С426 1427-1847 K848-D1055 Е1056-Е1066 Р1067-К1252 BoNT/F 18 M1/P2-F428 С429-С445 1446-1865 K866-D1075 K1076-Е1086 Р1087-Е1274 BoNT/G 21 M1/P2-M435 С436-С450 1451-1865 S866-N1075 A1076-Q1086 S1087-E1297 TeNT 22 M1/P2-L438 С439-С467 I468-L881 K882-N1097 P1098-Y1108 L1109-D1315 BaNT 23 M1/P2-L420 С421-С435 I436-I857 I858-D1064 K1065-Е 1075 Р1076-Е1268 BuNT 24 M1/P2-F411 С412-С426 I427-I847 K848-D1055 Е1056-Е1066 Р1067-K1251

[020] Связывание, транслокация и энзиматическая активность этих трех функциональных доменов - все они необходимы для токсичности. В то время, как точные детали данного процесса еще точно не известны, общий механизм клеточной интоксикации, посредством которой клостридиальные токсины входят в нейрон и ингибируют высвобождение нейромедиатора, подобны, вне зависимости от серотипа или подтипа. Хотя заявители не имеют желания быть ограниченными следующим описанием, механизм интоксикации может быть описан как состоящий, по меньшей мере, из четырех следующих этапов: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи и 4) энзиматическая модификация мишени (ФИГ.3). Процесс инициируется, когда домен Не клостридиального токсина связывается с рецепторной системой, специфичной к токсину, которая расположена на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Специфичность связывания рецепторного комплекса, как считается, частично достигается специфической комбинацией ганглиозидов и белковых рецепторов, которые, по-видимому, определенно включают каждый комплекс клостридиального токсина и рецептора. Будучи связанными, комплексы токсин/рецептор интернализуются путем эндоцитоза и интернализированные везикулы распределятся по специфическим внутриклеточным путям. Этап транслокации, по-видимому, запускается подкислением компартмента везикулы. Этот процесс, как представляется, инициирует две важные рН-зависимые структурные перестройки, которые повышают гидрофобность и способствуют образованию двухцепочечной формы токсина. Будучи активированной, эндопептидаза легкой цепи эндотоксина высвобождается из внутриклеточной везикулы в цитозоль, где, по-видимому, она специфически направлена против одного из трех известных ключевых компонентов аппарата высвобождения нейромедиатора. Эти ключевые белки, мембранный белок, ассоциированный с везикулой (VAMP)/синаптобревин, белок 25 кДа, ассоциированный с синаптосомой (SNAP-25) и синтаксин, необходимы для докинга синаптической везикулы и слияния на нервном окончании, и они представляют собой членов семейства растворимого N-этилмалеимид чувствительного фактора - рецептора присоединения белка (SNARE). BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP-25 на терминальном карбоксильном участке, высвобождая, соответственно, сегмент в девять или двадцать шесть аминокислот, и BoNT/Cl также расщепляет SNAP-25 вблизи карбоксильного конца. Ботулинические серотипы BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G, и токсин столбняка действуют на консервативную центральную часть VAMP и высвобождают амино-концевую часть VAMP в цитозоль. BoNT/Cl расщепляет синтаксин в единичном месте вблизи цитозольной поверхности мембраны. Селективный протеолиз синаптических SNARE ответственен за блокирование высвобождения нейромедиатора, вызываемое клостридиальными токсинами in vivo. Мишень клостридиальных токсинов - белок SNARE является характерным белком для экзоцитоза в разнообразных клетках, не относящихся к нейрональным; в этих клетках, как и в нейронах, пептидазная активность легкой цепи ингибирует экзоцитоз, см, например, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

[021] Трехмерные кристаллические структуры BoNT/A, BoNT/B и домена Не TeNT указывают на то, что эти три функциональных домена клостридиальных нейротоксинов являются структурно различными доменами, что является общим для всех клостридиальных токсинов. Консенсусный мотив НЕХХН легкой цепи образует тетраэдральный карман, связывающий цинк, расположенный в глубокой щели на поверхности белка, которая доступна посредством канала. Структура доменов H_N и H_C состоит, в основном, из структур β-складчатости, связанных единичной α-спиралью. Домен H_N цилиндрической формы содержит две длинные алифатические α-спирали, которые напоминают мотив суперспирали, обнаруживаемый в некоторых вирусных белках. Домен H_N также образует длинную неструктурированную петлю, называемую «транслокационный пояс», которая оборачивается вокруг большой отрицательно заряженной щели легкой цепи, которая блокирует доступ к атому цинка к каталитическому связывающему карману активного сайта. Домен H_c содержит два различных структурных компонента приблизительно равного размера, которые определяют функцию. Первый, названный H_CN домен, расположен на амино- половине домена H_C. Домен H_CN образует β-бочковую складчатость в форме «рулета с вареньем». Домен H_CC является вторым доменом, который содержит домен H_C. Этот домен с карбокси концом включает модифицированный β-складчатый домен в форме трилистника, который формирует три различные карбогидрат-связывающие участки, которые напоминают карбогидрат-связывающие функциональные группы, обнаруживаемые во многих сахаро-связывающих белках, таких, как, например, сывороточный амилоид Р, сиалидаза, cryIA, инсектицидный 9-эндотоксин, и пектины. Биохимические исследования указывают на то, что β-складчатая, в форме трилистника структура домена H_CC, по-видимому, опосредует связывание со специфическими карбогидрат-содержащими компонентами рецептора клостридиального токсина на клеточной поверхности, см., например, Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site,4S2(l-2) FEBS Lett. 119-124 (2000). Домен Не отклоняется от домена hn, экспонируя поверхностные петли и делая их доступными для связывания. Между легкой цепью и доменом Не не происходит никаких контактов.

[022] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, клостридиальный токсин. В данном контексте термин «клостридиальный токсин» относится к любому токсину, вырабатываемому штаммом клостридиального токсина, который может осуществлять полный клеточный механизм, посредством которого клостридиальный токсин вызывает интоксикацию клетки и направляет связывание клостридиального токсина с рецепторным комплексом низкой или высокой афинности, интернализацию комплекса токсин/рецептор, транслокацию легкой цепи клостридиального токсина в цитоплазму, и энзиматическую модификацию субстрата клостридиального токсина. Клостридиальный токсин включает энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина. Примерные клостридиальные токсины включают токсины, вырабатываемые Clostridium botulinum, Clostridinm tetani, Clostridium baratii и Clostridium butyricum.

[023] Клостридиальные токсины включают, без ограничения, природные варианты клостридиального токсина, такие, как, например, изоформы клостридиального токсина и подтипы клостридиального токсина, не встречающиеся в природе варианты клостридиального токсина, такие, как, например, консервативные варианты клостридиального токсина, не-консервативные варианты клостридиального токсина и активные фрагменты этих вариантов клостридиального токсина, или любые их комбинации. В данном контексте термин «вариант клостридиального токсина», является ли это природный вариант, или вариант, не встречающийся в природе, относится к клостридиальному токсину, который имеет, по меньшей мере, одно изменение аминокислоты из соответствующего участка раскрываемых референтных последовательностей (Таблица 1), и может быть описан в процентной идентичности, по отношению к соответствующему участку референтной последовательности. В качестве примеров, не имеющих ограничительного характера, вариант BoNT/A с SEQ ID NO:1 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:1; вариант BoNT/B с SEQ ID NO:6 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:6; вариант BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:11; вариант BoNT/D с SEQ ID NO:13 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:13; вариант BoNT/E с SEQ ID NO:15 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:15; вариант BoNT/F с SEQ ID NO:18 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:18; вариант BoNT/G с SEQ ID NO:21 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:21; вариант TeNT с SEQ ID NO:22 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO; 22; вариант BaNT с SEQ ID NO:23 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:23; и вариант BuNT с SEQ ID NO:24 будет иметь, по меньшей мере, различие по одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление аминокислоты по сравнению с соответствующим положением(ями) SEQ ID NO:24.

[024] В данном контексте термин «встречающийся в природе вариант клостридиального токсина» относится к любому клостридиальному токсину, вырабатываемому без помощи какой-либо человеческой манипуляции, включая, без ограничения, изоформы клостридиального токсина, вырабатываемые из альтернативно сплайсированных транскриптов, изоформы клостридиального токсина, вырабатываемые путем спонтанной мутации, и подтипы клостридиального токсина. Не имеющие ограничительного характера примеры изоформы клостридиального токсина включают, например, изоформы BoNT/A, изоформы BoNT/B, изоформы BoNT/Cl, изоформы BoNT/D, изоформы BoNT/E, изоформы BoNT/F, изоформы BoNT/G, изоформы TeNT, изоформы BaNT и изоформы BuNT. Не имеющие ограничительного характера примеры подтипа клостридиального токсина включают, например, подтипы BoNT/A - BoNT/A I, BoNT/A2, BoNT/АЗ, BoNT/A4 и BoNT/A5; подтипы BoNT/B - BoNT/Bl, BoNT/B2, BoNT/ВЗ, BoNT/B бивалентный и BoNT/B непротеолитический; подтипы BoNT/Cl - BoNT/Cl-1 и BoNT/Cl-2; подтипы BoNT/E - BoNT/El, BoNT/E2 и BoNT/ЕЗ; подтипы BoNT/F - BoNT/Fl, BoNT/F2 и BoNT/F3; и подтипы BuNT - BuNT-1 и BuNT-2. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры подтипа клостридиального токсина включают, например, подтипы BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5; подтипы BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10; подтипы BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12; подтипы BoNT/Е с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:17; подтипы BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20; и подтипы BuNT с SEQ ID NO:24 и SEQ ID NO:25.

[025] В данном контексте термин «не встречающийся в природе вариант клостридиального токсина» относится к любому клостридиальному токсину, вырабатываемому с помочью человеческой манипуляции, включая, без ограничения, клостридиальные токсины, вырабатываемые путем генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или конструктивного расчета, и клостридиальные токсины, вырабатываемые путем химического синтеза. Не имеющие ограничительного характера примеры не встречающихся в природе вариантов клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты клостридиального токсина, неконсервативные варианты клостридиального токсина и активные фрагменты клостридиального токсина.

[026] В данном контексте термин «консервативный вариант клостридиального токсина» относится к клостридиальному токсину, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту, замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который имеет, по меньшей мере, одно свойство, подобное свойству оригинальной аминокислоты из референтной последовательности референтного клостридиального токсина (Таблица 1). Примеры свойств включают, без ограничения, сходный размер, топографию, заряд, гидрофобность, липофильность, способность к ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химическое свойство, тому подобное, или любую комбинацию этого. Консервативный вариант клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный клостридиальный токсин, на котором базируется консервативный вариант клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный клостридиальный токсин в любом аспекте настоящего описания. Консервативный вариант клостридиального токсина может замещать 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 или более аминокислот из референтного клостридиального токсина, на котором базируется консервативный вариант клостридиального токсина. Консервативный вариант клостридиального токсина также может замещать, по меньшей мере, 5, 10, 15, 20 или 25 непрерывных аминокислот из референтного клостридиального токсина, на котором базируется консервативный вариант клостидиального токсина. Не имеющие ограничительного характера примеры консервативного варианта клостидиального токсина включают, например, консервативные варианты BoNT/A, консервативные варианты BoNT/B, консервативные варианты BoNT/Cl, консервативные варианты BoNT/D, консервативные варианты BoNT/E, консервативные варианты BoNT/F, консервативные варианты BoNT/G, консервативные варианты TeNT, консервативные варианты BaNT и консервативные варианты BuNT.

[027] В данном контексте термин «не-консервативный вариант клостридиального токсина» относится к клостридиальному токсину, в котором 1) по меньшей мере, одна аминокислота вырезана из референтного клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный вариант клостридиального токсина; 2) по меньшей мере, одна аминокислота прибавлена к референтному клостридиальному токсину, на котором базируется не-консервативный вариант клостридиального токсина; или 3) по меньшей мере, одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который не имеет никакого свойства, подобного свойству оригинальной аминокислоты из последовательности референтного клостридиального токсина (Таблица 1). Неконсервативный вариант клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный клостридиальный токсин, на котором базируется не-консервативный вариант клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный клостридиальный токсин в любом аспекте настоящего описания. В не-консервативном варианте клостридиального токсина может быть вырезана одна или более аминокислоты, две или более аминокислоты, три или более аминокислоты, четыре или более аминокислоты, пять или более аминокислот или десять или более аминокислот из референтного клостридиального токсины, на котором базируется неконсервативный вариант клостридиального токсина. В не-консервативном варианте клостридиального токсина может быть добавлена одна или более аминокислота, две или более аминокислоты, три или более аминокислоты, четыре или более аминокислоты, пять или более аминокислот или десять или более аминокислот к референтному клостридиальному токсину, на котором базируется не-консервативный вариант клостридиального токсина. Не-консервативный вариант клостридиального токсина может замещать 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 или более аминокислот из референтного клостридиального токсина, на котором базируется неконсервативный вариант клостридиального токсина. Не-консервативный вариант клостридиального токсина также может замещать, по меньшей мере, 5, 10, 15, 20 или 25 непрерывных аминокислот из референтного клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный вариант клостидиального токсина. Не имеющие ограничительного характера примеры не-консервативного варианта клостидиального токсина включают, например, не-консервативные варианты BoNT/A, консервативные варианты BoNT/B, консервативные варианты BoNT/Cl, не-консервативные варианты BoNT/D, не-консервативные варианты BoNT/E, не-консервативные варианты BoNT/F, неконсервативные варианты BoNT/G, не-консервативные варианты TeNT, неконсервативные варианты BaNT и не-консервативные варианты BuNT.

[028] Также предусматривается, что любой из ряда фрагментов клостридиального токсина может быть полезен в аспектах настоящего описания при условии, что эти активные фрагменты могут осуществлять полный клеточный механизм, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Таким образом, аспекты варианта воплощения могут включать фрагменты клостридиального токсина, имеющие длину, например, по меньшей мере, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или, по меньшей мере, 1200 аминокислот.Другие аспекты данного варианта воплощения могут включать фрагменты клостридиального токсина, имеющие длину, например, максимально 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или, максимально 1200 аминокислот.

[029] Также предусматривается, что любой из ряда фрагментов клостридиального токсина, содержащий легкую цель, может быть пригоден в аспектах настоящего описания с условием того, что эти фрагменты с легкой цепью могут быть осуществлять специфический таргетинг ключевых компонентов аппарата высвобождения нейромедиатора и, таким образом, принимать участие в осуществление полного клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Легкие цепи клостридиальных токсинов имеют длину, приблизительно, 420-460 аминокислот и содержат энзиматический домен клостридиального токсина (Таблица 1). Исследования показали, что вся длина легкой цепи клостридиального токсина не является необходимой для энзиматической активности энзиматического домена клостридиального токсина. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, первые восемь аминокислот легкой цепи BoNT/A не являются необходимыми для энзиматической активности. Как другой пример, не имеющий ограничительного характера, первые восемь аминокислот легкой цепи TeNT не являются необходимыми для энзиматической активности. Сходным образом, карбоксильный конец легкой цепи не являются необходимыми для активности. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, последние 32 аминокислоты легкой цепи BoNT/A не требуются для энзиматической активности. Как другой пример, не имеющий ограничительного характера, последние 31 аминокислот легкой цепи TeNT не требуются для энзиматической активности. Поэтому аспекты данного варианта воплощения включают легкую цепь клостридиального токсина, содержащую энзиматический домен клостридиального токсина, имеющий в длину, например, по меньшей мере, 350, 375, 400, 425 или 450 аминокислот. Другие аспекты данного варианта воплощения включают легкую цепь клостридиального токсина, содержащую энзиматический домен клостридиального токсина, имеющий в длину, например, максимально 350, 375, 400, 425 или 450 аминокислот.

[030] Также предусматривается, что любой из ряда H_N участков клостридиального токсина, содержащих транслокационный домен клостридиального токсина, может быть пригоден в аспектах настоящего описания с условием того, что эти активные фрагменты могут способствовать высвобождению легкой цепи из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени и тем самым принимать участие в осуществление полного клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Участки H_N из тяжелых цепей клостридиальных токсинов имеют длину, приблизительно, 410-430 аминокислот и содержат транслокационный домен клостридиального токсина (Таблица 1). Исследования показали, что вся длина H_N участка тяжелой цепи клостридиального токсина не является необходимой для транслокационной активности транслокационного домена клостридиального токсина. Таким образом, аспекты данного варианта воплощения могут включать H_N участки клостридиального токсина, содержащие транслокационный домен клостридиального токсина, имеющий длину, по меньшей мере, 350, 375, 400 или 425 аминокислот. Другие аспекты данного варианта воплощения могут включать H_N участки клостридиального токсина, содержащие транслокационный домен клостридиального токсина, имеющий длину, максимально 350, 375, 400 или 425 аминокислот.

[031] Также предусматривается, что любой из ряда H_C участков клостридиального токсина, содержащих связывающий домен клостридиального токсина, может быть пригоден в аспектах настоящего описания при условии, что эти активные фрагменты могут определять связывающую активность и связывающую специфичность токсина с рецепторным комплексом, расположенным на поверхности клетки-мишени и способствовать полному клеточному механизму, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Участки H_C из тяжелых цепей клостридиальных токсинов имеют длину, приблизительно, 400-440 аминокислот и содержат связывающий домен (Таблица 1). Исследования показали, что вся длина Не участка тяжелой цепи клостридиального токсина не является необходимой для связывающей активности связывающего домена клостридиального токсина. Таким образом, аспекты данного варианта воплощения могут включать Не участки клостридиального токсина, содержащие связывающий домен клостридиального токсина, имеющий длину, по меньшей мере, 350, 375, 400 или 425 аминокислот. Другие аспекты данного варианта воплощения могут включать Не участки клостридиального токсина, содержащие связывающий домен клостридиального токсина, имеющий длину, максимально 350, 375, 400 или 425 аминокислот.

[032] Для определения процента идентичности могут быть использованы любые из ряда способспособов выравнивания последовательностей, включая, без ограничений, общие способспособы, локальные способспособы и гибридные способспособы, такие, как, например, способспособы разделения на сегменты. Протоколы для определения процентной идентичности являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[033] Общие способспособы выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание путем добавления баллов индивидуальным парам остатков и путем выставления штрафов за пропуск в последовательности. Не имеющие ограничительного характера способспособы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итерационное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996).

[034] Локальные способспособы выравнивают последовательности путем идентификации одного или более консервативных мотивов, разделяемых всеми вносимыми последовательностями. Не имеющие ограничительного характера способспособы включают, например. Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); сэмплирование по Гиббсу, см., например, С.Е. Lawrence et al.. Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9) Bioinfbrmatics,:1428-1435 (2004).

[035] Гибридные способы совмещают аспекты как общего, так и локального способов выравнивания. Не имеющие ограничительного характера способы включают, например, по-сегментное сравнивание, см., например, Burkhard Morgenstem et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison,93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996); T-Coffee, см., например, Cedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, см., например, Robert С.Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput,32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); и DIALIGN-T, см., например, Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).

[036] Настоящее описание описывает различные полипептидные варианты, где одна аминокислота замещена другой, такие, как, например, варианты клостридиального токсина, варианты энзиматического домена клостридиального токсина, варианты транслокационного домена клостридиального токсина, варианты связывающего домена клостридиального токсина, варианты, не относящиеся к вариантам связывающего домена клостридиального токсина и варианты сайта расщепления протеазой. Замена может быть оценена разнообразными факторами, такими, как, например, физическими свойствами замещаемой аминокислоты (Таблица 2), или тем, как оригинальная аминокислота будет переносить замену (Таблица 3). Выборы аминокислот, которые могут быть замещены другими аминокислотами в полипептиде, известны обычному специалисту в области техники.

ТАБЛИЦА 2. Свойства аминокислот Свойство Аминокислоты Алифатическая G, A, I, L, М, P, V Ароматическая F, Н, W, Y С-бета разветвленная I, V, T Гидрофобная C, F, I, L, М, V, W Малая полярная D, N, P Малая неполярная A, C, G, S, Т Большая полярная Е, Н, K, Q, R, W, Y Большая неполярная F, I, L, М, V Заряженная D, Е, Н, K, R Незаряженная C, S, T Негативная D, E Позитивная H, K, R Кислая D, E Основная K, R Амид N, Q

ТАБЛИЦА 3. Аминокислотные замены Амино- Подходящая Нейтральные замены Неподходящая замена А G, S, T С, Е, I, K, М, L, P, Q, R, V D, F, Н, N, Y, W С F, S, Y, W A, H, I, M, L, T, V D, Е, G, K, N, P, Q, R D E, N G, H, K, P, Q, R, S, T А, С, I, L, Е D, K, Q А, Н, N, P, R, S, Т С, F, G, I, L, М, V, W, Y F М, L, W, Y C, I, V А, D, Е, G, Н, K, N, P, Q, R, S, Т G A, S D, K, N, P, Q, R C, E, F, H, I, L, M, T, V, W, Y Н N, Y С, D, Е, K, Q, R, S, Т, W А, F, G, I, L, М, P, V I V, L, M А, С, Т, F, Y D, Е, G, Н, K, N, P, Q, R, S, W К Q, E, R А, D, G, Н, М, N, P, S, Т С, F, I, L, V, W, Y L F, I, М, V А, С, W, Y D, Е, G, Н, K, N, P, Q, R, S, Т М F, I, L, V А, С, R, Q, K, Т, W, Y D, Е, G, Н, N, P, S N D, H, S Е, G, K, Q, R, Т А, С, F, I, L, М, P, V, W, Y

P - A, D, E, G, K, Q, R, S, Т C, F, H, I, L, M, N, V, W, Y Q E, K, R A, D, G, H, M, N, Р, S, Т C, F, I, L, V, W, Y R K, Q A, D, E, G, H, M, N, Р, S, Т C, F, I, L, V, W, Y S A, N, T С, D, E, G, H, K, Р, Q, R, Т F, I, L, M, V, W, Y Т S A, C, D, E, H, I, K, M, N, Р, Q, R, V F, G, L, W, Y V I, L, M A, C, F, T, Y D, E, G, H, K, N, Р, Q, R, S, W W F, Y H, L, M A, C, D, E, G, I, K, N, Р, Q, R, S, T, V Y F, H, W C, I, L, M, V A, D, E, G, K, N, Р, Q, R, S, T Matthew J. Belts and Robert, B. Russell, Amino Acid Properties and Consequences of Substitutions, pp.289-316, In Biln Bioinformatics for Geneticists, (eds Michael R. Bames, lan C. Gray, Wiley, 2003).

[037] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин содержит энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен клостридиального токсина. В аспекте данного варианта воплощения клостридиальный токсин содержит природный вариант клостридиального токсина, такой, как, например, изоформа клостридиального токсина или подтип клостридиального токсина. В другом аспекте данного варианта воплощения клостридиальный токсин содержит не встречающийся в природе вариант клостридиального токсина, такой, как, например, консервативный вариант клостридиального токсина, не-консервативный вариант клостридиального токсина или активный фрагмент клостридиального токсина, или любую их комбинацию. В другом аспекте данного варианта воплощения клостридиальный токсин содержит энзиматический домен клостридиального токсина или активный фрагмент этого, транслокационный домен клостридиального токсина или активный фрагмент этого, свзывающий домен клостридиального токсина или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин может включать BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, a TeNT, BaNT или BuNT.

[038] В другом варианте воплощения гидрофобная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой. Примеры гидрофобных аминокислот включают, например, С, F, I, L, M, V и W. В другом аспекте данного варианта воплощения алифатическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой алифатической аминокислотой. Примеры алифатических аминокислот включают, например. А, I, L, Р, и V. В еще другом аспекте данного варианта воплощения ароматическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой ароматической аминокислотой. Примеры ароматических аминокислот включают, например, F, H, W и Y. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения стэкинг-взаимодействующая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой стэкинг-взаимодействующей аминокислотой. Примеры стэкинг-взаимодействующих аминокислот включают, например, F, H, W и Y. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения полярная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой полярной аминокислотой. Примеры полярных аминокислот включают, например, D, Е, K, N, Q и R. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения менее полярная или индифферентная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой менее полярной или индифферентной аминокислотой. Примеры менее полярных или индифферентных аминокислот включают, например, А, H, G, P, S, Т и Y. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения положительно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой положительно заряженной аминокислотой. Примеры положительно заряженных аминокислот включают, например, K, R и H. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения отрицательно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой отрицательно заряженной аминокислотой. Примеры отрицательно заряженных аминокислот включают, например, D и Е. В другом аспекте данного варианта воплощения малая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой малой аминокислотой. Примеры малых аминокислот включают, например. А, D, G, N, P, S и Т. В еще другом аспекте данного варианта воплощения С-бета разветвленная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи клостридиального токсина может быть заменена другой С-бета разветвленной аминокислотой. Примеры С-бета разветвленных аминокислот включают, например, I, Т и V.

[039] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин включает BoNT/A. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/A включает энзиматический домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/A и связывающий домен BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A содержит SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A содержит природный вариант BoNT/A, такой, как, например, изоформа BoNT/A или подтип BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A содержит природный вариант BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, изоформа BoNT/A или подтип BoNT/A. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/A, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/A, неконсервативный вариант BoNT/A или активный фрагмент BoNT/A, или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/A, не-консервативный вариант BoNT/A или активный фрагмент BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A включает энзиматический домен BoNT/A или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/A или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/A или активный фрагмент этого, или любую их комбинацию. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/A, включающий энзиматический домен BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[040] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/A содержит аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере,75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/A содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5.

[041] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BoNT/B. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит энзиматический домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B и связывающий домен BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит природный вариант BoNT/B, такой, как, например, изоформа BoNT/B или подтип BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит природный вариант BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10, такой, как, например, изоформа BoNT/B или подтип BoNT/B. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/B, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/B, неконсервативный вариант BoNT/B, активный фрагмент BoNT/B или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/B, не-консервативный вариант BoNT/B, активный фрагмент BoNT/B или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит энзиматический домен BoNT/B или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/B или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/B или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/B содержит энзиматический домен BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[042] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/B содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, например, по меньшей мере,70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:102; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или, максимально 95% с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/B содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8. SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/B содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.

[043] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BoNT/Cl. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит энзиматический домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/Cl и связывающий домен BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит природный вариант BoNT/Cl, такой, как, например, изоформа BoNT/Cl или подтип BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит природный вариант BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, изоформа BoNT/Cl или подтип BoNT/Cl. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения, BoNT/Cl содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/Cl, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/Cl, не-консервативный вариант BoNT/Cl, активный фрагмент BoNT/Cl или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/Cl, не-консервативный вариант BoNT/Cl, активный фрагмент BoNT/Cl или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит энзиматический домен BoNT/Cl или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/Cl или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/Cl или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит энзимтический домен BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[044] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или максимально 95% с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; или, максимально 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,20, 30,40, 50, 100,200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/Cl содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:3; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12.

[045] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BoNT/D. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит энзиматический доменВоОТЛ), транслокационный домен BoNT/D и связывающий домен BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит природный вариант BoNT/D, такой, как, например, изоформа BoNT/D или подтип BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит природный вариант BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, изоформа BoNT/D или подтип BoNT/D. subtype. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/D, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/D, не-консервативный вариант BoNT/D, активный фрагмент BoNT/D или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/D, неконсервативный вариант BoNT/D, активный фрагмент BoNT/D или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит энзиматический домен BoNT/D или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/D или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/D или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит энзиматический домен BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14 или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14 или an активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[046] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/D содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере,75%, по меньшей мере,80%, по меньшей мере,85%, по меньшей мере,90%, или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или, максимально 95% с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще одних аспектах данного варианта воплощения BoNT/D содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30. 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/D содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; или, максимально 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14.

[047] В другом варианте воплощения, клостридиальный токсин содержит BoNT/E. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит энзиматический домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/E и связывающий домен BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит природный вариант BoNT/E, такой, как, например, изоформа BoNT/E или подтип BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит природный вариант BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, изоформа BoNT/E или подтип BoNT/E. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/E, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/E, не-консервативный вариант BoNT/E, активный фрагмент BoNT/E или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17, такой, как, например, консервтивный вариант BoNT/E, не-консервативный вариант BoNT/E, активный фрагмент BoNT/E или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит энзиматический домен BoNT/E или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/E или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/E или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/E содержит энзиматический домен BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[048] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/E содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; или максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или максимально 95% с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/E содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/E содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17.

[049] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BoNT/F. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит энзиматический домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F и связывающий домен BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит природный вариант BoNT/F, такой, как, например, изоформа BoNT/F или подтип BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит природный вариантВоЭТ/Р с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, изоформа BoNT/F или подтип BoNT/F. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/F, такой, как, например, консервативный вариан BoNT/F, не-консервативный вариант BoNT/F, активный фрагмент BoNT/F или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, консервативный вариан BoNT/F, не-консервативный вариант BoNT/F, активный фрагмент BoNT/F или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит энзиматиеский домен BoNT/F или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/F или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/F или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/F содержит энзиматический домен BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20 или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20 или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[050] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/F содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; или максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или максимально 95% с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/F содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/F содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; или, максимально 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30,40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20.

[051] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BoNT/G. В аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит энзиматический домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G и связывающий домен BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит SEQ ID NO:21. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит природный вриант BoNT/G, такой, как, например, изоформа BoNT/G или подтип BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит природный вариант BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, а изоформа BoNT/G или подтип BoNT/G с SEQ ID NO:21. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/G, такой, как, например, консервативный вариант BoNT/G, неконсервативный вариант BoNT/G или актимвный фрагмент BoNT/G, или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/D содержит не встречающийся в природе вариант BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, нстример, консервативный вариант BoNT/G, не-консервативный вариант BoNT/G, активный фрагмент BoNT/G или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит энзимтический домен BoNT/G или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/G или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/G или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BoNT/G содержит энзиматический домен BoNT/G с SEQ ID NO:21 или активный фрагмент этого, транслокационный домен BoNT/G с SEQ ID NO:21 или активный фрагмент этого, связывающий домен BoNT/G с SEQ ID NO:21 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[052] В других аспектах данного варианта воплощения BoNT/G содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:21; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или максимально 95% с SEQ ID NO:21. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/G содержит а полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:21. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/G содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:21.

[053] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит TeNT. В аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит энзиматический домен TeNT, транслокационный домен TeNT и связывающий домен TeNT. В аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит SEQ ID NO:22. В другом аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит природный вариант TeNT, такой, как, например, изоформа TeNT или подтип TeNT. В другом аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит природный вариант TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, изоформа TeNT или подтип TeNT. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит не встречающийся в природе вариант TeNT, такой, как, например, консервативный вариант TeNT, не-консервативный вариант TeNT, активный фрагмент TeNT или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит не встречающийся в природе вариант TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, консервативный вариант TeNT, не-консервативный вариант TeNT, активный фрагмент TeNT или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит энзиматический домен TeNT или активный фрагмент этого, транслокационный домен TeNT или активный фрагмент этого, связывающий домен TeNT или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения TeNT содержит энзиматический домен TeNT с SEQ ID NO:22 или активный фрагмент этого, транслокационный домен TeNT с SEQ ID NO:22 или активный фрагмент этого, связывающий домен TeNT с SEQ ID NO:22 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[054] В других аспектах данного варианта воплощения TeNT содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:22; или максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или максимально 95% с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения TeNT содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:22. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения TeNT содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:22.

[055] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BaNT. В аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит энзиматический домен BaNT, транслокационный домен BaNT и связывающий домен BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит SEQ ID NO:23. В другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит природный вариант BaNT, такой, как, например, изоформа BaNT или подтип BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит природный вариант BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, изоформа BaNT или подтип BaNT. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит не встречающийся в природе вариант BaNT, такой, как, например, консервативный вариант BaNT, не-консервативный вариант BaNT или активный фрагмент BaNT, или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит не встречающийся в природе вариант BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, консервативный вариант BaNT, не-консервативный вариант BaNT, активный фрагмент BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит энзиматический домен BaNT или активный фрагмент этого, транслокационный домен BaNT или активный фрагмент этого, связывающий домен BaNT или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BaNT содержит энзиматический домен BaNT с SEQ ID NO:23 или активный фрагмент этого, транслокационный домен BaNT с SEQ ID NO:23 или активный фрагмент этого, связывающий домен BaNT с SEQ ID NO:23 или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[056] В других аспектах данного варианта воплощения BaNT содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:23; или максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или максимально 95% с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения BaNT содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:23. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BaNT содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:23.

[057] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин содержит BuNT. В аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит энзиматический домен BuNT, транслокационный домен BuNT и связывающий домен BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит природный вариант BuNT, такой, как, например, изоформа BuNT или подтип BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит природный вариант BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, изоформа BuNT или подтип BuNT. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит не встречающийся в природе вариант BuNT, такой, как, например, консервативный вариан BuNT, не-консервативный вариант BuNT, активный фрагмент BuNT или любую комбинацию этого. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит не встречающийся в природе вариант BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, консервативный вариант BuNT, не-консервативный вариант BuNT variant, активный фрагмент BuNT или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит энзиматический домен BuNT или активный фрагмент этого, транслокационный домен BuNT или активный фрагмент этого, связывающий домен BuNT или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения BuNT содержит энзимтический домен BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, или активный фрагмент этого, транслокационный домен BuNT SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, или активный фрагмент этого, связыващий домен BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, или активный фрагмент этого, или любую комбинацию этого.

[058] В других аспектах данного варианта воплощения BuNT содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90%, или, максимально 95% с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения BuNT содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BuNT содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[059] В данном контексте термин «гибрид клостридиального токсина» или «гибриды клостридиального токсина» относится к молекуле, содержащей, по меньшей мере, часть из одного клостридиального токсина и часть из, по меньшей мере, одного другого белка для образования токсина с, по меньшей мере, одним свойством, отличным от референтных клостридиальных токсинов из Таблицы 1. Не имеющие ограничительного характера примеры гибридов клостридиального токсина включают клостридиальный токсин, включающий энзиматический домен, не относящийся к клостридиальному токсину, клостридиальный токсин, включающий транслокационный домен, не относящийся к клостридиальному токсину, клостридиальный токсин, включающий связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, или любую комбинацию этого. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры гибридов клостридиального токсина включают клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен от другого клостридиального токсина, клостридиальный токсин, содержащий транслокационный домен от другого клостридиального токсина, клостридиальный токсин, содержащий связывающий домен от другого клостридиального, или любую комбинацию этого.

[060] Один класс клостридиального токсина содержит модифицированный клостридиальный токсин, где энзиматический домен или часть этого, транслокационный домен или часть этого и/или связывающий домен или часть этого от природного клостридиального токсина модифицирована или замещена энзиматическим доменом или частью этого, транслокационным доменом или частью этого и/или связывающим доменом или частью этого от другого клостридиального токсина. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, связывающий домен BoNT/A может быть замещен свяыващий доменом BoNT/B с получением гибрида клостридиального токсина, включающего энзиматический домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/A и связывающий домен BoNT/B. Такие гибриды клостридиального токсина описаны в, например, J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent 7,132,259, который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В качестве другого не имеющего ограничительного характера примера, мотив лейцина из BoNT/A может быть вставлен в легкую цепь BoNT/E с целью повышения биологической персистенции. Такие гибриды клостридиального токсина описаны в, например. Lance E. Steward et al., Leucine-based Motif and Clostridial Toxms.U.S. Patent Publication 2003/0027752 (Feb. 6, 2003); Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins.V.S. Patent Publication 2003/0219462 (Nov. 27, 2003); и Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins,U.S. Patent Publication 2004/0220386 (Nov. 4, 2004), каждый из которых включен посредством ссылки во всей полноте.

[061] Другой класс гибрида клостридиального токсина содержит клостридиальный токсин, где связывающий домен природного клостридиального токсина модифицирован или замещен связывающим доменом, не относящимся к клостридиальному токсину. Такие гибриды клостридиального токсина обладают измененной активностью связывания с клеткой, так как модифицированный токсин может, например, 1) использовать тот же рецептор, присутствующий на поверхности клетки-мишени природного клостридиального токсина, что и используется природным клостридиальным токсином, рассматриваемая как повышенная активность связывания с клеткой-мишенью природного клостридиального токсина; 2) использовать другой рецептор, присутствующий на поверхности клетки-мишени природного клостридиального токсина, что рассматривается как измененная активность связывания с клеткой-мишенью природного клостридиального токсина; или 3) использовать другой рецептор, присутствующий на поверхности клетки-мишени, не относящейся к клетке мишени клостридиального токсина, что рассматривается как измененная активность связывания с клеткой-мишенью не встречающегося в природе клостридиального токсина, перенаправленный токсин или TVEMP (Targeted Vesicular Exocytosis Modulator Protein -. белок - модулятор направленного везикулярного экзоцитоза).

[062] Гибридом клостридиального токсина может быть клостридиальный токсин с повышенной способностью к связыванию с клеткой, способный вызывать интоксикацию клетки-мишени природного клостридиального токсина, например, моторного нейрона. Одним из способов достижения этой повышенной связывающей активности является модификация эндогенного связывающего домена природного клостридиального токсина с целью повышения способности связывания с клеткой или с его природным рецептором. Такие модификации домена таргетинга приводят в результате к, например, повышенной активности связывания с клеткой, которая повышает аффинность связывания для эндогенного рецептора клостридиального токсина, присутствующего на клетке-мишени природного клостридиального токсина; к повышенной активности связывания с клеткой, которая повышает специфичность связывания для подгруппы эндогенных рецепторов клостридиального токсина, присутствующих на клетке-мишени природного клостридиального токсина; или к повышенной активности связывания с клеткой, которая повышает как аффинность связывания, так и специфичность связывания. Не имеющие ограничительного характера примеры модифицированных клостридиальных токсинов и повышенной активности связывания с клеткой для рецептора природного клостридиального токсина описаны в, например, Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, U.S. Patent Publication 2008/0096248; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, International Patent Publication 2008/105901; каждый из которых включен здесь посредством ссылки во всей полноте.

[063] Гибридом клостридиального токсина может быть клостридиальный токсин с измененной активностью связывания с клеткой, способный вызывать интоксикацию клетки-мишени природного клостридиального токсина, например, моторного нейрона. Одним из способов достижения этой повышенной связывающей активности является замещение эндогенного связывающего домена природного клостридиального токсина связывающим доменом другой молекулы, которая предпочтительно связывается с различными рецепторами, присутствующими на клетке-мишени. Такая модификация связывающего домена приводит в результате к модифицированному токсину, способному предпочтительно связываться с рецепторами, не относящимися к рецепторам клостридиального токсина, присутствующими на клетке-мишени клостридиального токсина. Эта повышенная связывающая активность в отношении клеток - мишеней природного клостридиального токсина позволяет использовать более низкие эффективные дозы модифицированного клостридиального токсина, вводимого индивидууму, так как к клетке-мишени будет доставляться больше токсина. Поэтому модифицированные клостридиальные токсины с повышенной связывающей способностью уменьшат нежелательную дисперсию токсина на зоны, которые не являются мишенями лечения, тем самым снижая или предотвращая нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с диффузией клостридиального токсина на нежелательные локализации. Не имеющие ограничительного характера примеры модифицированных клостридиальных токсинов с измененной способностью связываться с клеткой - мишенью клостридиального токсина описаны в, например. Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use.V.S. Patent 7,514,088; Lance E. Steward et al., Модифицированный Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities Ftinu Clostridial Toxin Target Cells, U.S. Patent Publication 2008/0161543; Lance E. Steward, Модифицированный Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity funu Clostridial Toxin Target Cells.V.S. Patent Publication 2008/0241881; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use,V.S. Patent Publication 2009/0048431; Lance E. Steward et al.. Модифицированный Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities Funu Clostridial Toxin Target Cells, International Patent Publication WO 2007/106115; каждый из которых включен здесь посредством ссылки во всей полноте.

