ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К КЛОСТРИДИАЛЬНЫМ НЕЙРОТОКСИНАМ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/79 C12N5/09 G01N33/50 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в основном относится к клетке, которая была генетически сконструирована так, чтобы иметь повышенную чувствительность к клостридиальному нейротоксину, такому как нейротоксин ботулина и нейротоксин столбняка. Изобретение также относится к способу получения такой клетки и способу применения такой клетки при анализе активности полипептидов, полученных из таких нейротоксинов, таких как модифицированные и рекомбинантные версии таких клостридиальных нейротоксинов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Анаэробная грамположительная бактерия Clostridium botulinum продуцирует различные типы нейротоксинов, включая нейротоксины ботулина (BoNT) и нейротоксин столбняка (TeNT).

BoNT являются наиболее сильнодействующими из известных токсинов со средними значениями летальной дозы (LD₅₀) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг, в зависимости от серотипа. BoNT адсорбируются в желудочно-кишечном тракте и, попадая в кровоток, связываются с пресинаптической мембраной холинергических нервных окончаний, и препятствуют высвобождению нейромедиатора ацетилхолина.

BoNT хорошо известны своей способностью вызывать вялый мышечный паралич. Указанные миорелаксантные свойства привели к применению BoNT в ряде медицинских и косметических процедур, включая лечение межбровных морщин или гиперкинетических линий лица, лечение головной боли, гемифациального спазма, гиперактивности мочевого пузыря, гипергидроза, носогубных морщин, шейной дистония, блефароспазма и спастичности.

В настоящее время существует, по меньшей мере, восемь различных классов, каждый из которых имеет схожие структуры и способы действия. Различные серотипы BoNT можно различить на основе инактивации специфическими нейтрализующими антисыворотками, при этом такая классификация по серотипу коррелирует с процентом идентичности последовательностей на уровне аминокислот. Белки BoNT данного серотипа подразделяются на различные подтипы на основе процента идентичности аминокислотной последовательности.

Различные серотипы BoNT различаются у пораженных видов животных относительно тяжести и продолжительности вызванного паралича. Например, BoNT/A является наиболее смертоносным из всех известных биологических веществ и, что касается паралича, он в 500 раз более действенен у крысы, чем BoNT/B. Кроме того, продолжительность паралича после инъекции BoNT/A у мышей в десять раз больше, чем продолжительность после инъекции BoNT/E.

В природе клостридиальные нейротоксины синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который посттрансляционно модифицируется путем протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью. Расщепление происходит на определенном участке расщепления, часто обозначаемом как сайт активации, расположенном между остатками цистеина, которые обеспечивают межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (H-цепь), которая имеет молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепь), которая имеет молекулярную массу приблизительно 50 кДа. Н-цепь включает C-концевой нацеливающий компонент, известный как «нацеливающая группа», и N-концевой транслокационный компонент, известный как «домен транслокации». Участок расщепления расположен между L-цепью и транслокационным компонентом в открытой петлевой области. После связывания нацеливающей группы с ее целевым нейроном и интернализации связанного токсина в клетку через эндосому, домен транслокации перемещает L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль.

L-цепь включает протеазный компонент, известный как «протеазный домен». Он имеет нецитотоксическую функцию и действует, протеолитически расщепляя внутриклеточные транспортные белки, известные как белки SNARE, см. Gerard K (2002) «Cell and molecular Biology» (4^th edition), John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE происходит от термина Soluble NSF Attachment Receptor (рецептор связывания растворимого NSF), где NSF означает N-ethylmaleimide Sensitive Factor (фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду). Протеазный домен имеет цинк-зависимую эндопептидазную активность и проявляет высокую субстратную специфичность для белков SNARE.

Посредством соответствующих протеазных доменов различные клостридиальные нейротоксины расщепляют различные белки SNARE. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G и TeNT расщепляют синаптобревин, известный также как мембранный белок, ассоциированный с везикулами (VAMP). BoNT/A, BoNT/C и BoNT/E расщепляют связанный с синаптосомой белок массой 25 кДа (SNAP-25). BoNT/C расщепляет синтаксин.

Белки SNARE ассоциированы либо с мембраной секреторного пузырька, либо с клеточной мембраной, и способствуют экзоцитозу молекул, опосредуя слияние секреторного пузырька с клеточной мембраной, таким образом, позволяя содержимому пузырька выходить за пределы клетки. Расщепление таких белков SNARE ингибирует такой экзоцитоз и, таким образом, подавляет высвобождение нейромедиатора из таких нейронов. В результате этого парализуется поперечнополосатые мышцы, а потовые железы прекращают секрецию.

Таким образом, после доставки в желаемую клетку-мишень, клостридиальные нейротоксины способны к ингибированию клеточной секреции из клетки-мишени.

В данной области известна модификация клостридиальных нейротоксинов для изменения их свойств. Модификации могут включать модификации аминокислот, такие как добавление, делеция и/или замещение аминокислоты/аминокислот и/или химические модификации, такие как добавление фосфата или углевода или образование дисульфидных связей. Модификация может также включать переупорядочение компонентов клостридиального нейротоксина, например, фланкирование протеазного компонента транслокационным компонентом и нацеливающим компонентом.

Также в данной области известно производство рекомбинантных клостридиальных нейротоксинов, которые либо генетически идентичны нейротоксину из Clostridia, либо отличаются от клостридиальных нейротоксинов дикого типа тем, что содержат меньшее количество аминокислот, дополнительные или отличающиеся аминокислоты и/или компоненты, расположенные в порядке, отличающемся от того, в котором они расположены в клостридиальных нейротоксинах дикого типа. Эти рекомбинантные клостридиальные нейротоксины также могут быть химически модифицированы, как описано выше.

Однако различия между модифицированными и рекомбинантными клостридиальными нейротоксинами и их эквивалентами дикого типа могут влиять на желаемое свойство нейротоксина расщеплять белок SNARE. Таким образом, может быть важным определение, улучшают ли такие различия, уменьшают или устраняют такую активность.

Доступны различные общепринятые анализы, которые позволяют специалистам в данной области подтвердить, обладают ли эти модифицированные или рекомбинантные клостридиальные нейротоксины желаемой активностью по расщеплению целевого белка SNARE. Эти анализы включают тестирование на наличие продуктов, возникающих в результате расщепления белка SNARE. Например, после контактирования клетки с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином, она может быть лизирована и проанализирована с помощью SDS-PAGE для обнаружения присутствия продуктов расщепления. Альтернативно, продукты расщепления могут быть обнаружены при контакте лизата клеток с антителами.

Хотя в таких анализах можно использовать природные клетки, но поскольку такие природные клетки могут иметь только ограниченную чувствительность к клостридиальным нейротоксинам, анализы, как правило, требуют использования высокой концентрации таких клеток. Кроме того, желательно, чтобы такие анализы использовали клональную стабильную клеточную линию.

Таким образом, существует потребность в генетически сконструированной клетке, которая имеет повышенную чувствительность к клостридиальным нейротоксинам для применения в таких анализах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится частично к клетке, которая была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта или его фрагмента. Таким рецептором может быть белковый рецептор или ганглиозид. Предпочтительно, клетка, описываемая в настоящем документе (в отношении ли клетки как таковой, описываемой в настоящем документе, или любого способа или применения, которые включают в себя клетку, описываемую в настоящем документе), содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию (предпочтительно, сверхэкспрессию) рецептора и/или ганглиозида, где указанная экзогенная нуклеиновая кислота находится под контролем конститутивного и/или индуцибельного промотора (предпочтительно, конститутивного промотора).

Изобретение также частично относится к способу производства такой клетки. Способ включает введение в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор клостридиального нейротоксина или его вариант или его фрагмент, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин, и/или фермент пути синтеза ганглиозида, или его вариант или его фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента.

Изобретение также частично относится к анализу для определения активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина. Способ включает контакт вышеуказанной клетки с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином в условиях и в течение периода времени, которые позволяют протеазному домену клостридиального нейротоксина дикого типа расщеплять индикаторный белок в клетке, и определение присутствия продукта, возникающего в результате расщепления такого индикаторного белка.

Изобретение включает способы тестирования/оценки активности партии клостридиального нейротоксина для терапевтического/косметического применения. Такие способы выгодно находят применение в мониторинге активности токсина во время хранения и в отслеживании активности с течением времени. Еще одним преимуществом является возможность определения оптимальных условий хранения (например, при которых не снижается уровень активности). Эти способы особенно полезны для характеристики активности (например, связывания с клеткой/способности расщепления SNARE) рекомбинантных клостридиальных нейротоксинов.

Один из аспектов изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT) или идентификации состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT) для терапевтического (и/или косметического) применения, указанный способ включает:

a. создание клетки (например, генетически сконструированной клетки), имеющей экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка (предпочтительно, индикаторного белка, содержащего домен SNARE), расщепляемого клостридиальным нейротоксином; предпочтительно, где клетка не экспрессирует рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно, рецептор) в отсутствии указанной экзогенной нуклеиновой кислоты;

b. контакт указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта (например, введения) с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификация (i) состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается, или идентификация (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается; или

e. идентификация (i) состава клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается, или идентификация (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT) или определения состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT), который подходит для терапевтического (и/или косметического) применения, указанный способ включает:

a. работу с клеткой (например, генетически сконструированной клеткой) для вставки экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка (предпочтительно, индикаторного белка, содержащего домен SNARE), расщепляемого клостридиальным нейротоксином; предпочтительно, где клетка не экспрессирует рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно, рецептор) в отсутствии указанной экзогенной нуклеиновой кислоты;

b. контакт указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта (например, введения) с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификация (i) клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается, или идентификация (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается; или

e. идентификация (i) клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается, или идентификация (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT) или определения состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT), который подходит для терапевтического (и/или косметического) применения, указанный способ включает:

a. создание клетки (например, генетически сконструированной клетки), имеющей экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка (предпочтительно, индикаторного белка, содержащего домен SNARE), расщепляемого клостридиальным нейротоксином; предпочтительно, где клетка не экспрессирует рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно, рецептор) в отсутствии указанной экзогенной нуклеиновой кислоты;

b. контакт указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта (например, введения) с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификация (i) состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка повышается или эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или идентификация (ii) наличия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается или эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина; или

е. идентификация (i) клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического (и/или косметического) применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или идентификация (ii) отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина.

Контрольный состав клостридиального нейротоксина представляет собой состав клостридиального нейротоксина (например, партию клостридиального нейротоксина), который, как известно, обладает активностью расщепления и/или, как известно, подходит для терапевтического (и/или косметического) применения (другими словами, контроль является положительным контролем). Предпочтительно, (тестовый) состав клостридиального нейротоксина и контрольный состав нейротоксина представляют собой составы клостридиального нейротоксина того же типа/серотипа, например, где (тестовый) состав клостридиального нейротоксина является составом BoNT/E, контрольный клостридиальный нейротоксин предпочтительно также является составом BoNT/E.

Другой аспект изобретения относится к способу конструирования клетки, подходящей для использования в анализе для характеристики активности клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT) или определения состава клостридиального нейротоксина (предпочтительно BoNT), который подходит для терапевтического (и/или косметического) применения, способ включает:

работу с клеткой для вставки:

(i) экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора и/или ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, предпочтительно, где клетка не экспрессирует рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно, рецептор) в отсутствие указанной экзогенной нуклеиновой кислоты; и

(ii) экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка (предпочтительно, индикаторного белка, содержащего домен SNARE), расщепляемого клостридиальным нейротоксином.

Ниже приведены необязательные варианты осуществления любого аспекта изобретения, описанного в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления клетка обычно не экспрессирует рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно, рецептор, предпочтительно, где рецептором является SV2A). Другими словами, в предпочтительном варианте осуществления клетка не экспрессирует рецептор и/или ганглиозид (предпочтительно, рецептор, предпочтительно, где рецептором является SV2A) при отсутствии указанной экзогенной нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления клетка происходит из типа клеток, который отличается от природной мишени клостридиального нейротоксина. Другими словами, в одном из вариантов осуществления клетка не является природной мишенью клостридиального нейротоксина. Например, клетка может не быть природной мишенью BoNT/A. Дополнительно или альтернативно, клетка может не быть природной мишенью BoNT/E.

В одном из вариантов осуществления клетка не является нервной клеткой (например, нейроном).

Благодаря экспрессии или сверхэкспрессии рецептора и/или ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, обеспечивается преимущество, состоящее в том, что способы и клетки по изобретению позволяют уменьшить ложноотрицательные результаты (например, когда низкая активность расщепления будет неправильно выявлена как результат низкой аффинности связывания клостридиального нейротоксина и транслокации в клетку, используемую в анализе, а не как низкая активность протеазного домена). Кроме того, изобретение относится к более широкому спектру типов клеток, которые можно использовать в таких анализах, что снижает зависимость, например, от нервных клеток (например, естественным образом экспрессирующих достаточные уровни рецептора/ганглиозида), которые может быть трудно культивировать in vitro. Эти преимущества обеспечиваются в контексте анализа на основе клеток (позволяющего охарактеризовать связывание, транслокацию и активность протеазы) в отличие от бесклеточной системы (которая характеризует только активность протеазы).

Термин «когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается» означает, что по существу нет увеличения уровня расщепления. Как применяют в настоящем документе, термин «по существу» в отношении термина «когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается» предпочтительно означает не более чем 0,1%. Более предпочтительно, как применяют в настоящем документе, термин «когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается» означает, что уровень расщепления индикаторного белка после контакта не снижается в целом (т.е. увеличение уровня расщепления составляет 0%).

Уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в клетке, описываемой в настоящем документе, предпочтительно равен уровню или выше уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в природной мишени (например, нервной клетке) клостридиального нейротоксина. Например, уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в клетке, описываемой в настоящем документе, может быть ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, или ≥100% относительно уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в природной мишени (например, нервной клетке) клостридиального нейротоксина.

Уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в клетке, описываемой в настоящем документе, предпочтительно может быть выше, чем уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в клетке, в которой отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота. Например, уровень рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в клетке, описываемой в настоящем документе, может быть ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, или ≥100% относительно уровня рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно, рецептора), который экспрессируется в клетке (например, какой-либо эквивалентной клетке), в которой отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления термин «сверхэкспрессия», используемый в отношении любого аспекта или варианта осуществления, означает ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% или ≥100% экспрессии относительно уровня рецептора и/или ганглиозида (целевого рецептора), который экспрессируется в природной мишени (например, нервной клетке) для клостридиального нейротоксина. В одном из вариантов осуществления термин «сверхэкспрессия», используемый в отношении любого аспекта или варианта осуществления, описываемого в настоящем документе, предпочтительно означает ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, или ≥100% экспрессии по отношению к уровню рецептора и/или ганглиозида (предпочтительно рецептора), который экспрессируется в клетке (например, какой-либо эквивалентной клетке), в которой отсутствует указанная экзогенная нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/A (или BoNT, содержащий домен BoNT/A H_CC), и предпочтительно рецептором может быть SV2A, SV2B и/или SV2C (предпочтительно SV2A).

Дополнительно или альтернативно клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/B (или BoNT, содержащий домен BoNT/B H_CC), и предпочтительно рецептором может быть Syt-I и/или Syt-II.

Дополнительно или альтернативно, клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/E (или BoNT, содержащий домен BoNT/E H_CC), и предпочтительно рецептором может быть SV2A и/или SV2B (предпочтительно SV2A).

Дополнительно или альтернативно, клостридиальным нейротоксином может быть BoNT/G (или BoNT, содержащий домен BoNT/G H_CC), и предпочтительно рецептором может быть Syt-I и/или Syt-II.

Для получения дополнительной информации о подходящем рецепторах/ганглиозидах, см. Binz and Rummel (Journal of Neurochemistry, Volume 109, Issue 6, June 2009, Pages 1584-1595)) включенный в настоящий документ в качестве ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1А изображен Вестерн-блоттинг с использованием антитела к SNAP-25 после обработки клеток N2a с помощью BoNT/A при 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ в течение 8 часов или при 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ в течение 24 часов. Наличие нижней полосы свидетельствует о наличии продукта расщепления.

На фиг. 1В изображен Вестерн-блоттинг с использованием антитела к SNAP-25 после обработки клеток M17 с помощью BoNT/A при 0,1 нМ, 1 нМ или 10 нМ в течение 8 часов или при 1 нМ, 0,1 нМ или 0,01 нМ в течение 24 часов. Наличие нижней полосы свидетельствует о наличии продукта расщепления.

На фиг. 1C изображен Вестерн-блоттинг с использованием антитела к SNAP-25 после обработки IMR-32 в течение 24 часов. Наличие нижней полосы свидетельствует о наличии продукта расщепления.

На фиг. 1D изображен Вестерн-блоттинг с использованием антитела к SNAP-25 после обработки NG108 через 24 часа. Наличие нижней полосы свидетельствует о наличии продукта расщепления.

На фиг. 2A изображена флуоресцентная микрофотография клеток NG108 через сутки после трансфекции плазмидой, содержащей конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг.2B изображена флуоресцентная микрофотография клеток M17 через сутки после трансфекции плазмидой, содержащей конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг.3 изображена флуоресцентная микрофотография пуромицин-устойчивых клеток N108, стабильно трансфицированных плазмидой, содержащей конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc.

Фиг. 4 представляет собой линейчатую диаграмму, отображающую среднее количество клеток на HPF для клеток, которые флуоресцируют зеленым цветом после обработки 0, 0,1 нМ или 1 нМ BoNT/A.

На фиг. 5А представлена диаграмма рассеяния для данных проточной цитометрии для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc, показывающая гранулярность/сложность по оси x и размер клетки по оси y.

На фиг. 5В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5C представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 585 нм для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5D представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 617 нм для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5E представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной на длине волны 665 нм для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5F представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм для клеток NG108, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 5G представлена диаграмма рассеяния для данных проточной цитометрии клеток NG108, стабильно трансфицированных mScarlet-SNAP-25-GeNluc, измеренных при 665 нм по оси x и боковом рассеянии (SS) по оси y.

На фиг. 6А представлена диаграмма рассеяния для данных проточной цитометрии для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc, показывающая гранулярность/сложность по оси x и размер клетки по оси y.

На фиг. 6В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6С представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 585 нм для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6D представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 617 нм для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6E представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 665 нм для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6F представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм для клеток M17, стабильно трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc.

На фиг. 6G представлена диаграмма рассеяния для данных проточной цитометрии для клеток M17, стабильно трансфицированных mScarlet-SNAP-25-GeNluc, измеренных при 665 нм по оси x и боковом рассеянии (SS) по оси y.

На фиг. 7А представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм для контрольных клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг. 7В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм для клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A.

На фиг. 7С представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 525 нм для клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 1,0 нМ BoNT/A.

На фиг. 8А представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм для контрольных клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc.

На фиг. 8В представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм для клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A.

На фиг. 8C представлена гистограмма интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при 785 нм для клеток NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP-25-GeNluc и обработанных 1,0 нМ BoNT/A.

На фиг. 9 показан Вестерн-блоттинг, проведенный на клетках NG108, трансфицированных индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных без токсина (контроль), 1 нМ или 8 нМ BoNT/A, или 0 (контроль), 1 нМ, 10 нМ, или 100 нМ BoNT/E.

На фиг. 10А представлены данные о проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и не обработанных токсином.

На фиг. 10В представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10C представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10D представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10E представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/E в течение 72 часов.

На фиг. 10F изображена флуоресцентная микрофотография клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и не обработанных токсином.

На фиг. 10G изображена флуоресцентная микрофотография клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10H изображены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10I изображена флуоресцентная микрофотография клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 0,1 нМ BoNT/A в течение 72 часов.

На фиг. 10J представлены флуоресцентные микрофотографии клеток NG108, трансфицированных конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc и обработанных 10 нМ BoNT/E в течение 72 часов.

На Фиг.11А представлены данные проточной цитометрии для клеток NG108 дикого типа.

На фиг. 11B представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые были отобраны по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 1000 пМ и не обрабатывались дополнительно BoNT/A.

На фиг. 11C показаны данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые выбирали по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 1000 пМ и которые обрабатывали 100 пМ BoNT/A в течение 48 часов.

На фиг. 11D показаны данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые выбирали по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 1000 пМ и которые обрабатывали 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

На фиг. 11E представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые выбирали по высокой экспрессии индикаторного белка, но не по чувствительности к BoNT/A и не обрабатывали в дальнейшем BoNT/A.

На фиг. 11F представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые выбирали по высокой экспрессии индикаторного белка, но не по чувствительности к BoNT/A, и которые обрабатывали 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

На фиг. 12A показаны данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые выбирали по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 100 пМ и не обрабатывали дополнительно BoNT/A.

На фиг. 12B представлены данные проточной цитометрии для генетически сконструированных клеток NG108, которые выбирали по высокой экспрессии индикаторного белка и чувствительности к BoNT/A при 100 пМ и которые обрабатывали 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

Фиг. 13A представляет собой график процентного содержания индикаторного белка, расщепленного после обработки клеток NG108, генетически сконструированных для экспрессии индикаторного белка и SV2A или SV2C, различной концентрацией BoNT/A в течение различных периодов времени.

Фиг. 13B представляет собой график процентного содержания индикаторного белка, расщепленного после обработки клеток NG108, генетически сконструированных для экспрессии индикаторного белка и SV2A или SV2C, различной концентрацией BoNT/E в течение различных периодов времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено вариантами осуществления, описываемыми в настоящем документе. Фактически, многочисленные вариации, изменения и замены будут очевидны специалистам в данной области без отклонения от изобретения. Следует понимать, что при практической реализации изобретения могут быть использованы различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, описанным в настоящем документе.

В описании изобретения, где указан диапазон значений в отношении варианта осуществления, следует понимать, что каждое промежуточное значение охватывается вариантом осуществления.

Как применяют в настоящем документе, «вариант» белка или полипептида относится к белку или полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью референсного белка или полипептида.

«Идентичность последовательности», как применяют в настоящем документе, относится к идентичности между референсной аминокислотной или нуклеотидной последовательностью и исследуемой аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, где последовательность выровнена таким образом, что получается совпадение наивысшего порядка, и которая может быть вычислена с использованием опубликованных способов или способов, закодированных в компьютерных программах, например, ВLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215:403).

Как применяют в настоящем документе, «фрагмент» белка или полипептида относится к усеченным формам белка или полипептида или усеченным формам варианта белка или полипептида.

Настоящее изобретение относится к клетке, которая была генетически сконструирована так, чтобы иметь повышенную чувствительность к клостридиальному нейротоксину.

Клостридиальные нейротоксины представляют собой нейротоксины, которые естественным образом вырабатываются бактериями Clostridium botulinum.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения клостридиальный нейротоксин представляет собой ботулинический нейротоксин (BoNT) или столбнячный нейротоксин (TeNT). Как применяют в настоящем документе, термины «клостридиальный нейротоксин», «BoNT’» и «TeNT’», соответственно, относятся к клостридиальным нейротоксинам дикого типа, в том числе вырабатываемым штаммами, отличными от Clostridium botulinum, а также к модифицированным и рекомбинантным клостридиальным нейротоксинам.

Модифицированные клостридиальные нейротоксины могут содержать одну или несколько модификаций по сравнению с клостридиальным нейротоксином дикого типа, включая аминокислотные модификации и/или химические модификации. Аминокислотные модификации включают делеции, замены или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков. Химические модификации включают модификации, внесенные в одну или несколько аминокислот, такие как добавление фосфата или углевода или образование дисульфидных связей.

В определенных вариантах осуществления модификации могут быть произведены для изменения свойств клостридиального нейротоксина. Модификации клостридиального нейротоксина могут увеличивать или уменьшать его биологическую активность.

Биологическая активность клостридиального нейротоксина охватывает по меньшей мере три отдельных активности: первая активность представляет собой «протеолитическую активность», находящуюся в протеазном компоненте нейротоксина, и ответственную за гидролиз пептидной связи одного или нескольких белков SNARE, участвующих в регуляции слияния клеточных мембран. Вторая активность представляет собой «транслокационную активность», находящуюся в транслокационном компоненте нейротоксина, и участвует в транспорте нейротоксина через эндосомальную мембрану и в цитоплазме. Третий вид активности представляет собой «активность связывания с рецептором», расположенную в нацеливающем компоненте нейротоксина, и участвует в связывании нейротоксина с рецептором на клетке-мишени.

В определенных вариантах осуществления модификация нейротоксина может включать укороченный компонент(-ы) клостридиального нейротоксина при сохранении активности такого компонента(-ов). Например, нейротоксин может быть модифицирован таким образом, чтобы включать только часть/части протеазного компонента, которая необходима для протеолитической активности, только часть/части транслокационного компонента транслокации, которая необходима для активности транслокации, и/или только часть/части нацеливающего компонента, необходимую для активности связывания с рецептором.

Клостридиальный нейротоксин исходно продуцируется в виде неактивного одноцепочечного полипептида и переходит в свою активную двухцепочечную форму после расщепления нейротоксина в его сайте активации. Такое расщепление приводит к образованию двухцепочечного белка с тяжелой цепью (H-цепью), включающей транслокационный и нацеливающий компоненты, и легкой цепью (L-цепь), содержащей протеазный компонент.

В определенных вариантах осуществления биологическая активность клостридиального нейротоксина модифицирована путем модификации сайта активации нейротоксина. Таким образом, способность нейротоксина к активации может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. В определенных вариантах осуществления биологическая активность клостридиального нейротоксина увеличивается или запускается путем модификации сайта активации так, чтобы он более легко расщеплялся, таким образом активируя нейротоксин. В вариантах осуществления, где активация желательна только в определенных средах или клетках, сайт активации может быть модифицирован так, что он расщепляется только протеазами, присутствующими в таких средах или клетках. В некоторых других средах биологическая активность нейротоксина снижается или инактивируется за счет модификации сайта активации так, чтобы он менее легко расщеплялся.

