ЭКСПРЕСС-МЕТОД ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ОВЕЦ И КОЗ В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/04 G01N33/53 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к экспресс-методу диагностики бруцеллеза овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации для исследования молока.

В доступной нам литературе мы не нашли данных по использованию реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с молоком и кольцевой реакции с молоком (КР с молоком) для выявления бруцеллеза у овец и коз. Кольцевая реакция с молоком официально применяется для исследования коров на бруцеллез. В связи с этим, в качестве аналога мы применяли кольцевую реакцию с молоком для исследования молока овец и коз.

Постановка кольцевой реакции

Перед исследованием молоко тщательно перемешивают путем энергичного встряхивания для равномерного распределения сливок.

Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока. В пробирки вносят по 2 мл молока. После взятия каждой пробы молока пипетку двукратно промывают теплой водой. Антиген вносят по 0,1 мл в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в каждые 10 проб штатив с пробирками энергично встряхивают для равномерного распределения антигена в молоке.

При постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят следующие контрольные пробы:

- молоко от заведомо здоровой коровы;

- смесь молока здоровой коровы с позитивной бруцеллезной сывороткой (0,1 мл сыворотки на 2 мл молока).

Штатив с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в термостат или водяную баню при температуре 37-38°С на один час и затем выдерживают 30 минут при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 минут после извлечения штативов из термостата (водяной бани) в крестах по следующей схеме:

+++ (3 креста) - четко выраженное синее или красно-вишневое кольцо (в зависимости от использованного антигена) в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

++ (2 креста) - четко выраженное синее (красно-вишневое) кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый или бледно-розовый цвет;

+ (1 крест) - синее (красно-вишневое) кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик молока имеет синий (розовый) цвет;

- (минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий (красно-вишневый) цвет.

Все пробирки молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают положительными, 1 крест - сомнительными.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду коров его считают благополучным по бруцеллезу.

Преимущество КР с молоком заключается в простоте постановки, быстроте получения результатов и в том, что ее можно использовать для контроля благополучия дойных стад коров.

Недостатком КР является ее слабая чувствительность и возможность получения неспецифических реакций у больных маститом животных.

Кольцевая реакция с молоком овец и коз не входит в число официально принятых методов диагностики бруцеллеза мелкого рогатого скота и не используется в практике с этой целью. Данная реакция применяется для исследования коровьего молока и имеет диагностическое значение для выявления больных бруцеллезом коров. Она менее эффективна для диагностики бруцеллеза овец и коз.

Основная причина недостаточной эффективности кольцевой реакции с молоком овец и коз при диагностике бруцеллеза заключается в том, что более мелкие жировые шарики молока овец и коз менее активно, чем у крупного рогатого скота, абсорбируют агглютинированные окрашенные бруцеллы (бруцеллезный антиген для КР с молоком) в положительных молочных образцах и не поднимаются для образования типичного окрашенного кольца.

Имеется еще один недостаток КР с молоком овец и коз - низкое содержание специфических антител в молоке овец и коз и слабая серологическая активность их по сравнению с антителами, содержащимися в коровьем молоке.

В связи с указанными причинами, кольцевая реакция оказалась непригодной для диагностики бруцеллеза у овец и коз. Поэтому для диагностики бруцеллеза овец и коз путем исследования молока возникает необходимость в изыскании более чувствительного метода, пригодного для выявления специфических антител, содержащихся в молоке у животных этого вида.

Известен метод диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, предназначенный для выявления специфических антител в сыворотке крови - реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с применением эритроцитарного антигена, разработанного Прикаспийским зональным НИВИ, ФГБУ «ВГНКИ» и ГНУ ВНИИБТЖ.

В связи с тем что в специальной литературе нет сообщений о возможности исследования на бруцеллез молока овец и коз с помощью РНГА, целесообразно испытать эту реакцию для выявления бруцеллезных специфических антител в молоке и установить диагностическую ценность РНГА с молоком животных этого вида.

На основании изложенного, мы решили испытать РНГА с эритроцитарным бруцеллезным антигеном, разработанным ПЗНИВИ, ВГНКИ и ВНИИБТЖ, для исследования молока овец и коз, по сравнению с КР с молоком и сывороткой крови РА, РСК и РНГА.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности метода исследования на бруцеллез молока овец и коз.

При исследовании на бруцеллез молока коров в неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве в РНГА выявлено гемагглютининов в молоке 44% больных, тогда как по КР реагировало 31%, что доказывает чувствительность РНГА. Полученные результаты были подтверждены при одновременном исследовании коров в РБП, РА, РСК и РНГА с сыворотками крови.