[064] Гибридом клостридиального токсина может быть клостридиальный токсин с измененной активностью связывания с клеткой, способный вызывать интоксикацию клетки, отличной от клетки-мишени природного клостридиального токсина, например, клетки, отличной от моторного нейрона. Называемые TVEMP, эти молекулы вызывают интоксикацию при использовании рецептора-мишени, присутствующей на клетке -мишени, не являющейся клеткой-мишенью клостридиального токсина. Эта способность к перенаправливанию достигается путем замещения природного связывающего домена клостридиального токсина связывающим доменом, демонстрирующим предпочтительную связывающую активность для рецептора, не являющегося рецептором клостридиального токсина, присутствующим на клетке, не являющейся клеткой-мишенью клостридиального токсина. Такие модификации связывающего домена приводят в результате к модифицированному токсину, который способный предпочтительно связываться с рецептором, не являющимся рецептором клостридиального токсина, присутствующим на клетке, не являющейся клеткой-мишенью клостридиального токсина. Гибрид клостридиального токсина с измененной способностью к таргетингу в отношении клеток-мишеней, не являющихся клетками-мишенями клостридиального токсина может связываться с рецептором-мишенью, транслоцироваться в цитоплазму и проявлять свое протеолитическое действие на комплекс SNARE клеток-мишеней, не являющихся клетками-мишенями клостридиального токсина. Не имеющие ограничительного характера примеры гибридов клостридиального токсина с измененным свойством таргетинга в отношении клеток, не являющихся клетками-мишенями клостридиального токсина описаны в, например, Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions,V.S. Patent 5,989,545; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, U.S. Patent 6,461,617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion.V.S. Patent 6,632,440; Lance E. Steward et al., Methods and Compositions for the Treatment of Pancreatitis, U.S. Patent 6,843,998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins. U.S. Patent 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain.V.S. Patent 7,244,437; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain,V.S. Patent 7,413,742; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain,U.S. Patent 7,415,338; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use,V.S. Patent 7,514,088; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells,V.S. Patent Publication 2006/0216283; Keith A. Foster, Fusion Proteins,U.S. Patent Publication 2008/0064092; Keith A. Foster, Fusion Proteins, U.S. Patent Publication 2009/0035822; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, U.S. Patent Publication 2009/0048431; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, U.S. Patent Publication 2009/0162341; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, International Patent Publication WO 2005/023309; и Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, International Patent Application WO 2008/008805; каждый из которых включен здесь посредством ссылки во всей полноте.

[065] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, энзиматический домен клостридиального токсина. В данном контексте термин «энзиматический домен клостридиального токсина» относится к любому полипептиду клостридиального токсина, способному выполнять этап процесса интоксикации - энзиматическую модификацию мишени. Таким образом, энзиматический домен клостридиального токсина специфически направлен по отношению к клостридиального токсина и охватывает протеолитическое расщепление субстрата клостридиального токсина, такого, как, например, субстрата SNAP-25, схожего с белками SNARE, субстрата VAMP и субстрата синтаксина. Не имеющие ограничительного характера примеры энзиматического домена клостридиального токсина включают, например, энзиматический домен BoNT/A, энзиматический домен BoNT/B, энзиматический домен BoNT/Cl, энзиматический домен BoNT/D, энзиматический домен BoNT/E, энзиматический домен BoNT/F, энзиматический домен BoNT/G, энзиматический домен TeNT, энзиматический домен BaNT и энзиматический домен BuNT.

[066] Энзиматический домен клостридиального токсина включает, без ограничений, энзиматический домен природных вариантов клостридиального токсина, такого, как, например, энзиматический домен изоформ клостридиального токсина и энзиматический домен подтипов клостридиального токсина, и энзиматический домен не встречающихся в природе вариантов клостридиального токсина, такого, как, например, энзиматический домен консервативных вариантов клостридиального токсина, энзиматический домен неконсервативных вариантов клостридиального токсина, энзиматический домен активных фрагментов этого, или любую комбинацию этого.

[067] В данном контексте термин «вариант энзиматического домена клостридиального токсина» - природного или не встречающегося в природе - относится к энзиматическому домену клостридиального токсина, имеющему изменение в, по меньшей мере, одной аминокислоте, по сравнению с соответствующим участком раскрываемых референтных последовательностей (Таблица 1), и который может быть описан в процентной идентичности с соответствующим участком референтной последовательности. Если не указано точно, вариантами энзиматического домена клостридиального токсина, пригодными для выполнения раскрываемых вариантов воплощения, являются варианты, которые осуществляют этап энзиматической модификации мишени в процессе интоксикации. В качестве примеров, не имеющих ограничительного характера, вариант энзиматического домена BoNT/A будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-429 SEQ ID NO:1; вариант энзиматического домена BoNT/B будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:6; вариант энзиматического домена BoNT/Cl будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:11; вариант энзиматического домена BoNT/D будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:13; вариант энзиматического домена BoNT/E будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-411 SEQ ID NO:15; вариант энзиматического домена BoNT/F будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-428 SEQ ID NO:18; вариант энзиматического домена BoNT/G будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-438 SEQ ID NO:21; вариант энзиматического домена TeNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-438 SEQ ID NO:22; вариант энзиматического домена BaNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-420 SEQ ID NO:23; и вариант энзиматического домена BuNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 1/2-411 SEQ ID NO:24.

[068] Специалистами в области техники признается, что в каждом серотипе клостридиального токсина могут существовать природные варианты энзиматического домена клостридиального токсина, которые несколько различаются по своей аминокислотной последовательности, а также по нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки. Например, в настоящее время имеется пять подтипов BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5, со специфическими подтипами энзиматического домена, демонстрирующие, приблизительно, от 80% до 95% идентичности аминокислот при сравнении с энзиматическим доменом BoNT/A с SEQ ID NO:1. В данном контексте термин «природный вариант энзиматического домена клостридиального токсина» относится к любому энзиматическому домену клостридиального токсина, создаваемому в результате природного процесса, включая, без ограничений, изоформы энзиматического домена клостридиального токсина, создаваемые из альтернативно сплайсированных транскриптов, изоформы энзиматического домена клостридиального токсина, создаваемые путем спонтанной мутации, и подтипы энзиматического домена клостридиального токсина. Природный вариант энзиматического домена клостридиального токсина может функционировать в значительной степени тем же способом, что и референтный вариант энзиматического домена клостридиального токсина, на котором базируется природный вариант энзиматического домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный энзиматический домен клостридиального токсина в любом аспекте настоящего описания.

[069] Не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта энзиматического домена клостридиального токсина - изоформа энзиматического домена клостридиального токсина, такая, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/A, изоформа энзиматического домена BoNT/B, изоформа энзиматического домена BoNT/Cl, изоформа энзиматического домена BoNT/D изоформа энзиматического домена BoNT/E, изоформа энзиматического домена BoNT/F, изоформа энзиматического домена BoNT/G, изоформа энзиматического домена TeNT, изоформа энзиматического домена BaNT и изоформа энзиматического домена BuNT. Другие не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта энзиматического домена клостридиального токсина - подтип энзиматического домена, такой, как, например, энзиматический домен из подтипа BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 или BoNT/A5; энзиматический домен из подтипа BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/Bbv, или BoNT/Bnp; энзиматический домен из подтипа BoNT/Cl-1 или BoNT/Cl-2; энзиматический домен из подтипа BoNT/E 1, BoNT/E2 и BoNT/Е3; энзиматический домен из подтипа BoNT/Fl, BoNT/F2 или BoNT/F3; и энзиматический домен из подтипа BuNT-1 или BuNT-2.

[070] В данном контексте термин «не встречающийся в природе вариант энзиматического домена клостридиального токсина» относится к любому энзиматическому домену клостридиального токсина, производимому с помощью человеческой манипуляции, включая, без ограничения, энзиматические домены клостридиального токсина вырабатываемые путем генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или конструктивного расчета, и энзиматические домены клостридиального токсина, вырабатываемые путем химического синтеза. Не имеющие ограничительного характера примеры не встречающихся в природе вариантов энзиматического домена клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты энзиматического домена клостридиального токсина, не-консервативные варианты энзиматического домена клостридиального токсина, гибридные варианты энзиматического домена клостридиального токсина и активные фрагменты энзиматического домена клостридиального токсина.

[071] В данном контексте термин «консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина» относится к энзиматическому домену клостридиального токсина, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который имеет, по меньшей мере, одно свойство, подобное свойству оригинальной аминокислоты из референтной последовательности энзиматического домена клостридиального токсина (Таблица 1). Примеры свойств включают, без ограничения, сходный размер, топографию, заряд, гидрофобность, липофильность, способность к ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химическое свойство, тому подобное, или любую комбинацию этого. Консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный энзиматический домен клостридиального токсина, на котором базируется консервативный вариант клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный энзиматический домен клостридиального токсина в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры консервативного энзиматического домена клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/A, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/B, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/Cl, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/D, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/E, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/F, консервативные варианты энзиматического домена BoNT/G, консервативные варианты энзиматического домена TeNT, консервативные варианты энзиматического домена BaNT и консервативные варианты энзиматического домена BuNT.

[072] В данном контексте термин «не-консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина» относится к энзиматическому домену клостридиального токсина, в котором 1) по меньшей мере, одна аминокислота удалена из референтного энзиматического домена клостридиального токсина, на котором базируется неконсервативный энзиматический домен клостридиального токсина; 2) по меньшей мере, одна аминокислота добавлена к референтному энзиматическому домену клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный энзиматический домен клостридиального токсина; или 3) по меньшей мере, одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который не имеет никакого свойства, подобного свойству последовательности референтного энзиматического домена клостридиального токсина (Таблица 1). Не-консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный энзиматический домен клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный энзиматический домен клостридиальный токсин в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры не-консервативного варианта энзиматического домена клостридиального токсина, включают, например, не-консервативные варианты энзиматического домена BoNT/A, не-консервативные варианты энзиматического домена BoNT/B, не-консервативные варианты энзиматического домена BoNT/Cl, неконсервативные варианты энзиматического домена BoNT/D, не-консервативные варианты энзиматического домена BoNT/E, не-консервативные варианты энзиматического домена BoNT/F, не-консервативные варианты энзиматического домена BoNT/G и неконсервативные варианты энзиматического домена TeNT, не-консервативные варианты энзиматического домена BaNT и не-консервативные варианты энзиматического домена BuNT.

[073] В данном контексте термин «активный фрагмент энзиматического домена клостридиального токсина» относится к любому из ряда фрагментов клостридиального токсина, содержащих энзиматический домен, который может быть пригоден в аспектах настоящего описания при условии, что эти фрагменты энзиматического домена могут специфически осуществлять таргетинг ключевых компонентов аппарата высвобождения нейромедиатора и таким образом принимать участие в осуществление полного клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат.Энзиматические домены клостридиальных токсинов имеют длину, приблизительно, 420-460 аминокислот и содержат энзиматический домен (Таблица 1). Исследования показали, что вся длина энзиматического домена клостридиального токсина не является необходимой для энзиматической активности энзиматического домена. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, первые восемь аминокислот энзиматического домена BoNT/A не являются необходимыми для энзиматической активности. Как другой пример, не имеющий ограничительного характера, первые восемь аминокислот энзиматического домена TeNT не являются необходимыми для энзиматической активности. Сходным образом, карбоксильный конец энзиматического домена не являются необходимыми для активности. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, последние 32 аминокислоты энзиматического домена BoNT/A не требуются для энзиматической активности. Как другой пример, не имеющий ограничительного характера, последние 31 аминокислот энзиматического домена TeNT не требуются для энзиматической активности. Поэтому аспекты данного варианта воплощения включают энзиматические домены клостридиального токсина, содержащие энзиматический домен, имеющий в длину, например, по меньшей мере, 350, 375, 400, 425 или 450 аминокислот.Другие аспекты данного варианта воплощения включают энзиматические домены клостридиального токсина, содержащие энзиматический домен, имеющий в длину, например, максимально 350, 375, 400, 425 или 450 аминокислот.

[074] Для определения процента идентичности природных вариантов энзиматического домена клостридиального токсина и не встречающихся в природе вариантов энзиматического домена клостридиального токсина могут быть использованы любые из ряда способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничений, общие способы, локальные способы и гибридные способы, такие, как, например, способы разделения на сегменты. Протоколы для определения процентной идентичности являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[075] Таким образом, в варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, содержит энзиматический домен клостридиального токсина. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит природный вариант энзиматического домена, такой, как, например, изоформа энзиматического домена клостридиального токсина или подтип энзиматического домена клостридиального токсина. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена клостридиального токсина, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина, не-консервативный вариант энзиматического домена клостридиального токсина, активный фрагмент энзиматического домена клостридиального токсина, или любую комбинацию этого.

[076] В другом варианте воплощения гидрофобная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой. Примеры гидрофобных аминокислот включают, например. С, F, I, L, М, V и W. В другом аспекте данного варианта воплощения алифатическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой алифатической аминокислотой. Примеры алифатических аминокислот включают, например, А, I, L, P, и V. В еще другом аспекте данного варианта воплощения ароматическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой ароматической аминокислотой. Примеры ароматических аминокислот включают, например, F, H, W и Y. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения стэкинг-взаимодействующая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой стэкинг-взаимодействующей аминокислотой. Примеры стэкинг-взаимодействующих аминокислот включают, например, F, H, W и Y. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения полярная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой полярной аминокислотой. Примеры полярных аминокислот включают, например, D, Е, K, N, Q и R. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения менее полярная или индифферентная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой менее полярной или индифферентной аминокислотой. Примеры менее полярных или индифферентных аминокислот включают, например, А, H, G, P, S, Т и Y. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения положительно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой положительно заряженной аминокислотой. Примеры положительно заряженных аминокислот включают, например, K, R и H. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения отрицательно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой отрицательно заряженной аминокислотой. Примеры отрицательно заряженных аминокислот включают, например, D и Е. В другом аспекте данного варианта воплощения малая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой малой аминокислотой. Примеры малых аминокислот включают, например, А, D, G, N, P, S и Т. В еще другом аспекте данного варианта воплощения С-бета разветвленная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи энзиматического домена клостридиального токсина может быть заменена другой С-бета разветвленной аминокислотой. Примеры С-бета разветвленных аминокислот включают, например, I, Т и V.

[077] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/A. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/А содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/A содержит аминокислоты 1/2-429 с SEQ ID NO:1. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/A, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/A или энзиматический домен из подтипа BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/A или подтип энзиматического домена BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A содержит аминокислоты 1/2-429 природного варианта энзиматического домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/A или подтип энзиматического домена BoNT/A. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BoNT/A, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/A, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/A, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/A, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/A, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A содержит аминокислоты 1/2-429 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/A, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/A, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/A, или любую комбинацию этого.

[078] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-429 SEQ ID NO:1; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-429 SEQ ID NO:1.

[079] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-429 SEQ ID NO:1; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-429 SEQ ID NO:1. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-429 SEQ ID NO:1; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-429 SEQ ID NO:1.

[080] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/B. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/B содержит аминокислоты 1/2-436 с SEQ ID NO:6. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/B, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/B или энзиматический домен из подтипа BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/B или подтип энзиматического домена BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит аминокислоты 1/2-436 природного варианта энзиматического домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/B или подтип энзиматического домена BoNT/B. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BoNT/B, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/B, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/B, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/B, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/B, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/B, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/B, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B содержит аминокислоты 1/2-436 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/B, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/B, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/B, или любую комбинацию этого.

[081] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:6; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:6.

[082] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:6; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:6. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:6; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:6.

[083] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/Cl. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 1/2-436 с SEQ ID NO:11. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/Cl или энзиматический домен из подтипа BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/Cl или подтип энзиматического домена BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 1/2-436 природного варианта энзиматического домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/Cl или подтип энзиматического домена BoNT/Cl. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BoNT/Cl, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 1/2-436 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/Cl, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого.

[084] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:11; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:11.

[085] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:11; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:11. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:11; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:11.

[086] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/D. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/D содержит аминокислоты 1/2-436 с SEQ ID NO:13. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/D, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/D или энзиматический домен из подтипа BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/D или подтип энзиматического домена BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит аминокислоты 1/2-436 природного варианта энзиматического домена BoNT/D с SEQ ID NO:13, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/D или подтип энзиматического домена BoNT/D. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит не встречающийся в природе вариант, энзиматического домена BoNT/D, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/D, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/D, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/D, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/D, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/D, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/D, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D содержит аминокислоты 1/2-436 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/D с SEQ ID NO:13, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/D, неконсервативный вариант энзиматического домена BoNT/D, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/D, или любую комбинацию этого.

[087] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:13; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-436 SEQ ID NO:13.

[088] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:13; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:13. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:13; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-436 SEQ ID NO:13.

[089] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/E. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/E содержит аминокислоты 1/2-411 с SEQ ID NO:15. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/E, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/E или энзиматический домен из подтипа BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/E или подтип энзиматического домена BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит аминокислоты 1/2-411 природного варианта энзиматического домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/E или подтип энзиматического домена BoNT/E. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BoNT/E, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/E, неконсервативный вариант энзиматического домена BoNT/E, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/E, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/E, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/E, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/E, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E содержит аминокислоты 1/2-411 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/E, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/E, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/E, или любую комбинацию этого.

[090] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере,70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-411 SEQ ID NO:15; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-411 SEQ ID NO:15.

[091) В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:15; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:15. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:15; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:15.

[092] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/F. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/F содержит аминокислоты 1/2-428 с SEQ ID NO:18. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/F, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/F или энзиматический домен из подтипа BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/F или подтип энзиматического домена BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит аминокислоты 1/2-428 природного варианта энзиматического домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/F или подтип энзиматического домена BoNT/F. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BoNT/F, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/F, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/F, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/F, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/F, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/F, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/F, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F содержит аминокислоты 1/2-428 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/F, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/F, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/F, или любую комбинацию этого.

[093] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-428 SEQ ID NO:18; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-428 SEQ ID NO:18.

[094] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-428 SEQ ID NO:18; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-428 SEQ ID NO:18. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-428 SEQ ID NO:18; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-428 SEQ ID NO:18.

[095] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/G. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:21. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/G содержит аминокислоты 1/2-4435 с SEQ ID NO:21. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/G, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BoNT/G или энзиматический домен из подтипа BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит природный вариант энзиматического домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/G или подтип энзиматического домена BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит аминокислоты 1/2-4435 природного варианта энзиматического домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BoNT/G или подтип энзиматического домена BoNT/G. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BoNT/G, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/G, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/G, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/G, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/G, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/G, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/G, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G содержит аминокислоты 1/2-4435 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BoNT/G, не-консервативный вариант энзиматического домена BoNT/G, активный фрагмент энзиматического домена BoNT/G, или любую комбинацию этого.

[096] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:21; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:21. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-4435 SEQ ID NO:21; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-4435 SEQ ID NO:21.

[097] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:21; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:21. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-4435 SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-4435 SEQ ID NO:21. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:21; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:21. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-4435 SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-4435 SEQ ID NO:21.

[098] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен TeNT. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:22. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен TeNT содержит аминокислоты 1/2-438 с SEQ ID NO:22. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит природный вариант энзиматического домена TeNT, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы TeNT или энзиматический домен из подтипа TeNT. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит природный вариант энзиматического домена TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, изоформа энзиматического домена TeNT или подтип энзиматического домена TeNT. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит аминокислоты 1/2-438 природного варианта энзиматического домена TeNT с SEQ ID NO:22, такого, как, например, изоформа энзиматического домена TeNT или подтип энзиматического домена TeNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена TeNT, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена TeNT, не-консервативный вариант энзиматического домена TeNT, активный фрагмент энзиматического домена TeNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена TeNT, неконсервативный вариант энзиматического домена TeNT, активный фрагмент энзиматического домена TeNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT содержит аминокислоты 1/2-438 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена TeNT с SEQ ID NO:22, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена TeNT, неконсервативный вариант энзиматического домена TeNT, активный фрагмент энзиматического домена TeNT, или любую комбинацию этого.

[099] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:22; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-438 SEQ ID NO:22; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-438 SEQ ID NO:22.

[0100] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:22; максимально 1, 2, 3, 4, 5 6 7 8 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-438 SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-438 SEQ ID NO:22. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:22; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:22. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-438 SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-438 SEQ ID NO:22.

[0101] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BaNT. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:23. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BaNT содержит аминокислоты 1/2-420 с SEQ ID NO:23. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит природный вариант энзиматического домена BaNT, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BaNT или энзиматический домен из подтипа BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит природный вариант энзиматического домена BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BaNT или подтип энзиматического домена BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит аминокислоты 1/2-420 природного варианта энзиматического домена BaNT с SEQ ID NO:23, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BaNT или подтип энзиматического домена BaNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BaNT, такой, как например, консервативный вариант энзиматического домена BaNT, не-консервативный вариант энзиматического домена BaNT, активный фрагмент энзиматического домена BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BaNT, неконсервативный вариант энзиматического домена BaNT, активный фрагмент энзиматического домена BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT содержит аминокислоты 1/2-420 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BaNT с SEQ ID NO:23, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BaNT, неконсервативный вариант энзиматического домена BaNT, активный фрагмент энзиматического домена BaNT, или любую комбинацию этого.

[0102] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:23; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-420 SEQ ID NO: 23; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-420 SEQ ID NO:23.

[0103] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:23; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-420 SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-420 SEQ ID NO:23. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:23; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:23. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-420 SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-420 SEQ ID NO:23.

[0104] В другом варианте воплощения энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BuNT. В аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит энзиматические домены с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BuNT содержит аминокислоты 1/2-411 с SEQ ID NO:24. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит природный вариант энзиматического домена BuNT, такой, как, например, энзиматический домен из изоформы BuNT или энзиматический домен из подтипа BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит природный вариант энзиматического домена BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, изоформа энзиматического домена BuNT или подтип энзиматического домена BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит аминокислоты 1/2-411 природного варианта энзиматического домена BuNT с SEQ ID NO:24, такого, как, например, изоформа энзиматического домена BuNT или подтип энзиматического домена BuNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит не встречающийся в природе вариант энзиматического домена BuNT, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BuNT, не-консервативный вариант энзиматического домена BuNT, активный фрагмент энзиматического домена BuNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит энзиматический домен не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BuNT c SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BuNT, не-консервативный вариант энзиматического домена BuNT, активный фрагмент энзиматического домена BuNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT содержит аминокислоты 1/2-411 не встречающегося в природе варианта энзиматического домена BuNT с SEQ ID NO:24, такого, как, например, консервативный вариант энзиматического домена BuNT, не-консервативный вариант энзиматического домена BuNT, активный фрагмент энзиматического домена BuNT, или любую комбинацию этого.

[0105] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с энзиматическим доменом с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1/2-411 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 1/2-411 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[0106] В других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно энзиматического домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения энзиматический домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1/2-411 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[0107] «Транслокационный домен» содержит часть тяжелой цепи клостридиального нейротоксина, обладающей транслокационной активностью. «Транслокация» означает способность содействовать транспорту полипептидов через везикулярную мембрану, тем самым экспонируя некоторые или все полипептиды в цитоплазму. В транслокации различных ботулинических нейротоксинов, как считается, задействовано аллостерическое конформационное изменение тяжелой цепи, вызванное снижением рН в эндосоме. Это конформационное изменение, как оказывается, задействует N-терминальную часть тяжелой цепи и ею модулируется, что в результате приводит к образованию пор на везикулярной мембране; это изменение позволяет протеолитической легкой цепи проникать из эндосомальной везикулы в цитоплазму. См., например. Lacy, et al., Nature Struct. Biol. 5:898-902 (October 1998).

[0108] Специалистам в области техники известна аминокислотная последовательность части тяжелой цепи ботулинического нейротоксина, опосредующая транслокацию; вдобавок в этой части также известны те аминокислотные остатки, которые, как известно, необходимы для обеспечения транслокационной активности. Поэтому, вполне в пределах квалификации обычного специалиста в области техники будет, например, использовать природную N-концевую терминальную половину тяжелой цепи любого из различных подтипов нейротоксина Clostridium tetanus или Clostridium botulinum в качестве транслокационного домена, или создать аналогичный транслокационный домен путем выравнивания первичных последовательностей N-концевых половин различных тяжелых цепей и отбора среди последовательностей консенсусной первичной транслокационной последовательности на основе консервативной аминокислоты, полярности, стерических и гидрофобных характеристик.

[0109] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, транслокационный домен клостридиального токсина. В данном контексте термин «транслокационный домен клостридиального токсина» относится к любому полипептиду клостридиального токсина, способному выполнять транлокационный этап процесса интоксикации, который опосредует транслокацию легкой цепи клостридиального токсина. Таким образом, транслокационный домен клостридиального токсина способствует передвижению легкой цепи клостридиального токсина через мембрану и осуществляет передвижение легкой цепи клостридиального токсина от мембраны внутриклеточной везикулы в цитоплазму клетки. Не имеющие ограничительного характера примеры транслокационного домена клостридиального токсина включают, например, транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT и транслокационный домен BuNT.

[0110] Транслокационный домен клостридиального токсина включает, без ограничений, транслокационный домен природных вариантов клостридиального токсина, такого, как, например, транслокационный домен изоформ клостридиального токсина и транслокационный домен подтипов клостридиального токсина, и транслокационный домен не встречающихся в природе вариантов клостридиального токсина, такого, как, например, транслокационный домен консервативных вариантов клостридиального токсина, транслокационный домен не-консервативных вариантов клостридиального токсина, транслокационный домен активных фрагментов этого, или любую комбинацию этого.

[0111] В данном контексте термин «вариант транслокационного домена клостридиального токсина» - природного или не встречающегося в природе - относится к транслокационному домену клостридиального токсина, имеющему изменение в, по меньшей мере, одной аминокислоте по сравнению с соответствующим участком раскрываемых референтных последовательностей (Таблица 1), и который может быть описан в процентной идентичности с соответствующим участком референтной последовательности. Если не указано точно, вариантами транслокационного домена клостридиального токсина, пригодными для выполнения раскрываемых вариантов воплощения, являются варианты, которые осуществляют транслокационный этап процесса интоксикации, который опосредует транслокацию легкой цепи клостридиального токсина. В качестве примеров, не имеющих ограничительного характера, вариант транслокационного домена BoNT/A будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 455-873 SEQ ID NO:1; вариант транслокационного домена BoNT/B будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 447-860 SEQ ID NO:6; вариант транслокационного домена BoNT/Cl будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 454-868 SEQ ID NO:11; вариант транслокационного домена BoNT/D будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 451-864 SEQ ID NO:13; вариант транслокационного домена BoNT/E будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 427-847 SEQ ID NO:15; вариант транслокационного домена BoNT/F будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 446-865 SEQ ID NO:18; вариант транслокационного домена BoNT/G будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 451-865 SEQ ID NO:21; вариант транслокационного домена TeNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 468-881 SEQ ID NO:22; вариант транслокационного домена BaNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 436-857 SEQ ID NO:23; и вариант транслокационного домена BuNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 427-847 SEQ ID NO:24.

[0112] Специалистами в области техники признается, что в каждом серотипе клостридиального токсина могут существовать природные варианты транслокационного домена клостридиального токсина, которые несколько различаются по своей аминокислотной последовательности, а также по нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки. Например, в настоящее время имеется пять подтипов BoNT/A, BoNT/A1 BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5, со специфическими подтипами транслокационного домена, демонстрирующие, приблизительно, от 85% до 87% идентичность аминокислот при сравнении с транслокационным доменом BoNT/A с SEQ ID NO:1. В данном контексте термин «природный вариант транслокационного домена клостридиального токсина» относится к любому транслокационному домену клостридиального токсина, создаваемому в результате природного процесса, включая, без ограничений, изоформы транслокационного домена клостридиального токсина, создаваемые из альтернативно сплайсированных транскриптов, изоформы транслокационного домена клостридиального токсина, создаваемые путем спонтанной мутации и подтипы транслокационного домена клостридиальпого токсина. Природный вариант транслокационного домена клостридиального токсина может функционировать в значительной степени тем же способом, что и референтный вариант транслокационного домена клостридиального токсина, на котором базируется природный вариант транслокационного домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный транслокационный домен клостридиального токсина в любом аспекте настоящего описания.

[0113] Не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта транслокационного домена клостридиального токсина - изоформа транслокационного домена клостридиального токсина, такая, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/A, изоформа транслокационного домена BoNT/B, изоформа транслокационного домена BoNT/Cl, транслокационного домена BoNT/D изоформа транслокационного домена BoNT/E, изоформа транслокационного домена BoNT/F, изоформа транслокационного домена BoNT/G, нзоформа транслокационного домена TeNT, изоформа транслокационного домена BaNT и изоформа транслокационного домена BuNT. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта транслокационного домена клостридиального токсина - подтип транслокационного домена, такой, как, например, транслокационный домен из подтипа BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 или BoNT/A5; транслокационный домен из подтипа BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B бивалентный BoNT/B не-протеолитический; транслокационный домен из подтипа BoNT/Cl-1 или BoNT/Cl-2; транслокационный домен из подтипа BoNT/E1, BoNT/E2 и BoNT/Е3; транслокационный домен из подтипа BoNT/F1, BoNT/F2 или BoNTYF3; и транслокационный домен из подтипа BuNT-1 или BuNT-2.А.

[0114] В данном контексте термин «не встречающийся в природе вариант транслокационного домена клостридиального токсина» относится к любому транслокационному домену клостридиального токсина, производимому с помощью человеческой манипуляции, включая, без ограничения, транслокационные домены клостридиального токсина, вырабатываемые путем генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или конструктивного расчета, и транслокационные домены клостридиального токсина, вырабатываемые путем химического синтеза. Не имеющие ограничительного характера примеры не встречающихся в природе вариантов транслокационного домена клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты транслокационного домена клостридиального токсина, не-консервативные варианты транслокационного домена клостридиального токсина, гибридные варианты транслокационного домена клостридиального токсина и активные фрагменты транслокационного домена клостридиального токсина.

[01151 В данном контексте термин «консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина» относится к транслокационному домену клостридиального токсина, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который имеет, по меньшей мере, одно свойство, подобное свойству оригинальной аминокислоты из референтной последовательности транслокационного домена клостридиального токсина (Таблица 1). Примеры свойств включают, без ограничения, сходный размер, топографию, заряд, гидрофобность, липофильность, способность к ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химическое свойство, тому подобное, или любую комбинацию этого. Консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный транслокационный домен клостридиального токсин, на котором базируется консервативный вариант клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный транслокационный домен клостридиального токсина в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры консервативного транслокационного домена клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/A, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/B, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/Cl, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/D, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/E, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/F, консервативные варианты транслокационного домена BoNT/G, консервативные варианты транслокационного домена TeNT, консервативные варианты транслокационного домена BaNT и консервативные варианты транслокационного домена BuNT.

[0116] В данном контексте термин «не-консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина» относится к траислокационному домену клостридиального токсина, в котором 1) по меньшей мере, одна аминокислота удалена из референтного транслокационного домена клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный транслокационный домен клостридиального токсина; 2) по меньшей мере, одна аминокислота добавлена к референтному транслокационному домену клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный транслокационный домен клостридиального токсина; или 3) по меньшей мере, одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который не имеет никакого свойства, подобного свойству последовательности референтного транслокационного домена клостридиального токсина (Таблица 1). Не-консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный транслокационный домен клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный транслокационный домен клостридиальный токсин в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры не-консервативного варианта транслокационного домена клостридиального токсина, включают, например, не-консервативные варианты транслокационного домена BoNT/A, не-консервативные варианты транслокационного домена BoNT/B, не-консервативные варианты транслокационного домена BoNT/Cl, неконсервативные варианты транслокационного домена BoNT/D, не-консервативные варианты транслокационного домена BoNT/E, не-консервативные варианты транслокационного домена BoNT/F, не-консервативные варианты транслокационного домена BoNT/G и не-консервативные варианты транслокационного домена TeNT, неконсервативные варианты транслокационного домена BaNT и не-консервативные варианты транслокационного домена BuNT.

[0117] В данном контексте термин «активный фрагмент транслокационного домена клостридиального токсина» относится к любому из ряда фрагментов клостридиального токсина, содержащих транслокационный домен, который может быть пригоден в аспектах настоящего описания при условии, что эти активные фрагменты могут способствовать высвобождению легкой цепи из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени и тем самым участвовать в осуществлении общего клеточного механизма, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Транслокационные домены из тяжелых цепей клостридиальных токсинов имеют длину, приблизительно, 410-430 аминокислот и содержат транслокационный домен (Таблица 1). Исследования показали, что вся длина транслокационного домена из клостридиального токсина не является необходимой для транслокационной активности транслокационного домена. Поэтому аспекты данного варианта воплощения включают транслокационные домены клостридиального токсина, содержащие транслокационный домен, имеющий в длину, например, по меньшей мере, 350, 375, 400 или 425 аминокислот. Другие аспекты данного варианта воплощения включают транслокационные домены клостридиального токсина, содержащие транслокационный домен, имеющий в длину, например, максимально 350, 375, 400 или 425 аминокислот.

[0118] Для определения процента идентичности природных вариантов транслокационного домена клостридиального токсина и не встречающихся в природе вариантов транслокационного домена клостридиального токсина могут быть использованы любые из ряда способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничений, общие способы, локальные способы и гибридные способы, такие, как, например, способы разделения на сегменты. Протоколы для определения процентной идентичности являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[0119] Таким образом, в варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, содержит транслокационный домен клостридиального токсина. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит природный вариант транслокационного домена, такой, как, например, изоформа транслокационного домена клостридиального токсина или подтип транслокационного домена клостридиального токсина. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена клостридиального токсина, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина, не-консервативный вариант транслокационного домена клостридиального токсина, активный фрагмент транслокационного домена клостридиального токсина, или любую комбинацию этого.

[0120] В другом варианте воплощения гидрофобная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой. Примеры гидрофобных аминокислот включают, например. С, F, I, L, М, V и W. В другом аспекте данного варианта воплощения алифатическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокациопного домена клостридиального токсина может быть заменена другой алифатической аминокислотой. Примеры алифатических аминокислот включают, напргшер. А, I, L, P, и V. В еще другом аспекте данного варианта воплощения ароматическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой ароматической аминокислотой. Примеры ароматических аминокислот включают, например, F, H, W и Y. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения стэкинг-взаимодействующая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокациоыного домена клостридиального токсина может быть заменена другой стэкинг-взаимодействующей аминокислотой. Примеры стэкинг-взаимодействующих аминокислот включают, например, F, H, W и Y. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения полярная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой полярной аминокислотой, Примеры полярных аминокислот включают, например, D, Е, K, N, Q и R. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения менее полярная или индифферентная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой менее полярной или индифферентной аминокислотой. Примеры менее полярных или индифферентных аминокислот включают, например. А, H, G, P, S, Т и Y. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения положительно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой положительно заряженной аминокислотой. Примеры положительно заряженных аминокислот включают, например. K, R и H. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения отрицательно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой отрицательно заряженной аминокислотой. Примеры отрицательно заряженных аминокислот включают, например, D и Е. В другом аспекте данного варианта воплощения малая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой малой аминокислотой. Примеры малых аминокислот включают, например, А, D, G, N, P, S и Т. В еще другом аспекте данного варианта воплощения С-бета разветвленная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи транслокационного домена клостридиального токсина может быть заменена другой С-бета разветвленной аминокислотой. Примеры С-бета разветвленных аминокислот включают, например, I, Т и V.

[0121] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BoNT/A. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит аминокислоты 455-873 с SEQ ID NO:1. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/A, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/A или транслокационный домен из подтипа BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокациоиный домен BoNT/A содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/A или подтип транслокационного домена BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит аминокислоты 455-873 природного варианта транслокационного домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/A или подтип транслокационного домена BoNT/A. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/A, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/A, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/A, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/A с SEQ ГО NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ГО NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/A, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/A, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A содержит аминокислоты 455-873 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/A, не-консервативиый вариант транслокационного домена BoNT/A, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/A, или любую комбинацию этого.

[0122] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 455-873 SEQ ID NO:1; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 455-873 SEQ ID NO:1.

[0123] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 455-873 SEQ ID NO:1; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 455-873 SEQ ID NO:1. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 455-873 SEQ ID NO:1; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 455-873 SEQ ID NO:1.

[0124] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BoNT/B. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/B содержит аминокислоты 447-860 с SEQ ID NO:6. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/B, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/B или транслокационный домен из подтипа BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/B или подтип транслокационного домена BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит аминокислоты 447-860 природного варианта транслокационного домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/B или подтип транслокационного домена BoNT/B. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/B, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/B, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/B, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/B, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/B, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/B, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/B, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B содержит аминокислоты 447-860 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/B, неконсервативный вариант транслокационного домена BoNT/B, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/B, или любую комбинацию этого.

[0125] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 447-860 SEQ ID NO:6; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 447-860 SEQ ID NO:6.

[0126] В других аспектах данного варианта воплощения транслокацнонный домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO; 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 447-860 SEQ ID NO:6; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 447-860 SEQ ID NO:6. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO; 10. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокациониый домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 447-860 SEQ ID NO:6; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 447-860 SEQ ID NO:6.

[0127] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BoNT/Cl. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 454-868 с SEQ ID NO:11. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокацнонный домен BoNT/Cl содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/Cl, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/Cl или транслокационный домен из подтипа BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/Cl или подтип транслокационного домена BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 454-868 природного варианта транслокационного домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/Cl или подтип транслокационного домена BoNT/Cl. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/Cl, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/Cl, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/Cl активный фрагмент транслокационного домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 454-868 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/Cl, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого.

[0128] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 454-868 SEQ ID NO:11; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 454-868 SEQ ID NO:11.

[0129] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 454-868 SEQ ID NO:11; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 454-868 SEQ ID NO:11. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 454-868 SEQ ID NO:11; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 454-868 SEQ ID NO:11.

[0130] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BoNT/D. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/D содержит аминокислоты 451-864 с SEQ ID NO:13. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/D, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/D или транслокационный домен из подтипа BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/D или подтип транслокационного домена BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит аминокислоты 451-864 природного варианта транслокационного домена BoNT/D с SEQ ID NO:13, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/D или подтип транслокационного домена BoNT/D. В е1це другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/D, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/D, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/D, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/D, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/D, неконсервативный вариант транслокационного домена BoNT/D, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/D, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D содержит аминокислоты 451-864 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/D с SEQ ID NO:13, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/D, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/D активный фрагмент транслокационного домена BoNT/D, или любую комбинацию этого.

[0131] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационньтй домен BoNT/D включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 451-864 SEQ ID NO:13; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 451-864 SEQ ID NO:13.

[0132] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO; 13 или SEQ ID NO:14; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-864 SEQ ID NO:13; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-864 SEQ ID NO:13. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-864 SEQ ID NO:13; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-864 SEQ ID NO:13.

[0133] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиалыюго токсина содержит транслокационный домен BoNT/E. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/E содержит аминокислоты 427-847 с SEQ ID NO:15. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/E, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/E или транслокационный домен из подтипа BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/E или подтип транслокационного домена BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E содержит аминокислоты 427-847 природного варианта транслокационного домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/E или подтип транслокационного домена BoNT/E. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/E, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/E, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/E, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/E, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационыый домен BoNT/E содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/E, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/E, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/E, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E содержит аминокислоты 427-847 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/E, неконсервативный вариант транслокационного домена BoNT/E, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/E, или любую комбинацию этого.

[0134] В других аспектах данного варианта воплощения трапслокационный домен BoNT/E включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 427-847 SEQ ID NO:15; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 427-847 SEQ ID NO:15.

[0135] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно гранслокационного домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:15; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:15. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:15; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:15.

[0136] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BoNT/F. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит транслокациониые домены с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/F содержит аминокислоты 446-865 с SEQ ID NO:18. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/F, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/F или транслокационньтй домен из подтипа BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/F или подтип транслокационного домена BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит аминокислоты 446-865 природного варианта транслокационного домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/F или подтип транслокационного домена BoNT/F. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/F, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/F, не-консервативный вариант транслокацнонного домена BoNT/F, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/F, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/F, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/F, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/F, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F содержит аминокислоты 446-865 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/F, неконсервативный вариант транслокационного домена BoNT/F, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/F, или любую комбинацию этого.

[0137] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационньш доменом с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 446-865 SEQ ID NO:18; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 446-865 SEQ ID NO:18.