В определенных вариантах осуществления биологическая активность клостридиального нейротоксина модифицирована путем модификации протеазного компонента нейротоксина. Протеолитическая активность нейротоксина может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. В определенных вариантах осуществления протеазный компонент может быть заменен протеазным компонентом из другого клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента. Например, BoNT/A можно модифицировать, заменив его протеазный компонент на протеазный компонент BoNT/E.

В определенных вариантах осуществления биологическая активность клостридиального нейротоксина модифицирована путем модификации транслокационного компонента нейротоксина. Таким образом, транслокационная активность нейротоксина может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. В определенных вариантах осуществления транслокационный компонент может быть заменен транслокационным компонентом из другого клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента. Например, BoNT/A можно модифицировать, заменив его транслокационный компонент на транслокационный компонент BoNT/E.

В определенных вариантах осуществления биологическая активность клостридиального нейротоксина модифицирована путем модификации нацеливающего компонента нейротоксина. Таким образом, способность нейротоксина к нацеливанию может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. В определенных вариантах осуществления нацеливающий компонент может быть заменен нацеливающим компонентом из другого клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента. Например, BoNT/A можно модифицировать, заменив его нацеливающий компонент на нацеливающий компонент BoNT/E. В других определенных вариантах осуществления нацеливающий компонент может быть заменен неклостридиальным полипептидом, например, антителом.

Кроме того, модификация может включать изменение порядка компонентов клостридиального нейротоксина, например, фланкирование протеазного компонента транслокационным компонентом и нацеливающим компонентом.

Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины производят генетическим способом. Они могут быть либо генетически идентичны клостридиальным нейротоксинам дикого типа, либо могут отличаться от клостридиальных нейротоксинов дикого типа тем, что содержат дополнительные аминокислоты, меньшее количество аминокислот или отличающиеся аминокислоты. Например, можно получать рекомбинантные клостридиальные нейротоксины, повторяющие любой из указанных выше модифицированных клостридиальных нейротоксинов. Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины могут также иметь компоненты, расположенные в порядке, отличающемся от того, в котором они расположены в клостридиальных нейротоксинах дикого типа. Рекомбинантные клостридиальные нейротоксины также могут быть химически модифицированы, как описано выше.

В определенных вариантах осуществления модифицированный или рекомбинантный клостридиальный нейротоксин представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с клостридиальным нейротоксином дикого типа, например, BoNT серотипа A, B, C, D, E, F, G, или H, или TeNT.

Специалистам в данной области доступен ряд программ, основанных на алгоритмах для сравнения разных последовательностей. В этом контексте алгоритмы Needleman и Wunsch, или Smith и Waterman дают особенно надежные результаты. Для выполнения выравнивания последовательностей и вычисления значений идентичности последовательностей, указанных в документе, использовали коммерчески доступную программу DNASTAR Lasergene MegAlign, версии 7.1.0, основанную на алгоритме Clustal W, по всей области последовательностей со следующими настройками: Параметры парного выравнивания: штраф за пропуск: 10,00, штраф за длину пропуска: 0,10, матрица сравнения аминокислот по Gonnet: 250, которые, если не указано иначе, всегда должны использоваться как стандартные настройки для выравнивания последовательностей.

Серотип BoNT/A делится, по меньшей мере, на шесть подсеротипов (также известных как подтипы), от BoNT/A1 до BoNT/A6, которые имеют от 84% до 98% идентичности аминокислотных последовательностей. Белки BoNT/A в пределах данного подтипа имеют более высокий процент идентичности аминокилотной последовательности.

Клостридиальные нейротоксины нацелены на нейроны за счет связывания с рецепторами. Рецепторы клостридиального нейротоксина включают белковые рецепторы и ганглиозиды плазматической мембраны.

Ганглиозиды представляют собой олигогликозилцерамиды, производные от лактозилцерамида и содержащие остаток сиаловой кислоты, такой как N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac), N-гликолил-нейраминовая кислота (Neu5Gc) или 3-дезокси-D-глиц-D-галакто-кислота (кулозоновая кислота). Ганглиозиды присутствуют и сконцентрированы на клеточных поверхностях, с двумя гидроуглеродными цепями церамидной группы, встроенной в плазматическую мембрану, и олигосахаридами, расположенными на внеклеточных поверхностях, где они представляют точки распознавания для внеклеточных молекул или поверхностей соседних клеток. Ганглиозиды также специфически связываются с вирусами и бактериальными токсинами, такими как клостридиальные нейротоксины.

Ганглиозиды определяются системой номенклатуры, в которой M, D, T и Q относятся к моно-, ди-, три- и тетрасиалоганглиозидам, соответственно, и числа 1, 2, 3 и т.д. относятся к порядку миграции ганглиозидов на тонкослойной хроматографии. Например, порядок миграции моносиалоганглиозидов - GM3> GM2> GM1. Чтобы обозначить вариации в пределах базовых структур, добавляют дополнительные термины, например, GM1a, GD1b, и т.д. Гликосфинголипиды, имеющие 0, 1, 2 и 3 остатка сиаловой кислоты, связанные с внутренней галактозной единицей, называются асиало- (или 0-), ганглиозидами серий a-, b- и c, соответственно, в то время как ганглиозиды, имеющие остатки сиаловой кислоты, связанные с внутренними остатками N-галактозамина классифицируют как ганглиозиды a-серий. Пути для биосинтеза серий ганглиозидов 0-, a-, b- и c- включают последовательную активность сиалилтрансфераз и гликозилтрансфераз, как показано, например, в Ledeen et al., Trends in Biochemical Sciences, 40: 407-418 (2015). Дальнейшая сиализация каждой серии и в различных положениях в углеводной цепи может происходить с образованием все более сложного и гетерогенного ряда продуктов, таких как ганглиозиды a-серий с остатком/остатками сиаловой кислотой, связанными с внутренним остатком N-ацетилгалактозамина. Ганглиозиды переносятся к наружному слою плазматической мембраны с помощью транспортной системы, включающей образование везикул.

На сегодняшний день в тканях позвоночных обнаружено около 200 ганглиозидов. Распространенные ганглиозиды включают: GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, и GQ1.

Клостридиальные нейротоксины обладают двумя независимыми областями связывания в домене HCC для ганглиозидов и рецепторов нейрональных белков. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G имеют консервативный сайт связывания ганглиозидов в домене HCC, состоящий из мотива «E(Q)...H(K)...SXWY...G», тогда как BoNT/C и BoNT/D демонстрируют два независимых сайта связывания ганглиозидов. Lam et al., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 117:225-231 (2015).

Большинство BoNT связываются только с ганглиозидами, которые имеют 2,3-связанный остаток N-ацетилнейраминовой кислоты (обозначенный Sia5), присоединенный к Gal4 олигосахаридного ядра, тогда как соответствующий связывающий ганглиозид карман на TeNT может также связываться с GM1a, ганглиозидом, лишенным остатка сахара Sia5. Было обнаружено, что BoNT/D связывает GM1a и GD1a. См. Kroken et al., Journal of Biological Chemistry, 286: 26828-26837 (2011). Комбинируя данные, полученные от мышей с дефицитом ганглиозидов и биохимических анализов, BoNT/A, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G демонстрируют предпочтение концевому фрагменту NAcGal-Gal-NAcNeu, присутствующему в GD1a и GT1b, тогда как BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D и TeNT требуют дисиалильного мотива, обнаруженного в GD1b, GT1b и GQ1b. Обильные сложные полисиало-ганглиозиды, такие как GD1a, GD1b и GT1b, таким образом, по-видимому, необходимы для специфического накопления всех серотипов BoNT и TeNT на поверхности нейрональных клеток на первом этапе интоксикации. См. Rummel, Andreas, "Double receptor 10 anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity," Botulinum Neurotoxins, Springer Berlin Heidelberg (2012) 61-90.

В свете вышеизложенного, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии ганглиозида. В конкретных вариантах осуществления клетка генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GM1a, GD1a, GD1b, GT1b, и/или GQ1b. В определенных вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD1a, GD1b и/или GT1b. В определенных вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD1b и/или GT1b.

Ганглиозиды синтезируют, начиная с церамида. От церамида один из путей включает добавление глюкозной единицы глюкозилцерамидсинтазой с образованием глюкозилцерамида (GlcCer). β1,4-галактозилтрансфераза I (GalT-I) затем катализирует добавление галактозной единицы к GlcCer с образованием лактозилцерамида (LacCer). От LacCer GalNAc-трансфераза (GalNAcT) может добавлять N-ацетилгалактозамин с образованием GA1 или GM3-синтаза может добавлять сиаловую кислоту с образованием GM3. Из GM3 может быть образован GD3 добавлением дополнительной сиаловой кислоты GD3-синтазой. GT3 может быть образован из GD3 путем добавления еще одной сиаловой кислоты с помощью GT3-синтазы. В отдельном пути галактозную единицу добавляют к LacCer с помощью галактозилцерамидсинтазы с образованием галактозилцерамида (GalCer). Затем GM4-синтаза добавляет еще одну углеводную группу к (ST-V). Например, из GD3 образуются ганглиозиды серии «b» - GD1b, GT1b, и GQ1b.

Rлетки по настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать желаемый ганглиозид, будучи сконструированы так, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать фермент пути биосинтеза, который приводит к ганглиозиду. Например, клетка может быть сконструирована (т.е. путем трансфекции), чтобы содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую такой фермент. Таким образом, в определенных вариантах осуществления клетка была сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии глюкозилцерамидсинтазы, GalT-I, GalNAcT, GM3-синтазы, GD3-синтазы, GT3-синтазы, галактозилцерамид-синтазы, GM4-синтазы, GalT-II, ST-IV и/или СТ-В.

Специалисты в данной области поймут, что варианты или фрагменты таких ферментов, которые сохраняют желаемую каталитическую активность, также могут играть роль в синтезе представляющих интерес ганглиозидов. Таким образом, в определенных вариантах осуществления клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента фермента пути синтеза ганглиозида, который сохраняет способность этого фермента. Например, в определенных вариантах осуществления клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента глюкозилцерамидсинтазы, который обладает способностью добавлять глюкозу к церамиду, варианта или фрагмента GalT-I, который обладает способностью добавлять галактозную единицу к GlcCer, варианта или фрагмента GalNAcT, который имеет способность добавлять N-ацетилгалактозамин к LacCer, варианта или фрагмента GM3-синтазы, который имеет способность добавлять сиаловую кислоту к LacCer, варианта или фрагмента GD3-синтазы, который имеет способность добавлять сиаловую кислоту к GM3, варианта или фрагмента GT3-синтазы, который имеет способность добавлять сиаловую кислоту к GD3, варианта или фрагмента галактозилцерамидсинтазы, который имеет способность добавлять галактозную единицу к LacCer, и/или варианта GM4-синтазы, который имеет способность добавлять углеводную группу к GalCer.

В определенных вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, которая имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью фермента пути биосинтеза, который приводит к ганглиозиду и который сохраняет желаемую каталитическую активность такого фермента. В других определенных вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, которая имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с глюкозилцерамидсинтазой, GalT-I, LacCer, GalNAcT, GD3-синтазой, GT3-синтазой, галактозилцерамидсинтазой, GM4-синтазой, GalT-II, ST-IV, и/или ST-V и, которая сохраняет желаемую каталитическую активность этого фермента.

Фрагмент может, например, содержать 50 аминокислот или меньше, 40 аминокислот или меньше, 30 аминокислот или меньше, 20 аминокислот или меньше, или 10 аминокислот или меньше.

В данной области известны анализы, которые можно использовать для определения того, какие варианты или фрагменты обладают желаемой каталитической активностью. Например, специалистам в данной области известны анализы, которые можно использовать, чтобы определить, имеет ли вариант или фрагмент GD3-синтазы способность добавлять сиаловую кислоту к GM3.

Специалисты в данной области поймут, что указанные выше ферменты также могут кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые отличаются от указанной выше экзогенной нуклеиновой кислоты консервативными заменами, известными в данной области. Специалисты в данной области также поймут, что варианты ферментов могут, например, кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент дикого типа. Таким образом, изобретение также относится к клетке, которая была генетически сконструирована так, чтобы содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, которая имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с нуклеиновой кислотой, которая кодирует один из вышеуказанных ферментов и/или нуклеиновой кислотой, которая отличается от нуклеиновой кислоты дикого типа и кодирует такой фермент только с консервативными заменами, где кодируемый белок представляет собой фермент дикого типа или вариант, который сохраняет каталитическую активность фермента дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии фермента, который служит для катализирования того, что, как было установлено, является лимитирующей стадией биосинтеза желаемого ганглиозида, или его варианта или его фрагмента, который имеет желаемую каталитическую активность такого фермента. Например, GD3-синтаза представляет собой фермент, который катализирует лимитирующую стадию в биосинтезе ганглиозидов серий «b», в частности, добавление сиаловой кислоты к GM3. Таким образом, в вариантах осуществления, где желательна экспрессия или сверхэкспрессия GD1b, GT1b, и/или GQ1b, конструируют клетку для экспрессии или сверхэкспрессии GD3-синтазы или ее варианта или ее фрагмента, который обладает способностью добавлять сиаловую кислоту к GM3.

Например, клетка может быть трансфицирована нуклеиновой кислотой, кодирующей GD3-синтазу, или нуклеиновой кислотой, как описано выше, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с такой нуклеиновой кислотой, например, такой, которая кодирует вариант GD3-синтазы, который сохраняет ее каталитическую активность, или такой, которая отличается от GD3-синтазы дикого типа только консервативными заменами.

Связывание определенных клостридиальных нейротоксинов с клетками также может зависеть от связывания с белковыми рецепторами. BoNT/A, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и TeNT связываются с белком 2 синаптического пузырька (SV2), при этом BoNT/A способен связываться со всеми его тремя изоформами (SV2A, SV2B, и SV2C), а BoNT/E способен связываться только с изоформами SV2A и SV2B. BoNT/B и BoNT/G связываются с обеими изоформами (I и II) синаптотагмина. Синаптотагмин и SV2 локализуются на синаптических пузырьках и становятся доступными во внеклеточном пространстве, когда пузырьки сливаются с пресинаптической мембраной. Именно в этот период клостридиальные нейротоксины связываются со своими белковыми рецепторами.

Клетки по настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать желаемый белковый рецептор, например, SV2 (например, SV2A, SV2B и SV2C) или синаптотагмин (например, синаптотагмин I и синаптотагмин II). Например, клетка может быть сконструирована (например, путем трансфекции) для содержания экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белковый рецептор.

Настоящее изобретение также относится к белкам, которые отличаются от таких белковых рецепторов, но все же сохраняют способность связывать клостридиальный нейротоксин. Такие белки могут быть вариантом или фрагментом такого белкового рецептора, который сохраняет способность рецептора связывать клостридиальный нейротоксин. Таким образом, в определенных вариантах осуществления клетка была сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии варианта или фрагмента SV2, который связывает BoNT/A, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и/или TeNT. Также в определенных вариантах осуществления клетка была сконструирована так, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать вариант или фрагмент синаптотагмина, который связывает BoNT/B и/или BoNT/G.

В определенных вариантах осуществления вариант представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, который имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью белкового рецептора, который связывает клостридиальный нейротоксин. В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой белок, имеющий аминокилотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с SV2 (например, SV2A (SEQ ID NO: 8), SV2B (SEQ ID NO: 9) и SV2C (SEQ ID NO: 10)) или синаптотагмином (например, синаптотагмин I (SEQ ID NO: 14) и синаптотагмин II (SEQ ID NO: 15)).

Фрагмент может, например, содержать 50 аминокислот или меньше, 40 аминокислот или меньше, 30 аминокислот или меньше, 20 аминокислот или меньше или 10 аминокислот или меньше.

В определенных вариантах осуществления вариант или фрагмент содержит домены белковых рецепторов дикого типа, которые связываются с нейротоксином. Например, вариант или фрагмент может включать люминальный домен (-ы) дикого типа SV2 (например, SV2A, SV2B, и SV2C) или синаптотагмин дикого типа (например, синаптотагмин I и синаптотагмин II). В других определенных вариантах осуществления вариант или фрагмент может содержать четвертый люминальный домен SV2 дикого типа, например четвертый люминальный домен SV2A (SEQ ID NO: 11), четвертый люминальный домен SV2B (SEQ ID NO: 12), или четвертый люминальный домен SV2C (SEQ ID NO: 13).

В данной области известны анализы, которые можно использовать для определения того, какие варианты или фрагменты обладают желаемой активностью связывания клостридиального нейротоксина. Например, специалисты в данной области знают, какой анализ можно использовать, чтобы определить, имеет ли вариант или фрагмент SV2C способность связывать BoNT/A.

Специалисты в данной области поймут, что указанные выше ферменты также могут кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые отличаются от указанной выше экзогенной нуклеиновой кислоты консервативными заменами, известными в данной области. Специалисты в данной области также поймут, что варианты белкового рецептора могут, например, кодироваться нуклеиновыми кислотами, которые имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичности последовательности с нуклеиновой кислотой, кодирующей белковый рецептор дикого типа. Таким образом, изобретение также относится к клетке, которая была генетически сконструирована так, чтобы содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, которая имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с нуклеиновой кислотой, которая кодирует один из вышеуказанных белковых рецепторов и/или нуклеиновой кислотой, которая отличается от нуклеиновой кислоты дикого типа, кодирующей такой белковый рецептор, только консервативными заменами, где кодируемый белок является белковым рецептором дикого типа или вариантом, который сохраняет способность связывать клостридиальный нейротоксин.

SV2C наиболее чувствителен к BoNT/A. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, где желательна чувствительность к BoNT/A, генетически сконструирована клетка для экспрессии или сверхэкспрессии SV2C или варианта или его фрагмента, который способен связывать BoNT/A. SV2C, однако, не связывает BoNT/E, который вместо этого связывается с SV2A и SV2B. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, где желательна чувствительность к BoNT/E, генетически сконструирована клетка для экспрессии или сверхэкспрессии SV2A и/или SV2B, или их вариантов или фрагментов, способных к связыванию BoNT/E.

В настоящем изобретении предполагается, что клетка может быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии двух или более белковых рецепторов, двух или более ферментов пути синтеза ганглиозида или белка рецептора(-ов) и фермента(-ов) пути синтеза ганглиозида. Например, клетка может быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии SV2A и SV2C. Такая клетка может, например, иметь повышенную чувствительность к BoNT/A и BoNT/E. Также, клетка может быть сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD3-синтазы и SV2A и/или SV2C.

Кроме того, известно, что химерные рецепторы способны к связыванию нейротоксинов. Например, известно, что химерные рецепторы, которые содержат домен указанного выше белкового рецептора, который связывается с нейротоксином (например, четвертый люминальный домен SV2), слитый с трансмембранным доменом другого рецептора, такого как LDL-рецептор, связываются с BoNT и позволяют интернализацировать его в клетку. Настоящее изобретение таким образом также предполагает конструирование клеток для экспрессии таких химерных рецепторов.

Клетка, используемая в настоящем изобретении, может быть любой клеткой, прокариотической или эукариотической, способной экспрессировать ганглиозид и белковый рецептор, как описано выше. Примеры таких клеток включают нервные клетки, нейроэндокринные клетки (например, PC12), клетки эмбриональной почки (например, клетки HEK293), злокачественные клетки молочной железы (например, MC7), клетки нейробластомы (например, клетки Neuro2a (N2a), M17, IMR-32, N18 и LA-N-2) и гибридные клетки нейробластомы-глиомы (например, клетки NG108). В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку нейробластомы или нейробластомы-глиомы. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку NG108, M17 или IMR-32. В конкретном варианте осуществления клетка представляет собой клетку NG108.

Клетки, сконструированные для экспрессии или сверхэкспрессии рецепторов клостридиальных токсинов, могут быть дополнительно отобраны для повышения чувствительности с использованием направленной эволюции. В этом процессе клетки подвергаются действию клостридиального нейротоксина, и отбирают клетки, которые проявляют чувствительность к более низкой концентрации клостридиального нейротоксина (как определено, например, по расщеплению в них индикаторного белка) по сравнению с другими клетками. Ожидается, что эти клетки обладают большей чувствительностью к клостридиальному нейротоксину, чем клетки в целом. Этот процесс может повторяться с более низкой концентрацией клостридиального нейротоксина с отобранными клетками, проявляющими чувствительность к более низкой концентрации.

Выбранные клетки с каждым раундом будут иметь повышающуюся чувствительность к клостридиальному нейротоксину.

Как обсуждалось ранее, клетку по настоящему изобретению можно использовать в анализе для определения активности полипептида (например, модифицированного или рекомбинантного клостридиального нейротоксина). Такой анализ включает в себя контактирование клетки с полипептидом и тестирование на наличие продукта/продуктов, возникающих в результате расщепления белка SNARE в клетке.

Как применяют в настоящем документе, термин «контактирование» относится к приведению клетки и клостридиального нейротоксина в физическую близость для обеспечения физического и/или химического взаимодействия. Контактирование осуществляется в условиях и в течение некоторого времени, достаточного для обеспечения взаимодействия полипептида и белка, который восприимчив к протеолизу клостридиальным нейротоксином дикого типа (например, белка SNARE).

В определенных вариантах осуществления такое контактирование может осуществляться путем культивирования клетки в среде, содержащей полипептид. Как правило, полипептид присутствует в среде в концентрации от 0,0001 до 10000 нМ, от 0,0001 до 1000 нМ, от 0,0001 до 100 нМ, от 0,0001 до 10 нМ, от 0,0001 до 1 нМ, 0,0001 до 0,1 нМ, 0,0001 до 0,01 нМ, или 0,0001 до 0,001 нМ. Такое культивирование может, например, происходить в течение 2 часов или больше, 4 часов или больше, 6 часов или больше, 12 часов или больше, 18 часов или больше, 24 часов или больше, 30 часов или больше, 36 часов или больше, 40 часов или больше, или 48 часов или больше.

В других конкретных вариантах осуществления такое контактирование может осуществляться путем трансфекции клетки (например, транзиторной трансфекции) экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид.

Чтобы обеспечить возможность применения в таком анализе, клетка содержит белок, восприимчивый к протеолизу дикого типа клостридиальным нейротоксином дикого типа. Эти белки будут называться в настоящем документе «индикаторным(-и) белком/белками». Индикаторный белок может быть эндогенным (например, эндогенный белок SNARE) или клетка может быть генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка.

Как указано выше, известно, что белки SNARE, такие как SNAP-25, синаптобревин и синтаксин восприимчивы к протеолизу клостридиальными нейротоксинами. Например, известно, что BoNT/A, BoNT/C и BoNT/E расщепляют SNAP-25, известно также, что BoNT/C расщепляет синтаксин, а другие серотипы BoNT и TeNT, как известно, расщепляют синаптобревин. Таким образом, изобретение предполагает, что такой индикаторный белок может содержать аминокислотную последовательность такого белка SNARE. Изобретение также предполагает, что индикаторный белок может вместо этого содержать аминокислотную последовательность варианта или фрагмента такого белка SNARE при условии, что вариант или фрагмент чувствителен к протеолизу клостридиальным нейротоксином дикого типа. В определенных вариантах осуществления вариант может иметь, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с белком SNARE. Часть индикаторного белка, имеющая аминокислотнуюпоследовательность белка SNARE, или его варианта или его фрагмента, будет в настоящем документе обозначаться как «домен SNARE» индикаторного белка.

Термин «восприимчивый к протеолизу» означает, что белок протеолитически расщепляется протеазным компонентом клостридиального нейротоксина дикого типа. Другими словами, такой белок включает участок распознавания и расщепления протеазой, позволяющий его распознавать и расщеплять протеазным компонентом клостридиального нейротоксина дикого типа.

В определенных вариантах осуществления индикаторный белок помечен. Например, патент США № 8940482, Oyler et al. описывает клеточный анализ для оценки активности клостридиального нейротоксина, где клетка была сконструирована так, чтобы экспрессировать меченый слитый белок, содержащий домен флуоресцентного белка, слитый с SNAP-25. Домен флуоресцентного белка является C-концевым доменом SNAP-25 и становится частью C-концевого фрагмента, который возникает после расщепления SNAP-25 клостридиальным нейротоксином. В анализе, описанном у Oyler, полноразмерный слитый белок с трудом деградирует в клетке, но полученный C-концевой фрагмент деградирует легко, приводя к деградации флуоресцентного белка. Это происходит из-за присутствия в SNAP-25 остатков, которые служат дегроном только тогда, когда они обнажаются путем расщепления на N-конце полученного фрагмента. Такие «N-дегроны» помечены убиквитиновыми лигазами, и, таким образом, фрагмент является объектом для деградации в протеасомах.

Настоящее изобретение, таким образом, рассматривает варианты осуществления, как это описано у Oyler, где клетка сконструирована для экспрессии меченого индикаторного белка, который в полноразмерной форме не разрушается легко. В таких вариантах осуществления расщепление приводит к получению меченого фрагмента, который легко разрушается в клетке (например, из-за присутствия N-дегрона). Индикаторный белок имеет метку на части, которая образует фрагмент, который легко разрушается, и метка деградирует вместе с фрагментом. В таких вариантах осуществления способность полипептида расщеплять белок SNARE в клетке можно определить по наличию (или отсутствию) сигнала от метки после контактирования клетки с полипептидом.

В других конкретных вариантах осуществления индикаторный белок также включает метку на части индикаторного белка, которая после расщепления образует фрагмент, который не разрушается так легко, как другой фрагмент. Например, индикаторный белок может быть слитым белком, содержащим две метки, и домен SNARE с метками, фланкирующими домен SNARE. В вариантах осуществления, где полноразмерный индикаторный белок с трудом расщепляется в клетке, но после его расщепления один из полученных фрагментов расщепляется легко, расщепление белка SNARE можно определять путем сравнения сигнала, полученного с метки на легко разлагаемом фрагменте, с сигналом с метки на менее легко разрушаемом фрагменте. Например, в вариантах осуществления, таких как у Oyler, где C-концевой фрагмент, полученный в результате расщепления, легко расщепляется, а N-концевойй фрагмент - нет, расщепление можно определить путем сравнения сигнала, полученного от метки на C-концевом фрагменте, с сигналом с метки на N-концевом фрагменте. В таких вариантах осуществления могут быть выбраны метки, испускающие флуоресцентные сигналы, которые более четко различимы друг от друга (например, красный и зеленый, или красный и голубой).

