Способ экспресс-диагностики бруцеллеза в овечьем и козьем молоке, предназначенном для реализации на сельскохозяйственном рынке Российский патент 2023 года по МПК G01N33/04 G01N33/53 

Изобретение относится к области ветеринарной экспертизы, а именно к методу исследования молока овец и коз на бруцеллез.

Возбудителем бруцеллеза мелкого рогатого скота является Br. melitensis, которая способна заражать и другие виды животных, а также весьма патогенна для человека. Заболевание распространено во многих странах мира, в том числе и Российской Федерации, особенно широко в Южном и Северо-Кавказском федеральных округах. Характерной особенностью бруцеллеза овец и коз является склонность его к переходу в хроническую, латентную форму. На внешний вид здоровое животное, приносящий, по внешним признакам вполне здоровый приплод, является источником заражения животных и людей. Зачастую завоз таких животных, без предварительного серологического исследования и карантина, является причиной возникновения вспышек бруцеллеза в ранее благополучных хозяйствах. С целью недопущения ввоза больных животных в благополучные хозяйства следует строго соблюдать регламент ветеринарных правил по борьбе с бруцеллезом животных [1, 2].

В последние годы во многих регионах России, в том числе Республиках Северного Кавказа, возрос интерес к разведению коз молочных пород. Наряду с этим дойку овец для производства брынзы и овечьего сыра практикуют в ряде сельхоз предприятий и крестьянско-фермерских хозяйств. Практически повсеместно стало использование козьего молока, как гипоаллергенного, для вскармливания грудных детей. Принимая во внимание увеличение спроса на молочную продукцию от мелкого рогатого скота и вирулентность Br.melitensis для человека, можно прогнозировать учащение случаев заболеваемости людей бруцеллезом в детском возрасте.

В связи с этим возникает острая необходимость разработки эффективного метода диагностики бруцеллеза в молоке овец и коз.

Из имеющихся диагностических тестов большое внимание заслуживает кольцевая реакция (КР) с молоком. Она широко применяется для исследования лактирующих коров, с целью контроля благополучия стада по бруцеллезу, а также для исследования рыночного молока. Преимуществом данного метода является простота постановки и быстрота получения результатов [3, 4].

С развитием овцеводства, открытием новых козьих ферм, повсеместной торговлей молоком на рынках и ярмарках вопрос исследования овечьего и козьего молока на бруцеллез приобретает большую актуальность.

Известен способ диагностики бруцеллеза мелкого рогатого скота (патент РФ №2303458, кл. A61K 39/10, 2007 г.), он заключается в исследовании сыворотки животного с антигеном в реакции иммунодиффузии, при этом в качестве антигена используют О-ПС М-антиген, приготовленный из вакцинного штамма В.melitensis Rev-1. Способ позволяет значительно повысить чувствительность метода и эффективность диагностики, однако требует больших трудозатрат и времени, и не приемлем для экспресс диагностики в условиях торговли на сельскохозяйственном рынке.

Также известен способ диагностики бруцеллеза (патент №2491545, кл. A61K 39/10, 2013 г.), который включает внесение в лунки диагностической пластины свежего или консервированного формалином молока, добавление антигена в дозе 0,015 мл, перемешивание компонентов, покачивание пластины в течение 4 минут, учет результатов реакции. В качестве антигена используют антиген для кольцевой реакции с молоком. Молоко вносят в количестве 0,03-0,04 мл. Положительный результат оценивают по образованию агглютината, собирающегося в виде колец различной ширины и интенсивности окрашивания по краю лунки.

В доступной патентно-технической литературе авторы не обнаружили данных по использованию кольцевой реакции для выявления бруцеллеза в овечьем и козьем молоке. Однако кольцевая реакция с молоком официально применяемая для исследования коров на бруцеллез опубликована в качестве аналога в патенте РФ №2571560, кл. A63K 39/00, 2015 г. и принята авторами за прототип. Сущность этой реакции заключается в следующем.

При постановке кольцевой реакции, предусмотрено использование серологических пробирок Флоринского для контрольных проб в дозе 2 мл молока от заведомо здорового животного и испытываемых проб смеси молока от здорового животного в количестве 2 мл с позитивной бруцеллезной сывороткой (антиген), помещение их в термостат или водяную баню при температуре 37-38°С, выдерживание при комнатной температуре и визуальный учет результатов реакции,

Результаты реакции учитывают визуально, в крестах по следующей схеме:

+++ (3 креста) - четко выраженное синее или красно-вишневое кольцо (в зависимости от использованного антигена) в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

++ (2 креста) - четко выраженное синее (красно-вишневое) кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый или бледно-розовый цвет;

+ (1 крест) - синее (красно-вишневое) кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик молока имеет синий (розовый) цвет;

- (минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий (красно-вишневый) цвет.