[0138] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; максимально I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 446-865 SEQ ID NO:18; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 446-865 SEQ ID NO:18. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 446-865 SEQ ID NO:18; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 446-865 SEQ ID NO:18.

[0139] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BoNT/G. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:21. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/G содержит аминокислоты 451-865 с SEQ ID NO:21. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/G, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BoNT/G или транслокационный домен из подтипа BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит природный вариант транслокационного домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/G или подтип транслокационного домена BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит аминокислоты 451-865 природного варианта транслокационного домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BoNT/G или подтип транслокационного домена BoNT/G. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BoNT/G, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/G, неконсервативный вариант транслокационного домена BoNT/G, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/G, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/G, не-консервативный вариант транслокационного домена BoNT/G, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/G, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G содержит аминокислоты 451-865 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BoNT/G, неконсервативный вариант транслокационного домена BoNT/G, активный фрагмент транслокационного домена BoNT/G, или любую комбинацию этого.

[0140] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:21; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO; 21. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 451-865 SEQ ID NO:21; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 451-865 SEQ ID NO:21.

[0141] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:21; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:21. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-865 SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-865 SEQ ID NO:21. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:21; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:21. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-865 SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 451-865 SEQ ID NO:21.

[0142] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиалыюго токсина содержит транслокационный домен TeNT. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:22. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен TeNT содержит аминокислоты 468-881 с SEQ ID NO:22. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит природный вариант транслокационного домена TeNT, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы TeNT или транслокационньгй домен из подтипа TeNT. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит природный вариант транслокационного домена TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, изоформа транслокационного домена TeNT или подтип транслокационного домена TeNT. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит аминокислоты 468-881 природного варианта транслокационного домена TeNT с SEQ ID NO:22, такого, как, например, изоформа транслокационного домена TeNT или подтип транслокационного домена TeNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена TeNT, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена TeNT, не-консервативный вариант транслокационного домена TeNT, активный фрагмент транслокационного домена TeNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена TeNT, не-консервативный вариант транслокационного домена TeNT, активный фрагмент транслокационного домена TeNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT содержит аминокислоты 468-881 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена TeNT с SEQ ID NO:22, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена TeNT, не-консервативный вариант транслокационного домена TeNT, активный фрагмент транслокационного домена TeNT, или любую комбинацию этого.

[0143] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID N0; 22; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 468-881 SEQ ID NO:22; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 468-881 SEQ ID NO; 22.

[0144] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокациоиного домена с SEQ ID NO:22; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 468-881 SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 468-881 SEQ ID NO:22. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:22; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокациоыного домена с SEQ ID NO:22. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 468-881 SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 468-881 SEQ ID NO:22.

[0145] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BaNT. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:23. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BaNT содержит аминокислоты 436-857 с SEQ ID NO:23. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит природный вариант транслокационного домена BaNT, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BaNT или транслокационный домен из подтипа BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит природный вариант транслокационного домена BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BaNT или подтип транслокационного домена BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит аминокислоты 436-857 природного варианта транслокационного домена BaNT с SEQ ID NO; 23, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BaNT или подтип транслокационного домена BaNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BaNT, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BaNT, не-консервативный вариант транслокационного домена BaNT, активный фрагмент транслокационного домена BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BaNT, не-консервативный вариант транслокационного домена BaNT, активный фрагмент транслокационного домена BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT содержит аминокислоты 436-857 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BaNT с SEQ ID NO:23, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BaNT, не-консервативный вариант транслокационного домена BaNT, активный фрагмент транслокационного домена BaNT, или любую комбинацию этого.

[0146] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:23; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 436-857 SEQ ID NO:23; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 436-857 SEQ ID NO:23.

[0147] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:23; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 436-857 SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 436-857 SEQ ID NO:23. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делецнй, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:23; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:23. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 436-857 SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 436-857 SEQ ID NO:23.

[0148] В другом варианте воплощения транслокационный домен клостридиального токсина содержит транслокационный домен BuNT. В аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит транслокационные домены с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BuNT содержит аминокислоты 427-847 с SEQ ID NO:24. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит природный вариант транслокационного домена BuNT, такой, как, например, транслокационный домен из изоформы BuNT или транслокационный домен из подтипа BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит природный вариант транслокационного домена BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, изоформа транслокационного домена BuNT или подтип транслокационного домена BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит аминокислоты 427-847 природного варианта транслокационного домена BuNT с SEQ ID NO:24, такого, как, например, изоформа транслокационного домена BuNT или подтип транслокационного домена BuNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит не встречающийся в природе вариант транслокационного домена BuNT, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BuNT, не-консервативный вариант транслокационного домена BuNT, активный фрагмент транслокационного домена BuNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит транслокационный домен не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BuNT, не-консервативный вариант транслокационного домена BuNT, активный фрагмент транслокационного домена BuNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT содержит аминокислоты 427-847 не встречающегося в природе варианта транслокационного домена BuNT с SEQ ID NO:24, такого, как, например, консервативный вариант транслокационного домена BuNT, не-консервативный вариант транслокационного домена BuNT, активный фрагмент транслокационного домена BuNT, или любую комбинацию этого.

[0149] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO; 25; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с транслокационным доменом с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 427-847 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 427-847 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[0150] В других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно транслокациоиного домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, максимально 1, 2, 3. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно транслокационного домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения транслокационный домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 427-847 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[0151] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, связывающий домен. В данном контексте термин «связывающий домен» является синонимом «лиганда» или «направленной функциональной группы» и относится к любой молекуле, способной в физиологических условиях предпочтительно взаимодействовать с другой молекулой, присутствующей не поверхности клетки. Молекула клеточной поверхности может включать полипептид, полисахарид, липид или может иметь более одной из этих структурных характеристик. В данном контексте термин «предпочтительно взаимодействует» относится к молекуле, способной в физиологических условиях или в условиях in vitro, которые в значительной степени приближены к физиологическим условиям, связывать свой целевый рецептор в статистически значимо большей степени по сравнению со связыванием с другим, не-целевым рецептором. По отношению к связывающему домену клостридиального токсина, раскрываемому в настоящем описании, имеется дискриминационное связывание связывающего домена клостридиального токсина со своим когнатным рецептором по сравнению с другими рецепторами.

[0152] Таким образом, в варианте воплощения связывающий домен, которые селективно связывается с целевым рецептором, имеет константу равновесия при диссоциации (K_D) большую для целевого рецептора по сравнению с не-целевым рецептором в, например, по меньшей мере, один раз, по меньшей мере, два раза, по меньшей мере, три раза, по меньшей мере, четыре раза, по меньшей мере, пять раз, по меньшей мере, 10 раз, по меньшей мере, 50 раз, по меньшей мере, 100 раз, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 10000 или, по меньшей мере, 100000 раз.

[0153] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, связывающий домен клостридиального токсина. В данном контексте термин «связывающий домен клостридиального токсина» относится к любому полипептиду клостридиального токсина способному выполнять этап связывания процесса интоксикации, который инициирует общий механизм интернализации, посредством которого модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, вызывает интоксикацию клетки-мишени. Не имеющие ограничительного характера примеры связывающего домена клостридиального токсина включают, например, связывающий домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/Cl, связывающий домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/G, связывающий домен TeNT, связывающий домен BaNT и связывающий домен BuNT. Другие не имеющие ограничительного характера примеры связывающего домена клостридиального токсина включают, например, аминокислоты 874-1296 SEQ ID NO:1 аминокислоты 861-1291 SEQ ID NO:2, аминокислоты 869-1291 SEQ ID NO:3, аминокислоты 865-1291 SEQ ID NO:4, аминокислоты 848-1252 SEQ ID NO:5, аминокислоты 866-1274 SEQ ID NO:6, аминокислоты 866-1297 SEQ ID NO:7, аминокислоты 882-1315 SEQ ID NO:8, аминокислоты 858-1268 SEQ ID NO:9 и аминокислоты 848-1251 SEQ ID NO:10.

[0154] Связывающий домен клостридиального токсина включает, без ограничений, связывающий домен природных вариантов клостридиального токсина, такого, как, например, связывающий домен изоформ клостридиального токсина и связывающий домен подтипов клостридиального токсина, и связывающий домен не встречающихся в природе вариантов клостридиального токсина, такого, как, например, связывающий домен консервативных вариантов клостридиального токсина, связывающий домен не-консерватнвных вариантов клостридиального токсина, связывающий домен активных 4)рагментов этого, или любую комбинацию этого.

[0155] В данном контексте термин «вариант связывающего домена клостридиального токсина» - природный или не встречающийся в природе - относится к связывающему домену клостридиального токсина, имеющему изменение в, по меньшей мере, одной аминокислоте по сравнению с соответствующим участком раскрываемых референтных последовательностей (Таблица 1), и который может быть описан в процентной идентичности с соответствующим участком референтной последовательности. Если не указано точно, вариантами связывающего домена клостридиального токсина, пригодными для выполнения раскрываемых вариантов воплощения, являются варианты, которые осуществляют связывающий этап процесса интоксикации, который опосредует транслокацию легкой цепи клостридиального токсина. В качестве примеров, не имеющих ограничительного характера, вариант связывающего домена BoNT/A будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, деления или добавление, по сравнению с аминокислотами 874-1296 SEQ ID NO:1; вариант связывающего домена BoNT/B будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, деления или добавление, по сравнению с аминокислотами 861-1291 SEQ ID NO:6; вариант связывающего домена BoNT/Cl будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 869-1291 SEQ ID NO:11; вариант связывающего домена BoNT/D будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, деления или добавление, по сравнению с аминокислотами 865-1291 SEQ ID NO:13; вариант связывающего домена BoNT/E будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 848-1252 SEQ ID NO:15; вариант связывающего домена BoNT/F будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 866-1274 SEQ ID NO:18; вариант связывающего домена BoNT/G будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 866-1297 SEQ ID NO:21; вариант связывающего домена TeNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 882-1315 SEQ ID NO:22; вариант связывающего домена BaNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 858-1268 SEQ ID NO:23; и вариант связывающего домена BuNT будет иметь, различие в, по меньшей мере, одной аминокислоте, такое, как, например, замена, делеция или добавление, по сравнению с аминокислотами 848-1251 SEQ ID NO:24.

[0156] Специалистами в области техники признается, что в каждом серотипе клостридиального токсина могут существовать природные варианты связывающего домена клостридиального токсина, которые несколько различаются по своей аминокислотной последовательности, а также по нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки. Например, в настоящее время имеется пять подтипов BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5 со специфическими подтипами связывающего домена, демонстрирующие, приблизительно, 83-97% идентичности аминокислот при сравнении со подтипом связывающего домена BoNT/A с SEQ ID NO:1. Приведем другой пример, в настоящее время имеется пять подтипов BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 и BoNT/A5 со специфическими подтипами связывающего домена, демонстрирующие, приблизительно, 83-97% идентичности аминокислот при сравнении со подтипом связывающего домена BoNT/A с SEQ ID NO:1. В данном контексте термин «природный вариант связывающего домена клостридиального токсина» относится к любому связывающему домену клостридиального токсина, создаваемому в результате природного процесса, включая, без ограничений, изоформы связывающего домена клостридиального токсина, создаваемые из альтернативно сплайсированных транскриптов, изоформы связывающего домена клостридиального токсина, создаваемые путем спонтанной мутации и подтипы связывающего домена клостридиального токсина. Природный вариант связывающего домена клостридиального токсина может функционировать в значительной степени тем же способом, что и референтный вариант связывающего домена клостридиального токсина, на котором базируется природный вариант связывающего домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный связывающий домен клостридиального токсина в любом аспекте настоящего описания.

[0157] Не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта связывающего домена клостридиального токсина - изоформа связывающего домена клостридиального токсина, такая, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/A, изоформа связывающего домена BoNT/B, изоформа связывающего домена BoNT/Cl, связывающего домена BoNT/D изоформа связывающего домена BoNT/E, изоформа связывающего домена BoNT/F, изоформа связывающего домена BoNT/G, изоформа связывающего домена TeNT, изоформа связывающего домена BaNT и изоформа связывающего домена BuNT. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта связывающего домена клостридиального токсина - подтип связывающего домена, такой, как, например, связывающий домен из подтипа BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3, BoNT/A4 или BoNT/A5; связывающий домен из подтипа BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B бивалентный BoNT/B не-протеолитический; связывающий домен из подтипа BoNT/Cl-1 или BoNT/Cl-2; связывающий домен из подтипа BoNT/E1, BoNT/E2 и BoNT/ЕЗ; связывающий домен из подтипа BoNT/F J, BoNT/F2 или BoNT/F3; и связывающий домен из подтипа BuNT-1 или BuNT-2.

[0158] В данном контексте термин «не встречающийся в природе вариант связывающего домена клостридиального токсина» относится к любому связывающему домену клостридиального токсина, производимому с помощью человеческой манипуляции, включая, без ограничения, связывающие домены клостридиального токсина, вырабатываемые путем генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или конструктивного расчета, и связывающие домены клостридиального токсина, вырабатываемые путем химического синтеза. Не имеющие ограничительного характера примеры не встречающихся в природе вариантов связывающего домена клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты связывающего домена клостридиального токсина, не-консервативные варианты связывающего домена клостридиального токсина, гибридные варианты связывающего домена клостридиального токсина и активные фрагменты связывающего домена клостридиального токсина.

[0159] В данном контексте термин «консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина» относится к связывающему домену клостридиального токсина, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который имеет, по меньшей мере, одно свойство, подобное свойству оригинальной аминокислоты из референтной последовательности связывающего домена клостридиального токсина (Таблица 1). Примеры свойств включают, без ограничения, сходный размер, топографию, заряд, гидрофобность, липофильность, способность к ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химическое свойство, тому подобное, или любую комбинацию этого. Консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный связывающий домен клостридиального токсин, на котором базируется консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный связывающий домен клостридиального токсина в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры консервативного связывающего домена клостридиального токсина включают, например, консервативные варианты связывающего домена BoNT/A, консервативные варианты связывающего домена BoNT/B, консервативные варианты связывающего домена BoNT/Cl, консервативные варианты связывающего домена BoNT/D, консервативные варианты связывающего домена BoNT/E, консервативные варианты связывающего домена BoNT/F, консервативные варианты связывающего домена BoNT/G, консервативные варианты связывающего домена TeNT, консервативные варианты связывающего домена BaNT и консервативные варианты связывающего домена BuNT.

[0160] В данном контексте термин «не-консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина» относится к связывающему домену клостридиального токсина, в котором 1) по меньшей мере, одна аминокислота удалена из референтного связывающего домена клостридиального токсина, на котором базируется неконсервативный связывающий домен клостридиального токсина; 2) по меньшей мере, одна аминокислота добавлена к референтному связывающему домену клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный связывающий домен клостридиального токсина; или 3) по меньшей мере, одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который не имеет никакого свойства, подобного свойству последовательности референтного связывающего домена клостридиального токсина (Таблица 1). Не-консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный связывающий домен клостридиального токсина, на котором базируется не-консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина, и он может быть замещен на референтный связывающий домен клостридиальный токсин в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры не-консервативного варианта связывающего домена клостридиального токсина, включают, например, не-консервативные варианты связывающего домена BoNT/A, неконсервативные варианты связывающего домена BoNT/B, не-консервативные варианты связывающего домена BoNT/Cl, не-консервативные варианты связывающего домена BoNT/D, не-консервативные варианты связывающего домена BoNT/E, не-консервативные варианты связывагощего домена BoNT/F, не-консервативные варианты связывающего домена BoNT/G и не-консервативные варианты связывающего домена TeNT, неконсервативные варианты связывающего домена BaNT и не-консервативные варианты связывающего домена BuNT.

[0161] В данном контексте термин «активный фрагмент связывающего домена клостридиального токсина» относится к любому из ряда фрагментов клостридиалыюго токсина, содержащих связывающий домен, который может быть пригоден в аспектах настоящего описания при условии, что эти активные фрагменты могут способствовать высвобождению легкой цепи из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени и тем самым участвовать в осуществлении общего клеточного механизма, посредством которого клостриднальный токсин протеолитически расщепляет субстрат. Связывающие домены из тяжелых цепей клостридиальных токсинов имеют длину, приблизительно, 400-440 аминокислот и содержат связывающий домен (Таблица 1). Исследования показали, что вся длина связывающего домена из клостридиального токсина не является необходимой для связывающей активности связывающего домена. Поэтому аспекты данного варианта воплощения включают связывающие домены клостридиального токсина, содержащие связывающий домен, имеющий в длину, например, по меньшей мере, 350, 375, 400 или 425 аминокислот.Другие аспекты данного варианта воплощения включают связывающие домены клостридиального токсина, содержащие связывающий домен, имеющий в длину, например, максимально, 350, 375, 400 или 425 аминокислот

[0162] Для определения процента идентичности природных вариантов связывающего домена клостридиального токсина и не встречающихся в природе вариантов связывающего домена клостридиального токсина могут быть использованы любые из ряда способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничений, общие способы, локальные способы и гибридные способы, такие, как, например, способы разделения на сегменты.

[0163] Таким образом, в варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, содержит связывающий домен клостридиального токсина. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит природный вариант связывающего домена, такой, как, например, изоформа связывающего домена клостридиального токсина или подтип связывающего домена клостридиального токсина. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена клостридиального токсина, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина, не-консервативный вариант связывающего домена клостридиального токсина, активный фрагмент связывающего домена клостридиального токсина, или любую комбинацию этого.

[0164] В другом варианте воплощения гидрофобная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой. Примеры гидрофобных аминокислот включают, например. С, F, I, L, М, V и W. В другом аспекте данного варианта воплощения алифатическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой алифатической аминокислотой. Примеры алифатических аминокислот включают, например, А, I, L, Р, и V. В еще другом аспекте данного варианта воплощения ароматическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой ароматической аминокислотой. Примеры ароматических аминокислот включают, например, F, Н, W и Y. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения стэкинг-взаимодействующая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой стэкинг-взаимодействующей аминокислотой. Примеры стэкинг-взаимодействующих аминокислот включают, например, F, Н, W и Y. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения полярная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой полярной аминокислотой. Примеры полярных аминокислот включают, например, D, Е, K, N, Q и R. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения менее полярная или индифферентная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой менее полярной или индифферентной аминокислотой. Примеры менее полярных или индиф4)ерентных аминокислот включают, например, А, Н, G, Р, S, Т и Y. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения положительно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиалыюго токсина может быть заменена другой положительно заряженной аминокислотой. Примеры положительно заряженных аминокислот включают, например. K, R и Н. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения отрицательно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиальиого токсина может быть заменена другой отрицательно заряженной аминокислотой. Примеры отрицательно заряженных аминокислот включают, например, D и Е. В другом аспекте данного варианта воплощения малая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой малой аминокислотой. Примеры малых аминокислот включают, например, A, D, G, N, P, S и Т. В еще другом аспекте данного варианта воплощения С-бета разветвленная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена клостридиального токсина может быть заменена другой С-бета разветвленной аминокислотой. Примеры С-бета разветвленных аминокислот включают, например, I, Т и V.

[0165] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BoNT/A. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит связывающие домены с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит аминокислоты 874-1296 с SEQ ID NO:1. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит природный вариант связывающего домена BoNT/A, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/A или связывающий домен из подтипа BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит природный вариант связывающего домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/A или подтип связывающего домена BoNT/A. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит аминокислоты 874-1296 природного варианта связывающего домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, такого, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/A или подтип связывающего домена BoNT/A. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/A, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/A, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/A, активный фрагмент связывающего домена BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/A, неконсервативный вариант связывающего домена BoNT/A, активный фрагмент связывающего домена BoNT/A, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A содержит аминокислоты 874-1296 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/A с SEQ ID NO:1, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/A, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/A, активный фрагмент связывающего домена BoNT/A, или любую комбинацию этого.

[0166] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO; 5; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 874-1296 SEQ ID NO:1; или, максимально 70%, максимально 75%;, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 874-1296 SEQ ID NO:1.

[0167] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO; 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 874-1296 SEQ ID NO:1; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 874-1296 SEQ ID NO:1. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO; 3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/A включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 874-1296 SEQ ID NO:1; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 874-1296 SEQ ID NO:1.

[0168] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BoNT/B. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит связывающие домены с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/B содержит аминокислоты 861-1291 с SEQ ID NO:6, В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит природный вариант связывающего домена BoNT/B, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/B или связывающий домен из подтипа BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит природный вариант связывающего домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/B или подтип связывающего домена BoNT/B. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит аминокислоты 861-1291 природного варианта связывающего домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, такого, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/B или подтип связывающего домена BoNT/B. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/B, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/B, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/B, активный фрагмент связывающего домена BoNT/B, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO; 8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/B не-консервативиый вариант связывающего домена BoNT/B, активный фрагмент связывающего домена BoNT/B, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B содержит аминокислоты 861-1291 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/B с SEQ ID NO:6, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/B, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/B, активный фрагмент связывающего домена BoNT/B, или любую комбинацию этого.

[0169] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO; 8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO; 10; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 861-1291 SEQ ID NO:6; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 861-1291 SEQ ID NO:6.

[0170] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 861-1291 SEQ ID NO:6; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 861-1291 SEQ ID NO:6. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10; максимально 1,2, 3, 4, 5, 6, 7. 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/B включает полип ептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 861-1291 SEQ ID NO:6; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 861-1291 SEQ ID NO:6.

[0171] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BoNT/Cl. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит связывающие домены с SEQ TD NO:11 или SEQ ID NO:12. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/Cl содержит аминокислоты8б9-1291 с SEQ ID NO:11. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит природный вариант связывающего домена BoNT/Cl, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/Cl или связывающий домен из подтипа BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит природный вариант связывающего домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/Cl или подтип связывающего домена BoNT/Cl. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит аминокислоты 869-1291 природного варианта связывающего домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11, такого, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/Cl или подтип связывающего домена BoNT/Cl. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/Cl, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/Cl, активный фрагмент связывающего домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/Cl, активный фрагмент связывающего домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl содержит аминокислоты8б9-)291 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/Cl с SEQ ID NO:11, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/Cl, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/Cl, активный фрагмент связывающего домена BoNT/Cl, или любую комбинацию этого.

[0172] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 869-1291 SEQ ID NO:11; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 869-1291 SEQ ID NO:11.

[0173] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 869-1291 SEQ ID NO:11; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 8б9-1291 SEQ ID NO:11. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/Cl включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 869-1291 SEQ ID NO:11; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 869-1291 SEQ ID NO:11.

[0174] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиалыгого токсина содержит связывающий домен BoNT/D. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит связывающие домены с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/D содержит аминокислоты 865-1291 с SEQ ID NO:13. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит природный вариант связывающего домена BoNT/D, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/D или связывающий домен из подтипа BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит природный вариант связывающего домена BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/D или подтип связывающего домена BoNT/D. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит аминокислоты 865-1291 природного варианта связывающего домена BoNT/D с SEQ ID NO:13, такого, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/D или подтип связывающего домена BoNT/D. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/D, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/D, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/D, активный фрагмент связывающего домена BoNT/D, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/D с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/D, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/D, активный фрагмент связывающего домена BoNT/D, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D содержит аминокислоты 865-1291 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/D с SEQ ID NO:13, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/D, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/D, активный фрагмент связывающего домена BoNT/D, или любую комбинацию этого.

[0175] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 865-1291 SEQ ID NO:13; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 865-1291 SEQ ID NO:13.

[0176] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 865-1291 SEQ ID NO:13; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 865-1291 SEQ ID NO:13. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/D включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 865-1291 SEQ ID NO:13; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 865-1291 SEQ ID NO:13.

[0177] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BoNT/E. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит связывающие домены с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/E содержит аминокислоты 848-1252 с SEQ ID NO:15. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит природный вариант связывающего домена BoNT/E, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/E или связывающий домен из подтипа BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит природный вариант связывающего домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/E или подтип связывающего домена BoNT/E. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит аминокислоты 848-1252природного варианта связывающего домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, такого, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/E или подтип связывающего домена BoNT/E. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/E, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/E, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/E, активный фрагмент связывающего домена BoNT/E, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/E, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/E, активный фрагмент связывающего домена BoNT/E, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E содержит аминокислоты 848-1252 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/E с SEQ ID NO:15, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/E, неконсервативный вариант связывающего домена BoNT/E, активный (фрагмент связывающего домена BoNT/E, или любую комбинацию этого.

[0178] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO; 17; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 848-1252SEQ ID NO:15; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 848-1252SEQ ID NO:15.

[0179] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 He-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1252SEQ ID NO:15; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1252 SEQ ID NO:15. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/E включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1252SEQ ID NO:15; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1252 SEQ ID NO:15.

[0180] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BoNT/F. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит связывающие домены с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/F содержит аминокислоты 866-1274 с SEQ ID NO; 18, В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит природный вариант связывающего домена BoNT/F, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/F или связывающий домен из подтипа BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит природный вариант связывающего домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/F или подтип связывающего домена BoNT/F. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит аминокислоты 866-1274 природного варианта связывающего домена BoNT/F с SEQ ID NO; 18, такого, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/F или подтип связывающего домена BoNT/F. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/F, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/F, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/F, активный фрагмент связывающего домена BoNT/F, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/F, не-консервативный вариант связывающего домена BoNT/F, активный фрагмент связывающего домена BoNT/F, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F содержит аминокислоты 866-1274 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/F с SEQ ID NO:18, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/F, неконсервативный вариант связывающего домена BoNT/F, активный фрагмент связывающего домена BoNT/F, или любую комбинацию этого.

[0181] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 866-1274 SEQ ID NO:18; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 866-1274 SEQ ID NO:18.

[0182] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывнътх аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO; 19 или SEQ ID NO:20; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1274 SEQ ID NO:18; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1274 SEQ ID NO:18. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/P включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO; 19 или SEQ ID NO:20; максимально I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/F включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1274 SEQ ID NO:18; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1274 SEQ ID NO:18.

[0183] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиалыюго токсина содержит связывающий домен BoNT/G. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит связывающие домены с SEQ ID NO:21. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BoNT/G содержит аминокислоты 866-1297 с SEQ ID NO:21. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит природный вариант связывающего домена BoNT/G, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BoNT/G или связывающий домен из подтипа BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит природный вариант связывающего домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, изоформа связывающего домена BoNT/G или подтип связывающего домена BoNT/G. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит аминокислоты 866- 1297 природного варианта связывающего домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такого, как, например, изо4юрма связывающего домена BoNT/G или подтип связывающего домена BoNT/G. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BoNT/G, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/G, неконсервативный вариант связывающего домена BoNT/G, активный фрагмент связывающего домена BoNT/G, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/G, неконсервативный вариант связывающего домена BoNT/G, активный фрагмент связывающего домена BoNT/G, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G содержит аминокислоты 866-1297 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BoNT/G с SEQ ID NO:21, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BoNT/G, неконсервативный вариант связывающего домена BoNT/G, активный фрагмент связывающего домена BoNT/G, или любую комбинацию этого.

[0184] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:21; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:21. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 866-1297 SEQ ID NO:21; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 866- 1297 SEQ ID NO:21.

[0185] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ TD NO:21; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:21. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1297 SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866- 1297 SEQ ID NO:21. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:21; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:21. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BoNT/G включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1297 SEQ ID NO:21; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 866-1297 SEQ ID NO:21.

[0186] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен TeNT. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит связывающие домены с SEQ ID NO:22. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен TeNT содержит аминокислоты 882-1315 с SEQ ID NO:22. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит природный вариант связывающего домена TeNT, такой, как, например, связывающий домен из изоформы TeNT или связывающий домен из подтипа ТеNТ. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит природный вариант связывающего домена TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, изоформа связывающего домена TeNT или подтип связывающего домена TeNT. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит аминокислоты 882-1315 природного варианта связывающего домена TeNT с SEQ ID NO; 22, такого, как, например, изоформа связывающего домена TeNT или подтип связывающего домена TeNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена TeNT, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена TeNT, не-консервативный вариант связывающего домена TeNT, активный фрагмент связывающего домена TeNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена TeNT с SEQ ID NO:22, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена TeNT, не-консервативный вариант связывающего домена TeNT, активный фрагмент связывающего домена TeNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен TeNT содержит аминокислоты 882-1315 не встречающегося в природе варианта связывающего домена TeNT с SEQ ID NO:22, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена TeNT, не-консервативный вариант связывающего домена TeNT, активный фрагмент связывающего домена TeNT, или любую комбинацию этого.

[0187] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен TeNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:22; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен TeNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 882-1315 SEQ ID NO:22; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 882-1315 SEQ ID NO:22.

[0188] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:22; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:22. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 882-1315 SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 882-1315 SEQ ID NO:22. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:22; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:22. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен TeNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 882-1315 SEQ ID NO:22; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 882-1315 SEQ ID NO:22.

[0189] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BaNT. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит связывающие домены с SEQ ID NO:23, В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BaNT содержит аминокислоты 858-1268 с SEQ ID NO:23. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит природный вариант связывающего домена BaNT, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BaNT или связывающий домен из подтипа BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит природный вариант связывающего домена BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, изоформа связывающего домена BaNT или подтип связывающего домена BaNT. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит аминокислоты 858-1268 природного варианта связывающего домена BaNT с SEQ ID NO:23, такого, как, например, изоформа связывающего домена BaNT или подтип связывающего домена BaNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BaNT, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BaNT, не-консервативный вариант связывающего домена BaNT, активный фрагмент связывающего домена BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BaNT с SEQ ID NO:23, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BaNT, не-консервативный вариант связывающего домена BaNT, активный фрагмент связывающего домена BaNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BaNT содержит аминокислоты 858-1268 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BaNT с SEQ ID NO:23, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BaNT, неконсервативный вариант связывающего домена BaNT, активный фрагмент связывающего домена BaNT, или любую комбинацию этого.

[0190] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BaNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:23; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BaNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 858-1268 SEQ ID NO:23; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 858-1268 SEQ ID NO:23.

[0191] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-ненрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:23; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-пепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:23. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 858-1268 SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 858-1268 SEQ ID NO:23. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:23; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO; 23. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BaNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 858-1268 SEQ ID NO:23; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 858-1268 SEQ ID NO:23.

[0192] В другом варианте воплощения связывающий домен клостридиального токсина содержит связывающий домен BuNT. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит связывающие домены с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В других аспектах данного варианта воплощения знзиматический домен BuNT содержит аминокислоты 848-1251 с SEQ ID NO:24. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит природный вариант связывающего домена BuNT, такой, как, например, связывающий домен из изоформы BuNT или связывающий домен из подтипа BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит природный вариант связывающего домена BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, изоформа связывающего домена BuNT или подтип связывающего домена BuNT. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит аминокислоты 848-1251 природного варианта связывающего домена BuNT с SEQ ID NO:24, такого, как, например, изоформа связывающего домена BuNT или подтип связывающего домена BuNT. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена BuNT, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BuNT, не-консервативный вариант связывающего домена BuNT, активный фрагмент связывающего домена BuNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит связывающий домен не встречающегося в природе варианта связывающего домена BuNT с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена BuNT, не-консервативный вариант связывающего домена BuNT, активный фрагмент связывающего домена BuNT, или любую комбинацию этого. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен BuNT содержит аминокислоты 848-1251 не встречающегося в природе варианта связывающего домена BuNT с SEQ ID NO:24, такого, как, например, консервативный вариант связывающего домена BuNT, не-консервативный вариант связывающего домена BuNT, активный фрагмент связывающего домена BuNT, или любую комбинацию этого.

[0193] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BuNT включает нолипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или по меньшей мере, 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% со связывающим доменом с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BuNT включает полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 848-1251 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25; или, максимально 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или максимально 95% с аминокислотами 848-1251 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[0194] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1251 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1251 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно связывающего домена с SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25. В дальнейших других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен BuNT включает полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1251 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 848-1251 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[0195] Аспекты настоящего изобретения предоставляют, частично, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину. В данном контексте термин «связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину» относится к любому полипептиду, способному выполнять этап связывания процесса интоксикации, который инициирует общий механизм интернализации, посредством которого модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, вызывает интоксикацию клетки-мишени. Примеры связывающих доменов описаны в, например, Keith A. Foster et al., Able To Clostridial Toxin Derivatives Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, U.S. Patent 5,989,545; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, U.S. Patent 6,461,617; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecrelion, U.S. Patent 6,632,440; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, U.S. Patent 6,843,998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recomlwiant Neurotoxins, U.S. Patent 7,132,259; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, U.S. Patent Publication 2002/0037833; Keith A. Foster et al.. Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, U.S. Patent Publication 2003/0180289; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, U.S. Patent Publication 2006/0211619; Keith A. Foster et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, U.S. Patent Publication 2008/0187960; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, U.S. Patent Application No. 11/776,075; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, U.S. Patent Application No.11/792,210; каждый из которых включен посредством ссылки во всей полноте.

[0196] Связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, включает, без ограничений, природные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, такие, как, например, изоформы связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, и не встречающиеся в природе варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, такие, как, например, консервативные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, не-консервативные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, гибриды связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, активные фрагменты связывающего домена этого, не относящегося к клостридиалъному токсину, или любую комбинацию этого.

[0197] В данном контексте термин «вариант связывающего домена, не относящийся к клостридиальному токсину» - природный или не встречающийся в природе - относится к варианту связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, имеющему изменение в, по меньшей мере, одной аминокислоте по сравнению с соответствующим участком раскрываемых референтных последовательностей (Таблица 1), и который может быть описан в процентной идентичности с соответствующим участком референтной последовательности. Если не указано точно, вариантами связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, пригодными для выполнения раскрываемых вариантов воплощения, являются варианты, осуществляющие этап связывания процесса интоксикации.

[0198] Специалистами в области техники признается, что в каждом связывающем домене, не относящемся к клостридиальному токсину, могут быть природные варианты, которые несколько различаются по своей аминокислотной последовательности, а также по нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки. В данном контексте термин «природные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину» относится к любому связывающему домену, не относящемуся к клостридиальному токсину, включая, без ограничений, изоформы связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, создаваемые из альтернативно сплайсированных транскриптов, и изоформы связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, создаваемые путем спонтанной мутации. Природный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может функционировать в значительной степени тем же способом, что и референтный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, на котором основан природный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиалытому токсину, и он может быть замещен на референтный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры природного варианта связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину - это изоформа связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину. Не имеющие ограничительного характера примеры изформы варианта связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину включают, например, изоформы опиод-связывающего домена, изоформы тахикинин-связывающего домена, изоформы меланокортин-связывающего домена, изоформы галанин-связывающего домена, изоформы гранин-связывающего домена, изоформы связывающего домена нейропептид Y родственного пептида, изоформы нейрогормон-связывающего домена, изоформы связывающего домена нейрорегуляторного цитокина, изоформы связывающего домена кининового пептида, изоформы связывающего домена ростового фактора и изоформы связывающего домена глюкагоно-подобного гормона,

[0199] В данном контексте термин «не встречающийся в природе вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиалъному токсину» относится к любому связывающему домену, не относящемуся к клостридиальному токсину, производимому с помощью человеческой манипуляции, включая, без ограничения, связывающие домены, не относящиеся к клостридиальному токсину, вырабатываемые путем генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или конструктивного расчета, и связывающие домены, не относящиеся к клостридиальному токсину, вырабатываемые путем химического синтеза. Не имеющие ограничительного характера примеры не встречающихся в природе вариантов связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, включают, например, консервативные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, не-консервативные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, гибридные варианты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, и фрагменты связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину.

[02(Ю] В данном контексте термин «консервативный вариант связывающего домена, не относя1цегося к клостридиальному токсину» относится к связывающему домену, не относящемуся к клостридиальному токсину, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который имеет, по меньшей мере, одно свойство, подобное свойству оригинальной аминокислоты из референтной последовательности связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину. Примеры свойств включают, без ограничения, сходный размер, топографию, заряд, гидрофобность, липофильность, способность к ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химическое свойство, тому подобное, или любую комбинацию этого. Консервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, на котором базируется консервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, и он может быть замещен на референтный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры консервативного связывающего домена, не относящегося к клостридиальиому токсину, включают, например, консервативные варианты опиоид-связывающего домена, консервативные варианты тахикинин-связывающего домена, консервативные варианты меланокортин-связывающего домена, консервативные варианты галанин-связывающего домена, консервативные варианты гранин-связывающего домена, консервативные варианты связывающего домена нейропептид Y родственного пептида, консервативные варианты нейрогормон-связывающето домена, консервативные варианты связывающего домена нейрорегуляторного цитокина, консервативные варианты связывающего домена кининового пептида, консервативные варианты связывающего домена ростового фактора и консервативные варианты связывающего домена глюкагоно-подобного гормона.

[0201] В данном контексте термин «не-консервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину» относится к связывающему домену, не относящемуся к клостридиальному токсину, в котором 1) по меньшей мере, одна аминокислота удалена из референтного связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, на котором базируется не-консервативный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину; 2) по меньшей мере, одна аминокислота добавлена к референтному связывающему домену, не относящемуся к клостридиальному токсину, на котором базируется не-консервативный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину; или 3) по меньшей мере, одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который не имеет никакого свойства, подобного свойству последовательности референтного связывающего домена, не относящемуся к клостридиальному токсину. Неконсервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, на котором базируется не-консервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, и он может быть замещен на референтный связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры не-консервативного связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, включают, например, не-консервативные варианты опиоид связывающего домена, неконсервативные варианты тахикинин связывающего домена, не-консервативные варианты меланокортин связывающего домена, не-консервативные варианты галанин связывающего домена, не-консервативные варианты Гранин связывающего домена, неконсервативные варианты связывающего домена нейропептид Y родственного пептида, не-консервативные варианты нейрогормон связывающего домена, не-консервативные варианты связывающего домена нейрорегуляторного цитокина, не-консервативные варианты связывающего домена кининового пептида, не-консервативные варианты связывающего домена ростового фактора и не-консервативные варианты связывающего домена глюкагоно-подобного гормона.

[0202] В данном контексте термин «активный фрагмент связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину» относится к любому из ряда фрагментов клостридиального токсина, содержащих связывающий домен, который может быть пригоден в аспектах настоящего описания при условии, что эти активные фрагменты связывающего домена могут преференциально взаимодействовать с когнатным рецептором и тем самым участвовать в осуществлении общего клеточного механизмам, посредством которого клостридиальный токсин протеолитически расщепляет субстрат.

[0203] Для определения процента идентичности природных вариантов связывающего домена клостридиального токсина и не встречающихся в природе вариантов связывающего домена клостридиального токсина могут быть использованы любые из ряда способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничений, общие способы, локальные способы и гибридные способы, такие, как, например, способы разделения на сегменты.

[0204] Таким образом, в варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, содержит связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину. В аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит природный вариант связывающего домена, такой, как, например, изоформа связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит не встречающийся в природе вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, такой, как, например, консервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиалыюму токсину, не-консервативный вариант связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, активный фрагмент связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, или любую комбинацию этого.

[0205] В другом варианте воплощения гидрофобная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой. Примеры гидрофобных аминокислот включают, например, С, F, I, L, М, V и W. В другом аспекте данного варианта воплощения алифатическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой алифатической аминокислотой. Примеры алифатических аминокислот включают, например, А, I, L, P, и V. В еще другом аспекте данного варианта воплощения ароматическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой ароматической аминокислотой. Примеры ароматических аминокислот включают, например, F, Н, W и Y. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения стэкинг-взаимодействующая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой стэкинг-взаимодействующей аминокислотой. Примеры стэкинг-взаимодействующих аминокислот включают, например, F, Н, W и Y. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения полярная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой полярной аминокислотой. Примеры полярных аминокислот включают, например, D, Е, K, N, Q и R. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения менее полярная или индифферентная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой менее полярной или индифферентной аминокислотой. Примеры менее полярных или индифферентных аминокислот включают, например. А, Н, G, P, S, Т и Y, В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения положительно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой положительно заряженной аминокислотой. Примеры положительно заряженных аминокислот включают, например. K, R и Н. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения отрицательно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, токсина может быть заменена другой отрицательно заряженной аминокислотой. Примеры отрицательно заряженных аминокислот включают, например, D и Е. В другом аспекте данного варианта воплощения малая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой малой аминокислотой. Примеры малых аминокислот включают, например, А, D, G, N, P, S и Т. В еще другом аспекте данного варианта воплощения С-бета разветвленная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи связывающего домена, не относящегося к клостридиальному токсину, может быть заменена другой С-бета разветвленной аминокислотой. Примеры С-бета разветвленных аминокислот включают, например, I, Т и V.