Как применяют в настоящем документе, термин «метка» означает детектируемый маркер и включает, например, радиоактивную метку, антитело и/или флуоресцентную метку. Количество исследуемого субстрата и/или продукта расщепления можно определять, например, способами радиоавтографии или спектрометрии, включая способы, основанные на передаче энергии резонанса, по меньшей мере, между двумя метками, такие как анализ FRET (обсуждается дополнительно ниже). Альтернативно, для обнаружения можно использовать иммунологические методы, такие как вестерн-блоттинг или ELISA.

Примеры меток, которые можно использовать в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают: радиоактивные изотопы; флуоресцентные метки; фосфоресцирующие метки; люминесцентные метки; и соединения, способные связывать меченый связывающий партнер. Примеры флуоресцентных меток включают: желтый флуоресцентный белок (YFP); синий флуоресцентный белок (BFP); зеленый флуоресцентный белок (GFP), такой как NeonGreen; красный флуоресцентный белок (RFP), такой как mScarlet; голубой флуоресцентный белок (CFP); и их флуоресцирующие мутанты. Примеры люминесцентных меток включают: фотобелки; люциферазу, такую как люцифераза светлячка, люцифераза Renilla и Gaussia; хемилюминесцентные соединения; и электрохемилюминесцентные (ECL) соединения. В вариантах осуществления, как указано выше, где N-концевая метка и C-концевая метка выбраны так, чтобы излучаемые сигналы были более легко различимы друг от друга, примеры таких пар меток могут включать RFP и GFP, и RFP и CFP. Например, RFP, такой как mScarlet, может служить N-концевой меткой, а GFP, такой как NeonGreen или CFP, может служить C-концевой меткой.

В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой белковую метку, такую как антитело, флуоресцентный белок, фотобелок и люцифераза.

Как применяют в настоящем документе, «N-концевая метка» относится к метке, белковой или нет, расположенной на участке индикаторного белка, который является N-концевым участком расщепления клостридиальным нейротоксином, и «C-концевая метка» относится к метке, белковой или нет, расположенной на участке индикаторного белка, который является C-концевым по отношению к участку расщепления клостридиальным нейротоксином. Метка не обязательно должна быть на N-конце или C-конце индикаторного белка, чтобы называться N-концевой или C-концевой меткой. Скорее эти термины относятся к положению метки относительно участка расщепления клостридиальным нейротоксином. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения RFP, такой как mScarlet, используют как N-концевую метку, и GFP, такой как NeonGreen или CFP используют как C-концевую метку.

Другой анализ представляет собой анализ резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). В таком анализе индикаторный белок содержит донорную метку с одной стороны участка расщепления и акцепторную метку с другой стороны. Метка-донор поглощает энергию и затем передает ее метке-акцептору. Передача энергии приводит к снижению интенсивности флуоресценции донорного хромофора и увеличению интенсивности излучения акцепторного хромофора. Расщепление субстрата приводит к менее успешной передаче энергии. Таким образом, успешное расщепление можно определить на основе ограничения возможности для этой передачи. В таких вариантах осуществления YFP и CFP могут быть взяты как пара FRET, так же как RFP и GFP.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индикаторный белок представляет собой слитый белок, который содержит домен SNARE. Слитый белок также может содержать дополнительные домены, такие как домен с меткой. Домен с меткой может иметь аминокислотную последовательность белковой метки. Пример такого слитого белка включает N-концевую метку, домен, такой как аминокислотная последовательность для mScarlet; домен SNARE, такой как последовательность аминокислот для SNAP-25; и C-концевой домен с меткой, такой как аминокислотная последовательность для NeonGreen.

Слитый белок также может включать другие домены, такие как селективный маркер (обсуждается ниже). В таких вариантах осуществления домен селективного маркера может быть отделен от части слитого белка, содержащей оставшиеся домены (например, домен SNARE и домен(-ы) с меткой) линкером, который может быть расщеплен, чтобы обеспечить разделение селективного маркера и остатка индикаторного белка после трансляции. Линкер может, например, быть саморасщепляющимся (например, саморасщепляющийся пептид 2А).

Как обсуждалось ранее, клетка может быть сконструирована так, чтобы экспрессировать или сверхэкспрессировать индикаторный белок. Специалистам в данной области известно, какие нуклеиновые кислоты можно использовать для такой экспрессии, и способы конструирования таких клеток для экспрессии такого индикаторного белка. Примером такой нуклеиновой кислоты является SEQ ID NO: 1, которая экспрессирует слитый белок, имеющий mScarlet в качестве N-концевой метки, SNAP-25 в качестве домена SNARE, NeonGreen в качестве C-концевой метки, люциферазу в качестве домена с дополнительной меткой, пуромицин-N-ацетилтрансферазу в качестве селективного маркера и саморасщепляющийся пептид 2A. Другой пример такой нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 2, которая экспрессирует слитый белок, имеющий mScarlet в качестве N-концевой метки, SNAP-25 в качестве домена SNARE, CFP в качестве C-концевой метки, люциферазу в качестве домена с дополнительной меткой, пуромицин-N-ацетилтрансферазу в качестве селективного маркера и саморасщепляющийся пептид 2A.

Настоящее изобретение также частично относится к способу получения указанной выше генетически сконструированной клетки. Способ включает введение в клетку экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, представляющий интерес. Представляющим интерес белком может быть, например, рецептор клостридиального нейротоксина или его вариант или его фрагмент, обладающий способностью связывать клостридиальный нейротоксин; фермент пути синтеза ганглиозида или его вариант, или его фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента; и/или индикаторный белок.

В определенных вариантах осуществления способ включает трансформацию клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, представляющий интерес. Такая трансформация может быть трансфекцией.

В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует слитый белок, содержащий два или более домена, причем каждый домен имеет аминокислотную последовательность для представляющего интерес белка или другие компоненты слитого белка. Например, нуклеиновая кислота может кодировать слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность для белкового рецептора (например, SV2A или SV2C) и аминокислотную последовательность для фермента пути синтеза ганглиозида (например, GD3-синтазы). В другом примере, нуклеиновая кислота может кодировать слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность для белкового рецептора, аминокислотную последовательность для фермента пути синтеза ганглиозида, и аминокислотную последовательность для селективного маркера. В еще одном примере нуклеиновая кислота может кодировать слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность для белкового рецептора, аминокислотную последовательность для фермента пути синтеза ганглиозида, аминокислотную последовательность для индикаторного белка и аминокислотную последовательность для селективного маркера.

В таких вариантах осуществления домены могут быть отделены друг от друга линкерами. Линкеры могут, например, расщепляться ферментами в клетке или содержать саморасщепляющийся пептид (например, саморасщепляющийся пептид 2A), позволяющий отдельным доменам образовывать отдельные белки в клетке.

Нуклеиновая кислота может необязательно содержать регуляторные элементы. Как применяют в настоящем документе, термин «регуляторные элементы» относится к регуляторным элементам экспрессии гена, включая транскрипцию и трансляцию, и включает такие элементы, как TATA-боксы, промоторы, энхансеры, участки связывания сигналов рибосомы, последовательности Шайна-Дальгарно, области IRES, последовательности полиаденилирования, концевые кэпирующие структуры и т.п. Регуляторный элемент может содержать один или несколько гетерологичных регуляторных элементов или один или несколько гомологичных регуляторных элементов. «Гомологичный регуляторный элемент» представляет собой регуляторный элемент из клетки дикого типа, из которой происходит молекула нуклеиновой кислоты, который участвует в регуляции экспрессии гена молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке дикого типа. «Гетерологичный регуляторный элемент» представляет собой регуляторный элемент, который не участвует в регуляции экспрессии гена молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке дикого типа. Также можно использовать регуляторные элементы для индуцируемой экспрессии, такие как индуцибельные промоторы.

Молекула нуклеиновой кислоты может быть, например, гяРНК, мРНК, РНК, ДНК, ПНК, ЗНК, и/или модифицированной молекулой нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть кольцевой, линейной, интегрированной в геном или эписомальной. Также изобретение охватывает конкатемеры, кодирующие слитые белки, содержащие три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять полипептидов. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательности, кодирующие сигнальные последовательности для внутриклеточнного транспорта, такие как сигнальные последовательности для транспортировки во внутриклеточный компартмент или для транспортировки через клеточную мембрану.

Нуклеиновая кислота может быть сконструирована для обеспечения высоких уровней экспрессии в клетке-хозяине. Способы конструирования молекул нуклеиновой кислоты для увеличения экспрессии белка в клетках-хозяевах известны в данной области и включают уменьшение частоты (числа появлений) «медленных кодонов» в кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновую кислоту можно вводить любым способом, известным в данной области. Например, она может быть включена в вектор (например, плазмиду), используемый для введения нуклеиновой кислоты в клетку.

Можно использовать любой вектор, известный в данной области, позволяющий экспрессировать нуклеиновую кислоту в клетке. Вектор может быть подходящим для экспрессии интересующего белка in vitro и/или in vivo. Вектор может быть вектором для транзиентной и/или стабильной экспрессии гена. Вектор может дополнительно содержать регуляторные элементы и/или селективные маркеры. Вектор может быть, например, искусственного или вирусного происхождения, фагового происхождения или бактериального происхождения. Примеры векторов для использования в настоящем изобретении включают аденовирусные векторы, векторы осповакцины, вирусные векторы SV-40, ретровирусные векторы, λ-производные, и плазмиды. Примеры плазмид для использования в настоящем изобретении включают плазмиды, имеющие остов pD2500 или pcDNA3.1.

Способы введения нуклеиновой кислоты в клетку известны в данной области. См. Laura Bonetta, "The Inside Scoop-Evaluating Gene Delivery Methods" Nature Methods 2: 875-883 (2005).

Клетка-хозяин может содержать индуктор экспрессии интересующего белка. Таким индуктором экспрессии может быть молекула нуклеиновой кислоты или полипептид или химическое соединение, включая малое химическое соединение. Индуктор экспрессии может, например, увеличивать транскрипцию или трансляцию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок. Индуктор может, например, экспрессироваться рекомбинантными способами, известными специалистам в данной области. Альтернативно, индуктор может быть выделен из клетки, например, клостридиальной клетки.

В определенных вариантах осуществления клетки, которые были успешно трансформированы, можно определить по присутствию селективного маркера. В таких вариантах осуществления вектор, содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый белок, также может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер.

В определенных вариантах осуществления селективный маркер представляет собой детектируемую метку. Примеры таких меток включают метку His, метку GST, метку Strep и метку SBP. Метку можно экспрессировать как часть слитого белка, который также включает в себя белок, представляющий интерес. В таких вариантах осуществления метка может быть фланкирована одним или несколькими участками расщепления протеазы или саморасщепляющимися пептидами. Это позволяет метка отщепляться от белка после трансляции.

В других определенных вариантах осуществления селективный маркер придает устойчивость к антибиотику. Примеры таких селективных маркеров включают пуромицин-N-ацетилтрансферазу (устойчивость к пуромицину), аминогликозид 3′f3-фосфотрансферазу (устойчивость к G418), бластицидин S дезаминазу (устойчивость к Бластицидину S), и гигромицин B фосфотрансферазу (устойчивость к гигромицину В). Успешная трансформация клетки, таким образом, может быть определена путем воздействия на клетку соответствующим антибиотиком.

В определенных вариантах осуществления успешную трансформацию клеток, которые генетически сконструированы для экспрессии или сверхэкспрессии ганглиозида и/или белкового рецептора, связывающего клостридиальный нейротоксин, можно определить путем контактирования таких клеток с клостридиальным нейротоксином и определения того, произошло ли расщепление в них индикаторного белка.

Настоящее изобретение относится к применению указанной выше генетически сконструированной клетки в анализе для определения биологической активности полипептида, например, модифицированного или рекомбинантного клостридиального нейротоксина.

Биологическую активность таких полипептидов можно измерить с помощью различных тестов, все из которых известны специалисту в данной области.

Как обсуждалось ранее, анализ включает контактирование клетки с полипептидом в условиях и в течение периода времени, которые позволили бы протеазному домену клостридиального нейротоксина дикого типа расщепить индикаторный белок в клетке, и определение присутствие продуктов, возникающих в результате расщепления индикаторного белка. Индикаторный белок может быть эндогенным по отношению к клетке (например, эндогеннный белок SNARE) или может быть экзогенным индикаторным белком из типа, описанного ранее.

Такие анализы, как правило, также включают в себя этап определения степени превращения индикаторного белка в его продукт (ы) расщепления. Наблюдение за одним или несколькими продуктами расщепления, возникающими после контакта полипептида с индикаторным белком, или наблюдение увеличения количества продукта/продуктов расщепления указывает на протеолитическую активность полипептида.

Этап определения может включать сравнение полноразмерного индикаторного белка и продукта расщепления. Сравнение может включать определение количества полноразмерного индикаторного белка и/или количества одного или нескольких продуктов расщепления и может также включать вычисление соотношения полноразмерного индикаторного белка и продукта расщепления. Кроме того, анализ для определения протеолитической активности может включать этап сравнения продукта/продуктов расщепления, которые появляются после контакта исследуемого полипептида и индикаторного белка, и контроля. Контролем может быть, например, продукт(-ы) расщепления, который появляется после контакта с клостридиальным нейротоксином, который, как известно, способен расщеплять тот же индикаторный белок.

В определенных вариантах осуществления после контактирования клетки с полипептидом, клетка может быть лизирована и проанализирована с помощью электрофореза в геле и Вестерн-блоттинга. Например, в Вестерн-блоттинге можно использовать антитело против SNAP-25, которое связывается с N-концом SNAP-25, для определения наличия полноразмерного SNAP-25 и расщепленного SNAP-25 (который будет мигрировать в отдельной полосе от полноразмерного SNAP-25).

Способы и подходы, используемые для лизиса клеток-хозяев, таких как бактериальные клетки, известны в данной области. Примеры включают обработку ультразвуком или использование пресса Френча.

В определенных вариантах осуществления полноразмерный индикатор белок не разрушается легко в клетке, но после его расщепления один из образующихся фрагментов разрушается легко. Это может быть, например, из-за присутствия остатка, который служит дегроном только тогда, когда он обнажается путем расщепления на N-конце полученного фрагмента.

В таких вариантах осуществления индикаторный белок может быть помечен на его части, которая более легко разрушается после расщепления. Метка должна быть выбрана таким образом, чтобы при разрушении фрагмента метка также разрушалась. В таких вариантах осуществления, происходит ли расщепление, можно определить на основании измерения сигнала от метки.

Полученный сигнал можно сравнивать с контролем.

В других определенных вариантах осуществления, где другой фрагмент, образованный после расщепления, не так легко деградирует, индикаторный белок также может включать метку на части индикаторного белка, которая после расщепления образует этот фрагмент. В таких вариантах осуществления, происходит ли расщепление, можно, таким образом, определить путем сравнения сигнала от метки на более легко расщепляемом фрагменте с сигналом от метки на менее легко расщепляемом фрагменте, который служит контролем.

Сигнал (ы) от метки/меток можно анализировать с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Например, в варианте осуществления, где полноразмерный индикаторный белок и его N-концевой фрагмент, образованный после расщепления, не легко разрушаются внутри клетки, но С-концевой фрагмент, полученный в результате расщепления, разрушается легко, и N-концевая метка представляет собой mScarlet, а С-концевая метка представляет собой NeonGreen, FACS-анализ клеток после успешного расщепления покажет более низкую эмиссию зеленого по сравнению с красной эмиссией. В отличие от этого, если расщепления не происходит, красная и зеленая флуоресценция должны быть равно преобладающими.

В качестве альтернативы могут быть взяты флуоресцентные микрофотографии клетки. В варианте осуществления, описанном выше, успешное расщепление привело бы к меньшему количеству зеленой флуоресценции, выделяемой клетками, по сравнению с контрольными клетками, которые не подвергались действию протеазы. В отличие от этого, красная флуоресценция должна оставаться такой же, как в контроле.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления анализ может представлять собой анализ FRET. Как обсуждалось ранее, в таком анализе индикаторный белок содержит N-концевую метку и C-концевую метку, причем одна метка является донорной меткой, а другая - акцепторной меткой. Передача энергии между донорной меткой и акцепторной меткой приводит к снижению интенсивности флуоресценции донорной метки и увеличению интенсивности излучения акцепторной метки. Успех такой передачи зависит от меток, остающихся в непосредственной близости. Расщепление индикаторного белка имеет тенденцию делать эти метки более отдаленными, и, таким образом, такая передача менее успешна. Успешное расщепление может быть определено, таким образом, на основании уменьшенной способности к передаче энергии.

В дополнение к вышеизложенному, любые другие способы, известные в данной области, с помощью которых можно анализировать флуоресценцию от индикаторных белков, чтобы определить, произошло ли расщепление, можно использовать в практическом осуществлении настоящего изобретения.

В определенных вариантах осуществления полипептид считается протеолитически активным, если 20% или больше, 50% или больше, 75% или больше, 80% или больше, 90% или больше, 95% или больше, 97% или больше, 98% или больше, или 99% или больше индикаторного белка превращается в продукт (ы) расщепления менее чем за 1 минуту, менее чем за 5 минут, менее чем за 20 минут, менее чем за 40 минут, менее за 60 минут, или менее чем за 120 минут.

Расщепление можно измерять через определенные промежутки времени, чтобы отслеживать каталитическую активность с течением времени.

Все ссылки, цитируемые в этом описании, включены сюда посредством ссылки в отношении их полного содержания и содержания изобретения, конкретно упомянутого в этом описании.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Выбор оптимальной родительской клеточной линии для создания индикаторной клеточной линии

Клетки Neuro2A (N2a; ATCC CCL-131), BE(2)-M17 (M17; ATCC CRL-2267), IMR-32 (ATCC CCL-127) и NG108-15 [108CC15] (ATCC HB-12317) исследовали для выбора оптимальной родительской клеточной линии для развития стабильной трансфицированной клеточной линии.

После доставки клеткам позволяли восстанавливаться и расти. Затем исходные культуры клеток замораживали и хранили в жидком азоте. После того, как было приготовлено достаточное количество флаконов с исходными культурами клеток, клетки анализировали на их чувствительность к BoNT/A.

клетки культивировали в среде, содержащей BoNT/A (Metabiologics, Inc.) в течение 8 или 24 часов.

Расщепление эндогенного SNAP-25 анализировали посредством Вестерн-блоттинга с использованием антитела к SNAP-25 (Sigma #S9684) со стандартными протоколами (фиг. 1). Клетки NG108 показали большую чувствительность к BoNT/A, чем другие клетки, при этом клетки N2a были наименее чувствительными. Таким образом, клеточная линия NG108 был выбрана в качестве основного кандидата для разработки стабильно трансфицированной индикаторной клеточной линии. Клеточные линии M17 и IMR-32 показали аналогичную чувствительность к BoNT/A в исследованных концентрациях и временных точках. Из-за простоты культивирования и знакомства с линией M17 была выбрана в качестве резервной линии для NG108.

Пример 2 - Трансфекция клеток плазмидой, содержащей индикаторную конструкцию

Определяли чувствительность клеток NG108 и клеток M17 к пуромицину (InvivoGen #ANT-PR) и G418 (VWR #97064-358). Клетки выращивали до ~50% конфлюэнтности, а затем культивировали с различными концентрациями пуромицина и G418. Обе клеточные линии показали аналогичную чувствительность к пуромицину и G418.

Плазмиды (pD2500; Atum) были сконструированы так, чтобы содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пуромицин-N-ацетилтрансферазу (PuroR), химерный белок и саморасщепляющийся пептид 2A. В экспрессированном продукте самоотщепляющийся пептид 2A располагался между PuroR и химерным белком. Химерный белок содержал SNAP-25, фланкированный между N-концевым и C-концевым флуоресцентными белками и люциферазу (расположенную на C-конце). PuroR придает устойчивость к пуромицину. Люцифераза позволяет проводить люминесцентные измерения разрушения в дополнение к флуоресцентным измерениям разрушения за счет флуоресцентных белков. N-концевой флуоресцентный белок представлял собой mScarlet, а C-концевой флуоресцентный белок представлял собой либо NeonGreen, зеленый флуоресцентный белок, либо голубой флуоресцентный белок (CFP). Плазмидная вставка, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие PuroR, саморасщепляющийся пептид 2A, и SNAP-25, CFP и люциферазу (mScarlet-SNAP25-CyanNluc) имела нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

NeonGreen был выбран из-за его спектра возбуждения/испускания и интенсивности. В случае, если NeonGreen плохо разрушается при расщеплении индикаторного белка, CFP был выбран в качестве резервного белка из-за предыдущих данных, указывающих на то, что он быстро разрушается при расщеплении индикаторного белка.

Клетки NG108 и клетки M17 трансфицировали плазмидами, содержащими конструкцию mScarlet-SNAP25-GeNluc или конструкцию mScarlet-SNAP25-CyanNluc. Трансфекцию проводили с использованием Липофектамина 3000 (ThermoFisher) или полиэтиленимина с использованием стандартных протоколов.

Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии для подтверждения эффективности трансфекции и правильной экспрессии индикаторного белка (фиг. 2A-B, показаны примеры клеток, экспрессирующих индикаторный белок, содержащий NeonGreen). Из-за сверхэкспрессии большая часть индикаторного белка была цитозольной. Красный и зеленый, представляющие, соответственно, N- и C-концы индикаторного белка, были легко обнаружены и указывали на то, что концы совместно локализованы. Высокая транзиторная экспрессия наблюдалась в обоих типах клеток с эффективностью трансфекции >70%.

После подтверждения того, что клетки были эффективно трансфицированы и индикаторные белки экспрессировались правильно, трансфицированные клетки отбирали при помощи либо 2,5 мкг/мл пуромицин, либо «шокировали» начальной высокой дозой 20 мкг/мл пуромицина на сутки 1, а затем культивировали в 5-10 мкг/мл пуромицина. Обе обработки дали на выходе пул флуоресцентных, пуромицин-резистентных клеток.

Одновременно с этим был проведен ряд дополнительных трансфекций с обеими индикаторными конструкциями и проведен отбор на устойчивость к пуромицину, в результате чего был получен дополнительный пул флуоресцентных пуромицин-устойчивых клеток. В конечном итоге это привело приблизительно к шести независимым пулам флуоресцентных пуромицин-резистентных клеток NG108 и двум независимым пулам пуромицин-резистентных флуоресцентных клеток M17. Пулы размножали, и культуры были заморожены и протестированы на жизнеспособность при оттаивании.

Пуромицин-устойчивые клетки анализировали для подтверждения стабильной трансфекции индикаторной конструкции (фиг. 3). В клетках NG108, стабильно трансфицированных индикаторной конструкцией, содержащей NeonGreen, как mScarlet (красный), так и NeonGreen (зеленый) были локализованы совместно. Это указывало на то, что был произведен полноразмерный интактный белок и распределен по клетке. Кроме того, флуоресценция преимущественно наблюдалась на клеточной мембране, что указывает на то, что белок был правильно локализован (из-за присутствия SNAP-25).

Пример 3 - Подтверждение расщепления индикаторного белка

Плазмиды (pcDNA3,1) были сконструированы так, чтобы содержать SEQ ID NO: 3, которая кодирует легкую цепь BoNT/A, CFP и N-концевую SBP-метку. Нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь BoNT/A, синтезировали с использованием DNA2.0 (Atum).

Клетки из Примера 2, стабильно трансфицированные индикаторными конструкциями (mScarlet-SNAP25-GeNluc или mScarlet-SNAP25-CyanNluc), временно трансфицировали экспрессирующим вектором, содержащим конструкцию CFP-BoNT/A. Многочисленные красные, но не зеленые или голубые клетки были продемонстрированы через 24 часа и 48 часов после трансфекции, что указывает на то, что индикаторный белок был расщеплен и C-концевой фрагмент быстро разрушился.

Пример 4 - Подтверждение расщепления индикаторного белка

Клетки NG108 из Примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, высевали в 96-луночные оптические планшеты (ThermoFisher #165305) (20-30 тыс. клеток на лунку) в полную среду DMEM (Corning #50-013-PB) и оставляли для прикрепления в течение 4 часов. Затем среду меняли на Neurobasal Plus (ThermoFisher # A35829) и клетки культивировали в течение следующих 20 часов, после чего среду меняли на среду Neurobasal Plus, содержащую BoNT/A с концентрацией 0 (контроль), 0,1 или 1,0 нМ. Клетки культивировали еще 24 часа. Клетки затем трипсинизировали, один раз промывали в среде и ресуспендировали в среде DMEM/FBS или DPBS с 10 единицами Бензоназы/мл при ~2×10⁶ клеток/мл. Затем клетки анализировали на клеточном сортере SY3200 (Sony Biotechnologies) с использованием соответствующих лазеров/фильтров для NeonGreen и mScarlet.

Фиг. 4 показывает количество зеленых клеток на HPF для mScarlet-SNAP25-GeNluc-экспрессирующих клеток NG108, после обработки BoNT/A в течение 24 часов. Примерно 25% снижение зеленых положительных клеток на HPF было указано для пула клеток, обработанных 1 нМ BoNT/A.

Пример 5 - Подтверждение расщепления индикаторного белка

Типичные клетки NG108 и M17 из Примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, трипсинизировали, промывали один раз в среде и ресуспендировали в среде DMEM/FBS или DPBS с 10 единицами Бензоназы/мл при ~2×10⁶ клеток/мл. Затем клетки анализировали на клеточном сортере SY3200 (Sony Biotechnologies) с использованием соответствующих лазеров/фильтров для NeonGreen и mScarlet.

