Способ получения фрагмента нативного пигментного эпителия сетчатки в виде универсального и стандартизированного образца для дальнейшего изучения РПЭ глаза взрослого донора-трупа Российский патент 2025 года по МПК A01N1/00 C12N5/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии и трансплантологии, а также к области биологии, а именно клеточной биологии, и может быть использовано для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа, при котором снижена степень загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. РПЭ представляет собой монослой клеток гексагональной формы, расположенный с внутренней стороны собственно сосудистой оболочки (ССО) глаза и образующий вместе с ней хороидально-пигментный комплекс (ХПК). Клетки РПЭ выполняют транспортную, барьерную, метаболическую, антиоксидантную функции, способствуют адгезии нейросенсорной сетчатки, фагоцитируют наружные сегменты фоторецепторов, абсорбируют световую энергию. Заболевания РПЭ являются звеном многих поражений сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит, наследственная дистрофия сетчатки. В эксперименте широко используют методы получения клеточных культур, для которых требуется выделить РПЭ из донорского глаза человека. Ближайшим аналогом является способ получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия из глаза взрослого донора-трупа, описанный в патенте РФ №2569481, при котором для получения культуры клеток РПЭ взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска. При целостности всех частей сосудистой оболочки, глазное яблоко без роговично-склерального диска полностью погружают в емкость с фосфатно-солевым буфером с pH 7,4, производят полное отделение склеры от собственно сосудистой оболочки глаза (ССО) путем рассечения склеры меридиональными разрезами спереди назад на 2, 3 или 4 «лепестка» и пересечения со стороны супрахориоидального пространства вортикозных вен и внутрисклеральной части зрительного нерва, после чего производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК), состоящего из ССО и РПЭ: первый круговой разрез на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный в любом меридиане в направлении от первого кругового разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяют от нейральной сетчатки пинцетом и укладывают на дно стерильной чашки Петри в положении клетками РПЭ вверх, заливают 3 мл смеси раствора 0,25% трипсина и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубируют при 37°C и 5% концентрации CO2 в течение 25 минут, после чего РПЭ отделяют с поверхности ССО струей фосфатно-солевого буфера с pH 7,4. Полученную взвесь клеток собирают в пробирку, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют питательную среду следующего состава: среда Игла в модификации Дульбекко со средой ХэмаF12 - 89%, эмбриональная телячья сыворотка - 10%, смесь антибиотиков, включающая пенициллин 10000 МЕ/мл, стрептомицин 10000 мкг/мл, амфотерицин 25 мкг/ мл - 1%. При этом культуру клеток инкубируют при 37°C и при 5% концентрации CO2, питательную среду заменяют каждые 3-4 дня.

Способ имеет ряд недостатков: неудобство препарирования глазного яблока, трудности с переносом ХПК, а также большую продолжительность по времени в связи с необходимостью погружать глазное яблоко в фосфатно-солевой буфер.

Задачей изобретения является получение фрагмента нативного пигментного эпителия сетчатки в виде универсального и стандартизированного образца для дальнейшего изучения РПЭ глаза взрослого донора-трупа при помощи люверсов диаметром 5 мм с кольцом и пластиковой винтовой крышкой размером 13 мм.

Техническим результатом является снижение степени загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости фрагмента нативного пигментного эпителия сетчатки.

Технический результат достигается тем, что способ выделения РПЭ взрослого донора-трупа включает полное удаление склеры от ССО путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 3-4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят три разреза ХПК от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 10 мм, после чего бранши ножниц необходимо развернуть на 90 градусов и разрезать ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами необходимо захватить ХПК и отделить его от нейральной сетчатки, затем уложить на люверс с диаметром отверстия 5 мм пигментным эпителием вниз. Потом на ХПК и люверс (фигура 1) необходимо положить фиксирующее кольцо для фиксации ткани, после чего люверс помещается в винтовую пластиковую крышку с диаметром 13 мм основанием вниз. Готовый комплекс переносят в лунку 24-луночного культурального планшета, заливают 3 мл раствора для хранения роговицы по ТУ №9398-013-29039336-2008 (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и накрывают крышкой. При данном способе обработки глазного яблока сетчатка не повреждается, поэтому вероятность клеточного загрязнения культуры клеток РПЭ снижается.

На Фиг. 1 изображен люверс, используемый для выделения РПЭ. Люверс имеет высоту 4 мм, просвет цилиндра диаметром 5 мм и люверсное фиксирующее кольцо размером 10 мм, которое имеет диаметр просвета 5 мм.