[0206] В другом варианте воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит опиоид-связывающий домен, такой, как например, энкефалин, эндоморфин, эндорфин, динорфин, ноцицептин или геморфин. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит тахикинин-связыващий домен, такой, как например, вещество P, нейропептид K (NPK), нейропептид гамма (NP gamma), нейрокинин A (NKA; вещество K, нейрокинин альфа, нейромедин L), нейрокинин В (NKB), гемокинин или эндокинин. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, включает меланокортин-связывающий домен, такой, как например, меланоцит-стимулирующий гормон, адренокортикотропин или липотропин. В еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит галанин-связывагощий домен, такой, как например, галанин или галанин транскрипт-ассоциированный пептид. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит гранин-связывающий домен, такой, как например, хроматогранин А, хроматогранин В или хроматогранин С. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида, такой, как например, нейропептид Y, пептид YY, панкреатический пептид или панкреатический икозапептид. В еще другом аспекте данного варианта вопло1цения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит нейрогормон-связывающий домен, такой, как например, кортикотропин-высвобождагощий гормон, паратиреоидный гормон, тиреотропип-высвобождающий гормон или соматостатин. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен нейрорегуляторного цитокина, такой, как например, цилиарньтй нейротрофический фактор, гликофорин-А, фактор ингебирования лейкемии, фактор холинэргической дифференцировки, интерлейкин, оностатин М, кардиотрофин-1, кардиотрофин-подобный цитокин или иейролейкин. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен кининового пептида, такой, как например, брадикинин, каллидина, desArg9 брадикинин или desArg10 брадикинин. В другом аспекте данного варианта воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен ростового фактора, такой, как, например, связывающий домен фактора роста фибробластов, связывающий домен фактора роста нервов, связывающий домен инсулинового фактора роста, связывающий домен эпидермального фактора роста, связывающий домен фактора роста эндотелия сосудов, связывающий домен нейротрофического фактора головного мозга, связывающий домен нейротрофического фактора роста, нейротрофин связывающий домен, такой, как, например, нейротрофин-3, нейротрофин-4/5, связывающий домен главного активаторного пептида, связывающий домен нейротурина, связывающий домен персефрина, связывающий домен артемина, связывающий домен трансформирующего фактора роста бета, такой, как, например, TGFβ1, TGFβB2, TGFβ3 или TGFβ4, связывающий домен костного морфогенетического белка, такой, как, например, ВМР2, ВМР3, ВМР4, ВМР5, ВМР6, ВМР7, ВМР8 или ВМР10, связывающий домен ростового фактора дифференцировки, такой, как, например, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF10, GDF11 или GDF15, или связывающий домен активина, такой, как, например, активин А, активин В, активин С, активин Е или ингибин А. В другом аспекте данного варианта воплощения, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен глюкагоно-подобного пептида, такой, как, например, секретин, глгокагоно-подобный пептид, типа GLP-1 и GLP-2, связывающий домен гипофизарного аденилат циклазу активирующего пептида, связывающий домен гормона, высвобождающего гормон роста, связывающий домен вазоактивного интестинального пептида типа VIP1 или VIP2, связывающий домен желудочного ингибиторного полипептида, связывающий домен кальцитонин-родственного пептидовисцерального пищеварительного пептида типа гастрина, гастрин-высвобождающего пептида или холецистокинина, или связывающий домен протеаза-активируемого рецептора - PAR пептнда типа PAR1 пептида, PAR2 пептида, PAR.3 пептида или PAR4 пептида.

[0207] В другом варианте воплощения опиоидный пептид содержит пептид энкефалина. В аспектах данного варианта воплощения пептид энкефалина содержит лей-энкефалин, мет-энкефалин, мет-энкефалин MRGL или мет-энкефалин MRF. В других аспектах данного варианта воплощения пептид энкефалина содержит SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29.

[0208] В других аспектах данного варианта воплощения энкефалин содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29. В еще других аспектах данного варианта воплощения энкефалин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2 или 3 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29; или, максимально 1, 2 или З не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29, Во все еще других аспектах данного варианта воплощения энкефалин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2 или 3 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29; или, максимально 1, 2 или 3 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29.

[0209] В другом варианте воплощения опиоидный пептид содержит бычий адреномедуллярный пептид-22 (ВАМ22). В аспектах данного варианта воплощения пептид ВАМ22 содержит пептид ВАМ22 (1-12), пептид ВАМ22 (6-22), пептид ВАМ22 (8-22) или пептид ВАМ22 (1-22). В других аспектах данного варианта воплощения, пептид ВАМ22 содержит аминокислоты 1-12, аминокислоты 6-22, аминокислоты 8-22 или аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислоты 1-12, аминокислоты 6-22, аминокислоты 8-22 или аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:31; аминокислоты 1-12 аминокислоты 6-22, аминокислоты 8-22 или аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:32; аминокислоты 1-12, аминокислоты 6-22, аминокислоты 8-22 или аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислоты 1-12, аминокислоты 6-22, аминокислоты 8-22 или аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислоты 1-12, аминокислоты 6-22, аминокислоты 8-22 или аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:35.

[0210] В других аспектах данного варианта воплощения, пептид ВАМ22 содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:31; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:32; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:35; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:31; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:32; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислотами 1-12, аминокислотами 6-22, аминокислотами 8-22 или аминокислотами 1-22 SEQ ID NO:35.

[0211] В еще других аспектах данного варианта воплощения пептид ВАМ22 содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:31; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO; 32; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:35; или, максимально 1, 2, 3, 4 или 5 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:31; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:32; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:35.

[0212] В еще других аспектах данного варианта воплощения пептид ВАМ22 содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:31; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:32; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:35; или, максимально 1, 2, 3, 4 или 5 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:30; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:71; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:32; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:33; аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:34 или аминокислот 1-12, аминокислот 6-22, аминокислот 8-22 или аминокислот 1-22 SEQ ID NO:35.

[0213] В другом варианте воплощения опиоидный пептид содержит пептид эндоморфина. В аспектах данного варианта воплощения пептид эндоморфина содержит эндоморфин-1 или эндоморфин-2. В других аспектах данного варианта воплощения пептид эндоморфина содержит SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37.

[0214] В других аспектах данного варианта воплощения эидоморфин содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37. В еще других аспектах данного варианта воплощения эндоморфин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2 или 3 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37; или, максимально 1, 2 или 3 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения эндоморфин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, I, 2 или 3 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37; или, максимально 1, 2 или 3 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:36 или SEQ ID NO:37.

[0215] В другом варианте воплощения опиоидный пептид содержит полипептид эндорфин. В аспектах данного варианта воплощения пептид эндорфин содержит эндорфин-α, неоэндорфин-α, эндорфин-β, неоэндорфин-β или эндорфин-γ. В других аспектах данного варианта воплощения пептид эндорфин содердит SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:43.

[0216] В других аспектах данного варианта воплощения содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:43; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:43. В еще других аспектах данного варианта воплощения эндорфин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, или SEQ ID NO:43; или, максимально 1, 2, 3, 4 или 5 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, или SEQ ID NO:43. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения эндорфин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, или SEQ ID NO:43; или, максимально 1, 2, 3, 4 или 5 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, или SEQ ID NO:43,

[0217] В другом варианте воплощения опиоидный пептид содержит пептид динорфин. В аспектах данного варианта воплощения пептид динорфин содержит динорфин А, динорфин В (лейморфин) или риморфин. В других аспектах данного варианта воплощения пептид динорфин содержит SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53. SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73 или SEQ ID NO:74.

[0218] В других аспектах данного варианта воплощения, динорфин содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53 или SEQ ID NO:69; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53 или SEQ ID NO:69. В еще других аспектах данного варианта воплощения динорфин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 ненепрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53, или SEQ ID NO:69; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53, или SEQ ID NO:69. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения динорфин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53, или SEQ ID NO:69; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53, или SEQ ID NO:69.

[0219] В другом варианте воплощения опиодный пептид содержит пептид ноцицептин. В аспектах данного варианта воплощения пептид ноцицептин содержит ноцицептин RK, ноцицептин, нейропептид 1, нейропептид 2 или нейропептид 3. В других аспектах данного варианта воплощения пептид ноцицептин содержит SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84.

[0220] В других аспектах данного варианта воплощения ноцицептин содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO; 82, SEQ ID NO:83, или SEQ ID NO; 84. В еще других аспектах данного варианта воплощения ноцицептин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:75, SEQ ID NO; 76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения ноцицептин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79. SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84; или, максимально I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84.

[0221] В другом варианте воплощения опиоидный пептид содержит пептид геморфин. В аспектах данного варианта воплощения пептид геморфин содержит LVVH7, VVH7, VH7, Н7, LVVH6, LVVH5, VVH5, LVVH4 и LVVH3. В других аспектах данного варианта воплощения пептид геморфин содержит SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92 или SEQ ID NO:93,

[222] В других аспектах данного варианта воплощения геморфин содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92 или SEQ ID NO:93; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92 или SEQ ID NO:93. В еще других аспектах данного варианта воплощения ноцицептин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2 или 3 не-непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92 или SEQ ID NO:93; или, максимально 1, 2 или З He-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, или SEQ ID NO:93. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения ноцицептин содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2 или 3 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92 или SEQ ID NO:93; или, максимально 1, 2 или З непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, или SEQ ID NO:93.

[223] В еще другом варианте воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен галанинового пептида. В аспектах данного варианта воплощения связывающий домен галанинового пептида содержит галанин или галанин транскрипт-ассоциированный пептид (GMAP). В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен галанинового пептида содержит SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95.

[224] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен галанинового пептида содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, но меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен галанинового пептида содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен галанинового пептида содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:94 или SEQ ID NO:95.

[225] Во все еще другом варианте воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен тахикининового пептида. В аспектах данного варианта воплощения связывающий домен тахикининового пептида содержит вещество Р, нейропептид K (NPK), нейропептид гамма (NP gamma), нейрокинин A (NKA; вещество K, нейрокинин альфа, нейромелин L), нейрокинин В (NKB), гемокинин или эндокинин. В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен тахикининового пептида содержит SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO; 102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 или SEQ ID NO:107.

[226] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен тахикининового пептида содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 или SEQ ID NO:107; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 иди SEQ ID NO:107. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен тахикининового пептида содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 или SEQ ID NO:107; или, максимально 1, 2, 3, 4пли 5 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 или SEQ ID NO:107. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен тахикининового пептида содержит полипелтид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99. SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 или SEQ ID NO:107; или, максимально 1, 2, 3, 4или 5 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106 или SEQ ID NO:107,

[227] Во все еще другом варианте воплощения связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида. В аспектах данного варианта воплощения связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида содержит нейропептид Y (NPY), пептид YY (PYY), панкреатический пептид (РР) или панкреатический икозапептид (PIP). В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида содержит SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112.

[228] В других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида содержит полипептид, имеющий аминокислотную идентичность, в, например, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112; или, самое большее 70%, максимально 75%, максимально 80%, максимально 85%, максимально 90% или, максимально 95% с SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112. В еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 ненепрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 не-непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения связывающий домен нейропептид Y-родственного пептида содержит полипептид, имеющий, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делеций, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 непрерывных аминокислотных делений, добавлений и/или замен относительно SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 или SEQ ID NO:112.

[229] Предусматривается, что гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может содержать связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, во всех и в любых локализациях с условием того, что гибрид клостридиального токсина может осуществлять процесс интоксикации. Не имеющие ограничительного характера примеры включают локализацию связывающего домена, не относящегося к клостридиальному, на амино-конце модифицированного клостридиального токсина; локализацию связывающего домена, не относящегося к клосгридиальному, между энзиматическим доменом клостридиального токсина и транслокационным доменом модифицированного клостридиального токсина; и локализацию связывающего домена, не относящегося к клостридиальному, на карбоксильном конце модифицированного клостридиального токсина. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры включают локализацию связывающего домена, не относящемуся к клострндиальному, между энзиматическим доменом клостридиального токсина и транслокационным доменом модифицированного клостридиального токсина. Энзиматический домен природного клостридиального токсина содержит нативный начальный метионин. Поэтому в организациях доменов, где энзиматический домен не находится в амино-концевой локализации, аминокислотная последовательность, содержащая начальный метионин, должна быть помещена спереди от амино-концевого домена. Сходным образом, в ситуациях, в которых связывающему домену, не относящемуся к клостридиальному, требуется свободный амино конец там, где связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, находится в амино-концевом положении, может быть функционально присоединена аминокислотная последовательность, содержащая начальный метионин и сайт расщепления протеазой, см., например, Shengwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins, U.S. Patent Application 11/572,512 (Jan. 23, 2007), который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В дополнение, в области техники известно, что при добавлении полипептида, функционально связанного с амино концом другого полипептида, содержащего начальный метионин, оригинальный метиониновый остаток может быть удален.

[230] Поэтому в варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, транслокационный домен, экзогенный сайт и энзиматический домен (ФИГ.3А). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, транслокационный домен клостридиального токсина, сайт расщепления экзогенной протеазой и энзиматический домен клостридиального токсина.

[231] В другом варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, энзиматический домен, сайт расщепления экзогенной протеазой и транслокационный домен (ФИГ.3В). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, энзиматический домен клостридиального токсина, сайт расщепления экзогенной протеазой, транслокациониый домен клостридиального токсина.

[232] В еще другом варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий энзиматический домен, сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, и транслокационный домен (ФИГ.4А). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий энзиматический домен клостридиального токсина, сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, и транслокационный домен клостридиального токсина.

[233] В еще другом варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий транслокационный домен, сайт расщепления экзогенной протеазой, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, и энзиматический домен (ФИГ.4В). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, сайт расщепления экзогенной протеазой и энзиматический домен клостридиального токсина.

[234] В другом варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий энзиматический домен, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, сайт расщепления экзогенной протеазой, и транслокационный домен (ФИГ.4С). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий энзиматический домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, сайт расщепления экзогенной протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина.

[235] В еще другом варианте воплощения модифицированный клостридиалъный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий транслокационный домен, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, сайт расщепления экзогенной протеазой и энзиматический домен (ФИГ.4D). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, сайт расщепления экзогенной протеазой и энзиматический домен клостридиального токсина.

[236] Во все еще другом варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий энзиматический домен, сайт расщепления экзогенной протеазой, транслокационный домен и связывающий домен, не относящийся к клостридиальному (ФИГ.5А). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий энзиматический домен клостридиального токсина, сайт расщепления экзогенной протеазой, транслокационный домен клостридиального токсина и связывающий домен, не относящийся к клостридиальному.

[237] Во все еще другом варианте воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий транслокационный домен, сайт расщепления экзогенной протеазой, энзиматический домен и связывающий домен, не относящийся к клостридиальному (ФИГ.5В). В аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать линейный порядок единичного полипептида от амино- до карбоксила, включающий транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному, сайт расщепления экзогенной протеазой и энзиматический домен клостридиального токсина.

[238] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «инактивационный сайт расщепления» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточный для селективного протеолиза в расщепляющейся связи протеазой, присутствующей в межтканевой жидкости или в циркуляторных системах, таких, как, например, сердечнососудистая система или лимфатическая система. Такой инактивационный сайт расщепления функционально связан в качестве гибридного белка с клостридиальньгм токсином или гибридом клостридиального токсина, раскрываемым в настоящем описании. По определению, инактивационный сайт расщепления восприимчив к селективному расщеплению, по меньшей мере, одной протеазой, присутствующей в межтканевых жидкостях или циркуляторных системах, Не имеющие ограничительного характера примеры инактивационных сайтов расщепления включают сайты расщепления тромбином, сайты расщепления плазмином, сайты расщепления фактором коагуляции Вила, сайты расщепления фактором коагуляции ГХа, сайты расщепления фактором коагуляции Ха, сайты расщепления фактором коагуляции Х1а, сайты расщепления фактором коагуляции ХПа, сайты расщепления калликреином плазмы, сайты расщепления активируемым протеазой рецептором 1, сопряженным с G протеином (PAR1), сайты расщепления PAR 2, сайты расщепления PAR3, сайты расщепления PAR4, сайты расщепления матричной металл опротеиназой-2 (ММР-2), сайты расщепления матричной металлопротеиназой-9 (ММР-9), сайты расщепления фурином, сайты расщепления активатором плазминогена типа урокиназы (uPA), сайты расщепления активатором плазминогена тканевого типа (tPA), сайты расщепления триптазой-е, сайты расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7), сайты расщепления эндотелин-конвертирующим ферментом-1 (ЕСЕ-1), сайты расщепления группой крови Келла, сайты расщепления DPPIV, сайты расщепления металлопептидазой ADAM с мотивом-13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS 13) и сайты расщепления катепсином L (Таблица 4).

ТАБЛИЦА 4. Инактивационные сайты расщепления Сайты расщепления протеазой Референтные последовательност SEQ ID NO:

Тромбин LVPR*GS 114   LVPK*GS 115   FIPR*TF 116   VLPR*SF 117   IVPR*SF 118   IVPR*GY 119   VVPR*GV 120   VLPR*LI 121   VMPR*SL 122   MFPR*SL 123 Фактор коагуляции Вила (FVIIA) KLTR*AETV 125   DFTR*VVGG 126   LSPR*TFHP 127   LIQR*NLSP 128   MATR*KMHD 129   LGIR*SFRN 130   PQGR*IVGG 131   NLTR*IVGG 132   QVVR*IVGG 133 Фактор коагуляции IXa (FIXa) PQGR*IVGG 135   PQLR*MKNN 136   NLTR*IVGG 137   QVVR4VGG 138

Фактор коагуляции Ха (FXa) IDGR* 140 IEGR* 141 IDGR*SVGG 142 IDGR*TVGG 143 IDGR*IVGG 144 IEGR*SVGG 145 IEGR*TVGG 146 IEGR*IVGG 147 PQGR*IVGG 148 IEGR*TSED 149 IEGR*IVEG 150 IDGR*IVEG 151 FNPR*TFGS 152 FDER*TPGL 153 IDER*IVGG 154 FNEK*TFGL 155 Фактор коагуляции XIa (FXIa) AFWK*TDAS 157 KLTR*AETV 158 KLTR*AETI 159 DFTR*VVGG 160 EFSR*VVGG 161 KLTR*AETV 162 DFTR*VVGG 163 IKPR*IVGG 164 DLHR*HIFW 165 KQLR*VVNG 166 Фактор коагуляции XIIa (FXIIa) PQGR*IVGG 168 IKPR*IVGG 169 SMTR*VVGG 170 TSTR*TVGG 171 PMKR*LTLG 172   SMTR*VVGG 174 SPFR*SSDI 175 SLMK*RPPG 176 YDWR*TPYL 177 SPFR*SVOV 178 SPFR*TPYL 179 TFHK*AEYR 180 PRFK*IIGG 181 ISLM*KRPP 182 LEAR*SAYH 183

Калликоеин 1 EAKR*SYHS 184 PNRW*STGA 185 EAFY*SOFG 186 NAAR*STGA 187 SSEW*SMPY 188 GTLF*RSGN 189 ARLY*SRGA 190 EASR*SATL 191 EASY*RRKO 192 TTFY*RRGA 193 AAWY*RTSR 194 SFHY*RMVG 195 ASSY*RTSR 196 TRFY*SRGR 197 IKFF*SAQT 198 Протеин С KKTR*NLKK 200 LDRR*GLOR 201 MATR*KMHD 202 RLKK*SOFL 203 PQLR*MKNN 204 VDQR*GNQI 205 IEPR*SPSO 206 KKTR*SPKT 207 LDOR*GVOR 208 PDPR*SKNN 209 Плазминоген GEAR*GSVI 211 GHAR*LVHV 212 AEFR*HDSG 213 HHOK*LVFF 214 GSNK*GALL 215 RAOR*SAGA 216 AFWK*TDAS 217 MSMR*VRRH 218 RGVR*RTAS 219 RAARTSQCT 220 POSR*SVPP 221 PYLK*VFNP 222 LSFR*ARAY 223 POLR*RGWR 224 EDNR*DSSM 225 LSFR*ARAY 226 FRAR*AYGF 227 YGFR*GPGP 228 ITFR*MNVA 229 THEK*GROS 230 PRLK*ARAG 231 PKAK*SHAP 232 PSHK*EGPO 233 LFEK*KVYL 234 ADGK*KPSS 235 PRFK*IIGG 236 POFR*IKGG 237 PRCR*HRPH 238 KGYR*SORG 239 DVAQ*FVLT 240   QPVS*VKVG 242 RGVG*IKST 243 FVDC*LIEO 244 VPAG*NWVL 245 YHAD*IYDK 246 RACR*LAKA 247

Матричная металлопротеиназа-2 (ММР-2) OGAY*OEAF 248 DVLS*LLEK 249 TLDD*LIMA 250 HISS*LIKL 251 DPNN*LLND 252 PVOP*OOSP 253 KPKT*ITGP 254 VVHP*LVLL 255 HPLV*LLSV 256 AVAL*LIGP 257 QPLQ*LLDA 258 YIQG*INLV 259 LPOE4KAN 260 NISD*LTAA 261 KPRA*LTAL 262 APSW*LLTA 263 AVRW*LLTA 264 AVSW*LLTA 265 SLRR*LTAA 266 SLSR*LTAL 267 RYSS*LTAA 268 SLAY*YTAL 269 SLRY*YTAA 270 SPAY*YTAL 271 MHKA*LTAA 272 LRLA*ITAL 273 Матричная металлопротеиназа-9 (ММР-9) IPEN*FFGV 275 MDIA*IHHP 276 SPSR*LFDQ 277 SEMR*LEKD 278 FSVN*LDVK 279 RLFD*QFFG 280 FFGE*HLLE 281 GLSE*MRLE 282 SPEEUKVK 283 DVIE*VHGK 284 EVHG*KHEE 285 DEHG*PISR 286 GEHL*LESD 287 PHRK*YRIP 288 GPRK*OVSG 289 LSPF*YLRP 290 PPSF*LRAP 291 NPLE*NSGF 292 VPYG*LGSP 293 PPLK*LMHS 294 GPEG*LRVG 295 FMKG*LSKA 296 VVTG*VTAV 297 AIIG*LMVG 298 SDLG*LTGI 299 VPYG*LGSP 300 GAAG*VKGD 301 GPTG*KOGD 302 GPSG*DOGA 303 GPSG*FPFP 304 GAPG*FPGP 305 GAPG*NRGF 306 GLRG*ERGE 307

  GPPG*SOGN 308 GPAG*OOGA 309 GPPG*KDGT 310 GOPG*SPGS 311 GSPG*YOGP 312 GPVS*AVLT 313 GPLG*MLSO 314 GPLG*MWAO 315 GPOG*IFGO 316 LPRS*AKEL 317 NSFG*LRFG 318 RAIH*INAE 319 Фурин RPRR*AKRF 32J RKKR*GLYA 322 RERR*RKKR 323 RKKR*GLYA 324 RKKR*TTSA 325 RHKR*ETLK 326 RLKR*DVVT 327 RMKR*EDLN 328 RAKR*FASL 329 RKKR*FVSS 330 RTKR*FLSY 331 RRAR*SVDG 332 VFRR*DAHK 333 VFRR*EAHK 334 RVAR*DITM 335 RISR*SLPO 336 RSRR*AATS 337 RAKR*SPKH 338 FWHR*GVTK 339 AKRR*TKRD 340 AKRR*AKRD 341 AKQR*AKRD 342 RDVR*GFAS 343 RKRR*SVNP 344 ROKR*FVLS 345 RSKR*SLSC 346 Активатор u-плазминогена (u-PA) GSGK*SATL 348 ORGR*SATL 349 RGSV*ILTV 350 PSSR*RRVN 351 CPGR*VVGG 352 PGAR*GRAF 353 SSSR*GPTH 354 VSNK*YFSN 355 NSGR*AVTY 356 TYSR*SRYL 357 NSGR*AVTY 358 PSGR*GRTL 359 AGSR*AVYY 360 TYGR*SRTN 361 NSSR*GVYL 362 PSSR*SVYN 363 ASGR*GRTY 364 TSSR*AVYL 365 NSGR*SRTL 366 VSGR*IRTG 367 SSGR4RTV 368   NALR*YAPD 370

Активатор t-плазминогена (t-PA) CPGR*VVGG 371 PQFR*IKGG 372 ALSR*MAVL 373 Триптаза-е (Проземин) *RVVGGE 375 *RIVGGE 376 *RIIGGE 377 *RVVGGD 378 *RIVGGD 379 *RIIGGD 380 *KVVGGE 381 *KIVGGE 382 *KIIGGE 383 *KVVGGD 384 *KIVGGD 385 *KIIGGD 386 Протеаза мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7) LSSR*QSPG 388 LQAR*GASL 389 LGPK*AITM 390 LGPR*SAVY 391 Эндотелии конвертирущий фермент-1 (ЕСЕ-1) HQKL*VFFA 393 HHOK*LVFF 394 KLVF*FAED 395 DRVY*IHPF 396 YIHP*FHLV 397 YGLG*SPRS 398 TPEH*VVPY 399 DIIW*VNTP 400 DIIW*INTP 401 CHLD*IIWV 402 HLDI*IWVN 403 CVYF*CHLD 404 SCSS*LMDK 405 ECVY*FCHL 406 RSKR*CSCS 407 RSKR*ALEN 408 GFSP*FRSS 409 PRRP*YILP 410 KPQQ*FFGL 411 PQQF*FGLM 412 Протеин группы крови Келла (KBGP) DIIW*YNTP 414     DIIW*INTP 415   MFLE*AIPM 417 KVFQ*EPLF 418 ATLT*FDHS 419 PLFY*EAPR 420 TGLR*DPFN 421 KILH*LPTS 422 AHLK*NSQE 423 APLT*AEIQ 424

Катепсин L EALF*AERK 425 EPLA*AERK 426 GTFT*SDYS 427 KYLD*SRRA 428 QDFV*QWLM 429 KQLA*TKAA 430 STFE*ERSY 431 LRLE*WPYQ 432 RGPF*YTPK 433 GFFY*TPKA 434 HFFK*NIVT 435 RGLS*LSRF 436 QWLG*APVP 437 NMLK*RGLP 438 LSLA*HTHQ 439 TPFA*ATSS 440 KLLA*VSGP 441 QLFR*RAVL 442 PRFK*IIGG 443 PAR1 *SFLLRN 445 *SFFLRN 446 *SFFLKN 447 *TFLLRN 448 *GFPGKF 449 *GYPAKF 450 *GYPLKF 451 *GYPIKF 452 PAR2 *SLIGKV 454 *SLIGRL 455 PAR3 "TFRGAP 457 *SFNGGP 458 *SFNGNE 459 PAR4 *GYPGQV 461 *AYPGKF 462 *TYPGKF 463 *GYPGKY 464 *GYPGKW 465 *GYPCKK 466 *GYPGKF 467 *GYPGRF 468 *GYPGFK 469 *GYPAKF 470 *GFPGKF 471 *GFPGKP 472 *SYPGKF 473 *SYPAKF 474 *SYPGRF 475 *SYAGKF 476 *SFPGOP 477 *SFPGQA 478 ADAMTS13 NLVY*MVTG 479 Звездочка (*) указывает на сайт расщепления пептидной связи P₁-P₁,

расщепляемый указанной протеазой.  

[239] Предусматривается, что инактивационный сайт расщепления всех или любой длины может быть пригодным в аспектах настоящего описания с условием того, что инактивационный сайт расщепления способен поддаваться расщеплению протеазой межтканевой жидкости или циркуляторной системы. Поэтому в аспектах данного варианта воплощения инактивационный сайт расщепления может быть, например, по меньшей мере, в длину 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 аминокислот. В других аспектах данного варианта воплощения инактивационный сайт расщепления может быть, например, максимально в длину 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15 или 20 аминокислот.

[240] Инактивационный сайт расщепления, пригодный в аспектах описания, включает, без ограничения, природный инактивационный сайт расщепления; варианты природного инактивационного сайта и варианты не встречающегося в природе инактивационного сайта расщепления, такие, как, например, консервативные варианты инактивационного сайта расщепления, не-консервативные варианты инактивационного сайта расщепления и пептидомиметики инактивационного сайта расщепления. В данном контексте термин «вариант инактивационного сайта расщепления» - природный или не встречающийся в природе - относится к инактивационному сайту расщепления, который имеет изменение, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с соответствующим участком раскрываемых референтных последовательностей, и может быть описан в процентной идентичности по отношению к соответствующему участку референтной последовательности. Для определения процента идентичности могут быть использованы любые из ряда способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничений, общие способы, локальные способы и гибридные способы, такие, как, например, способы разделения на сегменты. Протоколы для определения процентной идентичности являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[241] В данном контексте термин «природный инактивационный сайт расщепления» относится к любому инактивационному сайту расщепления, получаемому без помощи человеческой манипуляции. Не имеющие ограничительного характера примеры инактивационного сайта расщепления включают варианты сайта расщепления тромбином, варианты сайта расщепления плазмином, варианты сайта расщепления фактором коагуляции V, варианты сайта расщепления фактором коагуляции VII, варианты сайта расщепления фактором коагуляции VIII, варианты сайта расщепления фактором коагуляции IXa, варианты сайта расщепления фактором коагуляции Ха, варианты сайта расщепления фактором коагуляции XIa, варианты сайта расщепления фактором коагуляции XIIa, варианты сайта расщепления калликреином плазмы, варианты сайта расщепления ММР-2, варианты сайта расщепления ММР-9, варианты сайта расщепления фурином, варианты сайта расщепления активатором u-плазминогена, варианты сайта расщепления активатором t-плазминогена, варианты сайта расщепления триптазой-е, варианты сайта расщепления mMCP-7, варианты сайта расщепления ВСЕ- 1, варианты сайта расщепления KBGP, варианты сайта расщепления катепсином L, варианты сайта расщепления PAR1, варианты сайта расщепления PAR2, варианты сайта расщепления PAR3, варианты сайта расщепления PAR4 и варианты сайта расщепления ADAM-TS13.

[242] В данном контексте термин «не встречающийся в природе вариант инактивационного сайта расщепления» относится к любому инактивационному сайту расщепления, получаемому с помощью человеческой манипуляции, включая, без ограничения, варианты инактивационного сайта расщепления, вырабатываемые путем генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или конструктивного расчета, и варианты инактивационного сайта расщепления, вырабатываемые путем химического синтеза. Не имеющие ограничительного характера примеры не встречающихся в природе вариантов инактивационного сайта расщепления включают, например, консервативные варианты инактивационного сайта расщепления, неконсервативные варианты инактивационного сайта расщепления и псевдомиметики инактивационного сайта расщепления.

[243] В данном контексте термин «консервативный вариант инактивационного сайта расщепления» относится к инактивационному сайту расщепления, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту, замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который имеет, по меньшей мере, одно свойство, подобное свойству оригинальной аминокислоты из референтной последовательности инактивационного сайта расщепления. Примеры свойств включают, без ограничения, сходный размер, топографию, заряд, гидрофобность, липофильность, способность к ковалентному связыванию, способность к водородному связыванию, физико-химическое свойство, тому подобное, или любую комбинацию этого. Консервативный вариант инактивационного сайта расщепления может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный инактивационный сайт расщепления, на котором базируется консервативный вариант ннактивационного сайта расщепления, и он может быть замещен на референтный инактивационный сайт расщепления в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры консервативного инактивацнонного сайта расщепления включают, например, консервативные варианты сайта расщепления тромбином, консервативные варианты сайта расщепления плазмином, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции V, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции VII, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции VIII, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции IXa, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции Ха, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции XIa, консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции XIIa, консервативные варианты сайта расщепления калликреином плазмы, консервативные варианты сайта расщепления ММР-2, консервативные варианты сайта расщепления ММР-9, консервативные варианты сайта расщепления фурином, консервативные варианты сайта расщепления активатором u-плазминогена, консервативные варианты сайта расщепления активатором t-плазминогена, консервативные варианты сайта расщепления триптазой-е, консервативные варианты сайта расщепления mMCP-7, консервативные варианты сайта расщепления ЕСЕ-1, консервативные варианты сайта расщепления KBGP, консервативные варианты сайта расщепления катепсином L, консервативные варианты сайга расщепления PAR1, консервативные варианты сайта расщепления PAR2, консервативные варианты сайта расщепления PAR3, консервативные варианты сайта расщепления PAR4 и консервативные варианты сайта расщепления ADAM-TS 13.

[244] В данном контексте термин «не-консервативный вариант инактивационного сайта расщепления» относится к инактивационному сайту расщепления, в котором 1) по меньшей мере, одна аминокислота удалена из референтного инактивационного сайта расщепления, на котором базируется не-консервативный вариант инактивационного сайта расщепления; 2) по меньшей мере, одна аминокислота добавлена к референтному инактивационному сайту расщепления, на котором базируется не-консервативный вариант инактивационного сайта расщепления; или 3) по меньшей мере, одна аминокислота замещена другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, который не имеет никакого свойства, подобного свойству оригинальной аминокислоты из последовательности референтного инактивационного сайта расщепления (Таблица 4). Неконсервативный вариант инактивационного сайта расщепления может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный инактивационный сайт расщепления, на котором базируется не-консервативный вариант инактивационного сайта расщепления, и он может быть замещен на референтный инактивационный сайт расщепления в любом аспекте настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры не-консервативного инактивационного сайта расщепления включают например, не-консервативные варианты сайта расщепления тромбином, неконсервативные варианты сайта расщепления плазмином, не-консервативные варианты сайга расщепления фактором коагуляции V, не-консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции VII, не-консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции VIII, не-консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции IXa, не-консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции Ха, не-консервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции XIa, неконсервативные варианты сайта расщепления фактором коагуляции XIIa, неконсервативные варианты сайта расщепления калликреином плазмы, не-консервативные варианты сайта расщепления ММР-2, не-консервативные варианты сайта расщепления ММР-9, не-консервативные варианты сайта расщепления фурином, не-консервативные варианты сайта расщепления активатором u-плазминогена, не-консервативные варианты сайта расщепления активатором t-плазминогена, не-консервативные варианты сайта расщепления триптазой-е, не-консервативные варианты сайта расщепления mMCP-7, неконсервативные варианты сайта расщепления ЕСЕ-1, не-консервативные варианты сайта расщепления KBGP, не-консервативные варианты сайта расщепления катепсином L, неконсервативные варианты сайта расщепления PAR1, не-консервативные варианты сайта расщепления PAR2, не-консервативные варианты сайта расщепления PAR3, неконсервативные варианты сайга расщепления PAR4 и не-консервативные варианты сайга расщепления ADAM-TS13.

[245] В данном контексге термин «пептидомиметик инактивационного сайта расщепления» относигся к инактивационному сайту расщепления, который имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту, замещенную не встречающимся в природе олигомером, обладающим, по меньшей мере, одним свойством, подобным свойству первой аминокислоты. Примеры свойств включаюг, без ограничения, топографию элемента первичной структуры пептида, функциональность элемента первичной структуры пептида, топологию элемента вторичной структуры пептида, функциональность элемента вторичной структуры пептида, тому подобное, или любую комбинацию этого. Пептидомиметик инактивационного сайта расщепления может функционировать, в значительной степени, тем же способом, что и референтный инактивационный сайт расщепления, на котором базируется пептидомиметик инактивационного сайта расщепления, и он может быть замещен на референтный инактивационный сайт расщепления в любом аспекте настоящего описания. Для примеров способов пептидомиметиков см., например, Amy S, Ripka & Daniel H. Rich, Peptidomimetic design, 2(4) Curr. Opin. Chem. Biol. 441-452 (1998); и M. Angels Estiarte & Daniel H. Rich, Peplidoinimetics for Drug Design, 803-861 (Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery Vol.1 Principle and Practice, Donald J. Abraham ed., Wiley-lnterscience, 6^th ed 2003). He имеющие ограничительного характера примеры пептидомиметика инактивационного сайта расщепления включают, например, пептидомиметики сайта расщепления тромбином, пептидомиметики сайта расщепления плазмином, пептидомиметики сайта расщепления фактором коагуляции V, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фактором коагуляции VII, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фактором коагуляции VIIT, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фактором коагуляции IXa, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фактором коагуляции Ха, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фактором коагуляции XIa, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фактором коагуляции XIIa, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления калликреином плазмы, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления ММР-2, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления ММР-9, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления фурином, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления активатором u-плазминогена, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления активатором t-плазминогена, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления триптазой-е, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления mMCP-7, не- консервативные варианты сайта расщепления ЕСЕ-1, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления KBGP, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления катепсином L, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления PAR1, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления PAR2, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления PAR3, пептидомиметики сайта расщепления сайта расщепления PAR4 и пептидомиметики сайта расщепления ADAM-TS13.

[246] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин содержит инактивациониый сайт расщепления. В аспекте данного варианта воплощения клостридиальный токсин содержит энзиматический домен клостридиалытого токсина, транслокационный домен клостридиалытого токсина, связывающий домен клостридиального токсина и инактивационный сайт расщепления. В другом аспекте данного варианта осуществления клостридиальный токсин содержит природный вариант инактивационного сайта расщепления, такой, как, например, изоформа инактивационного сайта расщепления. В другом аспекте данного варианта осуществления клостридиальный токсин содержит не встречающийся в природе вариант инактивационного сайта расщепления, такой, как, например, консервативный вариант инактивационного сайта расщепления, не-консервативный вариант инактивационного сайта расщепления или активный фрагмент инактивационного сайта расщепления, или любую комбинацию этого.

[247] В другом варианте воплощения гибрид клостридиального токсина содержит инактивационный сайт расщепления. В аспекте данного варианта воплощения гибрид клостридиального токсина содержит энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен клостридиального токсина и инактивационный сайт расщепления. В другом аспекте данного варианта осуществления клостридиальный токсин содержит природный вариант инактивационного сайга расщепления, такой, как, например, изоформа инактивационного сайта расщепления. В другом аспекте данного варианта осуществления гибрид клостридиального токсина содержит не встречающийся в природе вариант инактивационного сайта расщепления, такой, как, например, консервативный вариант инактивационного сайта расщепления, ие-консервативный вариант инактивационного сайта расщепления или активный фрагмент инактивационного сайта расщепления, или любую комбинацию этого.

[248] В другом варианте воплощения гидрофобная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой гидрофобной аминокислотой. Примеры гидрофобных аминокислот включают, например, С, F, I, L, М, V и W. В другом аспекте данного варианта воплощения алифатическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой алифатической аминокислотой. Примеры алифатических аминокислот включают, например. А, I, L, Р и V. В еще другом аспекте данного варианта воплощения ароматическая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой ароматической аминокислотой. Примеры ароматических аминокислот включают, например, F, Н, W и Y. Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения стэкинг-взаимодействующая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой стэкинг-взаимодействующсй аминокислотой. Примеры стэкинг-взаимодействующих аминокислот включают, например, F, Н, W и Y. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения полярная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой полярной аминокислотой. Примеры полярных аминокислот включают, например, D, Е, K, N, Q и R. В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения менее полярная или индифферентная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой менее полярной или индифферентной аминокислотой. Примеры менее полярных или индифферентных аминокислот включают, например, А, Н, G, P, S, Т и Y. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения положительно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой положительно заряженной аминокислотой. Примеры положительно заряженных аминокислот включают, например, K, R и Н. В еще дальнейшем аспекте данного варианта воплощения отрицательно заряженная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой отрицательно заряженной аминокислотой. Примеры отрицательно заряженных аминокислот включают, например, D и Е. В другом аспекте данного варианта воплощения малая аминокислота в одном конкретном положении в полипептидиой цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой малой аминокислотой. Примеры малых аминокислот включают, например. А, D, G, N, P, S и Т. В еще другом аспекте данного варианта воплощения С-бета разветвленная аминокислота в одном конкретном положении в полипептидной цепи инактивационного сайта расщепления может быть заменена другой С-бета разветвленной аминокислотой. Примеры С-бета разветвленных аминокислот включают, например, I, Т и V.