Клетки NG108 возбуждали при 488 нм, чтобы непосредственно возбуждать NeonGreen, минимально возбуждая mScarlet. Флуоресценцию измеряли при разных длинах волн. Кроме того, интенсивность бокового и прямого рассеяния света измеряли для выявления субпопуляций клеток. На Фиг. 5A изображена диаграмма рассеяния, показывающая боковое рассеяние (SS) по оси x и прямое рассеяние (FS) по оси y: распределение иллюстрирует изменение степени зернистости/сложности (SS) и размера клетки (FS). На Фиг. 5B изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при длине волны 525 нм (фильтр FITC). На Фиг. 5C изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности излучения флуоресценции, измеренной при длине волны 585 нм (PE-фильтр). На Фиг. 5D изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 617 нм (фильтр PE-Texas Red). На Фиг. 5Е изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 665 нм (фильтр 7AAD). На Фиг. 5F изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 785 нм (фильтр PE-Cy7). На Фиг. 5G представлена диаграмма рассеяния, показывающая испускание флуоресценции клетками, измеренное при длине волны 665 нм (фильтр 7AAD) по оси x и боковое рассеяние (SS) по оси y. Гистограммы показывают два отчетливых пика флуоресценции, причем меньший пик флуоресценции представляет неэкспрессирующие клетки, а больший пик флуоресценции представляет клетки, экспрессирующие индикаторный белок. На всех длинах волн измерения испускания флуоресценция остается высокой. Это включает случай, когда излучение измеряли при 785 нм (фиг. 5F), когда большая часть излучаемого света приходится на FRET, таким образом, подтверждается FRET между NeonGreen и mScarlet. Процентная доля высоко флуоресцентных клеток в пуле N108 колебалась от 61% до 93%.

Клетки M17 возбуждали при 488 нм, чтобы непосредственно возбуждать NeonGreen, минимально возбуждая mScarlet. Флуоресценцию измеряли при разных длинах волн. Кроме того, интенсивность бокового и прямого рассеяния света измеряли для идентификации субпопуляции клеток. На Фиг. 6A изображена диаграмма рассеяния, показывающая боковое рассеяние (SS) по оси x и прямое рассеяние (FS) по оси y: распределение иллюстрирует изменение степени зернистости/сложности (SS) и размера клетки (FS). На Фиг. 6B изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 525 нм (фильтр FITC). На Фиг. 6C изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 585 нм (PE-фильтр). На Фиг. 6D изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 617 нм (PE-Texas Red filter). На Фиг. 6E изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 665 нм (фильтр 7AAD). На Фиг. 6F изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 785 нм (фильтр PE-Cy7). На Фиг. 6G изображена гистограмма, показывающая клеточное распределение интенсивности испускания флуоресценции, измеренной при длине волны 665 нм (фильтр 7AAD) по оси x и боковое рассеяние (SS) по оси y. Гистограммы показывают два отчетливых пика флуоресценции, причем меньший пик флуоресценции представляет неэкспрессирующие клетки, а больший пик флуоресценции представляет клетки, экспрессирующие индикаторный белок. На всех длинах волн измерения испускания флуоресценция остается высокой. Это включает случай, когда излучение измеряли при 785 нм (фиг. 6F), при котором большая часть излучаемого света приходится на FRET, таким образом, подтверждается FRET между NeonGreen и mScarlet. Процентная фракция высоко флуоресцентных клеток в пуле M17 колебалась от 14% до 24%, т.е. доля клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки в пуле клеток M17, была меньше по сравнению с пулом клеток NG108.

Клетки NG108 из Примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, обрабатывали BoNT/A при концентрации 0 (контроль), 0,1 или 1,0 нМ способом, описанным в примере 4.

Флуоресценцию пула стабильно трансфицированных клеток NG108 измеряли с помощью анализатора SY3200 (Sony Biotechnologies). Клетки возбуждали при 488 нм, чтобы непосредственно возбуждать NeonGreen, минимально возбуждая mScarlet. Флуоресценцию измеряли при 530 нм (фильтр FITC), который обнаруживает флуоресценцию NeonGreen, но не флуоресценцию mScarlet. На Фиг. 7A изображена гистограмма, показывающая распределение интенсивности испускания флуоресценции необработанными (контрольными) клетками, измеренную при длине волны 525 нм. На Фиг. 7B изображена гистограмма, показывающая распределение интенсивности испускания флуоресценции клетками, обработанными 0,1 нМ BoNT/A, измеренное при 525 нм. На Фиг. 7C изображена гистограмма, показывающая распределение интенсивности испускания флуоресценции клетками, обработанными 1 нМ BoNT/A, измеренное при 525 нм. Флуоресценция NeonGreen снизилась приблизительно на 15% в клеточном пуле (средняя флуоресценция клеток в воротах R2) после обработки 1 нМ BoNT/A (фиг. 7C) по сравнению с необработанным контролем (фиг. 7A), что позволяет предположить, что полученный NeonGreen-содержащий C-концевой фрагмент деградирует после расщепления.

Также была проведена проточная цитометрия для определения испускания FRET. Флуоресценцию от стабильно трансфицированного пула клеток NG108 измеряли с помощью анализатора SY3200 (Sony Biotechnologies). Клетки возбуждали при 488 нм, чтобы непосредственно возбуждать NeonGreen, минимально возбуждая mScarlet. Флуоресценцию измеряли при 785 нм (фильтр Cy7), который обнаруживает флуоресценцию mScarlet, но не флуоресценцию NeonGreen. На Фиг. 8A изображена гистограмма, показывающая распределение интенсивности испускания флуоресценции необработанными (контрольными) клетками, измеренную при длине волны 785 нм. На Фиг. 8B изображена гистограмма, показывающая распределение интенсивности испускания флуоресценции клетками, обработанными 0,1 нМ BoNT/A, измеренное при 785 нм. На Фиг. 8C изображена гистограмма, показывающая распределение интенсивности испускания флуоресценции клетками, обработанными 1 нМ BoNT/A, измеренное при 785 нм. Интенсивность FRET снизилась на 16% (средняя флуоресценция клеток в воротах R6) после обработки 1 нМ BoNT/A (фиг. 8C) по сравнению с необработанным контролем (фиг. 8A), что соответствует деградации NeonGreen.

Пример 6 - Подтверждение расщепления

Вестерн-блоттинг проводили на клетках NG108 из примера 2, стабильно трансфицированных индикаторной конструкцией mSclet-SNAP25-GeNluc и обработанных без токсина (контроль), 1 нМ или 8 нМ BoNT/A или 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ BoNT/Е способом, описанном в примере 4 (фиг. 9).

Клеточные линии тестировали на расщепление SNAP-25 (эндогенного или экзогенного) с использованием стандартных методов блоттинга и кроличьих первичных антител против SNAP25.

Клетки лизировали с использованием реагента M-PER (ThermoFisher # 78501) в соответствии с рекомендациями производителя. Лизат очищали при 15 кг в течение 10 минут, и 10 мкл образца прогоняли на геле NuPage с 12% Bis-Tris (ThermoFisher #NP0341BOX) в буфере MOPS (ThermoFisher #NP0001) при 200 В. Белки переносили на мембрану PVDF (ThermoFisher #LC2005) с помощью системы блоттинга XCell II и протокола переноса Nu-Page. Полученный в результате блот блокировали в 1% BSA/0,05% Tween20/PBS, с первичным антителом 1:3000 против SNAP-25, вторичным козлиным антителом к антителу кролика 1:5000, конъюгированным с щелочной фосфатазой (ThermoFisher #31340), и проявляли в субстрате NBT/BCIP (ThermoFisher #34042). Проявленный блот сканировали, рассчитывали денситометрию с помощью ImageJ и строили график в MS Excel.

Индикаторный белок был обнаружен во всех лизатах. В контрольных образцах явных продуктов расщепления не обнаружено. Клетки, обработанные либо BoNT/A, либо BoNT/E, производили продукты расщепления, повышающиеся с увеличением дозировки. Интересно, что клетки, по-видимому, примерно так же чувствительны к BoNT/E, как и к BoNT/A.

Пример 7 - Трансфекция рецепторной конструкцией

Плазмиды (pD2500; Atum) были сконструированы так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую рецепторную конструкцию GD3-SV2C-Syt и аминогликозид 3'-фосфотрансферазу (Neo) (SEQ ID NO: 4). Нуклеиновая кислота экспрессировала слитый белок, содержащий GD3-синтазу, SV2C, синтаксин и Neo, с каждым доменом, отделенным друг от друга саморасщепляющимися пептидами 2А. Синтаксин был вставлен в слитый белок для использования с другими изоформами BoNT. Neo придает устойчивость к G418.

Клетки NG108 из Примера 2, стабильно трансфицированные индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, выращивали в колбах T75 до ~60% конфлюэнтности. Затем их трансфицировали рецепторной конструкцией, содержащей плазмиду (2 мкг/мл) в 5 мл OptiMem/полиэтиленимина в течение ночи в соответствии со стандартным протоколом. Утром клетки отмывали однократно со свежей полной средой DMEM и культивировали еще от 24 до 48 часов в полной среде DMEM. Затем среду заменяли на полную среду DMEM с 500 мкг/мл G418 и клетки, культивировали еще от 1 до 2 недель с заменой среды/G418 по мере необходимости. Клетки наблюдали со старта гибели через 3 суток после добавления G418 и в течение ~ 1 недели (~ 60% гибель клеток). Клетки, оставшиеся через ~ 2 недели, были устойчивыми к G418.

Пример 8 - Направленная эволюция клеток

Клетки из Примера 7 подвергали двум сортировкам для выделения тех клеток, которые имели самую высокую флуоресценцию и, таким образом, наивысшую экспрессию индикаторного белка.

Пример 9 - Направленная эволюция клеток

Клетки, выбранные для высокой экспрессии индикаторного белка в примере 8 обрабатывали таким же образом, что и описанный в примере 4, при 0,1 нМ, 1 нМ, или 10 нМ для BoNT/A или 10 нМ BoNT/E в течение 72 часов. После обработки клетки отмывали трижды, трипсинизировали, ресуспендировали в свежей среде и сортировали. Скрининг клеток показал четкую дозозависимую реакцию на BoNT/A (фиг. 10A). Флуоресцентная микроскопия показала, что в клетках также снижалась зеленая флуоресценция с дозой лечения при сохранении того же уровня красной флуоресценции (фиг. 10B). Хотя результаты ясно показали увеличение чувствительности к BoNT/A, было отмечено, что аналогичного увеличения не наблюдалось для BoNT/E.

Выбирали клетки, чувствительные к BoNT/A при 1000 пМ (1 нМ).

Пример 10 - Направленная эволюция клеток

Были отсортированы клетки NG108 дикого типа (т.е. не трансфицированные репортерными или рецепторными конструкциями) (фиг. 11A). Эти клетки не проявляют ни зеленой, ни красной флуоресценции.

Клетки из Примера 9, которые были чувствительны к BoNT/A при 1000 пМ (1 нМ), размножали и обрабатывали 100 пМ BoNT/A описанным ранее способом или не обрабатывали (контроль). После обработки в течение 48 или 96 часов клетки отмывали трижды, трипсинизировали, ресуспендировали в свежей среде и сортировали. Фиг. 11B-D показывают, соответственно, данные проточной цитометрии для контроля, клеток, обработанных 100 пМ BoNT/A в течение 48 часов, и клеток, обработанных 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

Клетки из Примера 8, которые были дважды отсортированы по высокой экспрессии индикаторной конструкции, но не подвергались сортировке в Примере 9 на чувствительность к BoNT/A при 1000 пМ обрабатывали 100 пМ BoNT/A ранее описанным способом в течение 96 часов или не обрабатывали (контроль). Фиг. 11E-F показывают, соответственно, данные проточной цитометрии для контроля и клеток, обработанных 100 пМ BoNT/A в течение 96 часов.

На фигурах 11A-F приблизительно круглые ворота выделяют клетки, не демонстрирующие ни красной, ни зеленой флуоресценции (т.е. клетки, которые не экспрессируют индикаторный белок), приблизительно овальные ворота выделяют клетки, которые демонстрируют как красную, так и зеленую флуоресценцию (т.е. клетки, которые экспрессируют индикаторный белок, где индикаторный белок не расщеплен), и четырехсторонние ворота выделяют клетки, которые демонстрируют красную флуоресценцию, но сравнительно сниженную зеленую флуоресценцию (т.е. клетки, которые экспрессируют индикаторный белок, где индикаторный белок был расщеплен).

Клетки, ранее отобранные по чувствительности к 1 нМ BoNT/A (фиг. 11D), проявляли значительно большую чувствительность к BoNT/A при 100 пМ (большее расщепление), чем клетки, которые не были отобраны таким образом (фиг. 11F).

Выбирали клетки, которые были чувствительны к BoNT/A при 100 пМ через 96 часов обработки (>2 log более чувствительны, чем NG108 дикого типа).

Пример 11 - Направленная эволюция клеток

Клетки из Примера 10, которые были чувствительны к BoNT/A при 100 пМ в течение 96 часов обработки, размножали и обрабатывали 10 пМ BoNT/A в течение 96 часов описанным ранее способом или не обработывали (контроль). После обработки клетки отмывали трижды, трипсинизировали, ресуспендировали в свежей среде и сортировали.

Фиг. 12A-B показывают, соответственно, данные проточной цитометрии для контроля и клеток, обработанных 10 пМ BoNT/A. Наблюдался заметный сдвиг флуоресценции обработанных клеток, хотя и не такой значительный, как при более высокой концентрации токсина.

Пример 12 - Рецепторная конструкция для BoNT/E

Чтобы придать чувствительность к BoNT/E, клетки NG108 из Примера 2, которые были стабильно трансфицированы индикаторной конструкцией mScarlet-SNAP25-GeNluc, трансфицировали плазмидой, содержащей описанную рецепторную конструкцию GD3-SV2A-Syt (SEQ ID NO: 5), с использованием процедуры трансфекции в примере 2. Эту плазмиду конструировали путем модификации плазмиды, содержащей рецепторную конструкцию GD2-SV2C-Syt, с использованием набора HiFi (New England Biolabs), олигонуклеотиды от IDT и последовательности SV2A, синтезированные GeneArt.

Эти клетки и клетки из Примера 7, которые экспрессируют рецепторную конструкцию GD3-SV2C-Syt, культивировали в среде, содержащей или BoNT/A при концентрации 0 (контроль), 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ,0,001 нМ, или BoNT/E при концентрации 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, или 0 нМ (контроль). Клетки обрабатывали в течение 16, 40, 64 или 88 часов. После обработки клетки лизировали и проводили анти-SNAP-25 Вестерн-блоттинг, используя антитело к SNAP-25. Данные денситометрии блоттинга отображали как процент расщепления SNAP-25 (фиг. 13). Было отмечено заметное увеличение чувствительности клеток, экспрессирующих SV2A, к BoNT/A и BoNT/E по сравнению с клетками, экспрессирующими SV2C, что подтверждает необходимость SV2A для передачи чувствительности к BoNT/E.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий N-концевую метку mScarlet, SNAP-25, C-концевую метку NeonGreen, и C-концевую люциферазу.

SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий N-концевую метку mScarlet, SNAP-25, C-концевую метку CFP, и C-концевую люциферазу.

SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий N-концевой CFP и легкую цепь BoNT/A.

SEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий домены с аминокислотными последовательностями для GD3-синтазы, SV2C, синтаксина, и аминогликозид 3′-фосфотрансферазы. В слитом белке, каждый домен отделен друг от друга саморасщепляющимся пептидом 2A.

SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, содержащий домены с аминокислотными последовательностями для GD3-синтазы, SV2А, синтаксина, и аминогликозид 3′-фосфотрансферазы. В слитом белке, каждый домен отделен друг от друга саморасщепляющимся пептидом 2A.

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность для GD3-синтазы.

SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность для саморасщепляющегося пептида 2A, кодируемого SEQ ID NO: 4 и 5.

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность для SV2A.

SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность для SV2B.

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность для SV2C.

SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность для четвертого люминального домена SV2A.

SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность для четвертого люминального домена SV2B.

SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность для четвертого люминального домена SV2C.

SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность для синаптотагмина I.

SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность для синаптотагмина II.

SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность для MScarlet.

SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность для NeonGreen.

SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность для CFP.

SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность для SNAP-25.

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность для аминогликозид 3′-фосфотрансферазы (Neo).

SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность для пуромицин-N-ацетилтрансферазы (PuroR).

SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность для люциферазы.

SEQ ID NO: 1

ATGGTGTCGAAGGGGGAAGCGGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTTAAAGTGCATATGGAGGGATCTATGAACGGACACGAGTTTGAGATCGAAGGGGAAGGAGAGGGGCGCCCATACGAAGGCACCCAGACTGCCAAGCTGAAAGTCACAAAGGGTGGACCCTTGCCCTTCTCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAATTCATGTACGGGTCCCGGGCCTTCACCAAGCACCCTGCTGACATTCCGGATTACTATAAGCAGAGCTTCCCGGAAGGCTTCAAATGGGAGCGAGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGCGCCGTGACCGTGACTCAGGACACTTCACTGGAAGATGGCACTCTGATCTACAAGGTCAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCACCGGACGGACCGGTCATGCAGAAAAAGACCATGGGATGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCGAAGATGGAGTCCTCAAGGGGGACATCAAGATGGCCCTGCGGCTCAAGGATGGTGGAAGATACCTGGCTGACTTCAAGACCACGTACAAGGCCAAGAAGCCAGTCCAGATGCCCGGCGCGTACAATGTGGATCGCAAGCTGGACATCACTTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAACGGTCCGAGGGTCGGCACTCCACTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAAATGGCCGAGGATGCAGACATGAGAAACGAACTGGAAGAAATGCAGCGGAGAGCAGACCAGCTCGCGGACGAATCACTGGAATCGACCCGCCGGATGCTTCAACTGGTCGAGGAATCAAAGGACGCGGGTATCCGGACCCTTGTGATGCTGGACGAACAGGGAGAGCAGCTGGAGAGGATCGAAGAGGGAATGGACCAGATTAACAAGGACATGAAGGAAGCGGAAAAGAACCTCACCGACCTTGGAAAGTTCTGCGGGTTGTGCGTGTGTCCGTGCAACAAGCTGAAGTCCTCCGACGCCTACAAGAAGGCCTGGGGAAACAACCAGGACGGTGTCGTGGCTTCCCAACCCGCACGGGTGGTGGATGAGCGGGAACAGATGGCGATTTCCGGAGGCTTCATTAGACGCGTGACCAACGACGCCCGCGAAAACGAGATGGACGAAAACCTGGAACAAGTGTCGGGAATCATCGGAAACTTGAGACACATGGCCCTCGACATGGGCAACGAAATTGATACACAGAACCGGCAGATTGACCGGATCATGGAAAAGGCAGACTCAAACAAGACTCGGATTGACGAAGCGAACCAGAGGGCCACTAAGATGTTGGGTTCCGGGATGGTGTCAAAGGGAGAAGAAGACAACATGGCATCACTGCCCGCCACCCACGAGCTGCACATCTTCGGTTCCATCAACGGGGTCGACTTCGACATGGTCGGCCAGGGAACTGGAAACCCGAATGACGGTTATGA AGAACTGAACCTTAAATCAACCAAGGGGGACCTTCAGTTCTCGCCCTGGATTTTGGTCCCTCACATTGGATACGGATTCCATCAGTATCTGCCGTACCCCGACGGAATGAGCCCGTTCCAGGCTGCCATGGTGGACGGATCGGGATACCAGGTCCACCGCACCATGCAGTTTGAAGATGGCGCAAGCCTGACCGTGAACTACCGGTATACCTACGAGGGCTCACACATCAAGGGGGAAGCCCAAGTCAAGGGTACCGGCTTCCCGGCCGACGGACCAGTGATGACCAACTCCTTGACCGCCGCCGACTGGTGCCGCAGCAAGAAAACTTACCCCAACGATAAGACAATCATCTCCACTTTCAAGTGGTCCTACACCACGGGCAACGGCAAACGCTACCGAAGCACTGCACGGACCACCTACACTTTCGCGAAGCCTATGGCCGCCAACTACCTGAAGAACCAGCCGATGTACGTGTTCAGAAAGACGGAACTCAAGCACTCCAAAACCGAACTGAACTTTAAGGAGTGGCAGAAGGCTTTCACTGGATTCGAGGACTTTGTCGGCGACTGGCGCCAGACTGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTGCTCGAACAGGGGGGTGTCTCCAGCCTCTTCCAAAATCTGGGCGTGTCCGTGACCCCGATCCAGCGGATCGTGCTCAGCGGGGAAAACGGCCTGAAGATCGATATCCACGTCATCATCCCGTACGAGGGACTGAGCGGCGACCAGATGGGTCAGATCGAAAAGATTTTCAAGGTGGTCTATCCCGTGGATGACCACCACTTCAAAGTGATCCTGCATTACGGGACCCTCGTGATCGACGGCGTCACCCCGAACATGATTGATTACTTCGGACGGCCTTATGAAGGGATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACCGTGACTGGCACCCTGTGGAACGGAAATAAGATCATTGACGAGCGGCTGATCAACCCAGACGGGTCGCTGCTGTTCCGCGTGACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAGCGCATCCTCGCCTGATAG

SEP ID NO: 2

ATGGTGTCGAAGGGGGAAGCGGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTTAAAGTGCATATGGAGGGATCTATGAACGGACACGAGTTTGAGATCGAAGGGGAAGGAGAGGGGCGCCCATACGAAGGCACCCAGACTGCCAAGCTGAAAGTCACAAAGGGTGGACCCTTGCCCTTCTCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAATTCATGTACGGGTCCCGGGCCTTCACCAAGCACCCTGCTGACATTCCGGATTACTATAAGCAGAGCTTCCCGGAAGGCTTCAAATGGGAGCGAGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGCGCCGTGACCGTGACTCAGGACACTTCACTGGAAGATGGCACTCTGATCTACAAGGTCAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCACCGGACGGACCGGTCATGCAGAAAAAGACCATGGGATGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCGAAGATGGAGTCCTCAAGGGGGACATCAAGATGGCCCTGCGGCTCAAGGATGGTGGAAGATACCTGGCTGACTTCAAGACCACGTACAAGGCCAAGAAGCCAGTCCAGATGCCCGGCGCGTACAATGTGGATCGCAAGCTGGACATCACTTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAACGGTCCGAGGGTCGGCACTCCACTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAAATGGCCGAGGATGCAGACATGAGAAACGAACTGGAAGAAATGCAGCGGAGAGCAGACCAGCTCGCGGACGAATCACTGGAATCGACCCGCCGGATGCTTCAACTGGTCGAGGAATCAAAGGACGCGGGTATCCGGACCCTTGTGATGCTGGACGAACAGGGAGAGCAGCTGGAGAGGATCGAAGAGGGAATGGACCAGATTAACAAGGACATGAAGGAAGCGGAAAAGAACCTCACCGACCTTGGAAAGTTCTGCGGGTTGTGCGTGTGTCCGTGCAACAAGCTGAAGTCCTCCGACGCCTACAAGAAGGCCTGGGGAAACAACCAGGACGGTGTCGTGGCTTCCCAACCCGCACGGGTGGTGGATGAGCGGGAACAGATGGCGATTTCCGGAGGCTTCATTAGACGCGTGACCAACGACGCCCGCGAAAACGAGATGGACGAAAACCTGGAACAAGTGTCGGGAATCATCGGAAACTTGAGACACATGGCCCTCGACATGGGCAACGAAATTGATACACAGAACCGGCAGATTGACCGGATCATGGAAAAGGCAGACTCAAACAAGACTCGGATTGACGAAGCGAACCAGAGGGCCACTAAGATGTTGGGTTCCGGGATGGTGTCAAAGGGAGAAGAACTGTTCACTGGAGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTCTCAGTCAGCGGAGAGGGAGAGGGCGATGCGACTTACGGAAAGCTGACTTTGAAGTTTATCTGCACTACCGGAAAGCTGCCTGTGCCATGGCCTACCCTCGTGACCACCCTGTCCTGGGGCGTCCAATGTTTCGCACGCTACCCTGACCATATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAACGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAAACCAGGGCTGAAGTGAAGTTCGAGGGAGACACCCTGGTCAATCGGATTGAATTGAAGGGAATCGATTTCAAGGAAGATGGAAACATCCTGGGACATAAGCTTGAGTACAACTACTTCTCCGACAACGTGTACATCACGGCCGATAAGCAGAAGAACGGAATCAAAGCTAACTTCAAGATTCGGCACAACATTGAGGACGGCGGCGTCCAGCTGGCGGACCATTATCAGCAGAATACCCCTATTGGGGATGGACCGGTGCTGCTCCCGGACAACCATTACCTGTCCACCCAATCTAAGCTGAGCAAGGACCCAAACGAGAAGCGCGATCACATGGTGCTGCTCGAGTTCGTGACTGCCGCCGGGCTTCACACACTTGAGGACTTTGTCGGCGACTGGCGCCAGACTGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTGCTCGAACAGGGGGGTGTCTCCAGCCTCTTCCAAAATCTGGGCGTGTCCGTGACCCCGATCCAGCGGATCGTGCTCAGCGGGGAAAACGGCCTGAAGATCGATATCCACGTCATCATCCCGTACGAGGGACTGAGCGGCGACCAGATGGGTCAGATCGAAAAGATTTTCAAGGTGGTCTATCCCGTGGATGACCACCACTTCAAAGTGATCCTGCATTACGGGACCCTCGTGATCGACGGCGTCACCCCGAACATGATTGATTACTTCGGACGGCCTTATGAAGGGATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACCGTGACTGGCACCCTGTGGAACGGAAATAAGATCATTGACGAGCGGCTGATCAACCCAGACGGGTCGCTGCTGTTCCGCGTGACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAGCGCATCCTCGCCTGATAG

SEP ID NO: 3

ATGACCATGGATGAGCAGCAATCGCAGGCTGTAGCCCCGGTATATGTCGGTGGTATGGATGAGAAAACGACTGGGTGGCGGGGTGGACACGTCGTCGAGGGCCTGGCAGGCGAACTTGAACAACTGCGGGCTCGCTTGGAGCACCACCCGCAAGGACAGCGCGAGCCGTCCATGGTGTCAAAGGGGGAGGAACTGTTT ACTGGGGTCGTCCCTATCTTGGTGGAACTCGACGGGGATGTGAACGGACACAAGTTTTCGGTATCCGGGGAAGGCGAGGGGGATGCCACgTATGGAAAGCTCACACTTAAGTTCATCTGCACGACAGGGAAGCTCCCAGTGCCTTGGCCCACGTTGGTGACTACGCTCACATGGGGTGTCCAGTGCTTCGCACGGTATCCCGACCAcATGAAGCAGCATGATTTCTTTAAGTCAGCCATGCCGGAGGGATATGTACAAGAAAGGACCATCTTCTTCAAAGATGACGGTAACTACAAGACCAGAGCCGAGGTAAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTGAACAGGATTGAGCTGAAGGGAATTGATTTCAAAGAGGATGGGAACATCCTTGGTCACAAATTGGAGTACAATGCCATTTCGGATAACGTGTACATTACAGCGGATAAGCAGAAGAATGGGATCAAAGCGAATTTCAAAATCAGGCATAACATCGAGGACGGGTCGGTGCAGCTCGCCGACCATTACCAGCAGAATACGCCCATCGGAGATGGACCCGTACTTCTGCCCGACAATCATTATCTGTCAACGCAATCAGCGCTTAGCAAAGATCCCAATGAGAAAAGGGACCACATGGTGCTCCTCGAATTtGTGACGGCAGCGGGAATTACCCTCGGGATGGACGAACTGTACAAAAGCGGGTTGAGACTCGAGCGCTGAACTCGAGATGCCTTTTGTCAACAAGCAGTTTAACTATAAGGATCCCGTGAATGGTGTGGACATTGCCTACATCAAGATTCCAAACGCTGGACAAATGCAGCCCGTCAAGGCTTTCAAAATTCACAACAAGATCTGGGTGATCCCGGAGAGGGACACCTTTACCAATCCAGAAGAGGGCGACCTTAACCCTCCGCCAGAGGCCAAACAGGTGCCCGTGAGCTATTACGACTCAACTTATCTCTCCACCGACAACGAAAAGGACAATTACCTCAAGGGAGTCACCAAGCTGTTCGAACGGATCTACTCTACCGATCTCGGCAGGATGCTCCTGACTTCTATCGTGCGGGGCATCCCCTTCTGGGGTGGGAGCACCATTGACACCGAACTGAAGGTGATTGATACCAATTGCATCAACGTCATCCAGCCAGACGGTTCCTACCGGTCTGAGGAGCTCAATCTTGTGATTATTGGCCCGTCAGCTGATATCATCCAGTTCGAATGCAAGTCTTTCGGACACGACGTGCTTAATCTCACCCGCAATGGTTACGGAAGCACCCAGTACATCAGATTCTCTCCGGACTTTACTTTCGGATTTGAAGAGTCACTGGAAGTCGACACCAATCCTCTGCTCGGAGCCGGAAAGTTCGCCACCGACCCTGCAGTGACCCTTGCTCACGAGCTGATTCATGCAGAGCATCGCCTGTACGGGATCGCCATCAATCCTAACCGCGTGTTTAAGGTCAATACCAACGCTTACTATGAAATGAGCGGACTGGAGGTGTCCTTCGAGGAACTGCGCACCTTCGGAGGTCATGACGCTAAGTTCATCGACTCACTGCAAGAGAATGAGTTCCGGCTGTACTATTACAACAAGTTTAAGGATGTCGCCTCAACTCTGAACAAGGCCAAAAGCATCATCGGCACCACCGCCAGCCTGCAATACATGAAAAACGTGTTCAAGGAAAAGTACCTTCTTAGCGAAGATACTTCCGGGAAGTTTTCAGTCGACAAACTGAAGTTCGACAAGCTGTACAAGATGCTCACCGAAATCTACACCGAGGACAATTTTGTGAACTTCTTCAAAGTGATTAACAGAAAGACCTATCTGAACTTCGACAAAGCCGTGTTCCGGATTAACATTGTGCCCGATGAGAACTACACTATCAAGGACGGGTTCAACCTTAAGGGTGCAAATCTTTCAACTAATTTCAACGGACAGAATACTGAGATCAATTCAAGGAACTTCACTAGACTCAAGAATTTCACTGGGCTTTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGTGTCCGCGGAATTATCCCCTTCAAGTGAAGCTTCGTCAATGA

SEP ID NO: 4

ATGTCCCCATGTGGACGAGCGCGCAGACAGACCTCAAGAGGAGCGATGGCCGTGCTGGCCTGGAAGTTCCCGAGGACTCGCCTGCCCATGGGAGCCTCTGCTCTGTGTGTGGTCGTGCTGTGTTGGCTGTACATCTTCCCGGTGTACCGGCTGCCTAACGAAAAGGAAATTGTGCAGGGCGTGCTCCAGCAGGGGACCGCTTGGCGGCGCAACCAGACCGCTGCGAGGGCTTTTCGGAAGCAGATGGAAGATTGTTGCGACCCCGCCCATCTTTTCGCGATGACCAAGATGAACAGCCCGATGGGAAAGTCCATGTGGTACGACGGAGAGTTCCTGTATTCCTTCACCATTGACAACAGCACTTACTCACTGTTCCCGCAAGCCACCCCCTTCCAACTGCCGCTTAAGAAGTGCGCCGTCGTGGGGAACGGCGGCATCCTCAAGAAGTCCGGATGCGGGCGCCAGATTGATGAAGCCAACTTCGTGATGCGGTGCAATCTCCCGCCACTCTCGTCCGAGTACACCAAGGACGTGGGGTCAAAGTCGCAGCTCGTCACCGCCAACCCTTCGATCATCAGACAACGGTTCCAGAACCTTCTGTGGAGCCGGAAAACATTTGTGGATAACATGAAGATCTACAACCATTCCTACATCTATATGCCTGCCTTCTCCATGAAAACTGGAACCGAACCCTCCCTGAGAGTGTACTACACCCTGTCCGACGTGGGCGCAAACCAGACCGTCCTTTTCGCCAACCCCAACTTCCTGCGCTCCATCGGAAAGTTCTGGAAGTCCAGAGGCATTCACGCGAAACGCTTGTCCACTGGATTGTTCTTGGTGTCCGCCGCTCTGGGCCTGTGCGAGGAAGTGGCCATATACGGATTCTGGCCTTTCTCCGTCAACATGCACGAGCAGCCCATCTCCCACCATTATTACGACAATGTCCTGCCTTTCTCGGGATTTCACGCGATGCCCGAGGAGTTCTTGCAACTGTGGTACCTTCACAAGATCGGTGCCCTGCGGATGCAGCTGGACCCTTGCGAGGACACCTCGCTGCAACCCACCTCGGAGCAGAAACTCATTTCCGAAGAGGATCTGAACGGGGAGCAGAAGCTCATCTCCGAGGAGGACCTGAACGGAGAACAGAAGCTGATTAGCGAAGAGGACCTGGGCAGCGGTGCCACCAATTTTTCTCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCGGGTCCCATGGAGGACTCCTACAAAGATCGGACTTCTCTGATGAAGGGAGCCAAGGACATCGCCAGGGAAGTGAAGAAGCAAACCGTCAAGAAGGTCAACCAGGCCGTGGACAGAGCCCAGGACGAGTACACCCAGCGGTCGTACTCGCGGTTCCAGGATGAAGAGGATGACGACGACTACTACCCTGCCGGCGAAACCTATAATGGGGAAGCCAACGATGACGAAGGCTCCAGCGAAGCCACTGAAGGACACGACGAGGACGACGAAATCTACGAAGGAGAATACCAGGGCATCCCTTCGATGAATCAGGCCAAAGATTCAATTGTGTCAGTGGGACAGCCTAAGGGCGACGAGTACAAGGACCGGAGAGAGCTCGAAAGCGAGCGGAGGGCCGACGAAGAGGAACTGGCACAACAGTACGAGCTGATCATCCAGGAGTGTGGGCACGGCCGGTTCCAGTGGGCGCTGTTCTTCGTGCTCGGAATGGCACTGATGGCCGACGGCGTGGAAGTGTTCGTGGTCGGATTCGTGCTGCCCTCGGCCGAAACCGACCTCTGCATTCCCAACTCCGGCTCGGGATGGCTGGGGTCCATCGTGTACCTGGGAATGATGGTCGGCGCCTTCTTCTGGGGTGGCCTGGCAGACAAGGTCGGCCGGAAGCAGTCCCTCTTGATCTGCATGAGCGTCAACGGATTTTTCGCCTTCCTGTCATCATTCGTGCAAGGTTACGGGTTCTTCCTTTTCTGCCGCCTGCTGTCCGGCTTTGGGATCGGCGGGGCTATTCCGACTGTGTTCTCCTACTTTGCCGAAGTGCTGGCTCGCGAAAAACGGGGCGAACACCTTTCCTGGCTGTGTATGTTCTGGATGATCGGCGGCATCTACGCCTCGGCCATGGCCTGGGCTATTATCCCGCATTATGGGTGGTCCTTCTCAATGGGAAGCGCATACCAGTTCCATTCGTGGCGGGTGTTCGTGATCGTGTGCGCCCTCCCGTGTGTGTCCTCCGTGGTGGCTCTGACATTCATGCCGGAGTCACCTCGGTTCTTGTTGGAAGTCGGGAAGCACGACGAAGCCTGGATGATTCTGAAGCTGATCCACGACACTAATATGCGGGCCCGGGGACAGCCTGAGAAAGTGTTCACCGTCAACAAGATTAAGACCCCGAAGCAAATCGATGAACTGATTGAAATTGAGTCCGACACCGGAACTTGGTACCGCCGGTGCTTCGTGCGGATTCGCACCGAGCTGTACGGAATCTGGCTCACCTTCATGCGCTGCTTCAACTACCCCGTGCGCGACAACACCATCAAGCTGACCATCGTGTGGTTCACTCTGTCTTTCGGCTACTATGGGCTGTCAGTGTGGTTCCCGGATGTCATCAAGCCGCTCCAATCCGATGAATACGCCCTGCTGACCCGCAATGTGGAGAGAGACAAATACGCCAACTTCACCATCAATTTCACCATGGAAAACCAGATTCACACCGGAATGGAGTACGACAATGGACGATTCATCGGAGTGAAGTTCAAGAGCGTGACCTTCAAGGACTCGGTGTTCAAGTCCTGTACCTTCGAGGACGTGACCAGCGTGAACACTTATTTTAAGAATTGCACCTTCATCGATACTGTGTTCGATAACACCGACTTCGAGCCCTATAAGTTCATTGACTCGGAGTTCAAGAACTGTTCATTCTTCCACAACAAGACTGGTTGCCAGATCACCTTCGATGACGACTACAGCGCCTACTGGATCTACTTTGTGAACTTTTTGGGAACTCTCGCAGTGCTTCCTGGCAACATTGTGTCC GCACTCCTGATGGATCGGATTGGCAGGCTCACGATGCTTGGGGGGTCCATGGTCCTCTCCGGGATCTCGTGCTTCTTCCTGTGGTTCGGCACCTCGGAGTCCATGATGATCGGAATGTTGTGCCTGTACAACGGTCTGACCATCAGCGCCTGGAACAGCCTCGACGTGGTCACCGTCGAGCTGTATCCTACCGACCGGCGCGCGACAGGCTTCGGATTCCTGAACGCACTGTGCAAGGCAGCCGCGGTCCTGGGAAATCTGATCTTTGGTTCGCTGGTGTCCATCACTAAGAGCATCCCTATTCTGCTCGCCTCCACGGTGCTCGTGTGTGGTGGCCTGGTCGGGCTGTGCCTGCCCGACACTCGCACCCAAGTGCTCATGGACTACAAGGATGACGATGATAAGGGAGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGGGATTACAAGGACGACGATGACAAAGGAAGCGGCGCCACTAACTTTTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCCGGGCCAATGCGCAACATTTTCAAGCGGAATCAGGAGCCTATCGTGGCCCCGGCCACCACTACCGCCACTATGCCTATTGGACCTGTCGACAACTCCACGGAATCAGGCGGCGCCGGCGAATCCCAAGAGGACATGTTCGCCAAGCTGAAGGAGAAACTGTTCAACGAAATCAACAAGATTCCCCTCCCGCCGTGGGCCCTGATCGCTATCGCTGTCGTCGCCGGACTGCTGCTGCTTACTTGCTGCTTCTGCATTTGCAAGAAGTGTTGTTGCAAGAAAAAGAAAAACAAGAAGGAAAAGGGGAAGGGAATGAAGAACGCCATGAATATGAAGGACATGAAGGGCGGACAGGATGATGATGATGCTGAAACTGGGCTGACTGAGGGCGAAGGAGAGGGCGAAGAGGAGAAGGAACCTGAGAACCTGGGAAAGCTCCAATTCTCCCTGGATTACGACTTCCAAGCCAACCAGCTGACTGTGGGAGTGTTGCAAGCCGCCGAGCTGCCAGCCCTGGACATGGGCGGCACCTCCGACCCCTATGTGAAGGTGTTCTTGCTGCCTGACAAGAAGAAGAAGTACGAAACCAAGGTGCACCGCAAGACCCTGAACCCCGCTTTCAACGAAACCTTCACTTTCAAAGTGCCCTACCAAGAGCTCGGGGGAAAGACTCTCGTGATGGCGATCTACGACTTCGACCGGTTCAGCAAGCACGATATCATCGGGGAGGTCAAGGTCCCGATGAACACCGTGGACCTTGGCCAACCGATTGAAGAATGGCGCGATCTCCAGGGTGGCGAAAAGGAGGAGCCCGAGAAACTGGGTGACATCTGTACATCACTGCGCTACGTGCCGACCGCCGGGAAGCTCACTGTCTGCATCCTGGAGGCCAAGAACCTGAAGAAAATGGACGTGGGCGGGCTCTCCGACCCTTACGTGAAGATCCACCTGATGCAGAACGGAAAGCGGCTGAAGAAGAAGAAAACCACTGTGAAGAAAAAGACTCTGAACCCCTACTTCAACGAGTCGTTCTCCTTCGAAATCCCGTTTGAGCAAATCCAGAAGGTCCAAGTGGTCGTGACTGTGCTTGACTACGACAAGCTCGGAAAGAACGAGGCCATTGGCAAAATCTTCGTGGGATCGAACGCAACTGGCACCGAGCTGAGACACTGGTCTGACATGCTCGCCAACCCAAGGCGGCCGATTGCTCAGTGGCACTCCTTGAAACCTGAGGAAGAAGTGGATGCCCTTCTTGGAAAGAACAAGATGTACCCCTACGACGTCCCTGATTACGCGGGATACCCGTACGATGTGCCTGACTATGCCGGCTACCCGTACGATGTGCCAGACTACGCTGGCTCCGGAGCCACGAACTTTTCGCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCTGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACATGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAGGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAGGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTT GACGAGTTCTTCTGATAG

SEP ID NO: 5

ATGTCCCCATGTGGACGAGCGCGCAGACAGACCTCAAGAGGAGCGATGGCCGTGCTGGCCTGGAAGTTCCCGAGGACTCGCCTGCCCATGGGAGCCTCTGCTCTGTGTGTGGTCGTGCTGTGTTGGCTGTACATCTTCCCGGTGTACCGGCTGCCTAACGAAAAGGAAATTGTGCAGGGCGTGCTCCAGCAGGGGACCGCTTGGCGGCGCAACCAGACCGCTGCGAGGGCTTTTCGGAAGCAGATGGAAGATTGTTGCGACCCCGCCCATCTTTTCGCGATGACCAAGATGAACAGCCCGATGGGAAAGTCCATGTGGTACGACGGAGAGTTCCTGTATTCCTTCACCATTGACAACAGCACTTACTCACTGTTCCCGCAAGCCACCCCCTTCCAACTGCCGCTTAAGAAGTGCGCCGTCGTGGGGAACGGCGGCATCCTCAAGAAGTCCGGATGCGGGCGCCAGATTGATGAAGCCAACTTCGTGATGCGGTGCAATCTCCCGCCACTCTCGTCCGAGTACACCAAGGACGTGGGGTCAAAGTCGCAGCTCGTCACCGCCAACCCTTCGATCATCAGACAACGGTTCCAGAACCTTCTGTGGAGCCGGAAAACATTTGTGGATAACATGAAGATCTACAACCATTCCTACATCTATATGCCTGCCTTCTCCATGAAAACTGGAACCGAACCCTCCCTGAGAGTGTACTACACCCTGTCCGACGTGGGCGCAAACCAGACCGTCCTTTTCGCCAACCCCAACTTCCTGCGCTCCATCGGAAAGTTCTGGAAGTCCAGAGGCATTCACGCGAAACGCTTGTCCACTGGATTGTTCTTGGTGTCCGCCGCTCTGGGCCTGTGCGAGGAAGTGGCCATATACGGATTCTGGCCTTTCTCCGTCAACATGCACGAGCAGCCCATCTCCCACCATTATTACGACAATGTCCTGCCTTTCTCGGGATTTCACGCGATGCCCGAGGAGTTCTTGCAACTGTGGTACCTTCACAAGATCGGTGCCCTGCGGATGCAGCTGGACCCTTGCGAGGACACCTCGCTGCAACCCACCTCGGAGCAGAAACTCATTTCCGAAGAGGATCTGAACGGGGAGCAGAAGCTCATCTCCGAGGAGGACCTGAACGGAGAACAGAAGCTGATTAGCGAAGAGGACCTGGGCAGCGGTGCCACCAATTTTTCTCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCGGGTCCCATGGAGGACTCCTACAAAGATCGGACTTCTCTGATGAAGGGAGCCAAGGACATCGCCAGGGAAGTGAAGAAGCAAACCGTCAAGAAGGTCAACCAGGCCGTGGACAGAGCCCAGGACGAGTACACCCAGCGGTCGTACTCGCGGTTCCAGGATGAAGAGGATGACGACGACTACTACCCTGCCGGCGAAACCTATAATGGGGAAGCCAACGATGACGAAGGCTCCAGCGAAGCCACTGAAGGACACGACGAGGACGACGAAATCTACGAAGGAGAATACCAGGGCATCCCTTCGATGAATCAGGCCAAAGATTCAATTGTGTCAGTGGGACAGCCTAAGGGCGACGAGTACAAGGACCGGAGAGAGCTCGAAAGCGAGCGGAGGGCCGACGAAGAGGAACTGGCACAACAGTACGAGCTGATCATCCAGGAGTGTGGGCACGGCCGGTTCCAGTGGGCGCTGTTCTTCGTGCTCGGAATGGCACTGATGGCCGACGGCGTGGAAGTGTTCGTGGTCGGATTCGTGCTGCCCTCGGCCGAAACCGACCTCTGCATTCCCAACTCCGGCTCGGGATGGCTGGGGTCCATCGTGTACCTGGGAATGATGGTCGGCGCCTTCTTCTGGGGTGGCCTGGCAGACAAGGTCGGCCGGAAGCAGTCCCTCTTGATCTGCATGAGCGTCAACGGATTTTTCGCCTTCCTGTCATCATTCGTGCAAGGTTACGGGTTCTTCCTTTTCTGCCGCCTGCTGTCCGGCTTTGGGATCGGCGGGGCTATTCCGACTGTGTTCTCCTACTTTGCCGAAGTGCTGGCTCGCGAAAAACGGGGCGAACACCTTTCCTGGCTGTGTATGTTCTGGATGATCGGCGGCATCTACGCCTCGGCCATGGCCTGGGCTATTATCCCGCATTATGGGTGGTCCTTCTCAATGGGAAGCGCATACCAGTTCCATTCGTGGCGGGTGTTCGTGATCGTGTGCGCCCTCCCGTGTGTGTCCTCCGTGGTGGCTCTGACATTCATGCCGGAGTCACCTCGGTTCTTGTTGGAAGTCGGGAAGCACGACGAAGCCTGGATGATTCTGAAGCTGATCCACGACACTAATATGCGGGCCCGGGGACAGCCTGAGAAAGTGTTCACCGTCAACAAGATTAAGACCCCGAAGCAAATCGATGAACTGATTGAAATTGAGTCCGACACCGGAACTTGGTACCGCCGGTGCTTCGTGCGGATTCGCACCGAGCTGTACGGAATCTGGCTCACCTTCATGCGCTGCTTCAACTACCCCGTGCGCGACAACACCATCAAGCTGACCATCGTGTGGTTCACTCTGTCTTTCGGCTACTATGGGCTGTCAGTGTGGTTCCCGGATGTCATCAAGCCGCTCCAATCCGATGAATACGCCCTGCTGACCCGCAATGTGGAGAGAGACAAATACGCCAACTTCACCATCAATTTCACCATGGAAAACCAGATTCACACCGGAATGGAGTACGACAATGGACGATTCATCGGAGTGAAGTTCAAGAGCGTGACCTTCAAGGACTCGGTGTTCAAGTCCTGTACCTTCGAGGACGTGACCAGCGTGAACACTTATTTTAAGAATTGCACCTTCATCGATACTGTGTTCGATAACACCGACTTCGAGCCCTATAAGTTCATTGACTCGGAGTTCAAGAACTGTTCATTCTTCCACAACAAGACTGGTTGCCAGATCACCTTCGATGACGACTACAGCGCCTACTGGATCTACTTTGTGAACTTTTTGGGAACTCTCGCAGTGCTTCCTGGCAACATTGTGTCCGCACTCCTGATGGATCGGATTGGCAGGCTCACGATGCTTGGGGGGTCCATGGTCCTCTCCGGGATCTCGTGCTTCTTCCTGTGGTTCGGCACCTCGGAGTCCATGATGATCGGAATGTTGTGCCTGTACAACGGTCTGACCATCAGCGCCTGGAACAGCCTCGACGTGGTCACCGTCGAGCTGTATCCTACCGACCGGCGCGCGACAGGCTTCGGATTCCTGAACGCACTGTGCAAGGCAGCCGCGGTCCTGGGAAATCTGATCTTTGGTTCGCTGGTGTCCATCACTAAGAGCATCCCTATTCTGCTCGCCTCCACGGTGCTCGTGTGTGGTGGCCTGGTCGGGCTGTGCCTGCCCGACACTCGCACCCAAGTGCTCATGGACTACAAGGATGACGATGATAAGGGAGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGGGATTACAAGGACGACGATGACAAAGGAAGCGGCGCCACTAACTTTTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCCGGGCCAATGCGCAACATTTTCAAGCGGAATCAGGAGCCTATCGTGGCCCCGGCCACCACTACCGCCACTATGCCTATTGGACCTGTCGACAACTCCACGGAATCAGGCGGCGCCGGCGAATCCCAAGAGGACATGTTCGCCAAGCTGAAGGAGAAACTGTTCAACGAAATCAACAAGATTCCCCTCCCGCCGTGGGCCCTGATCGCTATCGCTGTCGTCGCCGGACTGCTGCTGCTTACTTGCTGCTTCTGCATTTGCAAGAAGTGTTGTTGCAAGAAAAAGAAAAACAAGAAGGAAAAGGGGAAGGGAATGAAGAACGCCATGAATATGAAGGACATGAAGGGCGGACAGGATGATGATGATGCTGAAACTGGGCTGACTGAGGGCGAAGGAGAGGGCGAAGAGGAGAAGGAACCTGAGAACCTGGGAAAGCTCCAATTCTCCCTGGATTACGACTTCCAAGCCAACCAGCTGACTGTGGGAGTGTTGCAAGCCGCCGAGCTGCCAGCCCTGGACATGGGCGGCACCTCCGACCCCTATGTGAAGGTGTTCTTGCTGCCTGACAAGAAGAAGAAGTACGAAACCAAGGTGCACCGCAAGACCCTGAACCCCGCTTTCAACGAAACCTTCACTTTCAAAGTGCCCTACCAAGAGCTCGGGGGAAAGACTCTCGTGATGGCGATCTACGACTTCGACCGGTTCAGCAAGCACGATATCATCGGGGAGGTCAAGGTCCCGATGAACACCGTGGACCTTGGCCAACCGATTGAAGAATGGCGCGATCTCCAGGGTGGCGAAAAGGAGGAGCCCGAGAAACTGGGTGACATCTGTACATCACTGCGCTACGTGCCGACCGCCGGGAAGCTCACTGTCTGCATCCTGGAGGCCAAGAACCTGAAGAAAATGGACGTGGGCGGGCTCTCCGACCCTTACGTGAAGATCCACCTGATGCAGAACGGAAAGCGGCTGAAGAAGAAGAAAACCACTGTGAAGAAAAAGACTCTGAACCCCTACTTCAACGAGTCGTTCTCCTTCGAAATCCCGTTTGAGCAAATCCAGAAGGTCCAAGTGGTCGTGACTGTGCTTGACTACGACAAGCTCGGAAAGAACGAGGCCATTGGCAAAATCTTCGTGGGATCGAACGCAACTGGCACCGAGCTGAGACACTGGTCTGACATGCTCGCCAACCCAAGGCGGCCGATTGCTCAGTGGCACTCCTTGAAACCTGAGGAAGAAGTGGATGCCCTTCTTGGAAAGAACAAGATGTACCCCTACGACGTCCCTGATTACGCGGGATACCCGTACGATGTGCCTGACTATGCCGGCTACCCGTACGATGTGCCAGACTACGCTGGCTCCGGAGCCACGAACTTTTCGCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCTGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACATGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAGGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAGGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTT GACGAGTTCTTCTGATAG

