СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАННОЙ КУЛЬТУРЫ СОБСТВЕННО СОСУДИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ИЗ ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ДОНОРА-ТРУПА Российский патент 2016 года по МПК A61F9/07 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, патофизиологии и экспериментальной трансплантологии, и может быть использовано для получения органной культуры собственно сосудистой оболочки (ССО) донора-трупа при снижении уровня загрязнения выделяемой ткани фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости.

ССО глаза вместе с располагающимся с ее внутренней стороны слоем ретинального пигментного эпителия (РПЭ) вместе составляют хороидально-пигментный комплекс (ХПК) и выполняют функцию двусторонней доставки многочисленных метаболитов из кровотока к слою фоторецепторов сетчатки и обратно, обеспечивая нормальную фототрансдуктивную функцию сетчатки. Патология РПЭ считается патогенетическим звеном дистрофических заболеваний сетчатки - возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита, наследственных дистрофий сетчатки. При экспериментальной разработке способов терапии указанных состояний широко используют методы клеточных и органных культур, которые позволяют изучать процессы взаимодействия РПЭ и ССО in vitro, для чего в ряде случаев получают органную культуру ССО из трупного донорского глаза.

Ближайшим аналогом является способ получения органной культуры ССО глаза взрослого человека, описанный в научной статье: Moore DJ, Hussain АА, Marshall J. Age-related variation in the hydraulic conductivity of Bruch′s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Jun; 36(7):1290-7. Согласно статье органную культуру ССО получают следующим образом. Используют глазное яблоко после удаления роговично-склерального комплекса для трансплантации роговицы. Проводят вокруг плоской части цилиарного тела, удаляют иридо-хрусталиковую диафрагму, цилиарное и стекловидное тела. Далее с помощью 7.75 мм трепана выкраивают фрагменты, включающие сетчатую оболочку, ХПК и склеру. Из полученных круглых фрагментов затем пинцетом удаляют сетчатую оболочку, мягкой соболевой кисточкой счищают слой РПЭ, а затем тупым расслаиванием отделяют ССО от склеры. ССО помещают в фосфатно-солевой буфер Дульбекко.

Способ имеет недостаток: при обработке глазного яблока таким способом неизбежно повреждается сетчатая оболочка глаза и стекловидное тело, что может приводить к попаданию на поверхность ССО способных к пролиферации клеток сетчатки (глиальных клеток Мюллера) и стекловидного тела (гиалоцитов), что может осложнять выполнение ряда экспериментальных задач. Задачей изобретения является получение органной культуры ССО глаза взрослого донора-трупа in vitro при снижении уровня ее загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости.

Техническим результатом является снижение степени загрязнения посторонними клеточными элементами получаемой органной культуры ССО. Технический результат достигается тем, что в способе получения органной культуры ССО из глаза взрослого донора-трупа, включающем удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, согласно изобретению при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и РПЭ: первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают двумя мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 20 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера pH=7,4, ССО переносят в отдельную чашку Петри, несколько раз промывают раствором стерильного фосфатно-солевого буфера pH 7,4 и к выделенной ССО добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%; при этом органную культуру ССО инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.

При данном способе обработки глазного яблока сетчатка не повреждается, витреальная полость остается невскрытой, радужная оболочка, цилиарное тело, хрусталик, сетчатка и стекловидное тело отделяются единым неповрежденным замкнутым блоком, таким образом, исключаются возможные источники клеточного загрязнения органной культуры ССО.

Изобретение поясняется рисунками 1 и 2.

На рис. 1 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ССО согласно ближайшему аналогу. На рис. 2 изображена схема пересечения тканей заднего отрезка глаза при выделении ССО согласно предложенному изобретению. На обоих рисунках позицией 1 обозначена склера, позицией 2 - ХПК, позицией 3 - сетчатая оболочка, позицией 4 - зрительный нерв. На рисунке 1 позицией 5 обозначены места рассечения сетчатой оболочки по ближайшему аналогу - трепанируют сетчатую оболочку, ХПК и склеру, при этом полость стекловидного тела неизбежно вскрывают, сетчатка повреждена. На рисунке 2 позицией 6 обозначены линии рассечения зрительного нерва на уровне его интрасклеральной части, согласно настоящему изобретению - полость стекловидного тела не вскрыта, сетчатка не повреждена.

Способ осуществляется следующим образом: глазное яблоко донора-трупа после удаления роговично-склерального диска осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости и при отсутствии перечисленных признаков погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером (pH=7,4). Склеру рассекают спереди назад двумя, тремя, или четырьмя меридиональными разрезами длиной 2/3 длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и интрасклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляют из операционного поля. Далее производят три разреза ХПК: первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх», заливают двумя мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 20 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера pH=7,4. ССО переносят в отдельную чашку Петри, несколько раз промывают раствором стерильного фосфатно-солевого буфера pH 7,4 и к выделенной ССО добавляют питательную среду следующего состава: DMEM/F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%; при этом органную культуру ССО инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.

Способ поясняется примером.

Пример. Глазное яблоко донора-трупа, мужчины 56 лет, после удаления роговично-склерального диска (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет выявления сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, глазное яблоко полностью погружают в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с pH=7,4 (ПанЭко, Россия). Склеру рассекают спереди назад тремя меридиональными разрезами длиной 2/3 от длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибают и со стороны супрахориоидального пространства пересекают вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склера удаляется из операционного поля. Далее производится три разреза ХПК: первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез - в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри (60×15 мм, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Корея) в положении «клетками РПЭ вверх», заливают двумя мл смеси раствора 0,25% трипсина (ПанЭко, Россия) и раствора Версена (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 20 минут (инкубатор NU-5510, NuAire, США), после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера pH=7,4. ССО переносят в отдельную чашку Петри (60×15 мм, SPL Life Sciences, Co., Ltd, Корея), несколько раз промывают раствором стерильного фосфатно-солевого буфера pH 7,4, чтобы смыть остатки РПЭ и к выделенной ССО добавляют питательную среду следующего состава: DMEM/F12 (БиолоТ, Россия) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США) - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1% (MP Biomedicals, LLC, США), получая, таким образом, органную культуру ССО; при этом органную культуру ССО инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии и трансплантологии, и касается получения органной культуры собственно сосудистой оболочки глаза (ССО). Для этого удаляют из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склеральный диск. Затем глазное яблоко осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО, а также выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости. При отсутствии перечисленных признаков полностью погружают глазное яблоко в стерильную емкость со стерильным фосфатно-солевым буфером с pH 7,4. Производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва. Производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Первый круговой разрез производят на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва. Еще один круговой разрез проводят на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх. Заливают ХПК 2 мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему. Инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 20 минут. После этого РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера pH=7,4. ССО переносят в отдельную чашку Петри, несколько раз промывают раствором стерильного фосфатно-солевого буфера pH 7,4. К выделенной ССО добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 (DMEM/F12) - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%. ССО инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂. При этом питательную среду заменяют 2 раза в день. Способ обеспечивает снижение степени загрязнения посторонними клеточными элементами получаемой органной культуры ССО. 2 ил.

Способ получения органной культуры собственно сосудистой оболочки (ССО) из глаза взрослого донора-трупа, включающий удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска, отличающийся тем, что при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО и выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от ССО путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва; производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и ретинального пигментного эпителия (РПЭ): первый круговой разрез - на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный - в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез - на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают двумя мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 20 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера pH=7,4, ССО переносят в отдельную чашку Петри, несколько раз промывают раствором стерильного фосфатно-солевого буфера pH 7,4 и к выделенной ССО добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/мл - 1%; при этом органную культуру ССО инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют 2 раза в день.