[249] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления тромбином как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления тромбином» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для селективного протеолиза в расщепляющейся связи тромбином в условиях, подходящих для активности тромбиновой протеазы. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая тромбином. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления тромбином - X₁X₂X₃(R/K)*X₄X₅X₆X₇ (SEQ ID NO:113), где X₁ предпочтительно, S, Т, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₂ - любая аминокислота; Х₃ предпочтительно F, S, Т, амидная аминокислота подобная N или Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₄ предпочтительно S, Т положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; и Х₅, Х₆ и Х₇, независимо, любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для тромбина (SEQ ID NO:114-123). Дополнительные сайты расщепления тромбином хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См., например, О. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Datahase-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[250] Таким образом, в варианте осуществления клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления тромбином. В аспекте данного варианта осуществления сайг расщепления тромбином содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:113, где X₁ - S, Т, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ любая аминокислота; Х₃ - F, S, Т, амидная аминокислота подобная N или Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - S, Т, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и М; и Х₅, Х₆, и X₇, независимо, любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления тромбином содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:113, где X₁ - S, Q, K или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - N, Q, G, Р, А, V, L или I; Х4 - S, Т, Н, G, А, L или I; X₅ S, Т, Q, K, R, F, Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - S, Т, Q, K, R, G, Р, А, V, L или I; и Х₇ - S, Т, Q, K, R, G, Р, А, V, L или I. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления тромбином содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:113, где X₁ - Q, G, Р, A, V, L, I или М; Х₂ - S, Т, D, Е, G, A, V или I; Х₃ - G, Р, A, V или L; Х₄ - S, G, А или L; X₅ - Q, K, F,A, V или L; X₆ - S, Q, K, R, G, Р, V или L; и Х₇ - S, T, K, G, V, L или I. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления тромбином содержит, например, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122 или SEQ ID NO:123.

[251] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления плазмином как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления плазмином» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи плазмином в условиях, подходящих для активности плазминовой протеазы. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая плазмином. Плазмин катализирует расщепление связей LysI и ArgI со специфичностью, сходной со специфичностью трипсина. Однако плазмин намного менее эффективный по сравнению с трипсином и расщепляет в белках только некоторые из этих связей, Трипсин расщепляет пептидные связи, в основном, на карбоксильной стороне аминокислот лизина или аргинина, кроме тех случаев, когда после какой-либо из них следует пролин.

[252] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления фактором коагуляции VIIa как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления фактором коагуляции Vila» или «сайт расщепления FVIIa» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточный для селективного протеолиза в расщепляющейся связи FVTIa в условиях, подходящих для активности протеазы FVIIa. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая FVIIa. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления FVIIa - Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:124), где X₁ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - Q, S, Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, why, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно Q, S, Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄, Х₅,, Х₆, и Х7, независимо, любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для FVIIa (SEQ ID NO:125-133). Дополнительные сайты расщепления FVIIa хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См., например, J.H. Morrissey, Coagulation Factor Vila. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1659-1662 (A.J. Barren, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and С.M. Overall, Proleome-Derived, Dalabase-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage. Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al-, MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[253] Таким образом, в варианте осуществления клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления фактором коагуляции Vila. В аспекте данного варианта осуществления сайт расщепления фактором коагуляции Vila содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:124, где X₁ - кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и M; Х₂ - Q, S, Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₃ - Q, S, Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; и Х₄, Х₅, Х₆, и Х₇, независимо, любая аминокислота. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции VIIa содержит, например, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132 или SEQ ID NO:133

[254] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления фактором коагуляции DCa как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления фактором коагуляции IXa» или «сайт расщепления FIXa» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточный для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи FIXa в условиях, подходящих для активности протеазы FIXa. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая FIXa. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления FIXa - Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:134), где X₁ предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; X₂ предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₃ предпочтительно S, Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₄, Х₅, Х₆ и Х₇, независимо, любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для FIXa (SEQ ID NO:135-138). Дополнительные сайты расщепления FIXa хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См., например, А.Т. Thompson, Molecular Biology of Factor IX, In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp.128-129 (R.W. Colman, J. Hirsh, V.J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); S. Kawabata and S. Iwanaga, Russellysin. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.683-684 (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); A.E. Schmidt and S.P. Bajaj, Coagulation factor IXa. In Handbook of Proleolytic Enzymes, pp.1655-1659 (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol, 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[255] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления фактором коагуляции IXa. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции IXa содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:134, где X₁ - кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - S, Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₄, X₅, Х₆ и Х₇, независимо, любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции IXa содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:134, где X₁ - кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - S, Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, A, V, L, I и М; Х₄, Х₅, Х₆ и X₇, независимо, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции IXa содержит, например, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:137 или SEQ ID NO:138.

[256] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления фактором коагуляции Ха как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления фактором коагуляции Ха» или «сайт расщепления FXa» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи FXa в условиях, подходящих для активности протеазы FXa. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая FXa. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления FXa - Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:139), где X₁ - любая аминокислота, Х₂ - предпочтительно G, A, S, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, Х₃ - предпочтительно ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₄ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₅, Х₆ и Х₇, независимо, любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для FXa (SEQ ID NO:140-155). Дополнительные сайты расщепления FXa хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См., например, D.L. Greenberg and Е.W. Davie, Blood Coagulation Factors: Their Complementary DNAs, Genes, and Expression. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp.34-35 (R.W. Colman, J. Hirsh, V.J. Marder, A.W Clowes, J.N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); O. Schilling и С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[257] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления фактором коагуляции Ха. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции Ха содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:139, где X₁ - любая аминокислота, Х₂ - G, A, S, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, Х₃ - ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофюбная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₅, Х₆ и X₇, независимо, любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции Ха содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:139, где X₁ - Е, Р, Р, А, L или I; Х₂ - S, Q, D, Б, F, G или А; Х₃ - F, G, или Р; Х₄ - S, Т, L или I; Х₅ - S, F, А или V; Х₆ - S, Т, Е, N, Н, G, А или М; и Х₇ - S, N, D, Q, K, R или G. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции Ха содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:139, где X₁ - I или А; X₂ - Е или F; Х₃ - F, G, или Р; Х₄ - S, Т или I; X₅ - S, F или V; Х₆ - Е или G; и Х₇ - S или G. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции Ха содержит, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:154 или SEQ ID NO:155.

[258] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления фактором коагуляции XIa как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления фактором коагуляции XIa» или «сайт расщепления FXIa» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи FXIa в условиях, подходящих для активности протеазы FXIa. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая FXIa, Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления FXIa Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:156), где X₁ предпочтительно кислая аминокислота подобная D или Е, основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D или Е, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно H, незаряженная аминокислота подобная С, S, и Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - предпочтительно Н, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - предпочтительно амидная аминокислота подобная Q и N, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гадрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₇ - предпочтительно незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для FXIa (SEQ ID NO:157-166). Дополнительные сайты расщепления FXIa хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, Р. N. Walsh, Coagulation Factor Xla. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1651-1655 (A.J. Barren, N D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling и С.М. Overall, Protcome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database. Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[259] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления фактором коагуляции XIa. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции XIa содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO; 156, где X₁ кислая аминокислота подобная D или Е, основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₂ - кислая аминокислота подобная D или Е, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная КиР, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - Н, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - Н, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - кислая аминокислота подобная D и Е, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - амидная аминокислота подобная Q и N, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₇ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции XIa содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:156, где X₁ кислая аминокислота подобная D или Б, или основная аминокислота подобная K и R; Х₂ - ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₅ кислая аминокислота подобная D и Е, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и М; Х₆ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и X₇ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции FXIa содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:156, где X₁ - D или K; Х₂ - F или L; Х₃ - Т или Р; Х₄ - А или V; Х₅ - Е или V; Х₆ - Т или G; и Х₇ - G или V. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции XIa содержит, например, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:165 или SEQ ID NO:166.

[260] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления фактором коагуляции ХПа как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления фактором коагуляции ХПа» или «сайт расщепления FXIIa» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи FXIIa в условиях, подходящих для активности протеазы FXIIa. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая FXIIa. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайга расщепления FXIIa Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:167), где X₁ - предпочтительно незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, Т и М; Х₄ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - предпочтительно незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ -предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₇ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для FXIIa (SEQ ID NO:168-172). Дополнительные сайты расщепления FXUa хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, О.D. Ratnoff, Coagulation Factor XIIa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1642-1644 (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C.М. Overall, Proteome-Derived, Datahase-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et a]., MEROPS; The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); NeH D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[261] Таким образом, в варианте воплощения а клостридиальный токсин или гибрид клостридиалъного токсина содержит сайт расщепления фактором коагуляции ХПа. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции XIIa содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:167, где X₁ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ кислая аминокислота подобная D и Е, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₇ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции XIIa содержит консенсуснуто последовательность SEQ ID NO:167, где X₁ - S, Т, Р или I; Х₂ - Q, K, S или М; Х₃ - K, Т, G или Р; Х₄ - L, I или V; Х₅ - Т или V; Х₆ - G или L; и Х₇ - G. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фактором коагуляции ХПа содержит, например, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:171, или SEQ ID NO:172.

[262] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления калликреином 1 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления калликреином I» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточный для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи калликреином 1 в условиях, подходящих для активности протеазы калликреина 1. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая калликреином 1. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления калликреином 1 Х₁Х₂Х₂Х₄*(R/K)_Х5Х6Х7 (SEQ ID NO:173), где X₁ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ любая аминокислота; Х₃ любая аминокислота; Х₄ - предпочтительно положительная аминокислота подобная Н, K и R, большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М и V, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y; X₅ любая аминокислота; Х₆ любая аминокислота; и X₇ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для калликреина 1 (SEQ ID NO:174-198). Дополнительные сайты расщепления калликреином 1 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, R. W. Colman, Contact Activation Pathway: Inflammation, Fibrinolytic.Anticoagulant, Antiadhesive, and Antiangioeenic Activities. In Hemostasis и Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp.103-104 (R.W. Colman, J. Hirsh, V.J. Marder, A.W Clowes, J.N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); J. Chao, Human KalUkrein 1, Tissue Kallikrein. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1577-1580 (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); Н, X. Li, et al., Substrate Specificity of Human Kullikreins 1 and 6 Determined by Phage D-play, Protein Sci, 17: 664-672 (2008); O. Schilling and С.M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Proiease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptiduse Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the. MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте,

[263] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления калликрсином 1. В аспекте данного варианта воплощения сайг расщепления калликреином 1 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:173, где X₁ кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₂ любая аминокислота; Х₃ любая аминокислота; Х₄ - положительная аминокислота подобная Н, K и R, большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, M и V, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y; X₅ любая аминокислота; Х₆ любая аминокислота; и X₇ любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления калликреином 1 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:173, где X₁ - D, S, Т или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₂ - S, Т, А, Р или V; Х₃ - S, F или L; Х₄ - R или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y; Х₅ - R, S, Т или А; Х₆ - R, S или G; и Х₇ - R, G или А. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления калликреином 1 содержит, например, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:184, SEQ ID NO:185. SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197 или SEQ ID NO:198.

[264] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления протеином С как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления протеином С» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточный для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи протеином С в условиях, подходящих для активности протеазы протеина С. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая протеином С. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления протеином С Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:199), где X₁ - предпочтительно основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₂ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₃ -предпочтительно амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - предпочтительно амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - предпочтительно амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - предпочтительно амидная аминокислота подобная Q и N, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y; X₇ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S, и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для протеина С (SEQ ID NO:200-209). Дополнительные сайты расщепления протеином С хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, L. Shen and В. Dahiback, Protein С.In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1673-1677 (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling и С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol, 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptldase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227- D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[265] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления протеином С. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления протеином С содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:199, где X₁ - основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ и Х₄, независимо, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - амидная аминокислота подобная Q и N, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y; X₇ кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная Q и N, основная аминокислота подобная K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления протеином С содержит последовательность с SEQ ID NO:199, где X₁ - K, R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - D, Е, Q, N, или K; Х₃ - Р, L, Т, Q, K или R; Х₄ - G, I, S, N, или K; Х₅ - Q, N, K, F, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - F, S, N, Q, K, или Н; Х₇ - L, I, Т, K, D, Е, Q, или N. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления протеина С содержит, например, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208 или SEQ ID NO:209.

[266] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления плазминогеном как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления плазминогеном» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи плазмингеном в условиях, подходящих для активности протеазы плазминогена. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая плазмингеном. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления плазминогеном Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:210), где X₁ - предпочтительно положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - предпочтительно положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₅ - предпочтительно положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х_{6 -} любая аминокислота; Х₇ - предпочтительно Н, F, Y, R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для плазминогена (SEQ ID NO:211-240). Дополнителные сайты расщепления плазмингеном хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, О. Schilling and С.М. Overall, Proleome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38 (Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[267] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления плазминогеном. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления плазминогеном содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:211, где X₁ - положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и М; Х₄ - положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ - положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ любая аминокислота; X₇ - Н, F, Y, R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления плазминогеном содержит последовательность с SEQ ID NO:211, где X₁ - K, R, S, Т, A, G, L или Р; X₂ - D, E, Q, N, K, R, S, T, A, G, I или L; Х₃ - N, Q, S, F, Y, А или L; X₄ - K, R, S, A, G, L или V; X₅ - K, R, N, S, F, Y, A, I, L, Р или V; X₆ - K, R, N, S, F, Y, A, G, L, Р или V; X₇ - R, S, T, F, Y, A, G, I, L или Р. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления плазминогеном содержит, например. SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:223, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:225, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239 или SEQ ID NO:240.

[268] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2» «сайт расщепления ММР-2» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи ММР-2 в условиях, подходящих для активности протсазы ММР-2. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая ММР-2. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления ММР-2 Х₁(Р/А/V/L/I)Х₂Х₃*(V/L/I/F/Q)Х₄Х₅Х₆ (SEQ ID NO:241), где X₁, Х₂, Х₃, X₄, Х₅ и Х_{6 -} любые аминокислоты. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для ММР-2 (SEQ ID NO:242-273). Дополнительные сайты расщепления ММР-2 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, О. Schilling and С.М. Overall, Proleome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685- 694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Pepfidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Dalabase issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peplidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[269] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2 содержит консенсуснуто последовательность SEQ ID NO:241, где X₁, Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:241, где X₁ - кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ кислая аминокислота подобная D и Е, основная аминокислота подобная K и R, амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - Н, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - основная аминокислота подобная K и R, амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₅ кислая аминокислота подобная D и Е, основная аминокислота подобная K и R, амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ кислая аминокислота подобная D и Е, основная аминокислота подобная K и R, амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2 содержит последовательность с SEQ ID NO:241, где X₁ - G, Р, А V, L, I, S, Т, Е или Q; Х₂ - G, A, L, S, N, Q, W или K; X₃ - G, Р, A, S, Q, D, Е или Н; Х₄ - G, A, V, L, I, F, S, T, Q или K; X₅ - G, A, V, S, T, Q или K; Х₆ - G, Р, А, V, L, I, S, T, D, Е, K, N или Q. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2 содержит последовательность SEQ ID NO:241, где X₁ - G, А или L, или Q; Х₂ - G, А или S; Х₃ - G, А, S или N; Х₄ - А, V, L, I или K; X₅ - G, А или S; Х₆ - G, Р, А, V, L или D. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-2 содержит, например, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO; 244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:253, SEQ ID NO:254, SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:256, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:265. SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:272 или SEQ ID NO:273.

[270] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9» или «сайт расщепления ММР-2» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи ММР-9 в условиях, подходящих для активности протеазы ММР-9. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая ММР-9. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления ММР-9 Х₁Х₂Х₃Х₄*Х₅Х₆Х₇Х₈ (SEQ ID NO:274), где X₁ - предпочтительно F, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - предпочтительно F, Y, S, Т, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно F, Y, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ любая аминокислота; Х₅ - предпочтительно S, Т, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; X₆ любая аминокислота; Х₇ любая аминокислота; Х₈ - предпочтительно F, Y, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, A, V, L, 1 и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для ММР-9 (SEQ ID NO:275-319). Дополнительные сайты расщепления ММР-9 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, S. L. Kriclel, et al., Substrate. Hydrolysis by Matrix Meialloproteinase-9, J. Biol. Chem. 276: 20572-20578 (2001); E.Y. Zhen, et al., Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cartilage, Arthrit-Rheum. 58: 2420-2431 (2008); 0. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The. Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D, Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[271] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:274, где X₁ - F, кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, 1 и М; Х₂ - F, Y, S, Т, кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₃ - F, Y, кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₄ любая аминокислота; Х₅ - S, Т, кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, why, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₆ любая аминокислота; Х₇ любая аминокислота; Х₈ - F, Y, кислая аминокислота подобная D и E, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная И, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9 содержит консенсусную последовательность SEQ TD NO:274, где X₁ - G, V, L, I, F, S, Q, K или R; Х₂ - P, А, V, L, Т или S; Х₃ - G, P, A, V, L, S, Q, E, K или R; X₄ - G, P, A, V, L, F, S, N, E или K; X₅ - A, V, L, I, M, F, S, Q или K; X₆ - P, A, V, L, I, S, T, Q, E, K или R; X₇ - G, A, V, L, S или Т; X₈ - G, P, A, V, L, F, T, D, E, K или R. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:274, где X₁ - G или L; Х₂ - P, А или V; Х₃ - P, A, R, K или S; X₄ - G; X₅ - A, V, L или I; Х₆ - T, Q, K или R; X₇ - G, А или S; X₈ - G, P, A, V или E. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления матричной металлопротеиназой-9 содержит, например, SEQ ID NO:275, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:285, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:288, SEQ ID NO:289, SEQ ID NO:290, SEQ ID NO; 291, SEQ ID NO:292, SEQ ID NO:293, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:301, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:305, SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:312, SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:318 или SEQ ID NO:319.

[272] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления фурином как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления фурином» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или неприлегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи фурином в условиях, подходящих для активности протеазы фурина. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая фурином. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайга расщепления фурином - (R/I/A)X₁(R/K/A/P)R*X₂*X₃X₄X₅ (SEQ ID NO:320), где X₁, Х₂, Х₃, Х₄ и X₅ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для фурина (SEQ ID NO:321-346). Дополнительные сайты расщепления фурином хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, A. Basak, et a1., Implication of the Proprotein Convertases Furin, PCS И РС7 т the Cleavage of Sin-face Glycoproteins of Hong Kong, Ebola and Respiratory Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides, Biochem. J. 353: 537-545 (2001); 0. Bader, et a1., Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Cuida albicans, C. glabrata, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, BMC Microbiol. 8: 116 (2008); 0. Schilling and С.M. Overall, Proteome-Derived, Dalabase-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[273] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления фурином. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фурином содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:320, где X₁, Х₂, Х₃, X₄ и X₅ любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фурином содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:320, где X₁ - F, S, Т, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ - G, Р, М, F, Y, кислая аминокислота подобная D и Б, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или незаряженная аминокислота подобная С, S и Т; Х₃ - G, Р, А, V, L, I, F, W, S, Т, N, Q, D, Н, K или R; Х₄ - F, Y, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₅ - F, Y, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления фурином содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:320, где X₁ - K, R, S или Т; Х₂ - D, Е, S, А или G; Х₃ - А, V, L или I; и Х₄ - S, G, D, Е или R; и Х₅ - G, Р, А, S, Т, Q, D или Е. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления фурином содержит, например, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO; 325, SEQ ID NO:326, SEQ ID NO:327, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:332, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:336, SEQ ID NO:337, SEQ ID NO:338, SEQ ID NO:339, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:341, SEQ ID NO:342, SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:344, SEQ ID NO:345 или SEQ ID NO:346.

[274] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления активатором u-плазминогена как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления активатором u-плазминогена» или или «сайт расщепления u-РА» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или неприлегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи u-РА в условиях, подходящих для активности протеазы u-РА. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая u-РА. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления u-РА - Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄*Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:347), где X₁ любая аминокислота; Х₂ - предпочтительно незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и М; Х₄ любая аминокислота; X₅ - предпочтительно основная аминокислота подобная K и R, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - предпочтительно незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₇ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для u-PA (SEQ ID NO:347-368), Дополнительные сайты расщепления u-РА хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, V. Ellis, u-Plasminogen Activator. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1677-1683 (A.J. Barren, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C.М. Overall, Proteoine-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[275] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалъного токсина содержит сайт расщепления активатором u-плазминогена. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления активатором u-плазминогена содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:347, где X₁ любая аминокислота; Х₂ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ любая аминокислота; Х₅ - основная аминокислота подобная K и R, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₇ любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления активатором u-плазминогена содержит консенсуснуто последовательность SEQ ID NO:347, где X₁ - Р, А, L, S, Т, С, N или R; X₂ - G, Р, L, Y, S или Т; Х₃ - G, А, S или N; и Х₄ - G, А, V, I, Y, S или R; Х₅ - Р, V, L, F или R; Х₆ - G, А, V, Y, S или Т; и Х₇ - G, V, L, F, У, N или Н. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления активатором u-плазминогена содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:347, где X₁ - Р, А, L, S, Т, С, N или R; Х₂ - G, Y или S; Х₃ - G или S; и Х₄ - G, А, V, I, Y, S или R; X₅ - V или R; Х₆ - Т или Y; и Х₇ - G, V, L, F, Y, N или Н. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления активатором u-плазминогена содержит, например, SEQ ID NO:348, SEQ ID NO:349. NO:350, SEQ ID NO:351, SEQ ID NO:352, SEQ ID NO:353, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:355, или SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:360, SEQ ID NO:361, SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:364, SEQ ID NO:365, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:367 или SEQ ID NO:368.

[276] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления активатором t-плазминогена как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления активатором t-плазминогена» или или «сайт расщепления t-PA» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи t-PA в условиях, подходящих для активности протеазы t-PA. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая t-PA. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайга расщепления t-PA - Х₁Х₂Х₃(R/K)*Х₄*Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:369), где X₁ Х₂, Х₃, Х₄, Х₅, Х₆ и X₇ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для t-PA (SEQ ID NO:370-373). Дополнительные сайты расщепления t-PA хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например.Р. Lijnen and D. Collen, t-Plasminogen Acfivator. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.1684-1689 (A.J. Barrett, N.D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; E]sevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C, M. Overall, Pi-oteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[277] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления активатором t-плазминогена. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления активатором t-плазминогена содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:369, где X₁, X₂, Х₃, Х₄, Х₅, Х₆, и X₇ любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления активатором t-плазминогена содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:369, где X₁ - амидная аминокислота подобная N и Q, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; X₂ - амидная аминокислота подобная N и Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₃ - амидная аминокислота подобная N и Q, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₄ - ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₅ - основная аминокислота подобная K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; Х₆ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; и Х₇ кислая аминокислота подобная D и Е, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления активатором t-плазминогена содержит консеисусную последовательность SEQ ID NO:369, где X₁ - А, Р, С или N; X₂ - А, L, Р или Q; Х₃ - G, L, S или F; Х₄ - I, V, М или Y; Х₅ - А, V или K; X₆ - G, V или Р; и Х₇ - G, L или D. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления активатором t-плазминогена содержит, например, SEQ ID NO:370, SEQ ID NO:371, SEQ ID NO:372 или SEQ ID NO:373.

[278] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления триптазой-е как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления триптазой-е» или «сайт расщепления проземином» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи триптазой-е в условиях, подходящих для активности протеазы триптазы-е. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая триптазой-е. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления триптазой-е - *(R/K)Х₁Х₂Х₂Х₄(В/Е) (SEQ ID NO:374), где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄, независимо, алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для триптазы-е (SEQ ID NO:375-386). Дополнительные сайты расщепления триптазой-е хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, О. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The. Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[279] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления триптазой-е. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления триптазой-е содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:374, где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄, независимо, алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления триптазой-е содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:374, где X₁ - I или V; Х₂ - I или V; Х₃ - G или S; Х₄ - G или S. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления триптазой-е содержит, например, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:385 или SEQ ID NO:386.

[280] Аспекты настоящего описания раскрывают, в части, сайт расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7» или «сайт расщепления mMCP-7» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи mMCP-7 в условиях, подходящих для активности протеазы mMCP-7. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая mMCP-7. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления mMCP-7 - Х₁Х₁Х₂(K/R)*Х₄Х₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:387), где X₁ любая аминокислота; Х₂ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N или Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₄, Х₅, Х₆, Х₇ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для mMMCP-7 (SEQ ID NO:388-391). Дополнительные сайты расщепления mMMCP-7 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, О. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peplidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[281] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:387, где X₁ любая аминокислота; Х₂ - амидная аминокислота подобная N или Q, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₄, Х₅, Х₆, Х₇, независимо, любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:387, где X₁ любая аминокислота; Х₂ - G, S или Q; Х₃ - А, Р или S; и Х₄, X₅, X₆, X₇ любая аминокислота. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 содержит, например, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:390, или SEQ ID NO:391.

[282] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления эндотелии конвертирущим ферментом-1 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления эндотелии конвертирущим ферментом-1» или «сайт расщепления ЕСЕ-1» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегатощими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи ЕСЕ-1 в условиях, подходящих для активности протеазы ЕСЕ-1. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая ЕСЕ-1. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления ЕСЕ-1 - Х₁Х₂Х₃Х₄* (F/L/I/V/Y)₅Х₆Х₇ (SEQ ID NO:392), где X₁, Х₂, Х₃, Х₄, X₅, Х₆ и X₇ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для ЕСЕ-1 (SEQ ID NO:393-412). Дополнительные сайты расщепления ЕСЕ-1 хороню известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, K. Ahn and G.D. Johnson, Endothelm-Convertmg Enzyme-1. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp.429-434 (A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J.F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); 0. Schilling and C.M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36 (Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[283] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления эндотелин конвертирущнм ферментом-1. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления эндотелин конвертирущим ферментом-1 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:392, где X₁, Х₂, Х₃, Х₄, Х₅, Х₆ и Х₇, независимо, любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления эндотелин конвертирущим ферментом-1 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:392, где X₁ - G, P, Y, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или незаряженная аминокислота подобная С, S и Т; X₂ - F, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и M; Х₃ - S, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и M; Х₄ - S, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W и Y, или алифатаческая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, 1 и М; Х₅ - F, W, S, С, N, Е, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофюбная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - G, Р, V, L, F, Y, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, или незаряженная аминокислота подобная С, S и Т; и Х₇ - Р, А, V, L, М, Р, Y, S, N, D или К. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления эндотелии коивертирувдим ферментом-1 содержит консенсуснуго последовательность SEQ ID NO:392, где X₁ - G, Р, Y, С, D, K, R или Н; X₂ - Р, L, I, F, S, С, Q, D, R или Н; Х₃ - V, L, I, S, Q, K или R; Х₄ - G, Р, L, Р, Y, W или R; Х₅ - V, I, М, F, N, R или Н; Х₆ - Р, L, F, Т, Е или Н; и Х₇ - Р, V, L, F, S, N, D или K. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления эндотелии конвертирущим ферментом-1 содержит консенсусиую последовательность SEQ ID NO:392, где X₁ - G, D или Н; Х₂ - I или F; Х₃ - V, I, S, Q или K; Х₄ - Р, F или W; X₅ - I, N, R или Н; Х₆ - L, Т или Н; и Х₇ - Р, S или D. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления эндотелии конвертирущим ферментом-1 содержит, например, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:406, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:408, SEQ ID NO:409, SEQ ID NO:410, SEQ ID NO:411 или SEQ ID NO:412.

[284] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления протеином группы крови Келла как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления протеином группы крови Келла» или «сайт расщепления KBGP» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или ие-прилегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи KBGP в условиях, подходящих для активности протеазьт KBGP. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая KBGP. Несмотря на то, что известны исключения, генерализованная консепсусная последовательность для сайта расщепления KBGP - Х₁Х₂Х₃Х₄*Х₅Х₆Х₇Х₈ (SEQ ID NO:413), где X₁ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е; Х₂ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - предпочтительно ароматическая аминокислота подобная F, W и Y; X₅ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q; X₇ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т; X₈ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для KBGP (SEQ ID NO:414-415). Дополнительные скайты расщепления KBGP хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, О. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Datahase-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Naf. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D, Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227- D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[285] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалъного токсина содержит сайт расщепления протеином группы крови Келла. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления протеином группы крови Келла содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:413, где Х₁ кислая аминокислота подобная D и Е; Х₂ - Т или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₄ - ароматическая аминокислота подобная F, W и Y; X₅ - Т или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₆ - амидная аминокислота подобная N и Q; X₇ - незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или С-бета разветвленная аминокислота подобная J, V или Т; X₈ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления протеином группы крови Келла содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:413, где X₁ - D; X₂ - I, V или Т; Х₃ - I, V или Т; Х₄ - W; X₅ - I, V или Т; Х₆ - N; X₇ - Т; X₈ - P. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления протеином группы крови Келла содержит, например, SEQ ID NO:414 или SEQ ID NO:415.

[286] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления катепсином L как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления катепсином L» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или не-прилегатощими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи катепсином L в условиях, подходящих для активности протеазы катепсина L. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая катепсином L, Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления катепсином L - Х₁Х₂Х₃Х₄*Х₅Х₆Х₇Х₈ (SEQ ID NO:416), где X₁ - предпочтительно W, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ любая аминокислота; X₃ - предпочтительно L, V, F или Y; и Х₄, Х₅, Х₆, Х₇ и X₈ любая аминокислота. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для катепсина Cathepsin L (SEQ ID NO:417-443). Дополнительные сайты расщепления катепсином L хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами. См. например, J.С. Kelly, et al., Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates, Biochim. Biophys, Acta 1794: 1505-1509 (2009); O. Schilling and С.М. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchuble Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS; The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325 (2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The. Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233 (2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press (2010), каждый из которых включен путем ссылки во всей полноте.

[287] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления катепсином L. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления катепсином L содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:416, где X₁ - W, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, положительная аминокислота подобная Н, K и R, незаряженная аминокислота подобная С, S и Т, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₂ любая аминокислота; Х₃ - L, V, F или Y; и Х₄, X₅, Х₆, Х₇ и X₈ любая аминокислота. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления катепсином L содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:416, где X₁ - G, Р, A, L, Q, Е или K; Х₂ - ароматическая аминокислота подобная F, W и Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; Х₃ - L, V, F или Y; Х₄ - G, А, F, Т, Q, Е, K или R; X₅ - G, А, S, кислая аминокислота подобная D и Е, амидпая аминокислота подобная N и Q, или положительная аминокислота подобная Н, K и R; Х₆ - Р, А, L, I, S, Q, кислая аминокислота подобная D и Е, или положительная аминокислота подобная Н, K и R; Х₇ - положительная аминокислота подобная Н, K и R, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; и X₈ - Р, L, S, Т, кислая аминокислота подобная D и Е, амидная аминокислота подобная N и Q, или основная аминокислота подобная K и R. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления катепсином L содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:416, где X₁ - G, A, Q, Е или K; X₂ - G, Р, L или F; Х₃ - L, V, F или Y; X₄ - G, A, F, T, Q, Е, K или R; X₅ - A, S, Q, Е, K или R; X₆ - Р, A, L, I, S или Е; X₇ Р, L или R; и X₈ - Р, L, S или K. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления катепсином L содержит, например, SEQ ID NO:417, SEQ ID NO:418, SEQ ID NO:419, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:421, SEQ ID NO; 422, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:430, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:432, SEQ ID NO; 433, SEQ ID NO:434, SEQ ID NO; 435, SEQ ID NO:436, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:442 или SEQ ID NO:443.

[288] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления PAR 1 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления PAR1» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или неприлегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи PAR1 в условиях, подходящих для активности протеазы PAR1. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая PAR1. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления PAR1 - X₁X₂X₃X₄(K/R)X₅ (SEQ ID NO:444), где X₁ - предпочтительно малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; X₂ - предпочтительно большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, M, V, или ароматическая аминокислота подобная F, H, W или Y; Х₃ - предпочтительно большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, M, V, или ароматическая аминокислота подобная F, H, W или Y; X₄ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и M; и X₅ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W или Y. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для PAR1 (SEQ ID NO:445-452), Дополнительные сайты расщепления PAR1 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами.

[289] Таким образом, в варианте воплощения а клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления PAR1. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR1 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:444, где X₁ - малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; X₂ - большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V, или ароматическая аминокислота подобная F, H, W или Y; Х₃ - большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V, или ароматическая аминокислота подобная F, H, W или Y; X₄ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₅ - амидная аминокислота подобная N и Q, или ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W или Y. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR1 содержит консепсуснуто последовательность SEQ ID NO:444, где X₁ - S, Т или G; Х₂ - F или Y; Х₃ - L, Р или F; X₄ - А, G, I или L; и Х₅ - F или N. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления PAR1 содержит, например, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:448, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:451, или SEQ ID NO:452.

[290] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления PAR2 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления PAR2» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или неприлегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи PAR2 в условиях, подходящих для активности протеазы PAR2. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая PAR2. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления PAR2 - X₁X₂X₃X₄(K/R)X₅, (SEQ ID NO:453), где X₁ - предпочтительно малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; X₂ - предпочтительно большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V; Х₃ - предпочтительно большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V; X₄ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₅ - предпочтительно большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для PAR2 (SEQ ID NO:454-455). Дополнительные сайты расщепления PAR2 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами.

[291] Таким образом, в варианте воплощения а клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления PAR2. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR2 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:453, где X₁ - малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; Х₂ - большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V; Х₃ - большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V; X₄ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М; и Х₅ - большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V, В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR2 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:453, где X₁ - S; Х₂ - I или L; Х₃ - I или L; X₄ - А или G; X₅ - L или V, В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления PAR2 содержит, например, SEQ ID NO:454 или SEQ ID NO:455.

[292] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления PAR3 как инактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления PAR3» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или неприлегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи PAR3 в условиях, подходящих для активности протеазы PAR3. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая PAR3. Хотя известны исключения, генерализованная консенсусная последовательность для сайта расщепления PAR3 - X₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO:456), где X₁ - предпочтительно малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; Х₂ - предпочтительно большая негюлярная аминокислота подобная F, I, L, М, V; Х₃ - предпочтительно амидная аминокислота подобная N и Q, или основная аминокислота подобная K и R; X₄ - предпочтительно малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; X₅ - предпочтительно малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т, или малая полярная аминокислота подобная D, N или Р; и Х₆ - предпочтительно кислая аминокислота подобная D и Е, или малая полярная аминокислота подобная D, N, или Р. В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для PAR3 (SEQ ID NO:457-459). Дополнительные сайты расщепления PAR3 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами.

[293] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления PAR3. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR3 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:456, где X₁ - малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; Х₂ - большая нсполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V; Х₃ - амидная аминокислота подобная N и Q, или основная аминокислота подобная K и R; X₄ - малая иеполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; X₅ - малая иеполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т, или малая полярная аминокислота подобная D, N или Р; и Х₆ кислая аминокислота подобная D и Е, или малая полярная аминокислота подобная D, N или Р. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR3 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:456, где X₁ - S или Т; Х₂ - F; Х₃ - N или R; X₄ - А или G; Х₅ - A,G или N и X₆ - P или Е. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления PAR3 содержит, например, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:458 или SEQ ID NO:459.

[294] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления PAR4 как ипактивационный сайт расщепления. В данном контексте термин «сайт расщепления PAR4» относится к расщепляющейся связи вместе с прилегающими или неприлегающими распознающими элементами, или с обоими, достаточной для поддающегося обнаружению протеолиза в расщепляющейся связи PAR4 в условиях, подходящих для активности протеазы PAR4. Предусматривается, что в аспектах настоящего описания может быть пригодной любая аминокислотная последовательность, расщепляемая PAR4. Хотя известны исключения, генерализованная консенсуспая последовательность для сайта расщепления PAR4 - X₁X₂X₃X₄(K/R/Q/F)X₅, (SEQ ID NO:460), где X₁ - предпочтительно малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; Х₂ - предпочтительно большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V, или ароматическая аминокислота подобная F, H, W или Y; Х₃ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₄ - предпочтительно алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; и Х₅ - предпочтительно основная аминокислота подобная K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W или Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М, В Таблице 4 перечислены примерные референтные сайты расщепления для PAR4 (SEQ ID NO:461-478). Дополнительные сайты расщепления PAR4 хорошо известны в области техники или могут быть определены рутинными способами.

[295] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит сайт расщепления PAR4. В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR4 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO:460, где X₁ - малая неполярная аминокислота подобная А, С G, S и Т; Х₂ - большая неполярная аминокислота подобная F, I, L, М, V, или ароматическая аминокислота подобная F, H, W или Y; Х₃ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М; Х₄ - алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, Г и М; и X₅ - основная аминокислота подобная K и R, ароматическая гидрофобная аминокислота подобная F, W или Y, или алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, P, А, V, L, I и М. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления PAR4 содержит консенсусную последовательность SEQ ID NO; 460. где X₁ - A, G, S или Т; Х₂ - F или Y; Х₃ - А или P; Х₄ - А или G; и X₅ - А, V, P, F, W, Y или K. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления PAR4 содержит, например, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:462, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO; 464, SEQ ID NO:465, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:468, SEQ ID NO:469, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:473, SEQ ID NO:474, SEQ ID NO:475, SEQ ID NO; 476, SEQ ID NO:477 или SEQ ID NO:478.

[296] Локализация инактивационного сайта расщепления является критическим аспектом, который определяется несколькими критериями. Первое, размещение инактивационного сайта расщепления не должно влиять значительно на способность клостриднального токсина или гибрида клостридиального токсина вызывать интоксикацию своей клетки-мишени. В данном контексте термин «не влиять значительно», в отношении интоксикации, относится к клостридиальному токсину или гибриду клостридиального токсина, раскрываемому в настоящем описании, который все еще может осуществлять полный механизм интоксикации, посредством которого клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина проникает в клетку-мишень и протеолитически расщепляет целевый субстрат и направляет связывание клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина с рецепторным комплексом низкой или высокой аффинности, интернализацию комплекса токсин/рецептор, транслокацию легкой цепи клостридиального токсина в цитоплазму и энзиматическую модификацию целевого субстрата.

[297] В аспекте данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, может вызывать интоксикацию клетки-мишени в той же степени, что и тот же или подобный клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, однако без модификации инактивационного сайта расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, может вызывать интоксикацию клетки-мишени на, например, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% от уровня этого же или подобного клостридиалыюго токсина или гибрида клостридиального токсина, однако без модификации инактивационного сайта расщепления, В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, может вызывать интоксикацию клетки-мишени на, например, максимально 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% от уровня этого же или подобного клостридиалыюго токсина или гибрида клостридиального токсина, однако без модификации инактивационного сайта расщепления.

[298] Второе, размещение инактивационного сайта расщепления должно быть на поверхности участка токсина или гибрида клостридиального токсина, экспонированного к поверхности, но не погруженного внутрь при помощи белка или не маскированного вторичными структурными элементами. Надлежащая поверхностная экспозиция инактивационного сайта расщепления способствует надлежащему доступу сайта к своей соответствующей протеазе, тем самым делая возможным протеолитическое расщепление. Протеолитическое расщепление инактивационного сайта расщепления своей соответствующей протеазой инактивирует способность клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина вызывать интоксикацию клетки. В данном контексте термин «в значительной степени инактивирует» в отношении к интоксикации, относится к клостридиальному токсину или гибриду клостридиального токсина, раскрываемому в настоящем описании, который после расщепления инактивационного сайта расщепления обладает сниженной способностью осуществлять полный механизм интоксикации, посредством которого клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина проникает в клетку-мишень и протеолитически расщепляет целевый субстрат и направляет связывание клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина с рецепторным комплексом низкой или высокой аффинности, интернализацию комплекса токсин/рецептор, транслокацию легкой цепи клостридиального токсина в цитоплазму и энзиматическую модификацию целевого субстрата.