SEQ ID NO: 6

MSPCGRARRQTSRGAMAVLAWKFPRTRLPMGASALCVWLCWLYIFPVYRLPNEKEIVQGVLQQGTAWRRNQTAARAFRKQMEDCCDPAHLFAMTKMNSPMGKSMWYDGEFLYSFTIDNSTYSLFPQATPFQLPLKKCAWGNGGILKKSGCGRQIDEANFVMRCNLPPLSSEYTKDVGSKSQLVTANPSIIRQRFQNLLWSRKTFVDNMKIYNHSYIYMPAFSMKTGTEPSLRVYYTLSDVGANQTVLFANPNFLRSIGKFWKSRGIHAKRLSTGLFLVSAALGLCEEVAIYGFWPFSVNMHEQPISHHYYDNVLPFSGFHAMPEEFLQLWYLHKIGALRMQLDPCEDTSLQPTS

SEP ID NO: 7

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

SEP ID NP: 8

MEEGFRDRAAFIRGAKDIAKEVKKHAAKKWKGLDRVQDEYSRRSYSRFEEEDDDDDFPAPSDGYYRGEGTQDEEEGGASSDATEGHDEDDEIYEGEYQGIPRAESGGKGERMADGAPLAGVRGGLSDGEGPPGGRGEAQRRKEREELAQQYEAILRECGHGRFQWTLYFVLGLALMADGVEVFVVGFVLPSAEKDMCLSDSNKGMLGLIVYLGMMVGAFLWGGLADRLGRRQCLLISLSVNSVFAFFSSFVQGYGTFLFCRLLSGVGIGGSIPIVFSYFSEFLAQEKRGEHLSWLCMFWMIGGVYAAAMAWAIIPHYGWSFQMGSAYQFHSWRVFVLVCAFPSVFAIGALTTQPESPRFFLENGKHDEAWMVLKQVHDTNMRAKGHPERVFSVTHIKTIHQEDELIEIQSDTGTWYQRWGVRALSLGGQVWGNFLSCFGPEYRRITLMMMGVWFTMSFSYYGLTVWFPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAYMVYFVSFLGTLAVLPGNIVSALLMDKIGRLRMLAGSSVMSCVSCFFLSFGNSESAMIALLCLFGGVSIASWNALDVLTVELYPSDKRTTAFGFLNALCKLAAVLGISIFTSFVGITKAAPILFASAALALGSSLALKLPETRGQVLQ

SEP ID NP: 9

MEDSYKDRTSLMKGAKDIAREVKKQTVKKVNQAVDRAQDEYTQRSYSRFQDEEDDDDYYPAGETYNGEANDDEGSSEATEGHDEDDEIYEGEYQGIPSMNQAKDSIVSVGQPKGDEYKDRRELESERRADEEELAQQYELIIQECGHGRFQWALFFVLGMALMADGVEVFWGFVLPSAETDLCIPNSGSGWLGSIVYLGMMVGAFFWGGLADKVGRKQSLLICMSVNGFFAFLSSFVQGYGFFLFCRLLSGFGIGGAIPTVFSYFAEVLAREKRGEHLSWLCMFWMIGGIYASAMAWAIIPHYGWSFSMGSAYQFHSWRVFVIVCALPCVSSWALTFMPESPRFLLEVGKHDEAWMILKLIHDTNMRARGQPEKVFTVNKIKTPKQIDELIEIESDTGTWYRRCFVRIRTELYGIWLTFMRCFNYPVRDNTIKLTIVWFTLSFGYYGLSVWFPDVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYSAYWIYFVNFLGTLAVLPGNIVSALLMDRIGRLTMLGGSMVLSGISCFFLWFGTSESMMIGMLCLYNGLTISAWNSLDWTVELYPTDRRATGFGFLNALCKAAAVLGNLIFGSLVSITKSIPILLASTVLVCGGLVGLCLPDTRTQVLM

SEP ID NO: 10

MDDYKYQDNYGGYAPSDGYYRGNESNPEEDAQSDVTEGHDEEDEIYEGEYQGIPHPDDVKAKQAKMAPSRMDSLRGQTDLMAERLEDEEQLAHQYETIMDECGHGRFQWILFFVLGLALMADGVEVFWSFALPSAEKDMCLSSSKKGMLGMIVYLGMMAGAFILGGLADKLGRKRVLSMSLAVNASFASLSSFVQGYGAFLFCRLIS GIGIGGALPIVFAYFSEFLSREKRGEHLSWLGIFWMTGGLYASAMAWSIIPHYGWGFSMGTNYHFHSWRVFVIVCALPCTVSMVALKFMPESPRFLLEMGKHDEAWMILKQVHDTNMRAKGTPEKVFTVSNIKTPKQMDEFIEIQSSTGTWYQRWLVRFKTIFKQVWDNALYCVMGPYRMNTLILAWWFAMAFSYYGLTVWFPDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDNDFLIYLVSFLGSLSVLPGNIISALLMDRIGRLKMIGGSMLISAVCCFFLFFGNSESAMIGWQCLFCGTSIAAWNALDVITVELYPTNQRATAFGILNGLCKFGAILGNTIFASFVGITKWPILLAAASLVGGGLIALRLPETREQVLM

SEP ID NO: 11

FPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAY

SEP ID NP: 12

WFPDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDNDFLIY

SEP ID NP: 13

WFPDVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYSAY

SEP ID NP: 14

MVSESHHEALAAPPVTTVATVLPSNATEPASPGEGKEDAFSKLKEKFMNELHKIPLPPWALIAIAIVAVLLVLTCCFCICKKCLFKKKNKKKGKEKGGKNAINMKDVKDLGKTMKDQALKDDDAETGLTDGEEKEEPKEEEKLGKLQYSLDYDFQNNQLLVGIIQAAELPALDMGGTSDPYVKVFLLPDKKKKFETKVHRKTLNPVFNEQFTFKVPYSELGGKTLVMAVYDFDRFSKHDIIGEFKVPMNTVDFGHVTEEWRDLQSAEKEEQEKLGDICFSLRYVPTAGKLTWILEAKNLKKMDVGGLSDPYVKIHLMQNGKRLKKKKTTIKKNTLNPYYNESFSFEVPFEQIQKVQWVTVLDYDKIGKNDAIGKVFVGYNSTGAELRHWSDMLANPRRPIAQWHTLQVEEEVD AMLAVKK

SEP ID NP: 15

MRNIFKRNQEPIVAPATTTATMPIGPVDNSTESGGAGESQEDMFAKLKEKLFNEINKIPLPPWALIAIAWAGLLLLTCCFCICKKCCCKKKKNKKEKGKGMKNAMNMKDMKGGQDDDDAETGLTEGEGEGEEEKEPENLGKLQFSLDYDFQANQLTVGVLQAAELPALDMGGTSDPYVKVFLLPDKKKKYETKVHRKTLNPAFNETFTFKVPYQELGGKTLVMAIYDFDRFSKHDIIGEVKVPMNTVDLGQPIEEWRDLQGGEKEEPEKLGDICTSLRYVPTAGKLTVCILEAKNLKKMDVGGLSDPYVKIHLMQNGKRLKKKKTTVKKKTLNPYFNESFSFEIPFEQIQKVQWVTVLDYDKLGKNEAIGKIFVGSNATGTELRHWSDMLANPRRPIAQWHSLKPEEEVDALLGKNK

SEP ID NO: 16

MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTWEQYERSEGRHSTGGMDELYK

SEP ID NO: 17

MASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTGFEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQ

SEP ID NP: 18

LFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSWGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYFSDNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEK RDHMVLLEFVTAAGL

SEP ID NP: 19

MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGWASQPARWDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG

SEP ID NP: 20

MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDWTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLWTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF

SEP ID NP: 21

MTEYKPTVRLATRDDVPRAVRTLAAAFADYPATRHTVDPDRHIERVTELQELFLTRVGLDIGKVWVADDGAAVAVWTTPESVEAGAVFAEIGPRMAELSGSRLAAQQQMEGLLAPHRPKEPAWFLATVGVSPDHQGKGLGSAWLPGVEAAERAGVPAFLETSAPRNLPFYERLGFTVTADVEVPEGPRTWCMTRKPGA

SEP ID NO: 22

HTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKWYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVT GWRLCERILA

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SYNAPTIC RESEARCH, LLC

<120> ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К

КЛОСТРИДИАЛЬНЫМ НЕЙРОТОКСИНАМ

<130> P67202WO

<150> US 62/858,384

<151> 2019-06-07

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2502

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 1

atggtgtcga agggggaagc ggtgatcaag gagttcatga ggtttaaagt gcatatggag 60

ggatctatga acggacacga gtttgagatc gaaggggaag gagaggggcg cccatacgaa 120

ggcacccaga ctgccaagct gaaagtcaca aagggtggac ccttgccctt ctcgtgggat 180

attctgagcc cgcaattcat gtacgggtcc cgggccttca ccaagcaccc tgctgacatt 240

ccggattact ataagcagag cttcccggaa ggcttcaaat gggagcgagt gatgaacttc 300

gaggatggag gcgccgtgac cgtgactcag gacacttcac tggaagatgg cactctgatc 360

tacaaggtca agctgcgggg caccaacttc ccaccggacg gaccggtcat gcagaaaaag 420

accatgggat gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccg aagatggagt cctcaagggg 480

gacatcaaga tggccctgcg gctcaaggat ggtggaagat acctggctga cttcaagacc 540

acgtacaagg ccaagaagcc agtccagatg cccggcgcgt acaatgtgga tcgcaagctg 600

gacatcactt cccacaacga ggactacacc gtggtggagc agtacgaacg gtccgagggt 660

cggcactcca ctggtggcat ggacgagctg tacaaaatgg ccgaggatgc agacatgaga 720

aacgaactgg aagaaatgca gcggagagca gaccagctcg cggacgaatc actggaatcg 780

acccgccgga tgcttcaact ggtcgaggaa tcaaaggacg cgggtatccg gacccttgtg 840

atgctggacg aacagggaga gcagctggag aggatcgaag agggaatgga ccagattaac 900

aaggacatga aggaagcgga aaagaacctc accgaccttg gaaagttctg cgggttgtgc 960

gtgtgtccgt gcaacaagct gaagtcctcc gacgcctaca agaaggcctg gggaaacaac 1020

caggacggtg tcgtggcttc ccaacccgca cgggtggtgg atgagcggga acagatggcg 1080

atttccggag gcttcattag acgcgtgacc aacgacgccc gcgaaaacga gatggacgaa 1140

aacctggaac aagtgtcggg aatcatcgga aacttgagac acatggccct cgacatgggc 1200

aacgaaattg atacacagaa ccggcagatt gaccggatca tggaaaaggc agactcaaac 1260

aagactcgga ttgacgaagc gaaccagagg gccactaaga tgttgggttc cgggatggtg 1320

tcaaagggag aagaagacaa catggcatca ctgcccgcca cccacgagct gcacatcttc 1380

ggttccatca acggggtcga cttcgacatg gtcggccagg gaactggaaa cccgaatgac 1440

ggttatgaag aactgaacct taaatcaacc aagggggacc ttcagttctc gccctggatt 1500

ttggtccctc acattggata cggattccat cagtatctgc cgtaccccga cggaatgagc 1560

ccgttccagg ctgccatggt ggacggatcg ggataccagg tccaccgcac catgcagttt 1620

gaagatggcg caagcctgac cgtgaactac cggtatacct acgagggctc acacatcaag 1680

ggggaagccc aagtcaaggg taccggcttc ccggccgacg gaccagtgat gaccaactcc 1740

ttgaccgccg ccgactggtg ccgcagcaag aaaacttacc ccaacgataa gacaatcatc 1800

tccactttca agtggtccta caccacgggc aacggcaaac gctaccgaag cactgcacgg 1860

accacctaca ctttcgcgaa gcctatggcc gccaactacc tgaagaacca gccgatgtac 1920

gtgttcagaa agacggaact caagcactcc aaaaccgaac tgaactttaa ggagtggcag 1980

aaggctttca ctggattcga ggactttgtc ggcgactggc gccagactgc cggctacaac 2040

ctggaccaag tgctcgaaca ggggggtgtc tccagcctct tccaaaatct gggcgtgtcc 2100

gtgaccccga tccagcggat cgtgctcagc ggggaaaacg gcctgaagat cgatatccac 2160

gtcatcatcc cgtacgaggg actgagcggc gaccagatgg gtcagatcga aaagattttc 2220

aaggtggtct atcccgtgga tgaccaccac ttcaaagtga tcctgcatta cgggaccctc 2280

gtgatcgacg gcgtcacccc gaacatgatt gattacttcg gacggcctta tgaagggatc 2340

gccgtgttcg acggcaaaaa gatcaccgtg actggcaccc tgtggaacgg aaataagatc 2400

attgacgagc ggctgatcaa cccagacggg tcgctgctgt tccgcgtgac catcaacgga 2460

gtgaccggct ggcggctgtg cgagcgcatc ctcgcctgat ag 2502

<210> 2

<211> 2517

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 2

atggtgtcga agggggaagc ggtgatcaag gagttcatga ggtttaaagt gcatatggag 60

ggatctatga acggacacga gtttgagatc gaaggggaag gagaggggcg cccatacgaa 120

ggcacccaga ctgccaagct gaaagtcaca aagggtggac ccttgccctt ctcgtgggat 180

attctgagcc cgcaattcat gtacgggtcc cgggccttca ccaagcaccc tgctgacatt 240

ccggattact ataagcagag cttcccggaa ggcttcaaat gggagcgagt gatgaacttc 300

gaggatggag gcgccgtgac cgtgactcag gacacttcac tggaagatgg cactctgatc 360

tacaaggtca agctgcgggg caccaacttc ccaccggacg gaccggtcat gcagaaaaag 420

accatgggat gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccg aagatggagt cctcaagggg 480

