СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАННОЙ КУЛЬТУРЫ ХОРОИДАЛЬНО-ПИГМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ДОНОРА-ТРУПА Российский патент 2016 года по МПК A01N1/00 C12N5/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, патофизиологии и экспериментальной трансплантологии, и может быть использовано для получения ткани хороидально-пигментного комплекса (ХПК) донора-трупа при снижении уровня загрязнения получаемой органной культуры ХПК фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. Собственно сосудистая оболочка (ССО) глаза и располагающийся с ее внутренней стороны слой ретинального пигментного эпителия (РПЭ) вместе составляют ХПК и выполняют функцию двусторонней доставки многочисленных метаболитов из кровотока к слою фоторецепторов сетчатки и обратно, обеспечивая нормальную фототрансдуктивную функцию сетчатки. Патология РПЭ считается патогенетическим звеном дистрофических заболеваний сетчатки - возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита, наследственных дистрофий сетчатки. При экспериментальной разработке способов лазерного и хирургического лечения указанных состояний традиционно используют модели экспериментальных животных, чаще всего кроликов. Данный подход имеет недостатки - по многим параметрам глаз животного отличается от глаза человека, эксперименты на животных относительно дороги и трудозатратны, требуют специально оборудованного вивария. В качестве альтернативы может быть использован метод органных культур, который позволяет получить небольшой жизнеспособный фрагмент интересующей ткани от трупного донора и поддерживать его жизнеспособность в течение некоторого срока. В частности, для изучения вариантов лазерного и хирургического воздействия на нативный слой РПЭ в ряде случаев можно использовать органную культуру ХПК.

Ближайшим аналогом является способ получения органной культуры ХПК глаза взрослого человека, описанный в научной статье: Sun K, Cai Н, Tezel ТН, Paik D, Gaillard ER, Del Priore LV. Bruch′s membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol Vis. 2007 Dec 21; 13: 2310-9. Согласно статье выделение ХПК является промежуточным звеном в процессе выделения мембраны Бруха (часть ССО, располагающаяся у основания клеток РПЭ) и осуществляется следующим образом. Производят один круговой (параллельно лимбу в 3 мм от него) и 4 меридиональных (вдоль переднезадней оси глаза) разреза склеры, пересекают зрительный нерв, полностью отделяют склеру от ССО. Последовательно удаляют передний сегмент глаза вместе со стекловидным телом и сетчатую оболочку, получая таким образом хороидально-пигментный комплекс (ХПК).

Способ имеет недостаток: при обработке глазного яблока таким способом неизбежно повреждается сетчатая оболочка глаза и стекловидное тело, что может приводить к попаданию на поверхность ХПК способных к пролиферации клеток сетчатки (глиальных клеток Мюллера) и стекловидного тела (гиалоцитов), что может осложнять выполнение ряда экспериментальных задач.

Задачей изобретения является получение органной культуры ХПК глаза взрослого донора-трупа in vitro при снижении уровня загрязнения выделяемой ткани фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости.

Техническим результатом является снижение степени загрязнения посторонними клеточными элементами получаемой органной культуры ХПК.

Технический результат достигается тем, что в способе получения органной культуры ХПК из глаза взрослого донора-трупа, включающем удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, согласно изобретению при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с рН 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и РПЭ, - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом, укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх и в нее добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.

При данном способе обработки глазного яблока сетчатка не повреждается, витреальная полость остается невскрытой, радужная оболочка, цилиарное тело, хрусталик, сетчатка и стекловидное тело отделяются единым неповрежденным замкнутым блоком, таким образом исключаются возможные источники клеточного загрязнения органной культуры ХПК.

Изобретение поясняется рисунками 1 и 2.

На рис. 1 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ХПК согласно ближайшему аналогу. На рис. 2 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ХПК согласно предложенному изобретению. На обоих рисунках позицией 1 обозначена сетчатая оболочка, позицией 2 - ХПК, позицией 3 - склера, позицией 4 - зрительный нерв. На рис. 1 позицией 5 обозначены места рассечения сетчатой оболочки по ближайшему аналогу - вокруг зрительного нерва и возле зубчатой линии, при этом полость стекловидного тела неизбежно вскрывают, сетчатка повреждена. На рис. 2 позицией 6 обозначена линия рассечения зрительного нерва на уровне его внутрисклеральной части, согласно настоящему изобретению полость стекловидного тела не вскрыта, сетчатка не повреждена.

Способ осуществляется следующим образом: глазное яблоко донора-трупа после удаления роговично-склерального диска при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости и при отсутствии перечисленных признаков погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН=7,4. Склеру рассекают спереди назад двумя, тремя или четырьмя меридиональными разрезами длиной 2/3 длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляют из операционного поля. Далее производят три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх» и добавляют в нее питательную среду следующего состава: DMEM/F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%; при этом органную культуру ХПК инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.

Способ поясняется примером.

Пример. Глазное яблоко донора-трупа, мужчины 56 лет, после удаления роговично-склерального диска (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет выявления сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, глазное яблоко полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН=7,4 (ПанЭко, Россия), склеру рассекают спереди назад тремя меридиональными разрезами длиной 2/3 от длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склера удаляется из операционного поля. Далее производится три разреза ХПК - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри (60*15 мм, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Корея) в положении «клетками РПЭ вверх». В чашку Петри добавляют питательную среду следующего состава: DMEM/F12 (БиолоТ, Россия) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США) - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл (MP Biomedicals, LLC, США) - 1%, получая таким образом органную культуру ХПК; при этом культуру инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ (инкубатор NU-5510, NuAire, США), питательную среду заменяют 2 раза в день.

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с рН 7,4. Производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка». Со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва. Производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Первый круговой разрез производят на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх. Добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 (DMEM/F12) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%. При этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СО₂, питательную среду заменяют 2 раза в день. Изобретение позволяет снизить степень загрязнения продукта. 2 ил., 1 пр.

Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса (ХПК) из глаза взрослого донора-трупа, включающий удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, отличающийся тем, что при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ), - первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом, укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх и в нее добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%, при этом культуру инкубируют при 37°C и при 5% концентрации СO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.