[299] В одном аспекте данного варианта воплощения протеолитическое расщепление в инактивационном сайте расщепления клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, приводит в результате к полной неспособности токсина вызывать интоксикацию клетки-мишени по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, однако в протеолитически нерасщепленном состоянии (то есть, интоксикационный сайт расщепления интактный или нерасщепленный). В других аспектах данного варианта воплощения протеолитическое расщепление в инактивационном сайте расщепления клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, приводит в результате к, например, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% снижению способности вызывать интоксикацию клетки-мишени по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиальпого токсина, однако в протеолитически нерасщепленном состоянии, В других аспектах данного варианта воплощения протеолитическое расщепление в инактивационном сайте расщепления клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, приводит в результате к например, максимально 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% снижению способности вызывать интоксикацию клетки-мишени по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиалыюго токсина, однако в протеолитически нерасщепленном состоянии.

[300] В аспекте настоящего описания ипактивационный сайт расщепления локализован на участке инактивационного сайта расщепления. В данном контексте термин «участок инактивационного сайта расщепления» относится к аминокислотной последовательности клостридиалыюго токсина или гибрида клостридиалыюго токсина, который может быть модифицирован с содержанием инактивационного сайта расщепления, поскольку такая модификация не будет в значительной степени нарушать способность белка вызывать интоксикацию клетки-мишени; и после экспозиции к своей когнатной протеазе инактивациоиный сайг расщепления будет расщеплен и в значительной степени ииактивирует клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина. Локализация инактивационного сайта расщепления может быть в любом месте участка инактивационного сайта расщепления при условии, что такая локализация не будет значительно влиять на способность клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина вызывать интоксикацию клетки-мишени; и после экспозиции к своей когнатной протеазе расщепление инактивационного сайта расщепления в значительной степени инактивирует клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина. В Таблице 5 перечислены примерные участки инактивационного сайта расщепления, пригодные для использования с клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, раскрываемым в настоящем описании.

[301] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления. В аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокациоиного домена или H_CN субдомена.

[302] В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит ипактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 462-496 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 458-492 SEQ ID NO:3; аминокислоты 464-487 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 463-496 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 458-491 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 434-467 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 453-486 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20; аминокислоты 458-491 SEQ ID NO:21; аминокислоты 475-508 SEQ ID NO:22; аминокислоты 443-476 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 434-467 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[303] В еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивациоиный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационпого сайта расщепления, содержащем аминокислоты 618-634 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 614-630 SEQ ID NO:3; аминокислоты 605-621 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 613-629 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 609-625 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 587-603 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 604-620 SEQ ID NO:18; аминокислоты 605- 621 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 610-626 SEQ ID NO:21; аминокислоты 627-643 SEQ ID NO:22; аминокислоты 596-612 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 587-603 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

Таблица 5. Участки инактивационного сайта расщепления клостридиальных Токсин SEQ ID NO: Участки инактивационного сайта расщепления 1 2 3 4 5 6 7 8 BoNT/A 1 L462-L496 Т618-1634 G638-D651 L665-N687 N752-N765 N826-D835 Т844-L863 К871-А895 BoNT/B 2 L464-Р487 А605-V621 G625-N638 L652-N674 N739-D752 N813-А824 Y831-1850 S858-G882 BoNT/Cl 3 L463-S496 1613-1629 G633-N646 L660-Е682 К747-Q760 Н821-D830 S839-К858 N866-N890 BoNT/D 4 L458-S491 1609-1625 G629-N642 L656-Е678 К743-Q756 Н817-D826 S835-К854 N862-N886 BoNT/E 5 L434-D467 А587-V603 G607-N620 L634-N659 N724-D739 Н800-Q809 Т818-1837 К845-D869 BoNT/F 6 L453-N486 А605-V621 G625-N638 L652-N677 N742-N757 Н818-N827 Т836-1855 К863-G887 BoNT/G 7 L458-S491 S610-1626 G630-N643 М657-N679 N744-D757 N818-N827 Н836-1855 S863-G887

TeNT 8 L475-S508 S627-V643 G647-N660 L674-Q696 K761-E774 N835-K844 V854-V871 V879-N903 BaNT 9 L443-N476 A596-V612 G616-N629 L643-S668 N733-N748 N809-P819 T828-1847 K855-G879 BuNT 10 L434-D467 A587-V603 G607-N620 L634-S659 N724-D739 H800-Q809 T818-1837 K845-D869

[304] Во все еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 638-651 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 634-647 SEQ ID NO:3; аминокислоты 625-638 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 633-646 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 629-642 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO; 14; аминокислоты 607-620 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 624-637 SEQ ID NO:18; аминокислоты 625-638 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 630-643 SEQ ID NO:21; аминокислоты 647-660 SEQ ID NO:22; аминокислоты 616-629 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 607-620 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[305] В дальнейших аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 665-687 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 661-683 SEQ ID NO:3; аминокислоты 652-674 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 660-682 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 656-678 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 634-659 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 651-676 SEQ ID NO:18; аминокислоты 652- 677 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 657-679 SEQ ID NO:21; аминокислоты 674-696 SEQ ID NO:22; аминокислоты 643-668 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 634-659 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[306] В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 752-765 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 748-761 SEQ ID NO:3; аминокислоты 739-752 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO; 9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 747-760 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 743-756 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 724-739 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 741-756 SEQ ID NO:18; аминокислоты 742- 757 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 744-757 SEQ ID NO:21; аминокислоты 761-774 SEQ ID NO:22; аминокислоты 733-748 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 724-739 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[307] В еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 826-835 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 824-831 SEQ ID NO:3; аминокислоты 813-824 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 821-830 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 817-826 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 800-809 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 817-826 SEQ ID NO:18; аминокислоты 818- 827 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 818-827 SEQ ID NO:21; аминокислоты 835-844 SEQ ID NO:22; аминокислоты 809-819 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 800-809 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[308] В еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 844-863 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 840-859 SEQ ID NO:3; аминокислоты 831-850 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 839-858 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 835-854 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 818-837 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 835-854 SEQ ID NO:18; аминокислоты 836- 855 SEQ ID NO; 19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 836-855 SEQ ID NO:21; аминокислоты 854-871 SEQ ID NO:22; аминокислоты 828-847 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 818-837 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[309] В дальнейших аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 871-895 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; аминокислоты 867-891 SEQ ID NO:3; аминокислоты 858-882 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10; аминокислоты 866-890 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12; аминокислоты 862-886 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14; аминокислоты 845-869 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17; аминокислоты 862-886 SEQ ID NO; 18; аминокислоты 863- 887 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20; аминокислоты 863-887 SEQ ID NO:21; аминокислоты 879-903 SEQ ID NO:22; аминокислоты 855-879 SEQ ID NO:23; или аминокислоты 845-869 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[310] В другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/A или BoNT/A, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BoNT/A или BoNT/A, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863, или 871-895 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5; или содержащем аминокислоты 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859, или 867- 891 SEQ ID NO:3. В еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/A, содержащий инактивационный сайта расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, кодируется SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:534, или SEQ ID NO:536. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения BoNT/A, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержит SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:535, или SEQ ID NO:537.

[311] В еще другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/B или BoNT/B, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке ипактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BoNT/B или BoNT/B, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850, или 858-882 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10.

[312] Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/Cl или BoNT/Cl, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BoNT/Cl или BoNT/Cl, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационпого сайта расщепления, содержащем аминокислоты 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858, или 866-890 SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12.

[313] В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/D или BoNT/D, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BoNT/D или BoNT/D, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854, или 862-886 SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14.

[314] В другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/E или BoNT/E, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения а BoNT/E или BoNT/E chimeric раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, или 845-869 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17.

[315] Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/F или BoNT/F, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена, В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BoNT/F или BoNT/F, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационцый сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854, или 862-886 SEQ TD NO:18; или содержащем аминокислоты 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855, или 863-887 SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20.

[316] В дальнейшем аспекте данного варианта воплощения гибрид BoNT/G или BoNT/G, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BoNT/G или BoNT/G, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855, или 863-887 SEQ ID NO:21.

[317] В другом аспекте данного варианта воплощения гибрид TeNT или TeNT, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид TeNT или TeNT, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 475-508, 627-643, 647-660, 674-696, 761-774, 835-844, 854-871, или 879-903 SEQ ID NO:22.

[318] В еще другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BaNT или BaNT, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BaNT или BaNT, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847, или 855-879 SEQ ID NO:23.

[319] Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения гибрид BuNT или BuNT, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивациогшого сайта расщепления от транслокационного домена или H_CN субдомена. В других аспектах данного варианта воплощения гибрид BuNT или BuNT, раскрываемый в настоящем описании, содержит инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, содержащем аминокислоты 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, или 845-869 SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25.

[320] В аспекте настоящего описания клостридиалы-тый токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем профиль безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления. Другими словами, добавление инактивационного сайта расщепления увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с тем же или подобным клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина, но без дополнительного инактивационного сайта расщепления.

[321] Таким образом в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем профиль безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления. В аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, например, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 100%, 110%, по меньшей мере, 120%, по меньшей мере, 130%, по меньшей мере, 140%, по меньшей мере, 150%, по меньшей мере, 160%, по меньшей мере, 170%, по меньшей мере, 180%, по меньшей мере, 190%, по меньшей мере, 200%, 210%, по меньшей мере, 220%, по меньшей мере, 230%, по меньшей мере, 240%, по меньшей мере, 250%, по меньшей мере, 260%, по меньшей мере, 270%, по меньшей мере, 280%, по меньшей мере, 290%, или по меньшей мере, 300%, по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, например, максимально 10%, максимально 20%, максимально 30%, максимально 40%, максимально 50%, максимально 60%, максимально 70%, максимально 80%, максимально 90%, максимально 100%, 110%, максимально 120%, максимально 130%, максимально 140%, максимально 150%, максимально 160%, максимально 170%, максимально 180%, максимально 190%, максимально 200%, 210%, максимально 220%, максимально 230%, максимально 240%, максимально 250%, максимально 260%, максимально 270%, максимально 280%, максимально 290%, или максимально 300%, по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, В еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший на, например, от, приблизительно, 10% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 20% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 30% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 40% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 50% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно 60% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 70% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 80% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 90% до, приблизительно, 300%, или от, приблизительно, 100% до, приблизительно, 300% по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без ипактивационного сайта расщепления.

[322] В других аспектах варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, например, по меньшей мере, 1-кратный, по меньшей мере, 1-кратный, по меньшей мере, 3-кратный, по меньшей мере, 4-кратный, по меньшей мере, 5-кратный, по меньшей мере, 6-кратный, по меньшей мере, 7-кратный, по меньшей мере, 8-кратный, по меньшей мере, 9-кратный, или по меньшей мере, 10-кратный по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления. В еще других аспектах варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, например, по меньшей мере, 1-кратный, максимально 1-кратный, максимально 3-кратный, максимально 4-кратный, максимально 5-кратный, максимально 6-кратный, максимально 7-кратный, максимально 8-кратный, максимально 9-кратный, или максимально 10-кратный по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший на, например, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 10-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 9-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 8-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 7-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 6-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 5-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 10-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 9-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 8-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 7-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 6-кратного или от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 5-кратного.

[323] В другом варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиалыюго токсина, но без ипактивационного сайта расщепления. В аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, на, например, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 100%, 110%, по меньшей мере, 120%, по меньшей мере, 130%, по меньшей мере, 140%, по меньшей мере, 150%, по меньшей мере, 160%, по меньшей мере, 170%, по меньшей мере, 180%, по меньшей мере, 190%, по меньшей мере, 200%, 210%, по меньшей мере, 220%, по меньшей мере, 230%, по меньшей мере, 240%, по меньшей мере, 250%, по меньшей мере, 260%, по меньшей мере, 270%, по меньшей мере, 280%, по меньшей мере, 290%, или по меньшей мере, 300%. В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, на, например, максимально 10%, максимально 20%, максимально 30%, максимально 40%, максимально 50%, максимально 60%, максимально 70%, максимально 80%, максимально 90%, максимально 100%, 110%, максимально 120%, максимально 130%, максимально 140%, максимально 150%, максимально 160%, максимально 170%, максимально 180%, максимально 190%, максимально 200%, 210%, максимально 220%, максимально 230%, максимально 240%, максимально 250%, максимально 260%, максимально 270%, максимально 280%, максимально 290%, или максимально 300%. В еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиалыюго токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, на, например, от, приблизительно, 10% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 20% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 30% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 40% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 50% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 60% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 70% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 80% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 90% до, приблизительно, 300%, или от, приблизительно, 100% до, приблизительно, 300%.

[324] В других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, например, по меньшей мере, 1-кратно, по меньшей мере, 1 -кратно, по меньшей мере, 3-кратно, по меньшей мере, 4-кратно, по меньшей мере, 5-кратно, по меньшей мере, 6-кратно, по меньшей мере, 7-кратно, по меньшей мере, 8-кратно, по меньшей мере, 9-кратно, или по меньшей мере, 10-кратно. В еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, например, максимально 1-кратно, максимально 3-кратно, максимально 4-кратно, максимально 5-кратно, максимально 6-кратно, максимально 7-кратно, максимально 8-кратно, максимально 9-кратно, или максимально 10-кратно. Во псе еще других аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который увеличивает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без ипактивационного сайта расщепления, на, например, от, приблизительно, 1-кратно до, приблизительно, 10-кратно, от, приблизительно, 1-кратно до, приблизительно, 9-кратно, от, приблизительно, 1-кратно до, приблизительно, 8-кратно, от, приблизительно, 1 -кратно до, приблизительно, 7-кратно, от, приблизительно, 1 -кратно до, приблизительно, 6-кратно, от, приблизительно, 1-кратно до, приблизительно, 5-кратно, от, приблизительно, 2-кратно до, приблизительно, 10-кратно, от, приблизительно, 2-кратно до, приблизительно, 9-кратно, от, приблизительно, 2-кратно до, приблизительно, 8-кратно, от, приблизительно, 2-кратно до, приблизительно, 7-кратно, от, приблизительно, 2-кратно до, приблизительно, 6-кратно, или от, приблизительно, 2-кратно до, приблизительно, 5-кратно.

[325] В другом варианте воплощения участок инактивационного сайта расщепления может быть модифицирован с включением единичного инактивационното сайта расщепления. В еще другом варианте воплощения участок инактивационного сайта расщепления может быть модифицирован с включением множества инактивационных сайтов расщепления. В аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления может включать, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 инактивационный сайтов расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления может включать, например, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 инактивационный сайтов расщепления. В еще других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления может включать, например, 2-10 инактивационных сайтов расщепления, 2-8 инактивационных сайтов расщепления, 2-6 инактивационных сайтов расщепления, 2-4 инактивационных сайтов расщепления, 2-3 инактивационных сайтов расщепления, 3-9 инактивационных сайтов расщепления, 3-7 инактивационных сайтов расщепления, 3-5 инактивационных сайтов расщепления, или 3-4 инактивационных сайтов расщепления.

[326] В другом варианте воплощения участок инактивационного сайта расщепления может быть модифицирован с включением только одного типа инактивационного сайта расщепления, такого, как, например, сайта расщепления тромбином. Во все еще другом варианте воплощения участок инактивационного сайта расщепления может быть модифицирован с включением множества различных типов инактивационных сайтов расщепления, таких, как, например, сайга расщепления тромбином, сайта расщепления фактором Ха, сайта расщепления ММР-2 и сайта расщепления ММР-9. В аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления может включать, например, по меньшей мере, 2, 3, 4, или 5 различных типов инактивационных сайтов расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления может включать, например, максимально 2, 3, 4, или 5 различных типов инактивационных сайтов расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления может включать, например, 2-5 различных типов инактивационных сайтов расщепления, 2-4 различных типов инактивационных сайтов расщепления, 2-3 различных типов инактивационных сайтов расщепления, 3-5 различных типов инактивационных сайтов расщепления, или 3-4 различных типов инактивационных сайтов расщепления.

[327] Модификация участка инактивационного сайта расщепления для включения инактивационного сайта расщепления может быть осуществлена путем изменения, по меньшей мере, одной аминокислоты в участке инактивационного сайта расщепления. Не имеющие ограничительного характера примеры изменения аминокислоты включают делецию аминокислоты, добавление аминокислоты или замещение оригинальной аминокислоты другой аминокислотой. В аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления модифицируется с включением инактивационного сайта расщепления путем изменения, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, или 5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления модифицируется с включением инактивационного сайта расщепления путем изменения, например, максимально 1, 2, 3, 4, или 5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления модифицируется с включением инактивационного сайта расщепления путем изменения, например, 1-5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 1-4 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 1-3 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 1-2 аминокислот в участке инактивационного сайга расщепления, 2-5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 2-4 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 2-3 аминокислоты в участке инактивационного сайта расщепления, 3-5 аминокислот в участке инактивационного сайга расщепления, или 4-5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления.

[328] В аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления модифицируется с включением инактивационного сайта расщепления путем делении, добавления, замещения или любой комбинации этого, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, или 5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления. В других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления модифицируется с включением инактивационного сайта расщепления путем делеции, добавления, замещения или любой комбинации этого, например, максимально 1, 2, 3, 4, или 5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления. В еще других аспектах данного варианта воплощения участок инактивационного сайта расщепления модифицируется с включением инактивационного сайта расщепления путем делеции, добавления, замещения или любой комбинации этого, например, 1-5 аминокислот в участке инактивационного сайга расщепления, 1-4 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 1-3 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 1-2 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 2-5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 2-4 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления, 2-3 аминокислоты в участке инактивационного сайта расщепления, 3-5 аминокислот в участке инактивационного сайта расщепления или 4-5 аминокислот в участке инактивационного сайга расщепления.

[329] Модификация участка инактивационного сайта расщепления для включения инактивационного сайта расщепления может быть достигнута с использованием стандартных процедур мутагенеза, известных специалисту в области техники. Не имеющие ограничительного характера примеры методик мутагенеза, наряду с хорошо охарактеризованными реагентами, условиями и протоколами легко доступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничения, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Tnc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; and Stratagene, La Jolla, CA. Эти протоколы являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[330] Как отмечено выше, клостридиальные токсины и гибриды клостридиальных токсинов, раскрываемые в настоящем описании, транслируются в виде одноцепочечных полипептидов, которые впоследствии расщепляется путем протеолнтического разрезания природной протеазой в участке дисульфидной петли. Этот посттрансляционный процессинг приводит к двухцепочечной молекуле, удерживаемой вместе единичной дисульфидной связью и не-ковалентными взаимодействиями. Это протеолитическое разрезание в участке дисульфидной петли может достигаться с использованием сайтов расщепления эндогенными протеазами, находящимися в природном состоянии в двухцепочечном участке петли, или путем конструирования двухцепочечного участка петли для включения сайта расщепления эндогенной протеазой.

[331] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, двухцепочечный участок петли. В данном контексте термин «двухцепочечный участок петли» относится к аминокислотной последовательности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, окруженной по бокам цистеиновыми аминокислотами и содержащей сайт расщепления протеазой, используемый для конвертирования одноцепочечной формы клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина в двухцепочечную форму (Таблица 6). Не имеющие ограничительного характера примеры двухцепочечного участка петли включают, двухцепочечный участок петли BoNT/A, содержащий аминокислоты 430-454 SEQ ID NO:1; двухцепочечный участок петли BoNT/B, содержащий аминокислоты 437-446 SEQ ID NO:2; двухцепочечный участок петли BoNT/Cl, содержащий аминокислоты 437-453 SEQ ID NO:3; двухцепочечный участок петли BoNT/D, содержащий аминокислоты 437-450 SEQ ID NO; 4; двухцепочечный участок петли BoNT/E, содержащий аминокислоты 412-426 SEQ ID NO:5; двухцепочечный участок петли BoNT/F, содержащий аминокислоты 429-445 SEQ ID NO; 6; двухцепочечный участок петли BoNT/G, содержащий аминокислоты 436-450 SEQ ID NO:7; и двухцепочечный участок петли Те NT, содержащий аминокислоты 439-467 SEQ ID NO:8 (Таблица 6).

Таблица 6. Двухцепочечный участок петли Токсин Двухцепочечный участок петли, содержащий сайт расщепления BoNT/A CVRGIITSKTKSLDKGYNK*-ALNDLC BoNT/B CKSVK*------------APGIC BoNT/Cl CHKAIDGRSLYNK*----TLDC BoNT/D CLRLTKNSR*--------DDSTC BoNT/E CKNIVSVKGIR*------KSIC BoNT/F CKSVIPRKGTK*------APPRLC BoNT/G CKPVMYKNTGK*------SEQC TeNT CKKIIPPTNIRENLYNRTA*SLTDLGGELC BaNT CKS-IVSKKGTK*----NSLC BuNT CKN-IVSVKGIR*------KSIC Указаны следующие аминокислотные последовательности: BoNT/A, остатки 430-454 SEQ ID NO:1; BoNT/B, остатки 437-446 SEQ ID NO:2; BoNT/Cl, остатки 437-453 SEQ ID NO:3; BoNT/D, остатки 437-450 SEQ ID NO:4; BoNT/E, остатки 412-426 SEQ ID NO; 5; BoNT/F, остатки 429- 445 SEQ ID NO:6; BoNT/G, остатки 436-450 SEQ ID NO:7; TeNT, остатки 439-467 SEQ ID NO:8; BaNT, остатки 421-435 SEQ ID NO:9; и BuNT, остатки 412-426 SEQ ID NO:10. Звездочки (*) указывают на пептидную связь, расщепляемую протеазой клостридиального токсина.

[332] Таким образом, в варианте воплощения двухцепочечный участок петли содержит двухцепочечный участок петли клостридиального токсина. В аспектах данного варианта воплощения двухцепочечный участок петли содержит, например, двухцепочечный участок петли BoNT/A, двухцепочечный участок петли BoNT/B, двухцепочечный участок петли BoNT/Cl, двухцепочечный участок петли BoNT/D, двухцепочечный участок петли BoNT/E, двухцепочечный участок петли BoNT/F, двухцепочечный участок петли BoNT/G, двухцепочечный участок петли TeNT, двухцепочечный участок петли BaNT, или двухцепочечный участок петли BuNT. В других аспектах данного варианта воплощения двухцепочечный участок петли содержит, например, двухцепочечный участок петли BoNT/A, содержащий аминокислоты 430-454 SEQ ID NO:1; двухцепочечный участок петли BoNT/B, содержащий аминокислоты 437-446 SEQ ID NO:2; двухцепочечный участок петли BoNT/Cl, содержащий аминокислоты 437-453 SEQ ID NO:3; двухцепочечный участок петли BoNT/D, содержащий аминокислоты 437-450 SEQ ID NO:4; двухцепочечный участок петли BoNT/E, содержащий аминокислоты 412-426 SEQ ID NO:5; двухцепочечный участок петли BoNT/F, содержащий аминокислоты 429-445 SEQ ID NO:6; двухцепочечный участок петли BoNT/G, содержащий аминокислоты 436-450 SEQ ID NO:7; или двухцепочечный участок петли TeNT, содержащий аминокислоты 439-467 SEQ ID NO:8. двухцепочечный участок петли BaNT, содержащий аминокислоты 421-435 SEQ ID NO:9; или двухцепочечный участок петли BuNT, содержащий аминокислоты 412-426 SEQ ID NO:10.

[333] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой. В данном контексте термин «двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой» является синонимом «природного двухцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой» и относится к природному сайту расщепления протеазой, находящемуся в двухцепочечном участке петли природного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, и включает, без ограничений, природные варианты двухцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой клостридиального токсина, такие, как например, изоформы двухцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой клостридиального токсина и подтипы двухцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой клостридиального токсина. Не имеющие ограничительного характера примеры сайта расщепления эндогенной протеазой, включают, например, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/A, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/B, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/Cl, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/D, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/E, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/F, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/G и двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой TeNT.

[334] В то время, как идентичность протеазы в настоящее время неизвестна, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой для многих клостридиальных токсинов был определен. В BoNT, расщепление в K448-А449 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/A в двухцепочечную форму; расщепление в K441-А442 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/B в двухцепочечную форму; расщепление в K449-Т450 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/Cl в двухцепочечную форму; расщепление в R445-D446 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/D в двухцепочечную форму; расщепление в R422-K423 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/E в двухцепочечнуто форму; расщепление в К439-А440 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/F в двухцепочечную форму; и расщепление в K446-S447 конвертирует единичную полипептидную форму BoNT/G в двухцепочечную форму. Протеолитическое расщепление единичной полипептидной формы TeNT в A457-S458 приводит в результате к двухцепочечной форме. Протеолитическое расщепление единичной полипептидной формы BaNT в K431-N432 приводит в результате к двухцепочечной форме. Протеолитическое расщепление единичной полипептидной формы BuNT в R422-K423 приводит в результате к двухцепочечной форме. Такой двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой функционально связан с клостридиальным токсином или гибридом клостридиального токсина как гибридный белок. Однако также следует отметить, что эти дополнительные сайты расщепления в двухцепочечной петле также, по-видимому, расщепляются с получением в результате малых пептидных фрагментов, которые теряются. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, одноцепочечный полипептид BoNT/A полностью расщепляется с потерей в результате фрагмента из десяти аминокислот в двухцепочечной петле.

[335] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит а двухцепочечный участок петли, включающий двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой. В аспектах данного варианта воплощения двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой, расположенный на двухцепочечный участок петли содержит, например, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/A, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/B, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/Cl, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/D, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/E, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/F, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BoNT/G, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой TeNT, двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BaNT или двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой BuNT. В других аспектах данного варианта воплощения двухцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой, расположенный на двухцепочечный участок петли содержит, например, двухцепочечный участок петли BoNT/A, содержащий аминокислоты 430-454 SEQ ID NO:1; двухцепочечный участок петли BoNT/B, содержащий аминокислоты 437-446 SEQ ID NO:2; двухцепочечный участок петли BoNT/Cl, содержащий аминокислоты 437-453 SEQ ID NO:3; двухцепочечньтй участок петли BoNT/D, содержащий аминокислоты 437-450 SEQ ID NO:4; двухцепочечный участок петли BoNT/E, содержащий аминокислоты 412-426 SEQ ID NO:5; двухцепочечный участок петли BoNT/F, содержащий аминокислоты 429-445 SEQ ID NO:6; двухцепочечный участок петли BoNT/G, содержащий аминокислоты 436-450 SEQ ID NO:7; или двухцепочечный участок петли TeNT, содержащий аминокислоты 439-467 SEQ ID NO:8; двухцепочечный участок петли BaNT, содержащий аминокислоты 421-435 SEQ ID NO:9; или двухцепочечный участок петли BuNT, содержащий аминокислоты 412-426 SEQ ID NO:10.

[336] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, сайт расщепления экзогенной протеазой. В данном контексте термин «сайт расщепления экзогенной протеазой» является синонимом «сконструированному сайту расщепления протеазой», «не встречающемуся в природе сайту расщепления протеазой» или «не-нативному сайту расщепления протеазой» и относится к сайту расщепления протеазой, который в норме не присутствует в двухцепочечном участке петли из природного клостридиального токсина. Такие сконструированные или экзогенные сайты расщепления протеазой в двухцепочечном участке петли используются для конвертирования одноцепочечной полипептидной формы клостридиального токсина из гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, в свою двухцепочечную форму. Предусматривается, что все или любые сайты расщепления экзогенной протеазой, которые могут быть использованы для конверсии одноцепочечной полипептидной формы клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина в его активную двухцепочечнуто форму, пригодны для осуществления аспектов настоящего описания. Не имеющие ограничительного характера примеры сайтов расщепления экзогенной протеазой включают, например, сайт расщепления растительным папаином, сайт расщепления папаином насекомых, сайт расщепления папаином ракообразных, сайт расщепления энтерокиназой, сайт расщепления протеазой человеческого риновируса 3С, сайт расщепления протеазой человеческого энтеровируса 3С, сайт расщепления протеазой вируса гравировки табака (Tobacco Etch Virus, TEV), сайт расщепления вирусом крапчатости жилок табака (Tobacco Vein Mottling Virus, TVMV), сайт расщепления субтилизином, сайт расщепления гидроксиламином или сайт расщепления каспазой 3. Сконструированные сайты расщепления протеазой, расположенные в двухцепочечной петле, описаны в, например, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent 7,419,676, Dolly, et al., Activatabie Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent 7,422,877, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent Publication 2009/0069238, Steward, et al., Activatahle Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent Publication 2008/0032930, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent Publication 2009/0018081, Steward, et al., Activatahle Recombinant Neurotoxins, U.S.Patent Publication 2009/0005313, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, U.S. Patent Publication 2009/0004224; каждый из которых включен здесь посредством ссылки во всей полноте.

[337] Предусматривается, что сайт расщепления экзогенной протеазой всех или любой длины может быть пригодным в аспектах настоящего описания с условием того, что сайт расщепления экзогенной протеазой способен поддаваться расщеплению своей соответствующей протеазой. Поэтому в аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой может иметь длину, например, по меньшей мере, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, или, по меньшей мере, 60 аминокислот; или, максимально 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, или, по меньшей мере, 60 аминокислот.

[338] В варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, содержит двухцепочечный участок петли, включающий сайт расщепления экзогенной протеазой. В аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления растительным папаином, сайт расщепления папаином насекомых, сайт расщепления папаином ракообразных, сайт расщепления протеазой энтерокиназы, не относящейся к человеку, сайт расщепления протеазой вируса гравировки табака, сайт расщепления протеазой вируса крапчатости жилок табака, сайт расщепления протеазой человеческого риновируса 3С, сайт расщепления протеазой человеческого энтеровируса 3С, сайт расщепления субтилизином, сайт расщепления гидроксиламином, сайт расщепления протеазой SUMO/ULP-1 и сайт расщепления каспазой 3, не относящейся к человеку.

[339] В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления энтерокиназой, не относящейся к человеку. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления протеазой бычьей энтерокиназы. В еще другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:480.

[340] В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, расщепление протеазой вируса гравировки табака. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, консенсуснуго последовательность EX₁X₂YX₃Q*G (SEQ ID NO:481) или EX₁X₂YX₃Q*S (SEQ ID NO:482), где X₁, X₂ и Х₃ любая аминокислота. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:483, SEQ ID NO:484, SEQ ID NO:485, SEQ ID NO:486, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:489, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:491 или SEQ ID NO:492.

[341] В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления протеазой вируса крапчатости жилок табака. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, консенсусную последовательность X₁X₂VRFQ*G (SEQ ID NO:493) или X₁X₂VRFQ*S (SEQ ID NO:494), где X₁ и Х₂, независимо, любая аминокислота. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:495, SEQ ID NO:496, SEQ ID NO:497, или SEQ ID NO:498.

[342] Во все еще другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления протеазой человеческого риновируса 3С. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, консенсусную последовательность X₁X₂LFQ*GP (SEQ ID NO:499), где X₁ любая аминокислота с предпочтительной кислой аминокислотой подобной D или Е; и Х₂ предпочтительно S, Т, и алифатическая гидрофобная аминокислота подобная G, Р, А, V, L, I и М. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:500, SEQ ID NO:501, SEQ ID NO:502, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:504 или SEQ ID NO:505. В другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, протеазу человеческого риновируса 3С, расщепляемую PRESCISSION^®.

[343] В еще другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления субтилизином. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, консенсусную последовательность Х₁Х₂Х₃Х₄Н*Y (SEQ ID NO:506) или X₁X₂X₃X₄YH* (SEQ ID NO:507), где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄, независимо, любая аминокислота. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:508, SEQ ID NO:509 или SEQ ID NO:510. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной лротеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления субтилизином, расщепляемый GENENASE.

[344] В еще другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления гидроксиламином. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, дипептид N*G. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:511 или SEQ ID NO:512.

[345] В еще другом аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления протеазой SUMO/ULP-1. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, консенсусную последовательность GG*Х₁Х₂Х₃ (SEQ ID NO:513), где X₁, X₂ и Х₃, независимо, любая аминокислота. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:514.

[346] В аспекте данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления каспазой 3. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, сайт расщепления протеазой каспазы 3, не относящейся к человеку. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, консенсусную последовательность DX₁X₂D*X₃, (SEQ ID NO:515), где X₁ любая аминокислота, предпочтительно, кислая аминокислота подобная D и Е, Х₂ любая аминокислота и Х₃ аминокислота, предпочтительно, малая неполярная аминокислота подобная А, С, G, S и Т. В других аспектах данного варианта воплощения сайт расщепления экзогенной протеазой, расположенный в двухцепочечном участке петли, содержит, например, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518, SEQ ID NO:519, SEQ ID NO:520 или SEQ ID NO:521.

[347] Двухцепочечный участок петли может быть модифицирован таким образом, что природный двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой замещается сайтом расщепления экзогенной протеазой. В этой модификации природный двухцепочечный петлевой сайт расщепления протеазой делается нефункциональным и, таким образом, он не может быть расщеплен своей протеазой. Только сайт расщепления экзогенной протеазой может быть расщеплен своей соответствующей протеазой. В этом типе модификации сайт экзогенной протеазы функционально присоединен к клостридиалыюму токсину или гибриду клостридиального токсина в качестве гибридного белка, и этот сайт может быть расщеплен своей соответствующей экзогенной протеазой. Заменой двухцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой на сайт расщепления экзогенной протеазой может быть замещение сайтов, где экзогенный сайт сконструирован в положении, приближающемуся к расположению сайта расщепления у эндогенного сайта. Заменой двухцепочечного петлевого сайта расщепления протеазой на сайт расщепления экзогенной протеазой может быть добавление экзогенного сайта, где экзогенный сайт сконструирован в положении, отличающемся от расположения сайта расщепления у эндогенного сайта, эндогенный сайт сконструирован таким образом, чтобы стать нефункциональным. Расположение и тип сайта расщепления протеазой могут быть критическими, так как некоторые связывающие домены требуют свободной амино-концевой или карбоксил-концевой аминокислоты. Например, когда пептид-связывающий домен располагается между двумя другими доменами, например, см. ФИГ.4, критерием отбора сайта расщепления протеазой может быть то, оставляет ли протеаза, которая расщепляет свой сайт, бесфланцевый срез, экспонируя свободный амино-конец или карбоксил-конец связывающего домена, необходимый для селективного связывания связывающего домена со своим рецептором.

[348] Природный сайт расщепления протеазой может быть сделан нефункциональным путем изменения, по меньшей мере, одной из двух аминокислот, расположенных по краям пептидной связи, расщепляемой природной протеазой двухцепочечной петли. Могут быть произведены более обширные изменения с условием того, что два цистеиновых остатка двухцепочечного участка петли остаются интактными и участок все еще способен образовывать дисульфидный мостик. Не имеющие ограничительного характера примеры изменения аминокислоты включают делению аминокислоты или замену оригинальной аминокислоты другой аминокислотой. Так, в одном варианте воплощения природный сайт расщепления протеазой сделан нефункциональным путем изменения, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 аминокислот, включая, по меньшей мере, одну из двух аминокислот, расположенных по краям пептидной связи, расщепляемой природной протеазой. В другом варианте воплощения природный сайт расщепления протеазой сделан нефункциональным путем изменения, самое большее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 аминокислот, включая, по меньшей мере, одну из двух аминокислот, расположенных по краям пептидной связи, расщепляемой природной протеазой.

[349] Понимается, что модифицированный клостридиальный токсин, раскрываемый в настоящем описании, может необязательно далее включать гибкий участок, содержащий гибкий спейсер. Гибкий участок, содержащий гибкие спейсеры, может быть использован для регулирования длины полинептидного участка с целью оптимизации характеристики, принадлежности или свойства полипептида. В качестве не имеющего ограничительного характера примера, полипептидный участок, содержащий один или более гибких спейсеров в тандеме, может быть использован для лучшей экспозиции сайта расщепления протеазой, тем самым способствуя расщеплению этого сайта протеазой. В качестве другого примера, не имеющего ограничительного характера, полипептидный участок, содержащий один или более гибких спейсеров в тандеме, может быть использован для лучшей презентации пептид-связывающего домена, тем самым способствуя связыванию этого связывающего домена со своим рецептором.

[350] Гибкий спейсер, содержащий пептид, имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту в длину и содержит незаряженные аминокислоты с R группами небольших боковых цепей, такие, как, например, малые неполярные аминокислоты подобные А, С, G, S и Т. Так, в варианте воплощения гибкий спейсер может иметь в длину, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот; или, максимально 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот.Во все еще другом варианте воплощения гибкий спейсер может быть, например, между 1-3 аминокислот, между 2-4 аминокислот, между 3-5 аминокислот, между 4-6 аминокислот или между 5-7 аминокислот.Не имеющие ограничительного характера примеры гибкого спейсера включают, например, G-спейсеры, такие, как GGG, GGGG (SEQ ID NO:522) и GGGGS (SEQ ID NO:523) или А-спейсеры, такие, как ААА, АААА (SEQ ID NO:524) и ААААТ (SEQ ID NO:525). Такой гибкий участок функционально присоединен внутри рамки считывания к модифицированному клостридиальному токсину в качестве гибридного белка.

[351] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может далее содержать гибкий участок, включающий гибкий спейсер. В другом варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может далее содержать гибкий участок, включающий множество гибких спейсеров в тандеме. В аспектах данного варианта воплощения гибкий участок может содержать в тандеме, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 G-спейсеров; или, максимально 1, 2, 3, 4 или 5 G-спейсеров. Во все еще других аспектах данного варианта воплощения гибкий участок может содержать в тандеме, например, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 А-спейсеров; или, самое большее 1, 2, 3, 4 или 5 А-спейсеров. В другом аспекте данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина может содержать гибкий участок, включающий одну или более копий тех же гибких спейсеров, одну или более копий тех же или отличных участков гибких спейсеров, или любую комбинацию этого.

[352] Предусматривается, что клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может содержать гибкий спейсер в любой и во всех локализациях с условием того, что клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина способен выполнять полный процесс интоксикации. В аспектах данного варианта воплощения гибкий спейсер позиционируется между, например, энзиматическим доменом и транслокационным доменом, энзиматическим доменом и связывающим доменом, энзиматическим доменом и сайтом расщепления экзогенной протеазой. В других аспектах данного варианта воплощения гибкий спейсер позиционируется между, например, связывающим доменом и транслокационным доменом, связывающим доменом и энзиматическим доменом, связывающим доменом и сайтом расщепления экзогенной протеазой. В еще других аспектах данного варианта воплощения гибкий спейсер позиционируется между, например, транслокационным доменом и энзиматическим доменом, транслокационным доменом и связывающим доменом, транслокационным доменом и сайтом расщепления экзогенной протеазой

[353] В качестве другого не имеющего ограничительного характера примера необязательного компонента, клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина может далее содержать эпитоп-связывающий участок. Эпитоп-связывающий участок может быть использован в широком спектре методик, включающих, например, очистку белка и визуализацию белка. Такой эпитоп-связывающий участок функционально присоединен внутри рамки считывания к модифицированному клостридиальному токсину в качестве гибридного белка. Не имеющие ограничительного характера примеры эпитоп-связывающего участка включают, например, FLAG, Express™, гемагглютинин вируса гриппа человека (НА), человеческий белок p62^cMyc (c-MYC), гликопротеин вируса везикулярного стоматита (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein, VSV-G), предшественник гликопротеина-D вируса простого герпеса (Herpes simplex virus, HSV), V5, AU1 и AU5; аффинное связывание, такое, как, например, полигистидин (HIS), стрептавидин-связътвающий пептид (strep), и биотин или последовательность биотинилирования; пептид-связывающие участки, такие, как, например, глютатион-связывающий домен глютатион-S-трансферазы, кальмодулин-связывающий домен калъмодулин-связывающего белка, и мальтоза-связывающий домен мальтоза-связывающего белка. Не имеющие ограничительного характера примеры конкретных протоколов для отбора, получения и использования соответствующего связывающего пептида описаны в, например, Epitope Tagging, pp.17.90-17.93 (Sambrook and Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol.3, 3^rd ed. 2001); Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1998); and Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998). В добавление, не имеющие ограничительного характера примеры связывающих пептидов, наряду с хорошо охарактеризованными реагентами, условиями и протоколами легко доступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничения, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; и Stratagene, La Jolla, CA. Эти протоколы являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[354] Таким образом, в варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может далее содержать эпитоп-связывающий участок. В другом варианте воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может далее содержать множество эпитоп-связывающих участков. В аспектах данного варианта воплощения клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина может содержать, напршюр, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 эпитоп-связывающих участков. В других аспектах данного варианта воплощения клостридиалъный токсин или гибрид клостридиального токсина может содержать, например, максимально 1, 2, 3, 4 или 5 эпитоп-связывающих участков. В другом аспекте данного варианта воплощения модифицированный клостридиальный токсин может содержать одну или более копий этого же эпитоп-связывающего участка, одну или более копий других эпитоп-связывающих участков, или любую комбинацию этого.