gacatcaaga tggccctgcg gctcaaggat ggtggaagat acctggctga cttcaagacc 540

acgtacaagg ccaagaagcc agtccagatg cccggcgcgt acaatgtgga tcgcaagctg 600

gacatcactt cccacaacga ggactacacc gtggtggagc agtacgaacg gtccgagggt 660

cggcactcca ctggtggcat ggacgagctg tacaaaatgg ccgaggatgc agacatgaga 720

aacgaactgg aagaaatgca gcggagagca gaccagctcg cggacgaatc actggaatcg 780

acccgccgga tgcttcaact ggtcgaggaa tcaaaggacg cgggtatccg gacccttgtg 840

atgctggacg aacagggaga gcagctggag aggatcgaag agggaatgga ccagattaac 900

aaggacatga aggaagcgga aaagaacctc accgaccttg gaaagttctg cgggttgtgc 960

gtgtgtccgt gcaacaagct gaagtcctcc gacgcctaca agaaggcctg gggaaacaac 1020

caggacggtg tcgtggcttc ccaacccgca cgggtggtgg atgagcggga acagatggcg 1080

atttccggag gcttcattag acgcgtgacc aacgacgccc gcgaaaacga gatggacgaa 1140

aacctggaac aagtgtcggg aatcatcgga aacttgagac acatggccct cgacatgggc 1200

aacgaaattg atacacagaa ccggcagatt gaccggatca tggaaaaggc agactcaaac 1260

aagactcgga ttgacgaagc gaaccagagg gccactaaga tgttgggttc cgggatggtg 1320

tcaaagggag aagaactgtt cactggagtg gtgcccatcc tggtggagct ggatggcgat 1380

gtgaacggcc ataaattctc agtcagcgga gagggagagg gcgatgcgac ttacggaaag 1440

ctgactttga agtttatctg cactaccgga aagctgcctg tgccatggcc taccctcgtg 1500

accaccctgt cctggggcgt ccaatgtttc gcacgctacc ctgaccatat gaagcagcac 1560

gacttcttca agtccgccat gcccgagggc tacgtgcagg aacgcaccat cttcttcaag 1620

gacgacggga actacaaaac cagggctgaa gtgaagttcg agggagacac cctggtcaat 1680

cggattgaat tgaagggaat cgatttcaag gaagatggaa acatcctggg acataagctt 1740

gagtacaact acttctccga caacgtgtac atcacggccg ataagcagaa gaacggaatc 1800

aaagctaact tcaagattcg gcacaacatt gaggacggcg gcgtccagct ggcggaccat 1860

tatcagcaga atacccctat tggggatgga ccggtgctgc tcccggacaa ccattacctg 1920

tccacccaat ctaagctgag caaggaccca aacgagaagc gcgatcacat ggtgctgctc 1980

gagttcgtga ctgccgccgg gcttcacaca cttgaggact ttgtcggcga ctggcgccag 2040

actgccggct acaacctgga ccaagtgctc gaacaggggg gtgtctccag cctcttccaa 2100

aatctgggcg tgtccgtgac cccgatccag cggatcgtgc tcagcgggga aaacggcctg 2160

aagatcgata tccacgtcat catcccgtac gagggactga gcggcgacca gatgggtcag 2220

atcgaaaaga ttttcaaggt ggtctatccc gtggatgacc accacttcaa agtgatcctg 2280

cattacggga ccctcgtgat cgacggcgtc accccgaaca tgattgatta cttcggacgg 2340

ccttatgaag ggatcgccgt gttcgacggc aaaaagatca ccgtgactgg caccctgtgg 2400

aacggaaata agatcattga cgagcggctg atcaacccag acgggtcgct gctgttccgc 2460

gtgaccatca acggagtgac cggctggcgg ctgtgcgagc gcatcctcgc ctgatag 2517

<210> 3

<211> 2250

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 3

atgaccatgg atgagcagca atcgcaggct gtagccccgg tatatgtcgg tggtatggat 60

gagaaaacga ctgggtggcg gggtggacac gtcgtcgagg gcctggcagg cgaacttgaa 120

caactgcggg ctcgcttgga gcaccacccg caaggacagc gcgagccgtc catggtgtca 180

aagggggagg aactgtttac tggggtcgtc cctatcttgg tggaactcga cggggatgtg 240

aacggacaca agttttcggt atccggggaa ggcgaggggg atgccacgta tggaaagctc 300

acacttaagt tcatctgcac gacagggaag ctcccagtgc cttggcccac gttggtgact 360

acgctcacat ggggtgtcca gtgcttcgca cggtatcccg accacatgaa gcagcatgat 420

ttctttaagt cagccatgcc ggagggatat gtacaagaaa ggaccatctt cttcaaagat 480

gacggtaact acaagaccag agccgaggta aagtttgaag gcgacactct cgtgaacagg 540

attgagctga agggaattga tttcaaagag gatgggaaca tccttggtca caaattggag 600

tacaatgcca tttcggataa cgtgtacatt acagcggata agcagaagaa tgggatcaaa 660

gcgaatttca aaatcaggca taacatcgag gacgggtcgg tgcagctcgc cgaccattac 720

cagcagaata cgcccatcgg agatggaccc gtacttctgc ccgacaatca ttatctgtca 780

acgcaatcag cgcttagcaa agatcccaat gagaaaaggg accacatggt gctcctcgaa 840

tttgtgacgg cagcgggaat taccctcggg atggacgaac tgtacaaaag cgggttgaga 900

ctcgagcgct gaactcgaga tgccttttgt caacaagcag tttaactata aggatcccgt 960

gaatggtgtg gacattgcct acatcaagat tccaaacgct ggacaaatgc agcccgtcaa 1020

ggctttcaaa attcacaaca agatctgggt gatcccggag agggacacct ttaccaatcc 1080

agaagagggc gaccttaacc ctccgccaga ggccaaacag gtgcccgtga gctattacga 1140

ctcaacttat ctctccaccg acaacgaaaa ggacaattac ctcaagggag tcaccaagct 1200

gttcgaacgg atctactcta ccgatctcgg caggatgctc ctgacttcta tcgtgcgggg 1260

catccccttc tggggtggga gcaccattga caccgaactg aaggtgattg ataccaattg 1320

catcaacgtc atccagccag acggttccta ccggtctgag gagctcaatc ttgtgattat 1380

tggcccgtca gctgatatca tccagttcga atgcaagtct ttcggacacg acgtgcttaa 1440

tctcacccgc aatggttacg gaagcaccca gtacatcaga ttctctccgg actttacttt 1500

cggatttgaa gagtcactgg aagtcgacac caatcctctg ctcggagccg gaaagttcgc 1560

caccgaccct gcagtgaccc ttgctcacga gctgattcat gcagagcatc gcctgtacgg 1620

gatcgccatc aatcctaacc gcgtgtttaa ggtcaatacc aacgcttact atgaaatgag 1680

cggactggag gtgtccttcg aggaactgcg caccttcgga ggtcatgacg ctaagttcat 1740

cgactcactg caagagaatg agttccggct gtactattac aacaagttta aggatgtcgc 1800

ctcaactctg aacaaggcca aaagcatcat cggcaccacc gccagcctgc aatacatgaa 1860

aaacgtgttc aaggaaaagt accttcttag cgaagatact tccgggaagt tttcagtcga 1920

caaactgaag ttcgacaagc tgtacaagat gctcaccgaa atctacaccg aggacaattt 1980

tgtgaacttc ttcaaagtga ttaacagaaa gacctatctg aacttcgaca aagccgtgtt 2040

ccggattaac attgtgcccg atgagaacta cactatcaag gacgggttca accttaaggg 2100

tgcaaatctt tcaactaatt tcaacggaca gaatactgag atcaattcaa ggaacttcac 2160

tagactcaag aatttcactg ggcttttcga gttctataag ctgctgtgtg tccgcggaat 2220

tatccccttc aagtgaagct tcgtcaatga 2250

<210> 4

<211> 5772

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

atgtccccat gtggacgagc gcgcagacag acctcaagag gagcgatggc cgtgctggcc 60

tggaagttcc cgaggactcg cctgcccatg ggagcctctg ctctgtgtgt ggtcgtgctg 120

tgttggctgt acatcttccc ggtgtaccgg ctgcctaacg aaaaggaaat tgtgcagggc 180

gtgctccagc aggggaccgc ttggcggcgc aaccagaccg ctgcgagggc ttttcggaag 240

cagatggaag attgttgcga ccccgcccat cttttcgcga tgaccaagat gaacagcccg 300

atgggaaagt ccatgtggta cgacggagag ttcctgtatt ccttcaccat tgacaacagc 360

acttactcac tgttcccgca agccaccccc ttccaactgc cgcttaagaa gtgcgccgtc 420

gtggggaacg gcggcatcct caagaagtcc ggatgcgggc gccagattga tgaagccaac 480

ttcgtgatgc ggtgcaatct cccgccactc tcgtccgagt acaccaagga cgtggggtca 540

aagtcgcagc tcgtcaccgc caacccttcg atcatcagac aacggttcca gaaccttctg 600

tggagccgga aaacatttgt ggataacatg aagatctaca accattccta catctatatg 660

cctgccttct ccatgaaaac tggaaccgaa ccctccctga gagtgtacta caccctgtcc 720

gacgtgggcg caaaccagac cgtccttttc gccaacccca acttcctgcg ctccatcgga 780

aagttctgga agtccagagg cattcacgcg aaacgcttgt ccactggatt gttcttggtg 840

tccgccgctc tgggcctgtg cgaggaagtg gccatatacg gattctggcc tttctccgtc 900

aacatgcacg agcagcccat ctcccaccat tattacgaca atgtcctgcc tttctcggga 960

tttcacgcga tgcccgagga gttcttgcaa ctgtggtacc ttcacaagat cggtgccctg 1020

cggatgcagc tggacccttg cgaggacacc tcgctgcaac ccacctcgga gcagaaactc 1080

atttccgaag aggatctgaa cggggagcag aagctcatct ccgaggagga cctgaacgga 1140

gaacagaagc tgattagcga agaggacctg ggcagcggtg ccaccaattt ttctctgctc 1200

aagcaggccg gagatgtgga agagaacccg ggtcccatgg aggactccta caaagatcgg 1260

acttctctga tgaagggagc caaggacatc gccagggaag tgaagaagca aaccgtcaag 1320

aaggtcaacc aggccgtgga cagagcccag gacgagtaca cccagcggtc gtactcgcgg 1380

ttccaggatg aagaggatga cgacgactac taccctgccg gcgaaaccta taatggggaa 1440

gccaacgatg acgaaggctc cagcgaagcc actgaaggac acgacgagga cgacgaaatc 1500

tacgaaggag aataccaggg catcccttcg atgaatcagg ccaaagattc aattgtgtca 1560

gtgggacagc ctaagggcga cgagtacaag gaccggagag agctcgaaag cgagcggagg 1620

gccgacgaag aggaactggc acaacagtac gagctgatca tccaggagtg tgggcacggc 1680

cggttccagt gggcgctgtt cttcgtgctc ggaatggcac tgatggccga cggcgtggaa 1740

gtgttcgtgg tcggattcgt gctgccctcg gccgaaaccg acctctgcat tcccaactcc 1800

ggctcgggat ggctggggtc catcgtgtac ctgggaatga tggtcggcgc cttcttctgg 1860

ggtggcctgg cagacaaggt cggccggaag cagtccctct tgatctgcat gagcgtcaac 1920

ggatttttcg ccttcctgtc atcattcgtg caaggttacg ggttcttcct tttctgccgc 1980

ctgctgtccg gctttgggat cggcggggct attccgactg tgttctccta ctttgccgaa 2040

gtgctggctc gcgaaaaacg gggcgaacac ctttcctggc tgtgtatgtt ctggatgatc 2100

ggcggcatct acgcctcggc catggcctgg gctattatcc cgcattatgg gtggtccttc 2160

tcaatgggaa gcgcatacca gttccattcg tggcgggtgt tcgtgatcgt gtgcgccctc 2220

ccgtgtgtgt cctccgtggt ggctctgaca ttcatgccgg agtcacctcg gttcttgttg 2280

gaagtcggga agcacgacga agcctggatg attctgaagc tgatccacga cactaatatg 2340

cgggcccggg gacagcctga gaaagtgttc accgtcaaca agattaagac cccgaagcaa 2400

atcgatgaac tgattgaaat tgagtccgac accggaactt ggtaccgccg gtgcttcgtg 2460

cggattcgca ccgagctgta cggaatctgg ctcaccttca tgcgctgctt caactacccc 2520

gtgcgcgaca acaccatcaa gctgaccatc gtgtggttca ctctgtcttt cggctactat 2580

gggctgtcag tgtggttccc ggatgtcatc aagccgctcc aatccgatga atacgccctg 2640

ctgacccgca atgtggagag agacaaatac gccaacttca ccatcaattt caccatggaa 2700

aaccagattc acaccggaat ggagtacgac aatggacgat tcatcggagt gaagttcaag 2760

agcgtgacct tcaaggactc ggtgttcaag tcctgtacct tcgaggacgt gaccagcgtg 2820

aacacttatt ttaagaattg caccttcatc gatactgtgt tcgataacac cgacttcgag 2880

ccctataagt tcattgactc ggagttcaag aactgttcat tcttccacaa caagactggt 2940

tgccagatca ccttcgatga cgactacagc gcctactgga tctactttgt gaactttttg 3000

ggaactctcg cagtgcttcc tggcaacatt gtgtccgcac tcctgatgga tcggattggc 3060

aggctcacga tgcttggggg gtccatggtc ctctccggga tctcgtgctt cttcctgtgg 3120

ttcggcacct cggagtccat gatgatcgga atgttgtgcc tgtacaacgg tctgaccatc 3180

agcgcctgga acagcctcga cgtggtcacc gtcgagctgt atcctaccga ccggcgcgcg 3240

acaggcttcg gattcctgaa cgcactgtgc aaggcagccg cggtcctggg aaatctgatc 3300

tttggttcgc tggtgtccat cactaagagc atccctattc tgctcgcctc cacggtgctc 3360

gtgtgtggtg gcctggtcgg gctgtgcctg cccgacactc gcacccaagt gctcatggac 3420

tacaaggatg acgatgataa gggagactac aaggacgatg acgacaaggg ggattacaag 3480

gacgacgatg acaaaggaag cggcgccact aacttttccc tgctgaagca ggccggggac 3540

gtcgaagaaa accccgggcc aatgcgcaac attttcaagc ggaatcagga gcctatcgtg 3600

gccccggcca ccactaccgc cactatgcct attggacctg tcgacaactc cacggaatca 3660

ggcggcgccg gcgaatccca agaggacatg ttcgccaagc tgaaggagaa actgttcaac 3720

gaaatcaaca agattcccct cccgccgtgg gccctgatcg ctatcgctgt cgtcgccgga 3780

ctgctgctgc ttacttgctg cttctgcatt tgcaagaagt gttgttgcaa gaaaaagaaa 3840

aacaagaagg aaaaggggaa gggaatgaag aacgccatga atatgaagga catgaagggc 3900

ggacaggatg atgatgatgc tgaaactggg ctgactgagg gcgaaggaga gggcgaagag 3960

gagaaggaac ctgagaacct gggaaagctc caattctccc tggattacga cttccaagcc 4020

aaccagctga ctgtgggagt gttgcaagcc gccgagctgc cagccctgga catgggcggc 4080

acctccgacc cctatgtgaa ggtgttcttg ctgcctgaca agaagaagaa gtacgaaacc 4140

aaggtgcacc gcaagaccct gaaccccgct ttcaacgaaa ccttcacttt caaagtgccc 4200

taccaagagc tcgggggaaa gactctcgtg atggcgatct acgacttcga ccggttcagc 4260

aagcacgata tcatcgggga ggtcaaggtc ccgatgaaca ccgtggacct tggccaaccg 4320

attgaagaat ggcgcgatct ccagggtggc gaaaaggagg agcccgagaa actgggtgac 4380

atctgtacat cactgcgcta cgtgccgacc gccgggaagc tcactgtctg catcctggag 4440

gccaagaacc tgaagaaaat ggacgtgggc gggctctccg acccttacgt gaagatccac 4500

ctgatgcaga acggaaagcg gctgaagaag aagaaaacca ctgtgaagaa aaagactctg 4560

aacccctact tcaacgagtc gttctccttc gaaatcccgt ttgagcaaat ccagaaggtc 4620

caagtggtcg tgactgtgct tgactacgac aagctcggaa agaacgaggc cattggcaaa 4680

atcttcgtgg gatcgaacgc aactggcacc gagctgagac actggtctga catgctcgcc 4740

aacccaaggc ggccgattgc tcagtggcac tccttgaaac ctgaggaaga agtggatgcc 4800

cttcttggaa agaacaagat gtacccctac gacgtccctg attacgcggg atacccgtac 4860

gatgtgcctg actatgccgg ctacccgtac gatgtgccag actacgctgg ctccggagcc 4920

acgaactttt cgctgctgaa acaggccggc gacgtggaag aaaatcccgg tccaatgatt 4980

gaacaagatg gattgcacgc tggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 5040

gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 5100

gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 5160

gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 5220

gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 5280

ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 5340

ctgcatacgc ttgatccggc tacatgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 5400

cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaggaacat 5460

caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 5520

gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 5580

ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 5640

ttggctaccc gtgatattgc tgaggaactt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 5700

ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 5760

ttcttctgat ag 5772

<210> 5

<211> 5772

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

atgtccccat gtggacgagc gcgcagacag acctcaagag gagcgatggc cgtgctggcc 60

tggaagttcc cgaggactcg cctgcccatg ggagcctctg ctctgtgtgt ggtcgtgctg 120

tgttggctgt acatcttccc ggtgtaccgg ctgcctaacg aaaaggaaat tgtgcagggc 180

gtgctccagc aggggaccgc ttggcggcgc aaccagaccg ctgcgagggc ttttcggaag 240

cagatggaag attgttgcga ccccgcccat cttttcgcga tgaccaagat gaacagcccg 300

atgggaaagt ccatgtggta cgacggagag ttcctgtatt ccttcaccat tgacaacagc 360

acttactcac tgttcccgca agccaccccc ttccaactgc cgcttaagaa gtgcgccgtc 420

gtggggaacg gcggcatcct caagaagtcc ggatgcgggc gccagattga tgaagccaac 480

ttcgtgatgc ggtgcaatct cccgccactc tcgtccgagt acaccaagga cgtggggtca 540

aagtcgcagc tcgtcaccgc caacccttcg atcatcagac aacggttcca gaaccttctg 600

tggagccgga aaacatttgt ggataacatg aagatctaca accattccta catctatatg 660

cctgccttct ccatgaaaac tggaaccgaa ccctccctga gagtgtacta caccctgtcc 720

gacgtgggcg caaaccagac cgtccttttc gccaacccca acttcctgcg ctccatcgga 780

aagttctgga agtccagagg cattcacgcg aaacgcttgt ccactggatt gttcttggtg 840

tccgccgctc tgggcctgtg cgaggaagtg gccatatacg gattctggcc tttctccgtc 900

aacatgcacg agcagcccat ctcccaccat tattacgaca atgtcctgcc tttctcggga 960

tttcacgcga tgcccgagga gttcttgcaa ctgtggtacc ttcacaagat cggtgccctg 1020

cggatgcagc tggacccttg cgaggacacc tcgctgcaac ccacctcgga gcagaaactc 1080

atttccgaag aggatctgaa cggggagcag aagctcatct ccgaggagga cctgaacgga 1140

gaacagaagc tgattagcga agaggacctg ggcagcggtg ccaccaattt ttctctgctc 1200

aagcaggccg gagatgtgga agagaacccg ggtcccatgg aggactccta caaagatcgg 1260

acttctctga tgaagggagc caaggacatc gccagggaag tgaagaagca aaccgtcaag 1320

aaggtcaacc aggccgtgga cagagcccag gacgagtaca cccagcggtc gtactcgcgg 1380

ttccaggatg aagaggatga cgacgactac taccctgccg gcgaaaccta taatggggaa 1440

gccaacgatg acgaaggctc cagcgaagcc actgaaggac acgacgagga cgacgaaatc 1500

tacgaaggag aataccaggg catcccttcg atgaatcagg ccaaagattc aattgtgtca 1560

gtgggacagc ctaagggcga cgagtacaag gaccggagag agctcgaaag cgagcggagg 1620

gccgacgaag aggaactggc acaacagtac gagctgatca tccaggagtg tgggcacggc 1680

cggttccagt gggcgctgtt cttcgtgctc ggaatggcac tgatggccga cggcgtggaa 1740

gtgttcgtgg tcggattcgt gctgccctcg gccgaaaccg acctctgcat tcccaactcc 1800

ggctcgggat ggctggggtc catcgtgtac ctgggaatga tggtcggcgc cttcttctgg 1860

ggtggcctgg cagacaaggt cggccggaag cagtccctct tgatctgcat gagcgtcaac 1920

ggatttttcg ccttcctgtc atcattcgtg caaggttacg ggttcttcct tttctgccgc 1980

ctgctgtccg gctttgggat cggcggggct attccgactg tgttctccta ctttgccgaa 2040

gtgctggctc gcgaaaaacg gggcgaacac ctttcctggc tgtgtatgtt ctggatgatc 2100

ggcggcatct acgcctcggc catggcctgg gctattatcc cgcattatgg gtggtccttc 2160

tcaatgggaa gcgcatacca gttccattcg tggcgggtgt tcgtgatcgt gtgcgccctc 2220

ccgtgtgtgt cctccgtggt ggctctgaca ttcatgccgg agtcacctcg gttcttgttg 2280

gaagtcggga agcacgacga agcctggatg attctgaagc tgatccacga cactaatatg 2340

cgggcccggg gacagcctga gaaagtgttc accgtcaaca agattaagac cccgaagcaa 2400

atcgatgaac tgattgaaat tgagtccgac accggaactt ggtaccgccg gtgcttcgtg 2460

cggattcgca ccgagctgta cggaatctgg ctcaccttca tgcgctgctt caactacccc 2520

gtgcgcgaca acaccatcaa gctgaccatc gtgtggttca ctctgtcttt cggctactat 2580

gggctgtcag tgtggttccc ggatgtcatc aagccgctcc aatccgatga atacgccctg 2640

ctgacccgca atgtggagag agacaaatac gccaacttca ccatcaattt caccatggaa 2700

aaccagattc acaccggaat ggagtacgac aatggacgat tcatcggagt gaagttcaag 2760

agcgtgacct tcaaggactc ggtgttcaag tcctgtacct tcgaggacgt gaccagcgtg 2820

aacacttatt ttaagaattg caccttcatc gatactgtgt tcgataacac cgacttcgag 2880

ccctataagt tcattgactc ggagttcaag aactgttcat tcttccacaa caagactggt 2940

tgccagatca ccttcgatga cgactacagc gcctactgga tctactttgt gaactttttg 3000

ggaactctcg cagtgcttcc tggcaacatt gtgtccgcac tcctgatgga tcggattggc 3060

aggctcacga tgcttggggg gtccatggtc ctctccggga tctcgtgctt cttcctgtgg 3120

ttcggcacct cggagtccat gatgatcgga atgttgtgcc tgtacaacgg tctgaccatc 3180

agcgcctgga acagcctcga cgtggtcacc gtcgagctgt atcctaccga ccggcgcgcg 3240

acaggcttcg gattcctgaa cgcactgtgc aaggcagccg cggtcctggg aaatctgatc 3300

tttggttcgc tggtgtccat cactaagagc atccctattc tgctcgcctc cacggtgctc 3360

gtgtgtggtg gcctggtcgg gctgtgcctg cccgacactc gcacccaagt gctcatggac 3420

tacaaggatg acgatgataa gggagactac aaggacgatg acgacaaggg ggattacaag 3480

gacgacgatg acaaaggaag cggcgccact aacttttccc tgctgaagca ggccggggac 3540

gtcgaagaaa accccgggcc aatgcgcaac attttcaagc ggaatcagga gcctatcgtg 3600

gccccggcca ccactaccgc cactatgcct attggacctg tcgacaactc cacggaatca 3660

ggcggcgccg gcgaatccca agaggacatg ttcgccaagc tgaaggagaa actgttcaac 3720

gaaatcaaca agattcccct cccgccgtgg gccctgatcg ctatcgctgt cgtcgccgga 3780

ctgctgctgc ttacttgctg cttctgcatt tgcaagaagt gttgttgcaa gaaaaagaaa 3840

aacaagaagg aaaaggggaa gggaatgaag aacgccatga atatgaagga catgaagggc 3900

ggacaggatg atgatgatgc tgaaactggg ctgactgagg gcgaaggaga gggcgaagag 3960

gagaaggaac ctgagaacct gggaaagctc caattctccc tggattacga cttccaagcc 4020

aaccagctga ctgtgggagt gttgcaagcc gccgagctgc cagccctgga catgggcggc 4080

acctccgacc cctatgtgaa ggtgttcttg ctgcctgaca agaagaagaa gtacgaaacc 4140

aaggtgcacc gcaagaccct gaaccccgct ttcaacgaaa ccttcacttt caaagtgccc 4200

taccaagagc tcgggggaaa gactctcgtg atggcgatct acgacttcga ccggttcagc 4260

aagcacgata tcatcgggga ggtcaaggtc ccgatgaaca ccgtggacct tggccaaccg 4320

attgaagaat ggcgcgatct ccagggtggc gaaaaggagg agcccgagaa actgggtgac 4380

atctgtacat cactgcgcta cgtgccgacc gccgggaagc tcactgtctg catcctggag 4440

gccaagaacc tgaagaaaat ggacgtgggc gggctctccg acccttacgt gaagatccac 4500

ctgatgcaga acggaaagcg gctgaagaag aagaaaacca ctgtgaagaa aaagactctg 4560

aacccctact tcaacgagtc gttctccttc gaaatcccgt ttgagcaaat ccagaaggtc 4620

caagtggtcg tgactgtgct tgactacgac aagctcggaa agaacgaggc cattggcaaa 4680

atcttcgtgg gatcgaacgc aactggcacc gagctgagac actggtctga catgctcgcc 4740

aacccaaggc ggccgattgc tcagtggcac tccttgaaac ctgaggaaga agtggatgcc 4800

cttcttggaa agaacaagat gtacccctac gacgtccctg attacgcggg atacccgtac 4860

gatgtgcctg actatgccgg ctacccgtac gatgtgccag actacgctgg ctccggagcc 4920

acgaactttt cgctgctgaa acaggccggc gacgtggaag aaaatcccgg tccaatgatt 4980

gaacaagatg gattgcacgc tggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 5040

gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 5100

gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac 5160

gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 5220

gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 5280

ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 5340

ctgcatacgc ttgatccggc tacatgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 5400

cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaggaacat 5460

caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag 5520

gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 5580

ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 5640

ttggctaccc gtgatattgc tgaggaactt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 5700

ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 5760

ttcttctgat ag 5772

<210> 6

<211> 356

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

Met Ser Pro Cys Gly Arg Ala Arg Arg Gln Thr Ser Arg Gly Ala Met

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Trp Lys Phe Pro Arg Thr Arg Leu Pro Met Gly Ala

20 25 30

Ser Ala Leu Cys Val Val Val Leu Cys Trp Leu Tyr Ile Phe Pro Val

35 40 45

Tyr Arg Leu Pro Asn Glu Lys Glu Ile Val Gln Gly Val Leu Gln Gln

50 55 60

Gly Thr Ala Trp Arg Arg Asn Gln Thr Ala Ala Arg Ala Phe Arg Lys

65 70 75 80

Gln Met Glu Asp Cys Cys Asp Pro Ala His Leu Phe Ala Met Thr Lys

85 90 95

Met Asn Ser Pro Met Gly Lys Ser Met Trp Tyr Asp Gly Glu Phe Leu

100 105 110

Tyr Ser Phe Thr Ile Asp Asn Ser Thr Tyr Ser Leu Phe Pro Gln Ala

115 120 125

Thr Pro Phe Gln Leu Pro Leu Lys Lys Cys Ala Val Val Gly Asn Gly

130 135 140

Gly Ile Leu Lys Lys Ser Gly Cys Gly Arg Gln Ile Asp Glu Ala Asn

145 150 155 160

Phe Val Met Arg Cys Asn Leu Pro Pro Leu Ser Ser Glu Tyr Thr Lys

165 170 175

Asp Val Gly Ser Lys Ser Gln Leu Val Thr Ala Asn Pro Ser Ile Ile

180 185 190

Arg Gln Arg Phe Gln Asn Leu Leu Trp Ser Arg Lys Thr Phe Val Asp

195 200 205

Asn Met Lys Ile Tyr Asn His Ser Tyr Ile Tyr Met Pro Ala Phe Ser

210 215 220

Met Lys Thr Gly Thr Glu Pro Ser Leu Arg Val Tyr Tyr Thr Leu Ser

225 230 235 240

Asp Val Gly Ala Asn Gln Thr Val Leu Phe Ala Asn Pro Asn Phe Leu

245 250 255

Arg Ser Ile Gly Lys Phe Trp Lys Ser Arg Gly Ile His Ala Lys Arg

260 265 270

Leu Ser Thr Gly Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Leu Gly Leu Cys Glu

275 280 285

Glu Val Ala Ile Tyr Gly Phe Trp Pro Phe Ser Val Asn Met His Glu

290 295 300

Gln Pro Ile Ser His His Tyr Tyr Asp Asn Val Leu Pro Phe Ser Gly

305 310 315 320

Phe His Ala Met Pro Glu Glu Phe Leu Gln Leu Trp Tyr Leu His Lys

325 330 335

Ile Gly Ala Leu Arg Met Gln Leu Asp Pro Cys Glu Asp Thr Ser Leu

340 345 350

Gln Pro Thr Ser

355

<210> 7

<211> 22

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 742

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

Met Glu Glu Gly Phe Arg Asp Arg Ala Ala Phe Ile Arg Gly Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Ala Lys Glu Val Lys Lys His Ala Ala Lys Lys Val Val Lys

20 25 30

Gly Leu Asp Arg Val Gln Asp Glu Tyr Ser Arg Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

Phe Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Phe Pro Ala Pro Ser Asp Gly

50 55 60

Tyr Tyr Arg Gly Glu Gly Thr Gln Asp Glu Glu Glu Gly Gly Ala Ser

65 70 75 80

Ser Asp Ala Thr Glu Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

85 90 95

Glu Tyr Gln Gly Ile Pro Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Gly Glu Arg

100 105 110

Met Ala Asp Gly Ala Pro Leu Ala Gly Val Arg Gly Gly Leu Ser Asp

115 120 125

Gly Glu Gly Pro Pro Gly Gly Arg Gly Glu Ala Gln Arg Arg Lys Glu

130 135 140

Arg Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Ala Ile Leu Arg Glu Cys Gly

145 150 155 160

His Gly Arg Phe Gln Trp Thr Leu Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu Pro Ser

180 185 190

Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Asp Ser Asn Lys Gly Met Leu Gly

195 200 205

Leu Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Leu Trp Gly Gly

210 215 220

Leu Ala Asp Arg Leu Gly Arg Arg Gln Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ser

225 230 235 240

Val Asn Ser Val Phe Ala Phe Phe Ser Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly

245 250 255

Thr Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Val Gly Ile Gly Gly Ser

260 265 270

Ile Pro Ile Val Phe Ser Tyr Phe Ser Glu Phe Leu Ala Gln Glu Lys

275 280 285

Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile Gly Gly

290 295 300

Val Tyr Ala Ala Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp

305 310 315 320

Ser Phe Gln Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg Val Phe

325 330 335

Val Leu Val Cys Ala Phe Pro Ser Val Phe Ala Ile Gly Ala Leu Thr

340 345 350

Thr Gln Pro Glu Ser Pro Arg Phe Phe Leu Glu Asn Gly Lys His Asp

355 360 365

Glu Ala Trp Met Val Leu Lys Gln Val His Asp Thr Asn Met Arg Ala

370 375 380

Lys Gly His Pro Glu Arg Val Phe Ser Val Thr His Ile Lys Thr Ile

385 390 395 400

His Gln Glu Asp Glu Leu Ile Glu Ile Gln Ser Asp Thr Gly Thr Trp

405 410 415

Tyr Gln Arg Trp Gly Val Arg Ala Leu Ser Leu Gly Gly Gln Val Trp

420 425 430

Gly Asn Phe Leu Ser Cys Phe Gly Pro Glu Tyr Arg Arg Ile Thr Leu

435 440 445

Met Met Met Gly Val Trp Phe Thr Met Ser Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu

450 455 460

Thr Val Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg His Leu Gln Ala Val Asp Tyr

465 470 475 480

Ala Ser Arg Thr Lys Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr

485 490 495

Phe Asn Phe Thr Leu Glu Asn Gln Ile His Arg Gly Gly Gln Tyr Phe

500 505 510

Asn Asp Lys Phe Ile Gly Leu Arg Leu Lys Ser Val Ser Phe Glu Asp

515 520 525

Ser Leu Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Ser Asn Thr

530 535 540

Phe Phe Arg Asn Cys Thr Phe Ile Asn Thr Val Phe Tyr Asn Thr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Glu Tyr Lys Phe Val Asn Ser Arg Leu Ile Asn Ser Thr Phe

565 570 575

Leu His Asn Lys Glu Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu

580 585 590

Gly Ala Tyr Met Val Tyr Phe Val Ser Phe Leu Gly Thr Leu Ala Val

595 600 605

Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Lys Ile Gly Arg

610 615 620

Leu Arg Met Leu Ala Gly Ser Ser Val Met Ser Cys Val Ser Cys Phe

625 630 635 640

Phe Leu Ser Phe Gly Asn Ser Glu Ser Ala Met Ile Ala Leu Leu Cys

645 650 655

Leu Phe Gly Gly Val Ser Ile Ala Ser Trp Asn Ala Leu Asp Val Leu

660 665 670

Thr Val Glu Leu Tyr Pro Ser Asp Lys Arg Thr Thr Ala Phe Gly Phe

675 680 685

Leu Asn Ala Leu Cys Lys Leu Ala Ala Val Leu Gly Ile Ser Ile Phe

690 695 700

Thr Ser Phe Val Gly Ile Thr Lys Ala Ala Pro Ile Leu Phe Ala Ser

705 710 715 720

Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ser Ser Leu Ala Leu Lys Leu Pro Glu Thr

725 730 735

Arg Gly Gln Val Leu Gln

740

<210> 9

<211> 727

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

Met Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Arg Thr Ser Leu Met Lys Gly Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Ala Arg Glu Val Lys Lys Gln Thr Val Lys Lys Val Asn Gln

20 25 30

Ala Val Asp Arg Ala Gln Asp Glu Tyr Thr Gln Arg Ser Tyr Ser Arg

35 40 45

Phe Gln Asp Glu Glu Asp Asp Asp Asp Tyr Tyr Pro Ala Gly Glu Thr

50 55 60

Tyr Asn Gly Glu Ala Asn Asp Asp Glu Gly Ser Ser Glu Ala Thr Glu

65 70 75 80

Gly His Asp Glu Asp Asp Glu Ile Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Gly Ile

85 90 95

Pro Ser Met Asn Gln Ala Lys Asp Ser Ile Val Ser Val Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Gly Asp Glu Tyr Lys Asp Arg Arg Glu Leu Glu Ser Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Asp Glu Glu Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Glu Leu Ile Ile Gln Glu

130 135 140

Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Ala Leu Phe Phe Val Leu Gly Met

145 150 155 160

Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val Val Gly Phe Val Leu

165 170 175

Pro Ser Ala Glu Thr Asp Leu Cys Ile Pro Asn Ser Gly Ser Gly Trp

180 185 190

Leu Gly Ser Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Val Gly Ala Phe Phe Trp

195 200 205

Gly Gly Leu Ala Asp Lys Val Gly Arg Lys Gln Ser Leu Leu Ile Cys

210 215 220

Met Ser Val Asn Gly Phe Phe Ala Phe Leu Ser Ser Phe Val Gln Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Phe Phe Leu Phe Cys Arg Leu Leu Ser Gly Phe Gly Ile Gly

245 250 255

Gly Ala Ile Pro Thr Val Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Val Leu Ala Arg

260 265 270

Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Cys Met Phe Trp Met Ile

275 280 285

Gly Gly Ile Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ala Ile Ile Pro His Tyr

290 295 300

Gly Trp Ser Phe Ser Met Gly Ser Ala Tyr Gln Phe His Ser Trp Arg

305 310 315 320

Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Cys Val Ser Ser Val Val Ala

325 330 335

Leu Thr Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Glu Val Gly Lys

340 345 350

His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Leu Ile His Asp Thr Asn Met

355 360 365

Arg Ala Arg Gly Gln Pro Glu Lys Val Phe Thr Val Asn Lys Ile Lys

370 375 380

Thr Pro Lys Gln Ile Asp Glu Leu Ile Glu Ile Glu Ser Asp Thr Gly

385 390 395 400

Thr Trp Tyr Arg Arg Cys Phe Val Arg Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Gly

405 410 415

Ile Trp Leu Thr Phe Met Arg Cys Phe Asn Tyr Pro Val Arg Asp Asn

420 425 430

Thr Ile Lys Leu Thr Ile Val Trp Phe Thr Leu Ser Phe Gly Tyr Tyr

435 440 445

Gly Leu Ser Val Trp Phe Pro Asp Val Ile Lys Pro Leu Gln Ser Asp

450 455 460

Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Arg Asn Val Glu Arg Asp Lys Tyr Ala Asn

465 470 475 480

Phe Thr Ile Asn Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile His Thr Gly Met Glu

485 490 495

Tyr Asp Asn Gly Arg Phe Ile Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe

500 505 510

Lys Asp Ser Val Phe Lys Ser Cys Thr Phe Glu Asp Val Thr Ser Val

515 520 525

Asn Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Phe Ile Asp Thr Val Phe Asp Asn

530 535 540

Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Lys Asn Cys

545 550 555 560

Ser Phe Phe His Asn Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp

565 570 575

Tyr Ser Ala Tyr Trp Ile Tyr Phe Val Asn Phe Leu Gly Thr Leu Ala

580 585 590

Val Leu Pro Gly Asn Ile Val Ser Ala Leu Leu Met Asp Arg Ile Gly

595 600 605

Arg Leu Thr Met Leu Gly Gly Ser Met Val Leu Ser Gly Ile Ser Cys

610 615 620

Phe Phe Leu Trp Phe Gly Thr Ser Glu Ser Met Met Ile Gly Met Leu

625 630 635 640

Cys Leu Tyr Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ala Trp Asn Ser Leu Asp Val