Способ осуществляется следующим образом: после удаления роговично-склерального диска глазное яблоко взрослого донора-трупа осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела, видимой части ССО, выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости. При отсутствии перечисленных признаков, приступают к выделению РПЭ таким образом, чтобы полностью удалить склеру от ССО путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 3-4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят три разреза ХПК от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 10 мм, после чего бранши ножниц необходимо развернуть на 90 градусов и разрезать ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами необходимо захватить ХПК и отделить его от нейральной сетчатки, затем уложить на люверс с диаметров отверстия 5 мм пигментным эпителием вниз. После этого на ХПК и люверс необходимо положить фиксирующее кольцо для фиксации ткани, после чего люверс помещается в винтовую пластиковую крышку с диаметром 13 мм основанием вниз. Готовый комплекс переносят в лунку 24-луночного культурального планшета, заливают 3 мл раствора для хранения роговицы по ТУ №9398-013-29039336-2008 (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и накрывают крышкой.

Способ поясняется примером. Глазное яблоко взрослого донора-трупа мужчины 27 лет после удаления роговично-склерального диска (разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/243 от 24 июня 2010 года «Алгоритм заготовки трупных роговиц человека для трансплантации») осматривают на предмет наличия сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части ССО. Убедившись в целостности указанных структур и отсутствии выхода стекловидного тела за пределы витреальной полости, производят удаление склеры от ССО путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 3-4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят три разреза ХПК от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 10 мм, после чего бранши ножниц необходимо развернуть на 90 градусов и разрезать ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами необходимо захватить ХПК и отделить его от нейральной сетчатки, затем уложить на люверс с диаметром отверстия 5 мм пигментным эпителием вниз. Потом на ХПК и люверс необходимо положить фиксирующее кольцо для фиксации ткани, после чего люверс помещается в винтовую пластиковую крышку с диаметром 13 мм основанием вниз. Готовый комплекс переносят в лунку 24-луночного культурального планшета, заливают 3 мл раствора для хранения роговицы по ТУ №9398-013-29039336-2008 (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и накрывают крышкой.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения фрагмента нативного пигментного эпителия сетчатки в виде универсального и стандартизированного образца для дальнейшего изучения ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза взрослого донора-трупа. Способ включает полное удаление склеры от ССО путем рассечения склеры от лимба и до зрительного нерва на 4 части. Каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства аккуратно отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру полностью иссекают. Далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят три разреза ХПК от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы, после чего бранши ножниц необходимо развернуть на 90 градусов и разрезать ХПК по всей окружности. Далее двумя анатомическими пинцетами необходимо захватить ХПК и отделить его от нейральной сетчатки, затем уложить на люверс пигментным эпителием вниз. Потом на ХПК и люверс необходимо положить фиксирующее кольцо для фиксации ткани, после чего люверс помещается в винтовую пластиковую крышку основанием вниз. Изобретение может быть использовано для получения культуры клеток РПЭ взрослого донора-трупа, при котором снижена степень загрязнения фрагментами сетчатки и содержимым витреальной полости. 1 ил., 1 пр.

Способ получения фрагмента нативного пигментного эпителия сетчатки в виде универсального и стандартизированного образца для дальнейшего изучения ретинального пигментного эпителия (РПЭ) глаза взрослого донора-трупа, отличающийся тем, что рассекают склеру от лимба и до зрительного нерва на 4 части параллельно переднезадней оси глаза через равные промежутки, далее каждую часть склеры поочередно отгибают и закручивают на зажим типа «москит» и со стороны супрахориоидального пространства отсекают вортикозные вены и зрительный нерв, после чего склеру удаляют из операционного поля, далее прямыми тупоконечными офтальмологическими ножницами производят три разреза хороидально-пигментного комплекса (ХПК) от области выхода зрительного нерва в направлении роговицы на расстоянии 10 мм, после чего бранши ножниц разворачивают на 90 градусов и разрезают ХПК по всей окружности, далее двумя анатомическими пинцетами захвают ХПК и отделяют его от нейральной сетчатки, затем укладывают на люверс пигментным эпителием вниз, затем на ХПК и люверс кладут фиксирующее кольцо для фиксации ткани, после чего люверс помещают в винтовую пластиковую крышку основанием вниз, готовый комплекс переносят в лунку 24-луночного культурального планшета, заливают 3 мл раствора для хранения роговицы и накрывают крышкой.