[355] Локализация эпитоп-связывающего участка может находиться в различных положениях, включая, без ограничения, на амино конце, внутри или на карбоксил конце клостридиалъного токсина или гибрида клостридиального токсина. Таким образом, в варианте воплощения эпитоп-связывающий участок расположен на амино конце клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, В другом варианте воплощения эпитоп-связывающий участок расположен на карбоксил конце модифицированного клостридиального токсина.

[356] Аспекты настоящего описания предоставляют, частично, полинуклеотидные молекулы. В данном контексте термин «полинуклеотидная молекула» является синонимом «молекула нуклеиновой кислоты» и относится к полимерной форме нуклеотидов, такой, как, например, рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды. Предусматривается, что любая и все полинуклеотидные молекулы, способные кодировать клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, могут быть пригодными, включая, без ограничения, природные и не встречающиеся в природе молекулы ДНК и природные и не встречающиеся в природе молекулы РНК. Не имеющие ограничительного характера примеры природных и не встречающихся в природе молекул ДНК включают однонитчатые молекулы ДНК, двунитчатые молекулы ДНК, молекулы геномной ДНК, молекулы кДНК, векторные конструкции, такие, как, например, плазмидные конструкции, фагмидные конструкции, конструкции бактериофагов, ретровирусные конструкции и конструкции искусственных хромосом. Не имеющие ограничительного характера примеры природных и не встречающихся в природе молекул РНК включают однонитчатые РНК, двунитчатые РНК и мРНК.

[357] Общепризнанные методики молекулярной биологии, которые могут быть необходимыми для получения полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсини или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, включая, но не ограничиваясь, процедурами, затрагивающими амплификацию полимеразной цепной реакции (ПЦР), реакции рестрикционных ферментов, электрофорез в агарозном геле, дотирование нуклеиновых кислот, бактериальную трансформацию, очистку нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот и методики, основанные на рекомбинации, являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения. Не имеющие ограничительного характера примеры конкретных протоколов, необходимых для получения полинуклеотидной молекулы, кодирующей модифицированный клостридиальный токсин, описаны в, например. Molecular Cloning A Laboratory Manual, supra, (2001); and Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004). В добавление, широко доступны многообразные коммерческие продукты, пригодные для получения полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. Эти протоколы являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[358] Таким образом, в варианте воплощения полинуклеотидная молекула кодирует клостридиалъный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании.

[359] Другой аспект настоящего описания предоставляет, частично, способ получения клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, такой способ, содержащий этап экспрессирования полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина в клетке. Другой аспект настоящего описания предоставляет способ получения клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, такой способ, содержащий этап введения экспрессирующей конструкции, содержащей полинуклеотидную молекулу, кодирующую клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсин, в клетку и экспрессию экспрессирующей конструкции в клетке.

[360] Способы, раскрываемые в настоящем описании, включают, частично, клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина. Предусматривается, что любой или все клостридиальные токсины или гибриды клостридиальных токсинов, раскрываемые в настоящем описании, могут быть получены, используя способы, раскрываемые в настоящем описании. Также предусматривается, что любые или все полинуклеотидныс молекулы, кодирующие клостридиальный токсин или гибрид клостридиалъного токсина, раскрываемый в настоящем описании, могут быть пригодными в получении клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, используя способы, раскрываемые в настоящем описании.

[361] Способы, раскрываемые в настоящем описании, включают, частично, экспрессирующую конструкцию. Экспрессирующая конструкция содержит полинуклеотидную молекулу, раскрываемую в настоящем описании, функционально присоединенную к экспрессионному вектору, пригодному для экспрессии полинуклеотидной молекулы в клетке или в бесклеточном экстракте. Для экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может быть использовано широкое многообразие экспрессионных векторов, включая, без ограничения, вирусный экспрессионный вектор; прокариотический экспрессионный вектор; эукариотические экспрессионные векторы, такие, как, например, экспрессионный вектор дрожжей, экспрессионный вектор насекомых и экспрессионный вектор млекопитающих; экспрессионный вектор бесклеточного экстракта. Далее понимается, что экспрессионные векторы, пригодные для осуществления аспектов данных способов, могут включать такие векторы, которые экспрессиругот клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина под контролем конститутивного, ткане-специфического, специфического для клетки или индуцибельного промоторного элемента, элемента - энхансера или обоих. Не имеющие ограничительного характера примеры экспрессионных векторов, наряду с общепризнанными реагентами и условиями для получения и использования экспрессирующей конструкции из таких экспрессионных векторов, легко доступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничения, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; и Stratagene, La Jolla, CA. Отбор, Отбор, получение и использование соответствующего экспрессионного векторя являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[362] Таким образом, в аспектах данного варианта воплощения полинуклеотидпая молекула, кодирующая клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, функционально связана с экспрессионным вектором. В аспектах данного варианта воплощения экспрессионный вектор это, например, вирусный экспрессионный вектор, прокариотический экспрессионный вектор, экспрессионный вектор дрожжей, экспрессионный вектор насекомых или экспрессионный вектор млекопитающих. В других аспектах данного варианта воплощения полинуклеотидная молекула, кодирующая клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, функционально связана с экспрессионным вектором бесклеточного экстракта.

[363] Способы, раскрываемые в настоящем описании, включают, частично, клетку. Предусматривается, что любая и все клетки могут быть использованы. Таким образом, аспекты данного варианта воплощения включают, без ограничений, прокариотические клетки, включая, без ограничения, штаммы аэробных, микроаэрофильных, капнофильных, факультативных, анаэробных, грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток таких, как те, что происходят из, например, Escherichia coli. Bacillus fiublllis, Bacillus lichenifonnis. Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudonwnas fliiorescens и Salmonella typhimurium; и эукариотические клетки, включая, без ограничения, штаммы дрожжей, таких, как, например, те, что получены из Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccliaromyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica; клетки насекомых и клеточные линии, происходящие из насекомых, таких, как, например, те, что происходят из Spodoptera frugiperda, Tricliopliisia ni, Drosopliila melanogaster и Manduca sexta; и клетки млекопитающих и клеточные линии, происходящие из клеток млекопитающих, такие, как, например, те, что происходят из мыши, крысы, хомяка, свиньи, быка, лошади, примата и человека. Клеточные линии могут быть получены от Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection), Европейской коллекции клеточных культур (European Collection of Cell Cultures) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). He имеющие ограничительного характера примеры конкретных протоколов для отбора, получения и использования соответствующей клеточной линии описаны в, например, Insect Cell Culture Engineering (Mattheus F.A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); Insect Cell Cultures: Fundamental and Applied Aspects (J.M. Vlak etal. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & lan F. Rae, General Techniques of Cell Culture (Cambridge University Press, 1997); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. lan Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Wiley-Liss, 4^th ed. 2000); Animal Cell Culture: A Practical Approach (John R.W. Masters ed., Oxford University Press, 3^rd ed. 2000); Molecular Cloning A Laboratory Manual, supra, (2001); Basic Cell Culture: A Practical Approach (John M. Davis, Oxford Press, 2^nd ed. 2002); и Current Protocols in Molecular Biology, supra, (2004). Эти протоколы являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[364] Способы, раскрываемые в настоящем описании, включают, частично, введение в клетку полинуклеотидной молекулы. Полинуклеотидная молекула, введенная в клетку, может временно или стабильно поддерживаться данной клеткой. Полинуклеотидные молекулы, поддерживаемые стабильно, могут быть внехромосомными и реплицироваться автономно, или они могут быть интегрированы в хромосомный материал и реплицироваться неавтономно. Подразумевается, что может быть применен любой и все способы для введения в клетку полинуклеотидной молекулы, раскрываемой в настоящем описании. Способы, пригодные для введения полинуклеотидной молекулы в клетку включают, без ограничений, химически опосредованную трансфекцию или трансформацию, такую, как, например, опосредованную кальция хлоридом, опосредованную кальция фосфатом, опосредованную диэтил-аминоэтил декстраном (DEAE), опосредованную липидом, опосредованную полиэтиленимином (PEI), опосредованную полилизином и опосредованную полибреном; физически опосредованную трансфекцию или трансформацию, такую, как, например, опосредованную доставкой биолостической частицы, микроинъекцией, слиянием протопласта и электропорацией; и трансфекця, опосредованная вирусом, такая, как, например, трансфекця, опосредованная ретровирусом, см., например. Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp.16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol.3, 3^rd ed. 2001). Специалист в области техники понимает, что выбор конкретного способа для введения экспрессирующей конструкцияи в клетку будет зависеть, частично, от того, будет ли клетка временно содержать экспрессирующую конструкцию, или клетка будет стабильно содержать экспрессирующую конструкцию. Эти протоколы являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[365] В аспекте данного варианта воплощения используется химически-опосредованный способ, называемый трансфекцией, для введения в клетку полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. В химически опосредованных способах трансфекции химический реагент образует с нуклеиновой кислотой комплекс, способствующий ее поглощению внутрь клеток. Такие химические реагенты включают, без ограничения, опосредованные кальция фосфатом, см., например, Martin Jordan & Florian Worm, Transfeclion of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); опосредованные диэтил-аминоэтил декстраном (DEAE), опосредованные липидом, опосредованные катионным полимером подобным полиэтилениману (PEI) и опосредованные полилизином и опосредованные полибреном, см., например, Chun Zhang et al., Polyetliylenimme strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150 (2004). Такие химически-опосредованные доставочные системы могут быть приготовлены при помощи стандартных способов и они являются коммерчески доступными, см., например, CellPhect Transfection Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); LIPOFECTAMINE™ Transfection Reagent (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 Transfection kit (Fermentas, Inc., Hanover, MD) и SuperFect and Effectene Transfection Kits (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

[366] В другом аспекте данного варианта воплощения используется физически опосредованный способ для введения в клетку полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, Физические методики включают, без ограничения, электропорацию, биолистику и микроинъекцию. Методики биолистики и микроинъекции перфорируют клеточную стенку с целью введения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, см., например, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods 67-75 (1997); and John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125 (2004). Электропорация, также называемая электропермеабилизацией, использует короткие, высоковольтные электрические импульсы для создания временных пор в мембране, через которые молекулы нуклеиновой кислоты входят и могут быть эффективно использованы для создания стабильных и временных трансфекций всех клеточных типов, см., например, М, Golzio et al., In vitro and in vivo electric field - mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); and Oliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004).

[367] В другом аспекте данного варианта воплощения используется опосредованный вирусом способ, называемый трансдукцией, для введения в клетку полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. В способах временной трансдукции, опосредованной вирусом, используется на практике способ, при помощи которого вирусные частицы осуществляют инфекцию и реплицируются в клетке хозяина, с целью применения этого механизма для введения полинуклеотидной молекулы в клетку. Способы, опосредованные вирусами, были разработаны из большого многообразия вирусов, включая, без ограничения, ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирусы простого герпеса, пикорнавирусы, альфавирусы и бакуловирусы, см., например, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); and Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E.М. Poeschia, Non-primate ientivircil vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al, Adenovirus vectors for gene delivery, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associaled viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associafed virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based экспрессионный вектору: strategies and applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombuiant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002); and A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).

[368] Аденовирусы - безобол очечные вирусы с двунитчатой ДНК часто выбираются для трансфекции клеток млекопитающих благодаря тому, что аденовирусы несут относительно большие полинуклеотидные молекулы в, приблизительно, 36 кб, продуцируются в высоком титре и могут эффективно инфицировать большое многообразие как делящихся, так и неделящихся клеток, см., например, Wim Т.J. M.С.Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia; analysis of adenoviral vector performance in The CNS and PNS, 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); and Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adcnovirus vectors, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001). Трансдукция с использование основанных на аденовирусах систем не поддерживает продолжительную экспрессию белка, так как молекула нуклеиновой кислоты, скорее, содержится, в эписоме, вместо того, чтобы быть интегрированной в хромосому клетки хозяина. Аденовирусные векторные системы и конкретные протоколы того, как использовать такие векторы, раскрываются в, например, VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWER™ Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); and ADEASY™ Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) and ADEASY™ Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.

[369] Доставка полинуклеотидной молекулы также может использовать однонитчатые РНК ретровирусы, такие, как, например, онкоретровирусы и лентивирусы. Трансдукция, опосредованная ретровирусами, часто демонстрирует в результате эффективность, близкую к 100%, может легко контролировать количество копий провируса путем изменения множественности инфекции (MOI), и она может быть использована как для временной, так и для постоянной трансдукции клеток, см, например, Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-hased vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); and Roland Wolkowicz et al., Lentiviral. vectors/or the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Ретровирусные частицы состоят из РНК генома, упакованного в белковый капсид, окруженный липидной оболочкой. Ретровирус инфицирует клетку хозяина путем введения своей РНК в цитоплазму вместе с ферментом обратной транскритттазой. РНК матрица затем транскрибируется путем обратной транскрипции в линейную двунитчатую кДНК, которая самореплицируется путем интегрирования в геном хозяина. Вирусные частицы распространяются как вертикально (от родительской клетки к дочерней клетке через провирус), так и горизонтально (от клетки к клетке через вирион). Эта стратегия репликации делает возможным долгосрочную персистентную экспрессию, так как искомые молекулы нуклеиновых кислот стабильно интегрированы в хромосому клетки хозяина, тем самым делая возможным долгосрочную экспрессию белка. Например, исследования на животных показали, что лентивирусные векторы, введенные в разнообразные ткани, производили устойчивую экспрессию белка в течение более 1 года, см., например, Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996). Широко используются векторные системы - производные онкоретровирусов, таких, как, например, вирус мышиной лейкемии Молони (Moloney murine leukemia virus, MoMLV), и они инфицируют многие различные неделящиеся клетки. Лентивирусы также могут инфицировать много различных клеточных типов, включая делящиеся и неделящиеся клетки, и они обладают сложными белками оболочки, которые обеспечивают высокоспецифичный клеточный таргетинг.

[370] Ретровирусные векторы и конкретные протоколы использования таких векторов раскрываются в, например, Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline- responsive promoters, U.S. Patent No.5,464,758 (Nov.7, 1995) and Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, U.S. Patent No.5,814,618 (Sep.29, 1998) David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid Iwrmone receptor polypeptides and cells transformed with same, U.S. Patent No.5,514,578 (May 7, 1996) and David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, U.S. Patent 6,245,531 (Jun, 12, 2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, U.S. Patent No.5,364,791 (Nov.15, 1994), Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, U.S. Patent No.5,874,534 (Feb. 23, 1999) and Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, U.S. Patent No.5,935,934 (Aug. 10, 1999). Более этого, такие вирусные поставочные системы могут быть приготовлены стандартными способами и являются коммерчески доступными, см., например, BD™ Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) and BD™ Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (Mar.14, 2003), GENESWITCH™ System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and GENESWITCH™ System A Mifepri stone-Regulated Expression System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov.4, 2002); VIRAPOWER™ Lentiviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWER™ Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec.8, 2003); and COMPLETE CONTROL^® Retroviral Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) and COMPLETE CONTROL^® Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e.

[371] Способы, раскрываемые в настоящем описании, включают, частично, экспрессию из полинуклеотидной молекулы клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании. Предусматривается, что любая из многообразия экспрессирующих систем может быть пригодной для экспрессии из полинуклеотидной молекулы клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании, включая, без ограничения, системы, основанные на клетках, и бесклеточные экспрессирующие системы. Системы, основанные на клетках, включают без ограничения вирусные экспрессирующие системы, прокариотические экспрессирующие системы, экспрессирующие системы дрожжей, экспрессирующие системы бакуловирусов, экспрессирующие системы насекомых и экспрессирующие системы млекопитающих. Бесклеточные системы включают, без ограничения, экстракты зародышей пшеницы, экстракты кроличьих ретикулоцитов и экстракты E.coli, и, в основном, они эквивалентны раскрываемым здесь способам. Экспрессия полинуклеотидной молекулы с использованием экспрессирующей системы может включать любую из многообразных характеристик, включая, без ограничения, индуцибельную экспрессию, неиндуцибельную экспрессию, конститутивную экспрессию, экспрессию, опосредованную вирусом, стабильно интегрированную экспрессию и временную экспрессию. Экспрессирующие системы, включающие хорошо охарактеризованные векторы, реагенты, условия и клетки, являются общепризнанными и они легкодоступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничения, Ambion, Inc. Austin, IX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; and Stratagene, La Jolla, CA. He имеющие ограничительного характера примеры выбора и использования подходящих гетерологических экспрессирующих систем описаны в, например, Protein Expression. A Practical Approach (S.J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, Gene Expression Systems. Using Nature for the Art of Expression (Academic Press, 1999); and Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) Current Science 1121-1128, (2001). Эти протоколы являются рутинными процедурами в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[372] Для экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиалы-юго токсина, раскрываемый в настоящем описании, пригодны разнообразные процедуры экспрессии, основанной на клетках. Включенные примеры, без ограничения, вирусные экспрессирующие системы, прокариотические экспрессирующие системы, экспрессирующие системы дрожжей, экспрессирующие системы бакуловирусов, экспрессирующие системы насекомых и экспрессирующие системы млекопитающих. Вирусные экспрессирующие системы включают, без ограничения, VIRAPOWER™ Lentiviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), аденовирусные экспрессирующие системы (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), аденовирусную векторною систему ADEASY™ XL (Stratagene, La Jolla, CA) и ретровирусную ген-экспрессирующую систему VIRAPORT^® (Stratagene, La Jolla, CA). He имеющие ограничительного характера примеры прокариотических экспрессирующих систем включают экспрессирущую систему CHAMPION™ pET (EMD Biosciences-Novagen, Madison, W1), бактериальную экспрессирущую систему TRIEX™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl), экспрессирущую систему QIAEXPRESS^® (QIAGEN, Inc.), и систему экспрессии и очистки белка AFFINITY^® (Stratagene, La Jolla, CA). Экспрессирующие системы дрожжей включают, без ограничения, набор для экспрессии EASYSELECT™ Pichia (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), наборы экспрессионного вектора YES-ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) и экспрессиругощую систему SPECTRA™ S. pombe (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), He имеющие ограничительного характера примеры экспрессирующих систем бакуловирусов включают BACULODIRECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), BAC-TO-BAC^® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) и BD BACULOGOLD™ (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA). Экспрессирующие системы насекомых включают, без ограничения, экспрессирующую систему Drosophila (DES^®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), систему INSECTSELECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) и INSECTDIRECT™ System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl). He имеющие ограничительного характера примеры экспрессирующих систем млекопитающих включают, без ограничения, систему T-REX™ (Tetracycline-Regulated Expression) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), систему FLP-IN™ T-REX™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), систему pcDNA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), систему pSecTag2 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), систему EXCHANGER^®, INTERPLAY™ Mammalian TAP System (Stratagene, La Jolla, CA), COMPLETE CONTROL^® Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA) и LACSWITCH^® II Inducible Mammalian Expression System (Stratagene, La Jolla, CA).

[373] Другая процедура экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, использует бесклеточную экспрессирущую систему, такую как, без ограничений, прокариотические экстракты и эукариотические экстракты. Не имеющие ограничительного характера примеры экстрактов прокариотических клеток включают RTS 100 Е.coli HY Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), ActivePro In Vitro Translation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX), систему ECOPRO™ System (EMD Biosciences-Novagen, Madison, W1) и экспрессирующую систему EXPRESSWAY™ Plus (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Эукариотический клеточный экстракт включает, без ограничения, набор RTS 100 Wheat Germ CECF (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), системы TNT^® Coupled Wheat Germ Extract (Promega Corp., Madison, W1), набор Wheat Germ IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX), набор Retie Lysate IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX), систему PROTEINSCRIPT^® II (Ambion, Inc., Austin, TX) и системы TNT^® Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega Corp., Madison, Wl).

[374] Клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, вырабатывается клеткой в одноцепочечной форме. С целью достижения полной активности одноцепочечной форме следует конвертироваться в свою двухцепочечную форму. Как раскрывается выше, этот процесс конверсии достигается путем расщепления сайга расщепления протеазой, расположенного в двухцепочечном участок петли клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, раскрываемого в настоящем описании. Этот процесс конверсии может быть проведен с использованием стандартного анализа протеолитического расщепления in vitro или с помощью основанной на клетках системы протеолитического расщепления, как описано в заявке на патент Ghanshani, et al., Methods of Intracellular Conversion of Single-Chain Proteins into their Di-chain Form, Attorney Docket No.18469 PROV (ВОТ), которая здесь включена путем ссылки во всей полноте.

[375] Аспекты настоящего описания раскрывают, частично, композицию, содержащую клостридиальный токсин или гибрид клостиридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. В дальнейшем аспекте, композиция - это фармацевтически приемлемая композиция. В данном контексте термин «фармацевтически приемлемая» относится к любой молекулярной структуре или композиции, которая не вызывает нежелательную, аллергическую или другую неблагоприятную или ненужную реакцию при введении индивидууму. В данном контексте термин «фармацевтически приемлемая композиция» является синонимом «фармацевтической композиции» и относится к терапевтически эффективной концентрации активного ингредиента, такой, как, например, любой из клостридиальных токсинов или гибридов клостридиального токсина, раскрываемых в настоящем описании. Фармацевтическая композиция, содержащая клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, пригодна для медицинских и ветеринарных применений. Фармацевтическая композиция может быть введена пациенту сама по себе или в комбинации с другими дополнительными активными ингредиентами, агентами, препаратами или гормонами. Фармацевтические композиции могут быть изготовлены с использованием разнообразных процессов, включая, без ограничения, традиционное смешивание, растворение, гранулирование, дражирование, растирание в порошок, эмульсификацию, инкапсуляцию, включение и лиофилизацию. Фармацевтическая композиция может принимать любую из многообразных форм, включая, без ограничения, стерильный раствор, суспензию, эмульсию, лиофилизат, таблетку, пилюлю, крупинку, капсулу, порошок, сироп, эликсир или любую другую лекарственную форму, подходящую для введения.

[376] Также предусматривается, что фармацевтическая композиция, содержащая клостридиальный токсин или гибрид клостиридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, может необязательно включать фармацевтически приемлемые носители, которые способствуют процессингу активного ингредиента в фармацевтически приемлемые композиции. В данном контексте термин «фармацевтически приемлемый носитель» является синонимом «фармацевтического носителя» и относится к любому носителю, не обладающему в значительной степени долгосрочным или постоянным негативным воздействием при введении, и охватывающий такие термины, как «фармакологически приемлемый переносчик, стабилизатор, разбавитель, аддитив, вспомогательное вещество или сопутствующее вещество». Такое носитель, в основном, смешивается с активным соединением или допускается для разбавления или заключения активного соединения, и он может быть твердым, полужидким или жидким агентом. Понимается, что активные ингредиенты могут быть растворимыми или могут доставляться в виде суспензии в желательном носителе или разбавителе. Может быть применен любой из многообразия фармацевтически приемлемых носителей, включая без ограничения, водные среды, такие, как, например, вода, физраствор, глицин, гиалуроновая кислота и подобное; твердые носители, такие, как, например, маннитол, лактоза, крахмал, магния стеарат, натрия сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза, магния карбонат и подобное; растворители; диспергенты; покрытия; антибактериальные и противогрибковые агенты; изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию; или любой другой неактивный ингредиент.Выбор фармацевтически приемлемого носителя может зависеть от способа введения. За исключением в той части, в какой фармакологически приемлемый носитель несовместим с активным ингредиентом, его использование в фармацевтически приемлемых композициях предполагается. Не имеющие ограничительного характера примеры конкретных применений таких фармацевтических носителей можно найти в Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7^th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20^th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman el al., eds., McGraw-Hill Professional, 10^th ed. 2001); и Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4^th edition 2003). Эти протоколы являются рутинными процедурами и хороши любые модификации в пределах компетенции специалиста в области техники и из приведенной здесь идеи изобретения.

[377] Далее предусматривается, что фармацевтическая композиция, раскрываемая в настоящем описании, может необязательно включать, без ограничений, другие фармацевтически приемлемые компоненты (или фармацевтические компоненты), включая, без ограничения, буферы, консерванты, агенты для доведения тоничности, соли, антиоксиданты, агенты для доведения осмолярности, физиологические вещества, фармакологические вещества, наполнители, эмульсификаторы, агенты-увлажнители, подсластители или ароматизаторьт, и подобное. Различные буферы и индикаторы для доведения рН могут быть использованы для приготовления фармацевтической композиции, раскрываемой в настоящем описании, при условии, что полученный в результате препарат является фармацевтически приемлемым. Такие буферы включают, без ограничений, ацетатные буферы, цитратные буферы, фосфатные буферы, нейтральный забуференный физраствор, забуференный фосфатами физраствор и боратные буферы. Понимается, что кислоты и основания могут быть использованы при доведении рН композиции, насколько это необходимо. Фармацевтически приемлемые антиоксиданты включают, без ограничений, натрия метабисульфит, натрия тиосульфат, ацетил цистеин, бутилированный гидроксианизол и бутилированный гидрокситолуол. Пригодные консерванты включают, без ограничений, бензалкония хлорид, хлоробутанол, тимеросал, фенилртуть ацетат, фенилртуть нитрат, стабилизированную оксо- хлоро- композицию, такую, как, например, PURITE^® и хелитирующие агенты, такие, как, например, диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) или DTPA-бисамид, кальция DTPA и CaNaDTPA-бисамид. Агенты для доведения тоничности, пригодные в фармацевтической композиции, включают, без ограничений, соли, такие, как, например, натрия хлорид, калия хлорид, маннитол или глицерин, и другой фармацевтически приемлемый агент для доведения тоничности. Фармацевтическая композиция может быть предоставлена в виде соли и может быть образована со многими различными кислотами, включая, но не ограничиваясь, соляной, серной, уксусной, молочной, винной, яблочной и янтарной. Соли склонны быть более растворимыми в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие свободные основные формы. Понимается, что эти и другие вещества, известные в области техники фармакологии, могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную в данном описании.

[378] В варианте воплощения композиция включает клостридиальный токсин или гибрид клостиридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. В аспекте данного варианта воплощения композиция является фармацевтической композицией, содержащей клостридиальный токсин или гибрид клостиридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании. В аспектах данного варианта воплощения фармацевтическая композиция, содержащая клостридиальный токсин или гибрид клостиридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, далее содержит фармакологический носитель, фармацевтический компонент, или как фармакологический носитель, так и фармацевтический компонент.В других аспектах данного варианта воплощения фармацевтическая композиция, содержащая клостридиальный токсин или гибрид клостиридиального токсина, раскрываемый в настоящем описании, далее содержит, по меньшей мере, один фармакологический носитель и, по меньшей мере, один, фармацевтический компонент.

[379] Аспекты настоящего описания также могут быть описаны следующим образом:

1. Клостридиальный токсин, содержащий, по меньшей мере, один инактивационный сайт расщепления, расположенный на участке инактивационного сайт расщепления, при этом участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или в H_CN связывающем субдомене, а, по меньшей мере, один инактивационный сайт расщепления содержит двойной сайт тромбин-тромбин, сайт фактора Ха, двойной сайт фактор Ха-тромбин и/или сайт ММР-9.

2. Клостридиальный токсин, содержащий эизиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен клостридиального токсина, двухцепочечный петлевой участок, сайт расщепления экзогенной протеазой, и, по меньшей мере, два инактивационных сайта расщепления, расположенных в участке инактивационного сайт расщепления, при этом сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке.

3. Клостридиальный токсин аспекта 2, отличающийся тем, что инактивационные сайты расщепления содержат двойной сайт тромбин-тромбин и/или двойной сайт фактор Ха-тромбин.

4. Гибрид клостридиального токсина, содержащий энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационное расщепление, расположенное в участке инактивационного сайта расщепления, при этом участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или в H_CN связывающем субдомене.

5. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты аминокислоты 462-496 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 458-492 SEQ ID NO:3; аминокислоты 464-487 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 463-496 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 458-491 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 434-467 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 453-486 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 458-491 SEQ ID NO:21; аминокислоты 443-476 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 434-467 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

6. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 618-634 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 614-630 SEQ ID NO:3; аминокислоты 605-621 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 613-629 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 609-625 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 587-603 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 604-620 SEQ ID NO:18; аминокислоты 605-621 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 610-626 SEQ ID NO:21; аминокислоты 596-612 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 587-603 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

7. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 638-651 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 634-647 SEQ ID NO:3; аминокислоты 625-638 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 633-646 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 629-642 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 607-620 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 624-637 SEQ ID NO:18; аминокислоты 625-638 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 630-643 SEQ ID NO:21; аминокислоты 616-629 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 607-620 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

8. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 665-687 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 661-683 SEQ ID NO:3; аминокислоты 652-674 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 660-682 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 656-678 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 634-659 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 651-676 SEQ ID NO:18; аминокислоты 652-677 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 657-679 SEQ ID NO:21; аминокислоты 643-668 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 634-659 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

9. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 752-765 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 748-761 SEQ ID NO:3; аминокислоты 739-752 SEQ ID NO; 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 747-760 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 743-756 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 724-739 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 741-756 SEQ ID NO:18; аминокислоты 742-757 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 744-757 SEQ ID NO:21; аминокислоты 733-748 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 724-739 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

10. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 826-835 SEQ ID NO; 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 824-831 SEQ ID NO:3; аминокислоты 813-824 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 821-830 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 817-826 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 800-809 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 817-826 SEQ ID NO:18; аминокислоты 818-827 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO; 20; аминокислоты 818- 827 SEQ ID NO:21; аминокислоты 809-819 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 800-809 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

11. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 844-863 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 840-859 SEQ ID NO:3;; аминокислоты 831-850 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 839-858 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 835-854 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 818-837 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 835-854 SEQ ID NO:18; аминокислоты 836-855 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 836- 855 SEQ ID NO:21; аминокислоты 828-847 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 818-837 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

12. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-4, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 871-895 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5; аминокислоты 867-891 SEQ ID NO:3; аминокислоты 858-882 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10; аминокислоты 866-890 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12; аминокислоты 862-886 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14; аминокислоты 845-869 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17; аминокислоты 862-886 SEQ ID NO:18; аминокислоты 863-887 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20; аминокислоты 863-887 SEQ ID NO:21; аминокислоты 855-879 SEQ ID NO:23; и/или аминокислоты 845-869 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

13. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-12, отличающийся тем,что энзиматический домен клостридиального токсина содержит энзиматический домен BoNT/A, энзиматический домен BoNT/B, энзиматический домен BoNT/Cl, энзиматический домен BoNT/D, энзиматический домен BoNT/E, энзиматический домен BoNT/F, энзиматический домен BoNT/G, энзиматический домен BaNT и/или энзиматический домен BuNT.

14. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-13, отличающийся тем, что инактивационный сайт расщепления содержит сайты расщепления тромбином, сайты расщепления плазмином, сайты расщепления фактором коагуляции Вила, сайты расщепления фактором коагуляции IXa, сайты расщепления фактором коагуляции Ха, сайты расщепления фактором коагуляции XIa, сайты расщепления фактором коагуляции XIIa, сайты расщепления калликреином плазмы, сайты расщепления активируемым протеазой рецептором 1, сопряженным с G протеином (PAR1), сайты расщепления PAR2, сайты расщепления PAR3, сайты расщепления PAR4, сайты расщепления матричной металлопротеиназой-2 (ММР-2), сайты расщепления матричной металлопротеиназой-9 (ММР-9), сайты расщепления фурином, сайты расщепления активатором плазминогена типа урокиназы (uPA), сайты расщепления активатором плазминогена тканевого типа (tPA), сайты расщепления триптазой-е, сайты расщепления протеазой мышиных тучных клеток-7 (mMCP-7), сайты расщепления эндотелин-конвертирующим ферментом-1 (ВСЕ-1), сайты расщепления группой крови Келла, сайты расщепления DPPIV, сайты расщепления металл опептидазой ADAM с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS13) и сайты расщепления катепсином L.

15. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-14, отличающийся тем, что клостридиальный токсин транслокационный домен содержит транслокационный домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/G, транслокационный домен TeNT, транслокационный домен BaNT и/или транслокационный домен BuNT.

16. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-15, отличающийся тем, что инактивационный сайт расщепления содержит двойной сайт тромбин-тромбин, сайт фактора Ха, двойной сайт фактор Ха-тромбин и/или сайт ММР-9.

17. Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина аспектов 1-16, отличающийся тем, что связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, содержит опиоид-связывающий домен, тахикинин-связывающий домен, меланокортин- связывающий домен, галанин-связывающий домен, гранин-связывающий домен, связывающий домен нейропептид Y родственного пептида, нейрогормон-связывающий домен, связывающий домен нейрорегуляторного цитокина, связывающий домен кининового пептида, связывающий домен ростового фактора и/или связывающий домен глтокагоно-подобного гормона.

18. BoNT/A, содержащий инактнвационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, при этом участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

19. Клостриднальный токсин, содержащий энзнматический домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/A и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

20. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/A, связывающий домен BoNT/A, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в двухцепочечном петлевом участке; при этом участок инактивационного сайга расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

21. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/A, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

22. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/A, транслокационный домен BoNT/A, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления,, расположенном в двухцепочечном петлевом участке; при этом участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

23. Токсин и/или гибрид аспектов 18-22, отличающийся тем,что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863, и/или 871-895 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5, и/или аминокислоты 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859, и/или 867-891 SEQ ID NO:3.

24. BoNT/B, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный на участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

25. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/B и инактивационный сайт расщепления, расположенный на участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

26. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B, связывающий домен BoNT/B, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, при этом сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке; а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

27. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

28. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/B, транслокационный домен BoNT/B, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, при этом сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

29. Токсин и/или гибрид аспектов 24-28, где участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850, и/или 858-882 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и/или SEQ ID NO:10.

30. BoNT/Cl, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

31. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/Cl, связывающий домен BoNT/Cl и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

32. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/Cl, связывающий домен BoNT/Cl, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, при этом сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

33. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/Cl, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

34. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/Cl, транслокационный домен BoNT/Cl, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, а сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке; где участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

35. Токсин и/или гибрид аспектов 30-34, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858, и/или 866-890 SEQ ID NO:11 и/или SEQ ID NO:12.

36. BoNT/D, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

37. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/D и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

38. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/D, связывающий домен BoNT/D, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

39. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/D, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

40. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/D, транслокационный домен BoNT/D, связывающий домен, не относящийся к клостридиалъному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, аучасток инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

41. Токсин и/или гибрид аспектов 36-40, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854, и/или 862-886 SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:14.

42. BoNT/E, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

43. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/E и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

44. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/E, связывающий домен BoNT/E, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайга расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайга расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

45. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/E транслокационный домен BoNT/E, связывающий домен, не огносящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайг расщепления, расположенный в участке инактивационного сайга расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

46. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/E, транслокационный домен BoNT/E, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

47. Токсин и/или гибрид аспектов 42-46, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, и/или 845-869 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, и/или SEQ ID NO:17.

48. BoNT/F, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

49. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/F и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

50. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F, связывающий домен BoNT/F, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

51. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

52. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/F, транслокационный домен BoNT/F, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

53. Токсин и/или гибрид аспектов 48-52, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854, и/или 862-886 SEQ ID NO:18; и/или аминокислоты 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855, и/или 863-887 SEQ ID NO:19 и/или SEQ ID NO:20.

54. BoNT/G, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайга расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

55. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G, связывающий домен BoNT/G и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

56. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G, связывающий домен BoNT/G, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

57. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

58. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BoNT/G, транслокационный домен BoNT/G, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

59. Токсин и/или гибрид аспектов 54-58, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855, и/или 863-887 SEQ ID NO:21.

60. BaNT, содержащий инактивационньтй сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

61. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BaNT, транслокационный домен BaNT, связывающий домен BaNT и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

62. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BaNT, транслокационный домен BaNT. связывающий домен BaNT, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

63. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BaNT, транслокационный домен BaNT, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

64. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BaNT, транслокационный домен BaNT, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

65. Токсин и/или гибрид аспектов 60-64, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847, и/или 855-879 SEQ ID NO:23.

66. BuNT, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

67. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BuNT, транслокационный домен BuNT, связывающий домен BuNT и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайга расщепления, расположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

68. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BuNT, транслокационный домен BuNT, связывающий домен BuNT, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

69. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BuNT, транслокационный домен BuNT, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, ррасположенном в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

70. Клостридиальный токсин, содержащий энзиматический домен BuNT, транслокационный домен BuNT, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, сайт расщепления экзогенной протеазой, двухцепочечный петлевой участок и инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, сайт расщепления экзогенной протеазой расположен в двухцепочечном петлевом участке, а участок инактивационного сайта расщепления расположен в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене.

71. Токсин и/или гибрид аспектов 66-70, отличающийся тем, что участок инактивационного сайта расщепления содержит аминокислоты 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837, и/или 845-869 SEQ ID NO:24 и/или SEQ ID NO:25.

72. Токсин и/или гибрид аспектов 1-71, отличающийся тем, что Клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем профиль безопасности того же и/или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления.

73. Токсин и/или гибрид аспекта 72, отличающийся тем, что клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 100%, 110%, по меньшей мере, 120%, по меньшей мере, 130%, по меньшей мере, 140%, по меньшей мере, 150%, по меньшей мере, 160%, по меньшей мере, 170%, по меньшей мере, 180%, по меньшей мере, 190%, по меньшей мере, 200%, 210%, по меньшей мере, 220%, по меньшей мере, 230%, по меньшей мере, 240%, по меньшей мере, 250%, по меньшей мере, 260%, по меньшей мере, 270%, по меньшей мере, 280%, по меньшей мере, 290% и/или по меньшей мере, 300% по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, и/или пари этом клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больше, чем, максимально 10%, максимально 20%, максимально 30%, максимально 40%, максимально 50%, максимально 60%, максимально 70%, максимально 80%, максимально 90%, максимально 100%, 110%, максимально 120%, максимально 130%, максимально 140%, максимально 150%, максимально 160%, максимально 170%, максимально 180%, максимально 190%, максимально 200%, 210%, максимально 220%, максимально 230%, максимально 240%, максимально 250%, максимально 260%, максимально 270%, максимально 280%, максимально 290%, и/или максимально 300% по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, и/или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший на, от, приблизительно, 10% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 20% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 30% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 40% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 50% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно 60% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 70% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 80% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 90% до, приблизительно, 300%, или от, приблизительно, 100% до, приблизительно, 300% по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, по меньшей мере, 1-кратный, по меньшей мере, 1-кратный, по меньшей мере, 3-кратный, по меньшей мере, 4-кратный, по меньшей мере, 5-кратный, по меньшей мере, 6-кратный, по меньшей мере, 7-кратный, по меньшей мере, 8-кратный, по меньшей мере, 9-кратный, или по меньшей мере, 10-кратный по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, и/или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности больший, чем, по меньшей мере, 1-кратный, максимально 1-кратный, максимально 3-кратный, максимально 4-кратный, максимально 5-кратный, максимально 6-кратный, максимально 7-кратный, максимально 8-кратный, максимально 9-кратный, или максимально 10-кратный по отношению к профилю безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, и/или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, имеет профиль безопасности, больший на, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 10-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 9-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 8-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 7-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 6-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 5-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 10-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 9-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 8-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 7-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 6-кратного или от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 5-кратного.

74. Токсин и/или гибрид аспектов 1-73, где добавление инактивационного сайта расщепления повышает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления.

