Способ получения образца фрагмента ретинального пигментного эпителия сетчатки Российский патент 2025 года по МПК A61F9/07 G01N1/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии и трансплантологии, а также к области биологии, а именно клеточной биологии, и может быть использовано для получения фрагмента ретинального пигментного эпителия (РПЭ) донора-трупа, при котором сохраняется естественное расположение и архитектоника клеток РПЭ, снижена степень загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. РПЭ представляет собой монослой клеток гексагональной формы, расположенный с внутренней стороны собственно сосудистой оболочки (ССО) глаза и образующий вместе с ней хориоидально-пигментный комплекс (ХПК). Клетки РПЭ выполняют транспортную, барьерную, метаболическую, антиоксидантную функции, способствуют адгезии нейросенсорной сетчатки, фагоцитируют наружные сегменты фоторецепторов, абсорбируют световую энергию. Заболевания РПЭ являются звеном многих поражений сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит, наследственная дистрофия сетчатки. В эксперименте широко используют донорский РПЭ, вследствие чего предложено несколько методов получения клеток РПЭ из донорского глаза человека. Ближайшим аналогом является способ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ИЗ ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ДОНОРА-ТРУПА, описанный в патенте РФ №2569481, при котором для получения культуры клеток РПЭ взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска. При целостности всех частей сосудистой оболочки, глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от собственно сосудистой оболочки глаза (ССО) путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва, после чего производят три разреза ХПК, состоящего из ССО и РПЭ: первый круговой разрез на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают 3 мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO₂ в течение 25 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера с pH 7,4. Полученную взвесь клеток собирают в пробирку, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой Хэма F12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/ мл - 1%. При этом культуру клеток инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO₂, питательную среду заменяют каждые 3-4 дня.

Способ имеет ряд недостатков: необходимость ферментативной дезагрегации исходного монослоя РПЭ, что может отразиться на жизнеспособности клеток и, что не менее важно, потере специфических маркеров нативного РПЭ, неудобство препарирования глазного яблока, трудности с переносом ХПК, а также большую продолжительность по времени в связи с необходимостью погружать глазное яблоко в фосфатно-солевой буфер.

Задачей изобретения является получение фрагмента нативного пигментного эпителия сетчатки в виде универсального и стандартизированного образца для дальнейшего изучения РПЭ глаза донора-трупа при помощи пластиковых колец с диаметром отверстия 14 мм и 15 мм.

Техническим результатом является сохранение естественной морфологии РПЭ, снижение степени загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости фрагмента ретинального пигментного эпителия сетчатки, а также четкое понимание локализации полученного фрагмента РПЭ. При данном способе не происходит повреждения РПЭ, поэтому вероятность трансформации РПЭ и потери специфического фенотипа снижается.

Способ осуществляется следующим образом: после удаления роговично-склерального диска глазное яблоко взрослого донора-трупа осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела, видимой части ССО, выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости. При отсутствии перечисленных признаков, приступают к выделению РПЭ таким образом, чтобы полностью удалить склеру от ССО путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят два разреза ХПК от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 16 мм, после чего бранши ножниц необходимо развернуть на 90 градусов и разрезать ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами необходимо захватить фрагмент РПЭ и отделить его от нейральной сетчатки, затем уложить на пластиковое кольцо с диаметром отверстия 14 мм пигментным эпителием вверх и зафиксировать при помощи пластикового кольца с диаметром отверстия 15 мм, поместив кольцо с меньшим диаметром отверстия в большее. После чего зафиксированный фрагмент РПЭ помещается в лунку 12-луночного культурального планшета, который заливают 5 мл раствора для хранения роговицы по ТУ № 9398-013-29039336-2008 (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и накрывают крышкой.

Способ поясняется примером. Глазное яблоко донора-трупа женщины 30 лет (количество времени от момента смерти до энуклеации глазного яблока составило 8 часов) после удаления роговично-склерального диска (разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, производят удаление склеры от ССО путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят два разреза ХПК от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 16 мм, после чего бранши ножниц необходимо развернуть на 90 градусов и разрезать ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами необходимо захватить фрагмент РПЭ и отделить его от нейральной сетчатки, затем уложить на пластиковое кольцо с диаметром отверстия 14 мм пигментным эпителием вверх и зафиксировать при помощи пластикового кольца с диаметром отверстия 15 мм, поместив кольцо с меньшим диаметром отверстия в большее. После чего зафиксированный фрагмент РПЭ помещается в лунку 12-луночного культурального планшета, который заливают 5 мл раствора для хранения роговицы по ТУ № 9398-013-29039336-2008 (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и накрывают крышкой.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и трансплантологии, к клеточной биологии, и может быть использовано для получения фрагмента ретинального пигментного эпителия, РПЭ. Для этого полностью удаляют склеру от собственно сосудистой оболочки путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв. После чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят два разреза хориоидально-пигментного комплекса, ХПК, от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 16 мм. Затем бранши ножниц разворачивают на 90 градусов и разрезают ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами захватывают фрагмент РПЭ и отделяют от нейральной сетчатки. Затем укладывают на пластиковое кольцо с диаметром отверстия 14 мм пигментным эпителием вверх и зафиксируют при помощи пластикового кольца с диаметром отверстия 15 мм, поместив кольцо с меньшим диаметром отверстия в большее. После чего зафиксированный фрагмент РПЭ помещается в лунку 12-луночного культурального планшета, который заливают 5 мл раствора для хранения роговицы и накрывают крышкой. Изобретение обеспечивает сохранение естественной морфологии РПЭ, снижение степени загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости фрагмента ретинального пигментного эпителия сетчатки, при этом не происходит повреждение РПЭ. 1 пр.

Способ получения образца фрагмента ретинального пигментного эпителия сетчатки, отличающийся тем, что производят полное удаление склеры от собственно сосудистой оболочки путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки, далее каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают, далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят два разреза хориоидально-пигментного комплекса (ХПК) от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 16 мм, после чего бранши ножниц разворачивают на 90 градусов и разрезают ХПК по всей окружности, далее двумя анатомическими пинцетами захватывают фрагмент ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и отделяют его от нейральной сетчатки, затем укладывают на пластиковое кольцо с диаметром отверстия 14 мм пигментным эпителием вверх и фиксируют при помощи пластикового кольца с диаметром отверстия 15 мм, поместив кольцо с меньшим диаметром отверстия в большее, после чего зафиксированный фрагмент РПЭ помещают в лунку 12-луночного культурального планшета, который заливают 5 мл раствора для хранения роговицы и накрывают крышкой.