СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ИЗ ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ДОНОРА-ТРУПА Российский патент 2015 года по МПК A01N1/00 C12N5/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии и трансплантологии, а также к области биологии, а именно клеточной биологии, и может быть использовано для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) донора-трупа при снижении уровня ее загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. РПЭ представляет собой монослой клеток гексагональной формы, расположенный с внутренней стороны собственно сосудистой оболочки (ССО) глаза и образующий вместе с ней хороидально-пигментный комплекс (ХПК). Клетки РПЭ выполняют транспортную, барьерную, метаболическую, антиоксидантную функции, способствуют адгезии нейросенсорной сетчатки, фагоцитируют наружные сегменты фоторецепторов, абсорбируют световую энергию, что обеспечивает нормальное функционирование сетчатки. Патология РПЭ является патогенетическим звеном дистрофических заболеваний сетчатки - возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита, наследственных дистрофий сетчатки. При экспериментальной разработке способов терапии указанных состояний широко используют методы клеточных культур, для получения которых РПЭ требуется выделить из донорского глаза. Ближайшим аналогом является способ получения клеток РПЭ глаза взрослого человека, описанный в патенте РФ №2409663, при котором энуклеируют глазное яблоко при аутопсии, промывают его в спиртовом растворе и в растворе Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с антибиотиком, удаляют по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от РПЭ, наполняют глазную чашу раствором Хенкса без Са²⁺, Mg²⁺ с этилендиаминтетрауксусной кислотой и инкубируют клетки РПЭ в течение 15-30 мин, полученные клетки собирают пипеткой и переносят в стерильную среду для выделения, пипетируют, центрифугируют, выделенные клетки ресуспендируют в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, затем полученную суспензию клеток ретинального пигментного эпителия распределяют на культуральной поверхности и культивируют до достижения прикрепившимися клетками 15-25% ее площади, суспензию с неприкрепившимися клетками аспирируют, распределяют на свежей культуральной поверхности и культивируют, а к прикрепившимся клеткам добавляют ростовую среду с высоким содержанием сыворотки и культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта.

Способ имеет недостаток: при обработке глазного яблока таким способом неизбежно повреждается сетчатая оболочка глаза и стекловидное тело, что может приводить к попаданию в полость глазного бокала способных к пролиферации клеток сетчатки (глиальных клеток Мюллера) и стекловидного тела (гиалоцитов), которые могут загрязнять культуру клеток РПЭ.

Задачей изобретения является получение культуры клеток РПЭ глаза донора-трупа in vitro при снижении уровня загрязнения выделяемого материала фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости.

Техническим результатом является снижение степени загрязнения посторонними клеточными элементами получаемой культуры клеток РПЭ. Технический результат достигается тем, что в способе получения культуры клеток РПЭ взрослого донора-трупа, включающем удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, согласно изобретению при целостности всех частей сосудистой оболочки глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва, после чего производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и РПЭ: первый круговой разрез на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают 3 мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 25 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера с pH 7,4, полученную взвесь клеток собирают в пробирку, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру клеток инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют каждые 3-4 дня. При данном способе обработки глазного яблока сетчатка не повреждается, витреальная полость остается невскрытой, таким образом исключаются возможные источники клеточного загрязнения культуры РПЭ.

Изобретение поясняется рисунками 1 и 2.

На рис. 1 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении РПЭ согласно ближайшему аналогу. На рис. 2 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении РПЭ согласно предложенному изобретению. На обоих рисунках позицией 1 обозначена склера, позицией 2 - ХПК, позицией 3 - сетчатая оболочка, позицией 4 - зрительный нерв. На рисунке 1 позицией 5 обозначены линии рассечения сетчатой оболочки по ближайшему аналогу - вокруг зрительного нерва и вдоль зубчатой линии, при этом полость стекловидного тела неизбежно вскрывают, сетчатка повреждена. На рисунке 2 позицией 6 обозначена линия рассечения зрительного нерва согласно настоящему изобретению - полость стекловидного тела не вскрыта, и сетчатка не повреждена.

Способ осуществляется следующим образом: глазное яблоко донора-трупа после удаления роговично-склерального диска осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости и при отсутствии перечисленных признаков погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с pH 7,4. Склеру рассекают спереди назад двумя, тремя или четырьмя меридиональными разрезами длиной 2/3 длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляют из операционного поля. Далее производят три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх», заливают тремя мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 25 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера pH 7,4, полученную взвесь клеток собирают в пробирку, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют питательную среду следующего состава: DMEM/F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, получая таким образом клеточную культуру РПЭ; при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO2, питательную среду заменяют каждые 3-4 дня.

Способ поясняется примером

Пример. Глазное яблоко донора-трупа, мужчины 56 лет после удаления роговично-склерального диска (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет выявления сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, глазное яблоко полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с pH 7,4. Склеру рассекают спереди назад тремя меридиональными разрезами длиной 2/3 от длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склера удаляется из операционного поля. Далее производится три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяется от нейральной сетчатки пинцетом и укладывается на дно стерильной чашки Петри (60*15 мм, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Корея) в положении «клетками РПЭ вверх». В чашку Петри добавляют ферментативную смесь раствора Версена (ПанЭко, Россия) и 0,25% раствора трипсина (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:1 и в объеме 3 мл. Далее чашку Петри инкубирут в стандартных условиях (при 37°C и 5% концентрации CO₂, инкубатор NU-5510, NuAire, США) в течение 25 минут. После инкубации ХПК многократно промывают со стороны РПЭ из шприца 5 мл (ООО «Фогт медикаль», Россия) струей стерильного фосфатно-солевого буфера. Суспензию клеток собирают в центрифужную пробирку 15 мл (Corning Lifesciences, США), центрифугируют (центрифуга SL-40 R, Thermo Scientific, Германия) в режиме 1500 оборотов в 1 мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливают и к полученному осадку добавляют питательную среду состава: 89% DMEM/F12 (БиолоТ, Россия), 10% эмбриональной телячей сыворотки (HyClone, США), 1% смеси антибиотиков, включающей пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл (MP Biomedicals, LLC, США), осадок ресуспендируют, полученную суспензию переносят в стерильную чашку Петри и инкубируют в стандартных условиях. Таким образом получают первичную культуру клеток РПЭ без посторонних пролиферирующих элементов сетчатки и стекловидного тела; при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют каждые 3 дня.

Изобретение относится к медицине. Для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска. При целостности всех частей сосудистой оболочки, глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от собственно сосудистой оболочки глаза (ССО) путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва, после чего производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и РПЭ: первый круговой разрез на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают 3 мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 25 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера с pH 7,4. Полученную взвесь клеток собирают в пробирку, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%. При этом культуру клеток инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют каждые 3-4 дня. Изобретение позволяет снизить степень загрязнения культуры клеток. 2 ил., 1 пр.

Способ получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа, включающий удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, отличающийся тем, что при целостности всех частей сосудистой оболочки глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от собственно сосудистой оболочки глаза (ССО) путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва, после чего производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и РПЭ: первый круговой разрез на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают 3 мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 25 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера с pH 7,4, полученную взвесь клеток собирают в пробирку, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру клеток инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют каждые 3-4 дня.