75. Токсин и/или гибрид аспекта 74, где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, которое повышает профиль безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсргаа, но без инактивационного сайта расщепления на, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 100%, 110%, по меньшей мере, 120%, по меньшей мере, 130%, по меньшей мере, 140%, по меньшей мере, 150%, по меньшей мере, 160%, по меньшей мере, 170%, по меньшей мере, 180%, по меньшей мере, 190%, по меньшей мере, 200%, 210%, по меньшей мере, 220%, по меньшей мере, 230%, по меньшей мере, 240%, по меньшей мере, 250%, по меньшей мере, 260%, по меньшей мере, 270%, по меньшей мере, 280%, по меньшей мере, 290%, или по меньшей мере, 300%, или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, которое повышает профиль безопасности клостридиалъного токсина и/или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, на, максимально 10%, максимально 20%, максимально 30%, максимально 40%, максимально 50%, максимально 60%, максимально 70%, максимально 80%, максимально 90%, максимально 100%, 110%, максимально 120%, максимально 130%, максимально 140%, максимально 150%, максимально 160%, максимально 170%, максимально 180%, максимально 190%, максимально 200%, 210%, максимально 220%, максимально 230%, максимально 240%, максимально 250%, максимально 260%, максимально 270%, максимально 280%, максимально 290%, или максимально 300%, или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, которые повышает профиль безопасности клостридиального токсина и/или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, на, от, приблизительно, 10% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 20% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 30% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 40% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 50% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 60% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 70% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 80% до, приблизительно, 300%, от, приблизительно, 90% до, приблизительно, 300%, или от, приблизительно, 100% до, приблизительно, 300%, или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайт расщепления, который повышает профиль безопасности клостридиального токсина и/или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, по меньшей мере, 1-кратно, по меньшей мере, 1-кратно, по меньшей мере, 3-кратно, по меньшей мере, 4-кратно, по меньшей мере, 5-кратно, по меньшей мере, 6-кратно, по меньшей мере, 7-кратно, по меньшей мере, 8-кратно, по меньшей мере, 9-кратно, или по меньшей мере, 10-кратно, и/или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который повышает профиль безопасности клостридиалъного токсина и/или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиалыюго токсина, но без инактивационного сайта расщепления, например, максимально 1-кратно, максимально 3-кратно, максимально 4-кратно, максимально 5-кратно, максимально 6-кратно, максимально 7-кратно, максимально 8-кратно, максимально 9-кратно, или максимально 10-кратно, и/или где клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина содержит добавление инактивационного сайта расщепления, который повышает профиль безопасности клостридиального токсина и/или гибрида клостридиального токсина по сравнению с профилем безопасности этого же или подобного клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, но без инактивационного сайта расщепления, на, например, от, приблизительно, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 10-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 9-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 8-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 7-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 6-кратного, от, приблизительно, 1-кратного до, приблизительно, 5-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 10-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 9-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 8-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 7-кратного, от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 6-кратного или от, приблизительно, 2-кратного до, приблизительно, 5-кратного. 76. Полинуклеотидная молекула, кодирующая токсин и/или гибрид в соответствии с любым из аспектов 1-75.

77. Полинуклеотидная молекула, молекула содержит SEQ ID NO:530, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO:534, и/или SEQ IS NO:536.

78. Способ получения клостридиального токсина и/или гибрида клостридиального токсина, включающий этап экспрессии в клетке полинуклеотидной молекулы в соответствии с аспектом 76 и/или 77, при этом экспрессия от полинуклеотидной молекулы производит кодируемый клостридиальный токсин или гибрид клострндиального токсина.

79. Способ получения модифицированного клостридиального токсина, содержащий этапы:

а. внедрения в клетку полинуклеотидной молекулы в соответствии с аспектом 76 и/или 77; и

б. экспрессию полинуклеотидной молекулы, при этом экспрессия от полинуклеотидной молекулы производит кодируемый клостридиальный токсин и/или гибрид клостридиального токсина,

80. Клостридиальный токсин, содержащий SEQ ID NO:531, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO:535, и/или SEQ ID NO:537.

81. Клостридиальный токсин, содержащий SEQ ID NO:531.

82. Клостридиальный токсин, содержащий SEQ ID NO:533.

83. Клостридиальный токсин, содержащий SEQ ID NO:535.

84. Клостридиальный токсин, содержащий SEQ ID NO:537.

ПРИМЕРЫ

[380] Следующие не имеющие ограничительного характера примеры предоставлены только для иллюстративных целей, чтобы способствовать более полному пониманию раскрываемых вариантов воплощения, и никоим образом не предназначены для ограничения какого-либо из вариантов воплощения, раскрываемого в настоящем описании.

Пример 1

Идентификация участков инактивацитного сайта расщепления

[381] Данный пример иллюстрирует, как идентифицировать в клостридиальном токсине или гибриде клостридиального токсина участки, пригодные для модифицирования токсина, с тем, чтобы включать инактивационный сайт расщепления, и как получить клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления.

[382] Для идентификации локализации или локализаций в структуре белка, пригодных в качестве потенциального участка инактивационного сайта расщепления, вначале была проанализирована при помощи компьютерного программного обеспечения трехмерная структура BoNT/A для определения петлей, экспонированных к поверхности, или выступающих участков, которые были бы более доступны для протеазы. Из участков, которые, согласно прогнозу, были бы доступными, для анализа были отобраны восемь: аминокислоты 462-496 SEQ ID NO:1, аминокислоты 618-634 SEQ ID NO:1, аминокислоты 638-651 SEQ ID NO:1, аминокислоты 665-687 SEQ ID NO:1, аминокислоты 752-765 SEQ ID NO:1 и аминокислоты 826-835 SEQ IN NO:1, аминокислоты 844-863 SEQ ID NO:1 и аминокислоты 871-895 SEQ ID NO:1.

[383] Для определения того, может ли участок, определенный компьютерным анализом, функционировать как участок инактивационного сайта расщепления, генно-инженерным способом с использованием мультипраймерного мутагенеза в эти участки были внедрены сайты расщепления тромбином и проанализированы на способность расщепляться тромбином. Была сформирована 50 мкл реакция, содержащая пул праймеров из однонаправленный олигонуклеотидных праймеров, каждый содержщий требуемую модификацию (125 нг каждого праймера), смешанные в различных соотношениях с ДНК матрицей, содержащей экспрессирующуго конструкцию, кодирующую BoNT/A, такую, как, например, экспрессирующую конструкцию, содержащую SEQ ID NO:526, кодирующую SEQ ID NO:527, или экспрессирующую конструкцию, содержащую SEQ ID NO:528, кодирующую SEQ ID NO:529, гиперметилированную dam метилазой. В эту смесь было добавлено 5 мкл 10× ПЦР буфера, 1 мкл дезоксирибонуклеотидов (dNTP), 1 мкл 2.5 единиц/мкл высокоточной ДНК полимеразы PFUULTRA™ (Stratagene, La Jolla, СА), ДНК лигазы Pfu, АТФ и свободной от нуклеазы воды до окончательного объема в 50 мкл. Условия термоцикла составили: 30 циклов 96°С в течение 1 минуты, 60°С в течение 30 секунд и 68°С в течение 20 минут. После термоциклирования в реакцию был добавлен 1 мкл рестрикционного энзима Dpn\ (Stratagene, La Jolla, СА) и была проведена инкубация в течение 1 часа при 37°С для расщепления матричной ДНК и снижения выхода клонов дикого типа. Расщепленная реакционная смесь была трансформирована в электрокомпетентные клетки Е.coli BL21 (DE3) Acella (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации, высеяна на чашки с 1,5% агаром Лурия-Бертани (рН 7.0), содержащим 50 мкг/мл канамицина, и помещена в термостат при 37°С для роста в течение ночи. Бактерии, содержащие экспрессирующие конструкции, были идентифицированы как колонии, резистентные к канамицину. Конструкции - кандидаты были изолированы с использованием процедуры получения мини-плазмид щелочным лизисом и проанализированы путем секвенирования для определения частоты и идентичности встроенных мутаций. В Таблице 7 указан каждый BoNT/A, содержащий полученный сайт расщепления тромбином (BoNT/A-TCS), протестированный в данном анализе сканирования тромбином.

ТАБЛИЦА 7.   Анализ сканирования тромбином  

Участок Модификация Экспрессия Чувствительность к протеазе Активность BoNT/A 462-496 T482insLVPRGS + ND ND 462-496 A489insLVPRGS ++ ++ ND 618-634 E620insLVPRGS + ND ND 638-651 M646insLVPRGS -/+ ND ND 665-687 1673insLVPRGS + ND ND 752-765 E758insLVPRGS - ND ND 826-835 delR827GT-insLVPRGS -/+ ND ND 844-863 T844insLVPRGS +++ + ND 844-863 D848insLVPRGS +++ + ND 844-863 Q852insLVPRGS -/+ ND ND 844-863 L862insLVPRGS +++ ++ ND 871-895 E868insLVPRGS     ND 871-895 delE868YIKNI-insLVPRGS     ND 871-895 K871insLVPRGS +++ +++ ND 871-895 l873insLVPRGS +++ ++++ ND 871-895 delN872IINTS-msLVPRGS     ND 871-895 T876insLVPRGS     ND 871-895 L879insVPRGS     ND 871-895 delL879NLRYE-insLVPRGS     ND 871-895 N880insLVPRGS +++ ++++ 4,05 871-895 L88linsVPRGS     ND 871-895 delL881 RYESN-insLVPRGS     ND 871-895 Y883insLVPRGS     ND 871-895 E884insLVPRGS +++ +++ >50 871-895 S885insLVPRGS     ND 871-895 delH887LIDLS-insLVPRGS     ND 871-895 L888insVPRGS     ND 871-895 D890insLVPRGS ++ ++++ 3,15 871-895 L891insVPRG     ND 871-895 delS892RYA-insVPRG     ND 467-496 T482insLVPRGS A489insLVPRGS + ND ND 618-634 665-687 E620insLVPRGS 1673insLVPRGS + ND ND 638-651 665-687 M646insLVPRGS 1673insLVPRGS + ND ND

825-832 delR827GT-insLVPRGS + +++ ND 871-895 K871insLVPRGS 844-863 T844insLVPRGS Q852insLVPRGS -/+ ND ND 844-863 Q852insLVPRGS L862insLVPRGS - ND ND 825-832 871-895 deIR827GT-insLVPRGS K871insLVPRGS + ND ND 825-832 871-895 deIR827GT-insLVPRGS K880insLVPRGS - ND ND 871-895 E868insLVPRGS l873insLVPRGS     1,32 871-895 delE868YIKNI-insLVPRGS     0,86 delL881RYESN-insLVPRGS 871-895 l873insLVPRGS     1,32 E884insLVPRGS 871-895 L881insVPRGS +++ ++++ 4,20 L891insVPRG Контроль Исходный уровень +++   Да Чувствительность к протеазе: +, менее, чем 25% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов; ++, от 25% до 50% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов; +++, от 51% до 75% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов; ++++, более, чем 75% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов.
Активность BoNT/A рассчитывается путем деления значения ЕС₅₀ токсина на значение ЕС₅₀ исходного контроля. ND - не определялось.

[384] Для определения уровня экспрессии растворимого белка для каждого BoNT/A-TCS была экспрессирована экспрессирующая конструкция, содержащая каждый BoNT/A-TCS, очищена при помощи аффинной хроматографии с использованием иммобилизированных металлов и проанализирована способом анализа в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Вначале с использованием 96-луночного планшета в 100 мкл среды PA-0.5G, содержащей 50 мкл/мл канамицина, была инокулирована единичная колония клеток BL21(DE3), несущих соответствующую экспрессирующую конструкцию, клетки выращивались при 37°С в течение ночи при встряхивании. Аликвоты в 5 мкл из этой начальной культуры были использованы для инокуляции в 1 мл ZYP-5052, содержащей 50 мкл/мл канамицина, клетки выращивались при 37°С со встряхиванием в течение 3, 5 часов и затем при 22°С в течение 16 часов. В каждый 1 мл экспрессирующей культуры в 96-луночном планшете добавляли 110 мкл аликвоты реагента для экстракции белка (Protein Extraction Reagent), содержащие реагент для клеточного лизиса (10Х FASTBREAK™ Cell Lysis Reagent, Promega Corp., Madison, W1), 250 ед./мл нуклеазы-бензоазы (EMD Biosciences-Novagen, Madison, W1), и смеси для ингибирования протеазы (10Х Protease Inhibitor Cocktail III, EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ). Затем в каждую лунку переносили по 75 мкл связующего вещества HISLINK™ (Promega Corp., Madison, W1) и смесь поочередно перемешивали путем пипетирования и путем встряхивания при 900 об./мин. в течение 30 минут.Лизаты переносили на фильтровальную пластину с размером пор 25 мкм (Promega Corp., Madison, W1), мембраны были предварительно увлажнены водой и жидкость удаляли путем вакуумной фильтрации. Связующее вещество отмывали три раза с 200 мкл промывочного буфера, содержащего 100 мМ HEPES (рН 7,5), 10 мМ имидазола. Белок элюировали путем добавления 200 мкл буфера для элюции, содержащего 100 мМ HEPES (рН 7,5), 500 мМ имидазола, инкубировали в течение 5 минут и элюат собирали путем вакуумной фильтрации в 96-луночный планшет.

[385] Для проведения анализа в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия равный объем 2×буфера Лэмли для образца добавляли в очищенный при помощи аффинной хроматографии с использованием иммобилизированных металлов BoNT/A, содержащий сайт расщепления тромбином, и смесь инкубировали при 95°С в течение 5 минут.Были загружены аликвоты в 15 мкл и их разделяли при помощи гель-электрофореза в MOPS (3-[N-морфолино] пропансульфоновая кислота) полиакриламидном геле с использованием готовых 4-12% бис-трис полиакриламидных гелей NUPAGE^® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) в денатурирующих восстановительных условиях. Гель отмывали и фиксировали в 10% метаноле и 7% уксусной кислоте в течение 30 минут.Промывочный раствор удаляли и гель инкубировали в растворе красного красителя для белка в геле SYPRO в течение от 3 часов до ночи при комнатной температуре. Окрашенный гель обесцвечивали в 10% метаноле и 7% уксусной кислоте в течение 30 минут. Обесцвеченный гель визуализировали при помощи цифрового прибора для визуализации Fluro-S-Max (Bio-Rad).

[386] Результаты анализа экспрессии представлены в Таблице 7. В целом, токсины, несущие вставленный сайт расщепления тромбином в инактивационных участках, содержащих аминокислоты 462-496 SEQ ID NO:1, аминокислоты 844-863 или аминокислоты 871-895 SEQ ID NO:1, были хорошо экспрессированы. Например, токсины, содержащие A489insLVPRGS, были экспрессированы, приблизительно, в 50% от уровня экспрессии контрольной конструкции дикого типа, и токсины, содержащие D848insLVPRGS или N880insLVPRGS, были экспрессированы на уровне контроля или близко к ним (Таблица 7), Эти результаты выявляют, что участки инактивационного сайта расщепления, расположенные в транслокационном домене и/или the H_CN связывающем субдомене, допускают модификацию участков с включением сайта расщепления протеазой.

[387] Для дальнейшего исследования уровня, до которого идентифицированные участки инактивационного сайта расщепления могут допускать модификации, которые включают сайты расщепления тромбином, токсины были модифицированы для включения сайтов расщепления тромбином по всему участку. Например, были приготовлены токсины, содержащие T884insLVPRGS или L862ins LVPRGS, для исследования участка инактивационного сайта расщепления, содержащего 844-863 SEQ ID NO:1. Сходным образом, были приготовлены токсины, содержащие E868insLVPRGS, delE868YIKNI-insLVPRGS, delN872IINTS-insLVPRGS, T876insLVPRGS, L879insVPRGS, delL879NLRYE-insLVPRGS, L881insVPRGS, delL881 RYESN-insLVPRGS, Y883insLVPRGS, E884insLVPRGS, S885insLVPRGS, delH887LIDLS-insLVPRGS, L888insLVPRGS, L891insVPRG и delS892RYA-insVPRG, для исследования участка инактивационного сайта расщепления, содержащего 871-895 SEQ ID NO:1. Были приготовлены обе модификации вставки и замещения для исследования того, оказывает ли какое-либо влияние тип модификации. В целом, все токсины, несущие вставленный сайт расщепления тромбином в этих инактивационных участках, были экспрессированы на уровнях контрольной конструкции дикого типа или близко к этим уровням. Эти результаты выявляют, что участки инактивационного сайта расщепления в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене могут допускать модификации, размещенные в любом месте в участке инактивационного сайта.

[388] Наконец, была исследована способность участка инактивационного сайта допускать присутствие двух или более участков расщепления протеазой (Таблица 7). Эти результаты указывают, что участки инактивационного сайта расщепления в транслокационном домене и/или H_CN связывающем субдомене могут допускать модификации размещения двух или более сайтов расщепления протеазой в участке инактивационного сайта.

[389] Для определения того, может ли BoNT/A, содержащий сайт расщепления тромбином, быть расщепленным тромбином, был проведен in vitro тест на расщепление тромбином. По 5 мкг каждого очищенного BoNT/A-TCS инкубировали с 1 ед. тромбина (Novagen) при 23°С в течение 1 часа, 3 часов и 18,5 часов. Также параллельно была установлена нулевая точка контроля фермента для каждого BoNT/A-TCS. Образцы брали в каждой временной точке и гасили при помощи нагрузочного буфера с додецилсульфатом натрия, включая ДТТ, и анализировали способом анализа в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия как описано выше.

[390] Результаты анализа экспрессии представлены в Таблице 7. В целом, модификация участка инактивационного сайта расщепления, содержащего аминокислоты 467-496, 844-863 или 871-895 SEQ ID NO:1 для включения сайта расщепления протеазой, давала в результате токсин, чувствительный к протеолитическому расщеплению соответствующей протеазой.

[391] Для определения того, сохраняет ли BoNT/A, содержащий сайт расщепления тромбином, свою активность, был проведен тест на активность BoNT/A с использованием теста на активность, основанного на клетках. Для проведения теста на активность, основанного на клетках, приблизительно, 1,2×10⁶ клеток Neuro-2a или SiMa помещали в лунки 24-луночных планшетов для культивирования тканей, содержащие 1 мл минимальной эссенциальной среды, 2 мМ GLUTAMAX™ I с солями Эрла, добавку 1×В27, добавку 1×N2, 0,1 мМ не-эссенциальных аминокислот, 10 мМ HEPES и 25 мкг/мл GT1b. Клетки инкубировали в 37°С инкубаторе с 5% окисью углерода до дифференцировки клеток, которая оценивалась стандартными и рутинными морфологическими критериями, такими, как остановка роста и нейритные удлинения (приблизительно, 3 дня). Среду отсасывали из каждой лунки и замещали либо 1) свежей средой, не содержащей токсин (необработанная клеточная линия), либо 2) свежей средой, содержащей 1 нМ комплекса BoNT/A (обработанная клеточная линия). После инкубации в течение ночи клетки отмывали путем отсасывания среды и ополаскивания каждой лунки 200 мкл 1×фосфатно-физиологического буфера. Для снятия клеток 1×фосфатно-физиологический буфер отсасывали, клетки лизировали путем добавления 50 мкл 2×нагрузочного буфера с додецилсульфатом натрия, лизат затем переносили в чистую тестовую пробирку и образец нагревали до 95°С в течение 5 минут.

[392] Для обнаружения наличия продуктов расщепления SNAP-25 аликвоту из каждого собранного образца анализировали способом вестер-блоттинга. В этом анализе 12 мкл аликвоту из собранного образца разделяли в MOPS (3-[N-морфолино] пропансульфоновая кислота) полиакрнламидном геле с использованием готовых 12% бис-трис полиакриламидных гелей NUPAGE^® Novex (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) в денатурирующих восстановительных условиях. Разделенные пептиды переносили из геля на поливинилиден фторидные (PVDF) мембраны (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) способом вестерн-блоттиннга, используя электрофоретический полусухой аппарат переноса TRANS-BLOT^® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). PVDF мембраны блокировали путем инкубации при комнатной температуре в течение 2 часов в растворе, содержащем трис-буферизированный физраствор (TBS) (25 мМ 2-амино-2-гидроксиметл-1,3-пропандиол хлористоводородная кислота (Tris-HCl) (рН 7,4), 137 мМ натрия хлорида, 2,7 мМ калия хлорида), 0.1% TWEEN-20^® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолауреат), 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 5% нежирного сухого молока. Блокированные мембраны инкубировали при 4°С в течение ночи в TBS, 0,1% TWEEN-20^® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолауреат), 2% BSA и 5% нежирного сухого молока, содержащем либо 1) разведение 1:5000 мышиного моноклонального антитела a-SNAP-25 в качестве первичного антитела (SMI-81; Stemberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD); либо 2) разведение 1:5000 S9684 a-SNAP-25 кроличьей поликлональной антисыворотки в качестве первичного антитела (Sigma, St. Louis, МО). Как мышиные моноклональные антитела a-SNAP-25, так и кроличьи поликлональные антитела, могут обнаруживать как нерасщепленный субстрат SNAP-25, так и продукт расщепления SNAP-25, что позволяет оценивать общую экспрессию SNAP-25 в каждой клеточной линии и процент SNAP-25, расщепленный после обработки BoNT/A, как параметра оценки количества поглощенного BoNT/A. Блоты, исследованные при помощи первичного антитела, отмывали три раза по 15 минут в TBS, TWEEN-20^® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолауреат). Отмытые мембраны инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов в TBS, 0,1% TWEEN-20^® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолауреат), 2% BSA и 5% нежирного сухого молока, содержащем либо 1) разведение 1:10000 козьего поликлонального антимышиного иммуноглобулина G, тяжелая и легкая цепь (IgG, H+L) антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Zymed, South San Francisco, CA) в качестве вторичного антитела; либо 2) разведение 1:10000 кроличьего поликлонального антимышиного иммуноглобулина G, тяжелая и легкая цепь (IgG, H+L) антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Zymed, South San Francisco, CA) в качестве вторичного антитела. Блоты, исследованные при помощи вторичного антитела, отмывали три раза по 15 минут в TBS, 0,1% TWEEN-20^® (полиоксиэтилен (20) сорбитан монолауреат). Детекцию сигнала меченных продуктов SNAP-25 визуализировали с использованием системы детекции вестерн-блоттинга ECL Plus™ Western Blot Detection System (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), создавали изображение мембран и процент расщепления, выраженный в количественной форме при помощи устройства формирования изображения Typhoon 9410 Variable Mode Imager и программного обеспечения Imager Analysis software (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Выбор пиксельного размера (от 100 до 200 пикселей) и установки напряжения РМТ (от 350 до 600, обычно, 400) зависел от индивидуального блота.

[393] Результаты анализа экспрессии даны в Таблице 7. В целом, модификация участка инактивационного сайта расщепления, содержащего аминокислоты 467-496, 844-863 или 871-895 SEQ ID NO:1 для включения сайта расщепления протеазой, давала в результате активный токсин, которые был способен осуществлять полный процесс интоксикации.

[394] Взятые вместе, эти результаты указывают, что, хотя было идентифицировано восемь различных участков инактивационного расщепления, не все были способны поддерживать вставку функционального сайта расщепления тромбином. В общем, модификация участков инактивационного сайта расщепления, содержащих аминокислоты 467-496, 844-863 и 871-895 SEQ ID NO:1 для включения сайта расщепления протеазой, давала в результате стабильно продуцируемый токсин, который был способным осуществлять полный процесс интоксикации и был чувствительным к протеолитическому расщеплению соответствующей протеазой.

[395] Из-за того, что трехмерная структура всех клострдиальных токсинов является схожей, соответствующие локализации в BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT и BuNT также пригодны в качестве участков инактивационного сайта расщепления. В Таблице 5 перечисляются эти участки.

Пример 2

Анализ сайта расщепления протеазой

[396] Данный пример иллюстрирует, как получить клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления.

[397] Для исследования того, могут ли сайты расщепления протеазой, отличной от тромбина, быть пригодными в качестве ипактивационного сайта были исследованы токсины, содержащие сайты расщепления многими различными протеазами.

[398] Для получения клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, содержащего инактивационный сайт расщепления, способом генной инженерии были внедрены сайты расщепления протеазой в участки ииактивационного сайта расщепления с использованием мультипраймсрного мутагенеза, как описано в Примере 1. В Таблице 8 перечислены экспрессирующие конструкции, модифицированные с тем, чтобы содержать сайт расщепления протеазой,

[399] Для определения того, может ли BoNT/A, содержащий сайт расщепления протеазой, расщепляться своей когнатной протеазой, были проведены in vitro тесты на расщепление протеазой, в основном, как описано выше, однако с использованием соответствующей протеазы вместо тромбина. Образцы брали в каждой временной точке и гасили при помощи нагрузочного буфера с додецилсульфатом натрия, включая ДТТ, и анализировали способом анализа в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия как описано в Примере 1.

[400] Результаты анализа экспрессии представлены в Таблице 7. В целом, модификация участка инактивационного сайта расщепления, содержащего аминокислоты 467-496, 844-863, or 871-895 SEQ ID NO:1 для включения сайта расщепления протеазой, давала в результате токсин, чувствительный к нротеолитическому расщеплению соответствующей протеазой.

ТАБЛИЦА 8. Анализ сайта расщепления протеазой Сайт расщепления протеазой Участок Модификация Чувствительность к протеазе Активность BoNT/A Фактор Ха 535 E535insG + 2,70 Фактор Ха 844-863 L863inslEGR + >50 Фактор Ха 871-895 K871inslEGR ++ 6,15 Фактор Ха 871-895 l873insEGR + 3,97 Фактор Ха 871-895 L881inslEG ND ND Фактор Ха 871-895 E884inslEGR + 2,95a Фактор Ха 871-895 L891inslEGR ++ ND Фактор Ха 1272 E1272insG + ND Фактор Ха×2 535 1272 E535insG
E1272insG + ND Фактор Ха×2 871-895 K871inslEGR L891inslEGR ++ 4,35 Фактор Ха×2 871-895 l873insEGR
L891inslEGR + 7,63 Фактор Ха×2 871-895 L881inslEG
L891inslEGR ++ >50 Фактор Ха tPA 871-895 l873insEGR
delS885NHLIDL-insPQRGRSA ND ND Фактор Ха 871-895 l873insEGR   3,29

Тромбин   E884insLVPRG ++++   ММР-2 871-895 S885insGPLGMLSQ + 6,55 ММР-2 871-895 delK871NIINTSI-insGPLGMLSQ ++ 5,27 ММР-2 871-895 delS885NHLIDLS-insGPLGMLSQ ++ 4,76 ММР-9 871-895 K871insGPLGLWAQ ND ND ММР-9 871-895 delK871NHNTSI-insGPLGLWAQ + 3,36 ММР-9 871-895 l873insGPLGLWAQ   22,8 ММР-9 871-895 dell874NTSILNL-insGPLGLWAQ   37,7 ММР-9 871-895 delL881 RYESNHL-insGPLGLWAQ ND ND ММР-9 871-895 E884insGPLGLWAQ ND ND ММР-9 871-895 delS885NHLIDLS-insGPLGLWAQ + 4,38 ММР-9 871-895 S885insGPLGLWAQ   3,38 ММР-9 871-895 L891 insGPLGLWAQ   20,61 ММР-9 871-895 delK871NIINTSI-insGPLGLWAQ ND ND Тромбин   E884insLVPRG     ММР-9 Фактор Ха 871-895 delK871NIINTSI-insGPLGLWAQ E884inslEGR   19,62 u-pa 871-895 delN872nNTSI-insPGSGKSA 4- ND u-pa 871-895 S885insPGSGKSA ++ 3,00 u-pa 871-895 delN886HLIDL-insPGSGKSA -h+ 4,90 t-PA 871-895 delN8721INTST-insPQRGRSA ++ 3,65 t-PA 871-895 S885insPQRGRSA +++ 3,30 t-PA 871-895 delS885NHLIDL-insPQRGRSA ++ 4,80 Тромбин tPA 871-895 I873LVPRGS delS885NHLIDL-insPQRGRSA ND ND Фурин 871-895 1870insRKKR +++ 6,70 Фурин 871-895 delK871 NII-insRKKR   3,50 Фурин 871-895 L881insRKK + 7,20 Фурин 871-895 delY883ES-insKKR   2,1 Фурин 871-895 S892RKK + 5,2 Фурин ×2 871-895 delK871 NII-insRKKR delY883ES-insKKR + 2,6

Фурин ×2 871-895 delK871 NII-insRKKR S892RKK ++ 6,00 Фурин ×3 871-895 delK871 NII-insRKKR delY883ES-insKKR S892RKK ND ND Келл 871-895 L891insAAF + 10,8 Келл 871-895 dell889DL-insAAF + 4,80 Триптаза е 871-895 K871inslVGGE + 9,45 Триптаза е 871-895 K871insRIVGGE + 6,48 Триптаза е 871-895 delN886HLIDL-insRIVGGE   5,50 Триптаза е 871-895 delN886HLlDL-insKlVGGE ND ND mMMCP-7 871-895 K871insSLSSRQSP   3,90 mMMCP-7 871-895 delN886HLIDLS-insLSSRQSP   4,80 ЕСЕ-1 871-895 1870insRPPGFSAF + 5,70 ЕСЕ-1 871-895 K871insAFA + 3,85 ЕСЕ-1 871-895 K871insDIIWVNTPEHVVPYGLGS + >50 ЕСЕ-1 871-895 K871insRPKPQQFFGLM ND ND ЕСЕ-1 871-895 delYES885NHLIDLS-insPKPQQFFGLM + 9,20 ЕСЕ-1 871-895 E884insKAFA + 2,95 ЕСЕ-1 871-895 delS885NHLIDLS-insRPPGFSAF + 3,70 Катепсин L 871-895 1870insRGFFYTPK ++++ 10,3 Катепсин L 871-895 K871insLR ++++ 2,25 Катепсин L 871-895 K871insFR ++++ 3,05 Катепсин L Тромбин 871-895 K871insLR
L891insLVPRGS   12,6 PolyArg 844-863 R861insRR ND ND PolyArg 871-895 R882insRRR   Yes PolyArg 871-895 S885insRRR   2,22 PolyArg 871-895 S892insRRR   3,02 PolyArg ×2 844-863 871-895 R861insRR
K871insRKR ND ND PolyArg ×2 844-863 871-895 R861insRR
l873insRRRR ND ND PolyArg ×2 844-863 R861insRR ND MD

  871-895 R882insRRR     PolyArg ×2 871-895 K871insRKR
S885insRRR   1,92 PolyArg ×2 871-895 R882insRRR
S892insRRR ND ND Чувствительность к протеазе: +, менее чем 25% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов; ++, от 25% до 50% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов; +++, от 51% до 75% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов; ++++, более чем 75% токсина подвергается протеолизу в течение от, приблизительно 1 до, приблизительно, 4 часов.
Активность BoNT/A рассчитывается путем деления значения EC₅₀ токсина на значение ЕС₅₀ исходного контроля. ND - не определялось.

[401] Для определения того, сохранил ли BoNT/A, содержащий сайт расщепления протеазой, свою активность, был проведен тест на активность с использованием описанного выше теста на активность, основанного на клетках (Таблица 8). В общем, токсины, содержащие сайт расщепления протеазой, демонстрирующие ЕС₅₀, близкую к 20 или менее, считались сохранившими достаточно активности для гарантированной оценки с использованием теста, основанного на животных..

Пример 3

Анализ in vivo

[402] Данный пример иллюстрирует, как оценивать клостридиальный токсин или гибрид клостридиалыюго токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, с использованием анализа теста, основанного на животных.

[403] Хотя тест, основанный на клетках, является хорошей оценкой того, может ли клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, был расщепленным своей когнатной протеазой, были отобраны определенные кандидаты для оценки в тесте, основанном на животных.

[404] Для тестирования активности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, содержащего инактивационный сайт расщепления, с использованием теста, основанного на животных, вначале был проведен тест in vivo показатель пальцевого отведения (Digit Abduction Score, DAS). Мышей CD-1 Fe взвешивали и помещали в подгруппы по 10 мышей для каждого отдельного теста DAS. Мышей включали в определенную группу на основе следующих критериев: 1) хорошее здоровье; 2) твердая исходная реакции DAS, равной 0; 3) включение в средний весовой диапазон, равный X±2 г, установленный для избранной подгруппы, и 4) вес больше 17,0 г.

[405] Каждой мыши вводили с использованием иглы 30-го калибра в икроножную мышцу правой задней лапы 1) 5 мкл 10,0 нМ BoNT/A, содержащего инактивационный сайт расщепления (исследования DAS с единичной дозой); или 2) 5 мкл одной из семи различных доз BoNT/A, содержащего инактиващгонный сайт расщепления (0,01 нМ, 0,04 нМ, 0,12 нМ, 0,37 нМ, 1,11 нМ, 3,33 нМ и 10,0 нМ; исследование DAS с полной дозировкой). В качестве контроля в икроножную мышцу правой задней лапы вводили 5 мкл раствора, не содержащего никакого токсина. Мышей наблюдали в отношении реакции DAS последовательно в течение 4 дней. DAS считывали путем поднимания каждой мыши за хвост и тщательного наблюдения за инъецированными задними конечностями. Отведения или не-отведения пальцев выявляло действие паралича, вызванного тестируемым токсином, введенным в мышцу. Пальцевое отведение инъецированной задней конечности сравнивали с отведением в неинъецированной конечности и соответственно оценивали в баллах. Данные DAS анализировали путем расчета дозы ED₅₀ на основе среднего максимального балла DAS и AUC (площадь под кривой) в показателях мкг/кг или нг/кг. Это выполнялось следующим:

1) В каждом исследовании для каждой дозы рассчитывали средний максимальный балл DAS; 2) любая доза, вызывающая более пяти смертей в каждом исследовании, была удалена из рассмотрения; 3) самая высокая доза, используемая в данном индивидуальном исследовании, была самой низкой дозой, которая вызывала средний максимум 4,0; 4) самая низкая доза, используемая в данном индивидуальном исследовании, была самой высокой дозой, которая вызывала средний максимум 0; 5) для каждого индивидуального исследования были построены кривые среднего максимального DAS vs. log (доза); 6) в некоторых исследованиях для множественных групп для каждой группы из 10 мышей рассчитывали значение AUC; 7) для каждого индивидуального исследования были построены кривые среднего AUC vs. log (доза); 8) была построена кривая повторного ответа х, у для каждой группы из множества идентичных исследований; для каждого тестируемого токсина; 9) данные доза-ответ анализировали способом нелинейной регрессии (невзвешенные величины) с использованием трех-параметрического логистического уравнения (Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, Chicago, Illinois), используя следующее уравнение:

y=а/(1+(x/x0)^b)

где y - ответ, а - асимптоматический ушах, b - наклон кривой, x - доза и 0 - доза ED₅₀, Для максимальных определений ED₅₀, Ymax был установлен равным 4 (максимальное значение DAS по шкале). Средние (максимальные и/или AUC) значения ED₅₀ были рассчитаны для каждого выполненного исследования с восемью дозами.

[406] Результаты указывают, что (Таблица 9), в целом, токсины, содержащие инактивационный сайт расщепления, которые проявляли относительную активность, равную, приблизительно, 10 или выше, считались такими, которые сохраняли достаточную активность для гарантированной оценки профиля безопасности.

[407] Для определения профиля безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, содержащего инактивационный сайт расщепления, был проведен мышиный тест на летальность.

[408] Для расчета профиля безопасности клостридиального токсина или гибрида клостридиального токсина, содержащего инактивационный сайт расщепления, значение LD₅₀, полученное в мышином тесте на летальность, делили на значение ЕС₅₀, полученное в исследовании DAS с полной дозировкой. Токсин, содержащий инактивационный сайт расщепления, считался таким, которые обладает достаточной активностью в инактивациоином сайте расщепления, если он демонстрировал профиль безопасности, приблизительно, 15 или более.

ТАБЛИЦА 9. Анализ теста, основанного на животных Сайт расщепления протеазой Участок Модификация DAS с единичной дозой DAS с полной дозировкой Тест на летальность Профиль безопасности EC₅₀ Относительный EC₅₀ Относительный LDso LDso/DAS EDso Тромбин 871-895 l873insLVPGRS 1,08 30,5 ND ND ND ND Тромбин 871-895 L881insVPRGS 0,37 7,38 ND ND ND ND Тромбин 871-895 E884insLVPRGS 0,16 25,3 0,15 46,7 1,90 12,5 Тромбин 871-895 L891insVPRG 0,12 23,3 0,19 36,8 2,74 14,8 Тромбин х 2 871-895 L881insVPRGS L891insVPRG 0,25 11,0 0,15 34,5 4,20 26,9 Фактор Ха 871-895 l873insEGR 0,11 46,3 0,10 70,0 2,39 23,0 Фактор Ха Тромбин 871-895 l873insEGR E884insLVPRG 0,09 37,2 0,26 15,3 6,69 26,9

ММР-2 871-895 delK871NIINTST-insGPLGMLSQ 0,33 10,0 ND ND ND ND ММР-2 871-895 delS885NHLIDLS-insGPLGMLSQ 0,10 34,5 ND ND ND ND ММР-9 871-895 delK871NIINTSI-insGPLGLWAQ 0,11 29,1 0,16 27,7 5,04 23,9 ММР-9 871-895 delS885NHLIDLS-insGPLGLWAQ 0,08 40,8 ND ND ND ND u-РА 871-895 S885insPGSGKSA 0,03 36,6 ND ND ND ND u-РА 871-895 delN886HLIDL-insPGSGKSA 0,35 3,52 ND ND ND ND t-PA 871-895 delN872IINTSI-insPQRGRSA 0,04 30,0 ND ND ND ND t-PA 871-895 S885insPQRGRSA 0,12 10,1 ND ND ND ND t-PA 871-895 delS885NHLIDL-insPQRGRSA 0,08 16,0 0,27 25,9 4,46 17.2 Фурин 871-895 1870insRKKR 0,80 2,68 ND ND ND ND Фурин ×2 871-895 delK871NII-insRKKR delY883ES-insKKR 0,24 8,93 ND ND ND ND Фурин х2 871-895 delK871NII-insRKKR S892RKK 0,34 6,25 ND ND ND ND Триптаза e 871-895 K871inslVGGE 0,14 37,3 ND ND ND ND Триптаза e 871-895 K871insRIVGGE 0,21 10,4 ND ND ND ND Триптаза e 871-895 delN886HLTDL-insRIVGGE 0,13 17,2 ND ND ND ND ЕСЕ-1 871-895 E884insKAFA 0,05 43,1 ND ND ND 4D Катепсин L 871-895 K871insLR 0,10 34,3 ND ND ND W Катепсин L 871-895 K871insFR 0,27 13,0 ND ND NTD W

Контроль - WT 0,05 57,0 0,07 32,4 0,88 14,2 ND - не определялось.

[0409] После анализа DAS клостридиальный токсин или гибрид клостридиального токсина, содержащий инактивационный сайт расщепления, оценивали с использованием мышиного теста на летальность с целью определения профиля безопасности путем сравнения ED₅₀ с LD₅₀.

[0410] Хотя аспекты настоящего описания были описаны со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, специалист в области техники легко поймет, что конкретные раскрываемые примеры являются только иллюстративными для этих аспектов, и они никоим образом не ограничивают настоящее описание. Могут быть сделаны различные модификации без отступления от духа настоящего описания.

Изобретение относится к генной инженерии. Описаны клостридиальные токсины или гибрид клостридиальнго токсина, содержащие инактивационный сайт расщепления. Изобретение позволяет получать клостридиальные токсины, которые снижают или предотвращают нежелательные побочные эффекты, ассоциированные с дисперсией токсина в целевые зоны. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 9 табл., 3 пр.

1. Клостридиальный токсин BoNT/A, содержащий инактивационный сайт расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, где участок инактивационного сайта расщепления расположен в участке аминокислот 871-895 SEQ ID NO: 1, при этом инактивационный сайт расщепления содержит двойной сайт тромбин-тромбин или двойной сайт фактор Xa-тромбин.

2. Гибрид клостридиального токсина BoNT/A, содержащий энзиматический домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен, не относящийся к клостридиальному токсину, и сайт инактивационного расщепления, расположенный в участке инактивационного сайта расщепления, где участок инактивационного сайта расщепления расположен в участке аминокислот 871-895 SEQ ID NO: 1, при этом инактивационный сайт расщепления содержит двойной сайт тромбин-тромбин или двойной сайт фактор Xa-тромбин.

3. Клостридиальный токсин, содержащий SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 535 и/или SEQ ID NO: 537.