645 650 655

Val Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asp Arg Arg Ala Thr Gly Phe Gly

660 665 670

Phe Leu Asn Ala Leu Cys Lys Ala Ala Ala Val Leu Gly Asn Leu Ile

675 680 685

Phe Gly Ser Leu Val Ser Ile Thr Lys Ser Ile Pro Ile Leu Leu Ala

690 695 700

Ser Thr Val Leu Val Cys Gly Gly Leu Val Gly Leu Cys Leu Pro Asp

705 710 715 720

Thr Arg Thr Gln Val Leu Met

725

<210> 10

<211> 683

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

Met Asp Asp Tyr Lys Tyr Gln Asp Asn Tyr Gly Gly Tyr Ala Pro Ser

1 5 10 15

Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Asn Glu Ser Asn Pro Glu Glu Asp Ala Gln

20 25 30

Ser Asp Val Thr Glu Gly His Asp Glu Glu Asp Glu Ile Tyr Glu Gly

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Ile Pro His Pro Asp Asp Val Lys Ala Lys Gln Ala

50 55 60

Lys Met Ala Pro Ser Arg Met Asp Ser Leu Arg Gly Gln Thr Asp Leu

65 70 75 80

Met Ala Glu Arg Leu Glu Asp Glu Glu Gln Leu Ala His Gln Tyr Glu

85 90 95

Thr Ile Met Asp Glu Cys Gly His Gly Arg Phe Gln Trp Ile Leu Phe

100 105 110

Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Asp Gly Val Glu Val Phe Val

115 120 125

Val Ser Phe Ala Leu Pro Ser Ala Glu Lys Asp Met Cys Leu Ser Ser

130 135 140

Ser Lys Lys Gly Met Leu Gly Met Ile Val Tyr Leu Gly Met Met Ala

145 150 155 160

Gly Ala Phe Ile Leu Gly Gly Leu Ala Asp Lys Leu Gly Arg Lys Arg

165 170 175

Val Leu Ser Met Ser Leu Ala Val Asn Ala Ser Phe Ala Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Phe Val Gln Gly Tyr Gly Ala Phe Leu Phe Cys Arg Leu Ile Ser

195 200 205

Gly Ile Gly Ile Gly Gly Ala Leu Pro Ile Val Phe Ala Tyr Phe Ser

210 215 220

Glu Phe Leu Ser Arg Glu Lys Arg Gly Glu His Leu Ser Trp Leu Gly

225 230 235 240

Ile Phe Trp Met Thr Gly Gly Leu Tyr Ala Ser Ala Met Ala Trp Ser

245 250 255

Ile Ile Pro His Tyr Gly Trp Gly Phe Ser Met Gly Thr Asn Tyr His

260 265 270

Phe His Ser Trp Arg Val Phe Val Ile Val Cys Ala Leu Pro Cys Thr

275 280 285

Val Ser Met Val Ala Leu Lys Phe Met Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu

290 295 300

Leu Glu Met Gly Lys His Asp Glu Ala Trp Met Ile Leu Lys Gln Val

305 310 315 320

His Asp Thr Asn Met Arg Ala Lys Gly Thr Pro Glu Lys Val Phe Thr

325 330 335

Val Ser Asn Ile Lys Thr Pro Lys Gln Met Asp Glu Phe Ile Glu Ile

340 345 350

Gln Ser Ser Thr Gly Thr Trp Tyr Gln Arg Trp Leu Val Arg Phe Lys

355 360 365

Thr Ile Phe Lys Gln Val Trp Asp Asn Ala Leu Tyr Cys Val Met Gly

370 375 380

Pro Tyr Arg Met Asn Thr Leu Ile Leu Ala Val Val Trp Phe Ala Met

385 390 395 400

Ala Phe Ser Tyr Tyr Gly Leu Thr Val Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg

405 410 415

Tyr Phe Gln Asp Glu Glu Tyr Lys Ser Lys Met Lys Val Phe Phe Gly

420 425 430

Glu His Val Tyr Gly Ala Thr Ile Asn Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile

435 440 445

His Gln His Gly Lys Leu Val Asn Asp Lys Phe Thr Arg Met Tyr Phe

450 455 460

Lys His Val Leu Phe Glu Asp Thr Phe Phe Asp Glu Cys Tyr Phe Glu

465 470 475 480

Asp Val Thr Ser Thr Asp Thr Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ile Glu Ser

485 490 495

Thr Ile Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Tyr Glu His Lys Phe Ile Asn Cys

500 505 510

Arg Phe Ile Asn Ser Thr Phe Leu Glu Gln Lys Glu Gly Cys His Met

515 520 525

Asp Leu Glu Gln Asp Asn Asp Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Phe Leu

530 535 540

Gly Ser Leu Ser Val Leu Pro Gly Asn Ile Ile Ser Ala Leu Leu Met

545 550 555 560

Asp Arg Ile Gly Arg Leu Lys Met Ile Gly Gly Ser Met Leu Ile Ser

565 570 575

Ala Val Cys Cys Phe Phe Leu Phe Phe Gly Asn Ser Glu Ser Ala Met

580 585 590

Ile Gly Trp Gln Cys Leu Phe Cys Gly Thr Ser Ile Ala Ala Trp Asn

595 600 605

Ala Leu Asp Val Ile Thr Val Glu Leu Tyr Pro Thr Asn Gln Arg Ala

610 615 620

Thr Ala Phe Gly Ile Leu Asn Gly Leu Cys Lys Phe Gly Ala Ile Leu

625 630 635 640

Gly Asn Thr Ile Phe Ala Ser Phe Val Gly Ile Thr Lys Val Val Pro

645 650 655

Ile Leu Leu Ala Ala Ala Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu Ile Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Pro Glu Thr Arg Glu Gln Val Leu Met

675 680

<210> 11

<211> 128

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

Phe Pro Asp Met Ile Arg His Leu Gln Ala Val Asp Tyr Ala Ser Arg

1 5 10 15

Thr Lys Val Phe Pro Gly Glu Arg Val Glu His Val Thr Phe Asn Phe

20 25 30

Thr Leu Glu Asn Gln Ile His Arg Gly Gly Gln Tyr Phe Asn Asp Lys

35 40 45

Phe Ile Gly Leu Arg Leu Lys Ser Val Ser Phe Glu Asp Ser Leu Phe

50 55 60

Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Ser Asn Thr Phe Phe Arg

65 70 75 80

Asn Cys Thr Phe Ile Asn Thr Val Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Glu

85 90 95

Tyr Lys Phe Val Asn Ser Arg Leu Ile Asn Ser Thr Phe Leu His Asn

100 105 110

Lys Glu Gly Cys Pro Leu Asp Val Thr Gly Thr Gly Glu Gly Ala Tyr

115 120 125

<210> 12

<211> 130

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

Trp Phe Pro Asp Met Ile Arg Tyr Phe Gln Asp Glu Glu Tyr Lys Ser

1 5 10 15

Lys Met Lys Val Phe Phe Gly Glu His Val Tyr Gly Ala Thr Ile Asn

20 25 30

Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile His Gln His Gly Lys Leu Val Asn Asp

35 40 45

Lys Phe Thr Arg Met Tyr Phe Lys His Val Leu Phe Glu Asp Thr Phe

50 55 60

Phe Asp Glu Cys Tyr Phe Glu Asp Val Thr Ser Thr Asp Thr Tyr Phe

65 70 75 80

Lys Asn Cys Thr Ile Glu Ser Thr Ile Phe Tyr Asn Thr Asp Leu Tyr

85 90 95

Glu His Lys Phe Ile Asn Cys Arg Phe Ile Asn Ser Thr Phe Leu Glu

100 105 110

Gln Lys Glu Gly Cys His Met Asp Leu Glu Gln Asp Asn Asp Phe Leu

115 120 125

Ile Tyr

130

<210> 13

<211> 128

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

Trp Phe Pro Asp Val Ile Lys Pro Leu Gln Ser Asp Glu Tyr Ala Leu

1 5 10 15

Leu Thr Arg Asn Val Glu Arg Asp Lys Tyr Ala Asn Phe Thr Ile Asn

20 25 30

Phe Thr Met Glu Asn Gln Ile His Thr Gly Met Glu Tyr Asp Asn Gly

35 40 45

Arg Phe Ile Gly Val Lys Phe Lys Ser Val Thr Phe Lys Asp Ser Val

50 55 60

Phe Lys Ser Cys Thr Phe Glu Asp Val Thr Ser Val Asn Thr Tyr Phe

65 70 75 80

Lys Asn Cys Thr Phe Ile Asp Thr Val Phe Asp Asn Thr Asp Phe Glu

85 90 95

Pro Tyr Lys Phe Ile Asp Ser Glu Phe Lys Asn Cys Ser Phe Phe His

100 105 110

Asn Lys Thr Gly Cys Gln Ile Thr Phe Asp Asp Asp Tyr Ser Ala Tyr

115 120 125

<210> 14

<211> 422

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

Met Val Ser Glu Ser His His Glu Ala Leu Ala Ala Pro Pro Val Thr

1 5 10 15

Thr Val Ala Thr Val Leu Pro Ser Asn Ala Thr Glu Pro Ala Ser Pro

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met

35 40 45

Asn Glu Leu His Lys Ile Pro Leu Pro Pro Trp Ala Leu Ile Ala Ile

50 55 60

Ala Ile Val Ala Val Leu Leu Val Leu Thr Cys Cys Phe Cys Ile Cys

65 70 75 80

Lys Lys Cys Leu Phe Lys Lys Lys Asn Lys Lys Lys Gly Lys Glu Lys

85 90 95

Gly Gly Lys Asn Ala Ile Asn Met Lys Asp Val Lys Asp Leu Gly Lys

100 105 110

Thr Met Lys Asp Gln Ala Leu Lys Asp Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu

115 120 125

Thr Asp Gly Glu Glu Lys Glu Glu Pro Lys Glu Glu Glu Lys Leu Gly

130 135 140

Lys Leu Gln Tyr Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Gln Asn Asn Gln Leu Leu

145 150 155 160

Val Gly Ile Ile Gln Ala Ala Glu Leu Pro Ala Leu Asp Met Gly Gly

165 170 175

Thr Ser Asp Pro Tyr Val Lys Val Phe Leu Leu Pro Asp Lys Lys Lys

180 185 190

Lys Phe Glu Thr Lys Val His Arg Lys Thr Leu Asn Pro Val Phe Asn

195 200 205

Glu Gln Phe Thr Phe Lys Val Pro Tyr Ser Glu Leu Gly Gly Lys Thr

210 215 220

Leu Val Met Ala Val Tyr Asp Phe Asp Arg Phe Ser Lys His Asp Ile

225 230 235 240

Ile Gly Glu Phe Lys Val Pro Met Asn Thr Val Asp Phe Gly His Val

245 250 255

Thr Glu Glu Trp Arg Asp Leu Gln Ser Ala Glu Lys Glu Glu Gln Glu

260 265 270

Lys Leu Gly Asp Ile Cys Phe Ser Leu Arg Tyr Val Pro Thr Ala Gly

275 280 285

Lys Leu Thr Val Val Ile Leu Glu Ala Lys Asn Leu Lys Lys Met Asp

290 295 300

Val Gly Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Ile His Leu Met Gln Asn

305 310 315 320

Gly Lys Arg Leu Lys Lys Lys Lys Thr Thr Ile Lys Lys Asn Thr Leu

325 330 335

Asn Pro Tyr Tyr Asn Glu Ser Phe Ser Phe Glu Val Pro Phe Glu Gln

340 345 350

Ile Gln Lys Val Gln Val Val Val Thr Val Leu Asp Tyr Asp Lys Ile

355 360 365

Gly Lys Asn Asp Ala Ile Gly Lys Val Phe Val Gly Tyr Asn Ser Thr

370 375 380

Gly Ala Glu Leu Arg His Trp Ser Asp Met Leu Ala Asn Pro Arg Arg

385 390 395 400

Pro Ile Ala Gln Trp His Thr Leu Gln Val Glu Glu Glu Val Asp Ala

405 410 415

Met Leu Ala Val Lys Lys

420

<210> 15

<211> 419

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

Met Arg Asn Ile Phe Lys Arg Asn Gln Glu Pro Ile Val Ala Pro Ala

1 5 10 15

Thr Thr Thr Ala Thr Met Pro Ile Gly Pro Val Asp Asn Ser Thr Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Ala Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Glu Lys Leu Phe Asn Glu Ile Asn Lys Ile Pro Leu Pro Pro Trp Ala

50 55 60

Leu Ile Ala Ile Ala Val Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Thr Cys Cys

65 70 75 80

Phe Cys Ile Cys Lys Lys Cys Cys Cys Lys Lys Lys Lys Asn Lys Lys

85 90 95

Glu Lys Gly Lys Gly Met Lys Asn Ala Met Asn Met Lys Asp Met Lys

100 105 110

Gly Gly Gln Asp Asp Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu Thr Glu Gly Glu

115 120 125

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Lys Glu Pro Glu Asn Leu Gly Lys Leu Gln

130 135 140

Phe Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Gln Ala Asn Gln Leu Thr Val Gly Val

145 150 155 160

Leu Gln Ala Ala Glu Leu Pro Ala Leu Asp Met Gly Gly Thr Ser Asp

165 170 175

Pro Tyr Val Lys Val Phe Leu Leu Pro Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Glu

180 185 190

Thr Lys Val His Arg Lys Thr Leu Asn Pro Ala Phe Asn Glu Thr Phe

195 200 205

Thr Phe Lys Val Pro Tyr Gln Glu Leu Gly Gly Lys Thr Leu Val Met

210 215 220

Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Arg Phe Ser Lys His Asp Ile Ile Gly Glu

225 230 235 240

Val Lys Val Pro Met Asn Thr Val Asp Leu Gly Gln Pro Ile Glu Glu

245 250 255

Trp Arg Asp Leu Gln Gly Gly Glu Lys Glu Glu Pro Glu Lys Leu Gly

260 265 270

Asp Ile Cys Thr Ser Leu Arg Tyr Val Pro Thr Ala Gly Lys Leu Thr

275 280 285

Val Cys Ile Leu Glu Ala Lys Asn Leu Lys Lys Met Asp Val Gly Gly

290 295 300

Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Ile His Leu Met Gln Asn Gly Lys Arg

305 310 315 320

Leu Lys Lys Lys Lys Thr Thr Val Lys Lys Lys Thr Leu Asn Pro Tyr

325 330 335

Phe Asn Glu Ser Phe Ser Phe Glu Ile Pro Phe Glu Gln Ile Gln Lys

340 345 350

Val Gln Val Val Val Thr Val Leu Asp Tyr Asp Lys Leu Gly Lys Asn

355 360 365

Glu Ala Ile Gly Lys Ile Phe Val Gly Ser Asn Ala Thr Gly Thr Glu

370 375 380

Leu Arg His Trp Ser Asp Met Leu Ala Asn Pro Arg Arg Pro Ile Ala

385 390 395 400

Gln Trp His Ser Leu Lys Pro Glu Glu Glu Val Asp Ala Leu Leu Gly

405 410 415

Lys Asn Lys

<210> 16

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

Met Val Ser Lys Gly Glu Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val His Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Met Tyr Gly Ser Arg Ala Phe Thr Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Tyr Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Ala Val Thr Val Thr Gln Asp Thr

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr

115 120 125

Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Asp Ile Lys Met Ala Leu Arg Leu Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala

165 170 175

Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Met Pro Gly

180 185 190

Ala Tyr Asn Val Asp Arg Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His Ser Thr

210 215 220

Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230

<210> 17

<211> 248

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

Met Ala Ser Leu Pro Ala Thr His Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile

1 5 10 15

Asn Gly Val Asp Phe Asp Met Val Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn

20 25 30

Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Leu Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln

35 40 45

Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val Pro His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln

50 55 60

Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly Met Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val

65 70 75 80

Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val His Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly

85 90 95

Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr Arg Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile

100 105 110

Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys Gly Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro

115 120 125

Val Met Thr Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys

130 135 140

Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr Ile Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr

145 150 155 160

Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr

165 170 175

Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala Ala Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met

180 185 190

Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu Leu Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn

195 200 205

Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala Phe Thr Gly Phe Glu Asp Phe Val Gly

210 215 220

Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln

225 230 235 240

Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln

245

<210> 18

<211> 223

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val

1 5 10 15

Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr

20 25 30

Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro

35 40 45

Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser Trp Gly Val Gln Cys

50 55 60

Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser

65 70 75 80

Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp

85 90 95

Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr

100 105 110

Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly

115 120 125

Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Phe Ser Asp Asn Val

130 135 140

Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys

145 150 155 160

Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr

165 170 175

Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

180 185 190

His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

195 200 205

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Leu

210 215 220

<210> 19

<211> 206

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 19

Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg

1 5 10 15

Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met

20 25 30

Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val

35 40 45

Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met

50 55 60

Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp

65 70 75 80

Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys

85 90 95

Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val

100 105 110

Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala

115 120 125

Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn

130 135 140

Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu

145 150 155 160

Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg

165 170 175

Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile

180 185 190

Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly

195 200 205

<210> 20

<211> 264

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 20

Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val

1 5 10 15

Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser

20 25 30

Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe

35 40 45

Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala

50 55 60

Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val

65 70 75 80

Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu

85 90 95

Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys

100 105 110

Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro

115 120 125

Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu

145 150 155 160

Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala

165 170 175

Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys

180 185 190

Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp

195 200 205

Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala

210 215 220

Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe

225 230 235 240

Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe

245 250 255

Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe

260

<210> 21

<211> 199

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val

1 5 10 15

Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala

20 25 30

Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu

35 40 45

Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val

50 55 60

Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu

65 70 75 80

Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala

85 90 95

Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu

100 105 110

Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val

130 135 140

Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe

165 170 175

Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys

180 185 190

Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala

195

<210> 22

<211> 169

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

His Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr

1 5 10 15

Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln

20 25 30

Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly

35 40 45

Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly

50 55 60

Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val

65 70 75 80

Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr

85 90 95

Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg

100 105 110

Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr

115 120 125

Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn

130 135 140

Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly

145 150 155 160

Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala

165

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клетке, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин, экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином, а также к способу ее получения. Изобретение эффективно для идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического и косметического применения, для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина, а также для анализа для определения активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина. 8 н. и 34 з.п. ф-лы, 13 ил., 12 пр.

1. Клетка для идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического и косметического применения, где указанная клетка была генетически сконструирована, чтобы содержать:

а. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин;

b. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и

c. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином.

2. Способ in vitro для идентификации состава клостридиального нейротоксина для терапевтического и косметического применения, где указанный способ включает:

a. создание клетки, имеющей

i. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин;

ii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и

iii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином;

b. контактирование указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. идентификация состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического и/или косметического применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается; или

e. идентификация состава клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического и/или косметического применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается.

3. Способ in vitro для идентификации состава клостридиального нейротоксина, который подходит для терапевтического и косметического применения, где указанный способ включает:

a. создание клетки, имеющей

i. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин; ii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и

iii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином;

b. контактирование указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, где контрольный состав клостридиального нейротоксина представляет собой состав клостридиального нейротоксина, у которого известно имеется расщепляющая активность и/или который известно является подходящим для терапевтического и/или косметического применения; и

d. идентификация состава клостридиального нейротоксина как подходящего для терапевтического и/или косметического применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается или эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина; или

е. идентификация клостридиального нейротоксина как непригодного для терапевтического и/или косметического применения, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта после контакта не повышается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина.

4. Способ in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина, где указанный способ включает:

a. создание клетки, имеющей

i. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин;

ii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и

iii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином;

b. контактирование указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления после контакта с составом клостридиального нейротоксина; и

d. характеристику присутствия активности в составе при повышении уровня расщепления индикаторного белка после контакта; или

e. характеристику отсутствия активности в составе в отсутствие повышения уровня расщепления индикаторного белка после контакта.

5. Способ in vitro для характеристики активности состава клостридиального нейротоксина, где указанный способ включает:

a. создание клетки, имеющей

i. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин;

ii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и

iii. экзогенную нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином;

b. контактирование указанной клетки с составом клостридиального нейротоксина;

c. сравнение уровня расщепления индикаторного белка после контакта с составом клостридиального нейротоксина с уровнем расщепления до контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, где контрольный состав клостридиального нейротоксина представляет собой состав клостридиального нейротоксина, у которого известно имеется расщепляющая активность; и

d. характеристику присутствия активности в составе, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта повышается или эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина, или

е. характеристику отсутствия активности, когда уровень расщепления индикаторного белка после контакта не повышается или не эквивалентен уровню расщепления после контакта с контрольным составом клостридиального нейротоксина.

6. Клетка по п.1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка, которая сверхэкспрессирует рецептор и ганглиозид, экспрессирует больше рецептора и ганглиозида по сравнению с естественной мишенью клостридиального нейротоксина.

7. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка, которая сверхэкспрессирует рецептор и ганглиозид, экспрессирует больше рецептора и ганглиозида по сравнению с клеткой без экзогенной нуклеиновой кислоты.

8. Клетка по п.1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка представляет собой нервную клетку, не нервную клетку, нейроэндокринную клетку, клетку эмбриональной почки, злокачественную клетку молочной железы, клетки нейробластомы или клетку гибрида нейробластомы-глиомы; предпочтительно не нервную клетку.

9. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка представляет собой клетку нейробластомы или клетку нейробластомы-глиомы.

10. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка представляет собой клетку нейробластомы-глиомы.

11. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка представляет собой клетку NG108.

12. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для сверхэкспрессии ганглиозида.

13. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GM1a, GD1a, GD1b, GT1b и/или GQ1b.

14. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD1a, GD1b и/или GT1b.

15. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD1b и/или GT1b.

16. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии фермента пути синтеза ганглиозида или его варианта, или его фрагмента, обладающего каталитической активностью такого фермента.

17. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии глюкозилцерамидсинтазы, GalT-I, GalNAcT, GM3-синтазы, GD3-синтазы, GT3-синтазы, галактозилцерамидсинтазы, GM4-синтазы, GalT-II, ST-IV, или ST-V, или их варианта или их фрагмента, обладающего каталитической активностью такого фермента.

18. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD3-синтазы, или ее варианта или ее фрагмента, обладающего каталитической активностью GD3-синтазы.

19. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии GD3-синтазы.

20. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для сверхэкспрессии белкового рецептора или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин.

21. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии SV2 или синаптотагмина, или его варианта или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин.

22. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии SV2 или его варианта или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин.

23. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии SV2A или SV2C (предпочтительно SV2A), или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин.

24. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии четвертого люминального домена SV2A или SV2C.

25. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка.

26. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка, содержащего домен SNARE.

27. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка, где индикаторный белок содержит аминокислотную последовательность синтаксина, синаптобревина или SNAP-25, или его варианта или его фрагмента, который восприимчив к протеолизу протеазным компонентом клостридиального нейротоксина дикого типа.

28. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии меченого индикаторного белка.

29. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка, содержащего N-концевую метку и C-концевую метку.

30. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка, содержащего аминокислотную последовательность метки с флуоресцентным белком.

31. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка, содержащего аминокислотную последовательность mScarlet и аминокислотную последовательность NeonGreen.

32. Клетка по п. 1 или способ по любому из пп. 2-5, где клетка была генетически сконструирована для экспрессии или сверхэкспрессии индикаторного белка, содержащего mScarlet в качестве N-концевой метки и NeonGreen в качестве C-концевой метки.

33. Способ получения клетки по любому из пп. 1 или 6-32, где способ включает введение в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор клостридиального нейротоксина или его вариант, или его фрагмент, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин, нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент пути синтеза ганглиозида, или его вариант, или его фрагмент, обладающий каталитической активностью такого фермента, и нуклеиновую кислоту, которая обеспечивает экспрессию или сверэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином.

34. Способ по п. 33, где способ дополнительно включает введение в клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей индикаторный белок.

35. Способ по пп. 33, 34, где нуклеиновую кислоту вводят путем трансфекции.

36. Способ анализа для определения активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина, включающий контактирование клетки по любому из пп. 1 или 6-32 с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином в условиях и в течение периода времени, который позволяет протеазному домену клостридиального нейротоксина дикого типа расщеплять индикаторный белок в клетке, и определение активности модифицированного или рекомбинантного нейротоксина при обнаружении продукта, возникающего в результате расщепления такого индикаторного белка.

37. Способ по п. 36, где полноразмерный индикаторный белок с трудом разрушается в клетке, но после его расщепления один из образующихся фрагментов разрушается легко.

38. Способ по любому из пп. 36-37, где индикаторный белок помечен.

39. Способ по любому из пп. 36-38, где индикаторный белок содержит C-концевую метку, и полноразмерный индикаторный белок с трудом разрушается в клетке, но после его расщепления образующийся C-концевой фрагмент разрушается легко, и разрушение C-концевого фрагмента приводит к разрушению С-концевой метки.

40. Способ по любому из пп. 36-39, где индикаторный белок содержит C-концевую метку, и полноразмерный индикаторный белок с трудом разрушается в клетке, но после его расщепления образующийся C-концевой фрагмент разрушается легко, и разрушение C-концевого фрагмента приводит к разрушению С-концевой метки, и расщепление индикаторного белка определяют путем измерения сигнала от C-концевой метки после контактирования клетки с модифицированным или рекомбинантным нейротоксином.

41. Способ по п. 36, где после такого контакта клетку лизируют, и полученный клеточный лизат контактирует с антителами при проведении Вестерн-блоттинга.

42. Способ конструирования клетки, подходящей для определения состава клостридиального нейротоксина, который подходит для терапевтического и/или косметического применения, где способ включает:

а. работу с клеткой для вставки:

i. экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию рецептора клостридиального нейротоксина или его варианта, или его фрагмента, который обладает способностью связывать клостридиальный нейротоксин;

ii. экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию ганглиозида, имеющего аффинность связывания клостридиального нейротоксина, и

iii. экзогенной нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию или сверхэкспрессию индикаторного белка, расщепляемого клостридиальным нейротоксином.