На большом фактическом материале при серологическом исследовании крупного и мелкого рогатого скота установлено, что РНГА с разработанным нами эритроцитарным антигеном для исследования сывороток крови реакция по диагностической эффективности значительно превосходит используемые в ветеринарной практике другие методы диагностики бруцеллеза (РА, РСК, РБП и РИД с ОП-С антигеном), вместе взятые, выявляет больных бруцеллезом животных в более ранние сроки после заболевания и может заменить все эти реакции.

По заключению республиканских, краевых и областных ветеринарных лабораторий, испытавших РНГА, эта реакция обладает специфичностью, высокой чувствительностью и пригодна для массовых исследований животных на бруцеллез.

Поэтому мы решили испытать возможность использования РНГА для исследования молока овец и коз по сравнению КР с молоком и другими серологическими реакциями, применяемыми в практике для исследования сывороток крови (РНГА, РБП, РА и РСК).

Специфичность РНГА с бруцеллезным эритроцитарным антигеном и КР для исследования молока изучали путем исследования 220 проб молока от овец и коз благополучных по бруцеллезу хозяйств.

Результаты исследования даны в таблице 1.

Таблица 1 Результаты проверки специфичности РНГА и КР с молоком здоровых овец и коз благополучных по бруцеллезу хозяйств Количество животных Исследовано проб молока РНГА КР пол. отр. пол. отр. Овцы - 120 гол. 120 - 120 2 118 Козы - 100 гол. 100 - 100 1 99 Итого: 220 - 220 3 97

Как видно из таблицы 1, при исследовании 220 проб молока овец и коз в РНГА со всеми пробами молока здоровых животных получен отрицательный результат, что показывает ее специфичность, тогда как по КР в трех случаях получен положительный результат. При проверке животные, которые реагировали в КР с молоком положительно, оказались больными маститом.

В неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах исследованию в РНГА и КР были подвергнуты молоко и сыворотки крови от 95 овец и коз. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты испытания РНГА и КР с молоком в сравнении с РА, РСК и РНГА с сывороткой крови для исследования овец и коз неблагополучных по бруцеллезу хозяйств Исследовано овец и коз Молоко Сыворотки крови   РНГА КР РА+РСК РНГА   пол. % пол. % пол. % пол. % 95 12 12,6 5 5,3 8 8,4 12 12,6

Как видно из приведенных в таблице 2 данных, РНГА с молоком по чувствительности не уступает РНГА с сывороткой крови и превосходит КР с молоком и РА, РСК с сывороткой крови. В частности, положительная РНГА с сывороткой крови получена у 12 (12,6%) овец и коз, которые положительно реагировали и в РНГА с молоком, тогда как с помощью КР с молоком бруцеллез был установлен у 5 (5,3%) овец и коз. В РА и РСК реагировало 8 (8,4%) животных.

Дополнительно к КР с молоком, РНГА с молоком выявила 7 больных бруцеллезом овец и коз.

Достоверность показаний РНГА с молоком была подтверждена положительными результатами ПНР и РНГА с антительным бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом проб молока и образцов биоматериала (экстракт гомогенизированных лимфоузлов и органов) от больных бруцеллезом животных. Эти данные свидетельствуют о высокой эффективности РНГА с эритроцитарным антигеном, разработанным Прикаспийским зональным НИВИ, ФГБУ ВГНКИ и ВНИИБТЖ для исследования на бруцеллез молока овец и коз.

Наряду с этим, нами было подвергнуто исследованию в РНГА молоко от 2 коз, принадлежащих частным владельцам г. Хасавюрт и с. Новый Параул, реагировавших положительно на бруцеллез в РНГА с сывороткой крови.

В обоих случаях с молоком этих коз получена положительная РНГА в титрах 1:200 и 1:4092. При этом было установлено, что владельцы животных, употреблявшие козье молоко, заболели бруцеллезом в острой форме.

Проведенными исследованиями установлено, что использование РНГА с эритроцитарным антигеном для обнаружения бруцеллезных гемагглютининов в молоке овец и коз позволяет своевременно установить диагноз на бруцеллез, выявлять источник возбудителя болезни для людей и животных и является высокочувствительным и специфичным методом, пригодным для осуществления контроля за благополучием овцепоголовья по бруцеллезу.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики бруцеллеза овец и коз. Изобретение заключается в применении молока в реакции непрямой агглютинации для диагностики бруцеллеза овец и коз. Заявленное изобретение позволяет выявлять бруцеллезные гемагглютинины в молоке овец и коз, позволяет своевременно ставить диагноз на бруцеллез, установить источник возбудителя бруцеллеза для людей и животных и является более чувствительным способом, пригодным для диагностики бруцеллеза у овец и коз и осуществления контроля за благополучием овцеводческих хозяйств по бруцеллезу. 2 табл., 1 пр.

Применение молока в реакции непрямой агглютинации для диагностики бруцеллеза овец и коз.