Все пробирки молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают положительными, 1 крест - сомнительными.

Преимущество кольцевой реакции с молоком заключается в простоте постановки, быстроте получения результатов.

Недостатком кольцевой реакции является ее слабая чувствительность и отсутствие возможности определения бруцеллеза в молоке овец и коз при его реализации на сельскохозяйственных рынках, особенно в южных регионах страны.

Основными причинами отсутствия возможности использования кольцевой реакции с молоком овец и коз при диагностике бруцеллеза являются:

- более мелкие жировые шарики молока овец и коз менее активны, чем у крупного рогатого скота, абсорбируют агглютинированные окрашенные бруцеллы (бруцеллезный антиген для кольцевой реакции с молоком) в положительных молочных образцах и не поднимаются для образования типичного окрашенного кольца;

- низкое содержание специфических антител в молоке овец и коз и слабая серологическая активность их по сравнению с антителами, содержащимися в коровьем молоке;

- при изменении кислотности овечьего или козьего молока в большую или в меньшую сторону от стандартных значений, проявляются большие погрешности при диагностировании бруцеллеза, что нарушает требования нормативных документов по безопасности молочных продуктов.

Техническим решением является расширение функциональных возможностей и повышение точности диагностирования бруцеллеза в молоке овец и коз, предназначенного для реализации.

Технический результат достигается тем, что в способе экспресс-диагностики бруцеллеза в овечьем и козьем молоке, предназначенном для реализации на сельскохозяйственном рынке, включающем постановку кольцевой реакции, предусматривающей использование серологических пробирок Флоринского для контрольных проб в дозе 2 мл молока от заведомо здорового животного и испытываемых проб смеси молока от здорового животного в количестве 2 мл с позитивной бруцеллезной сывороткой, помещение их в термостат или водяную баню при температуре 37-38°С, выдерживание при комнатной температуре и визуальный учет результатов реакции, согласно изобретению предварительно сырое молоко проверяют на кислотность, если кислотность козьего молока соответствует ГОСТУ 32940-2014, п. 4.3, а кислотность овечьего молока - 25±1°Т, то проводят постановку кольцевой реакции, при этом в серологические пробирки Флоринского с испытываемыми пробами молока добавляют не более 0,2 мл позитивную бруцеллезную сыворотку, помещают в термостат или водяную баню на 30 мин, выдерживают не более 15 мин при комнатной температуре и осуществляют учет результатов реакции.

Способ экспресс-диагностики бруцеллеза в овечьем и козьем молоке, предназначенном для реализации на сельскохозяйственном рынке осуществляют следующим образом.

Предварительно, известными методами, согласно нормативным документам, сырое молоко проверяют на кислотность.

Если кислотность козьего молока соответствует ГОСТУ 32940-2014, п. 4.3 (11-14°Т), а кислотность овечьего молока - 25±1°Т, то проводят постановку кольцевой реакции.

При не соответствии значения кислотности молока в меньшую сторону от стандарта, указывает на то, что молоко разбавлено водой, а в большую сторону - на наличие заболевания у животного и при диагностике такого молока будут наблюдаться большие погрешности, поэтому нет смысла проводить постановку кольцевой реакции.

При постановке кольцевой реакции используют серологические пробирки Флоринского для контрольных проб в дозе 2 мл молока от заведомо здорового животного и испытываемых проб смеси молока от здорового животного в количестве 2 мл с позитивной бруцеллезной сывороткой в дозе не более 0,2 мл. При меньшей дозе, как показала практика, кольцевая реакция не пригодна и дает большие погрешности при диагностике, при дозе больше 0,2 мл, наблюдаются те же результаты, что и при 0,2-х мл, поэтому нет смысла увеличивать дозу. Затем их помещают в термостат или водяную баню на 30 мин, выдерживают не более 15 мин при комнатной температуре и осуществляют учет результатов реакции.

Временные интервалы нахождения проб в термостате 30 мин и выдержки их при комнатной температуре 15-20 мин, как показали исследования, вполне достаточны для того чтобы начать учет результатов реакции. Таким образом, предложенные временные интервалы, сокращают время проведения кольцевой реакции по сравнению с прототипом в 2 раза.

Пример конкретного осуществления заявляемого способа

С целью выявления бруцеллеза в молоке с помощью кольцевой реакции (далее КР) исследовали пробы молока от 230 голов овец и коз, в том числе 80 проб от овец и коз из благополучного хозяйства Агрофирма им. «Даниялова» Гунибского района и 150 проб из частного подворья Карабудахкентского района. Для подтверждения результатов исследования молока параллельно проводились исследования сывороток крови от этих животных в РИГА (реакция непрямой гемагглютинации), РА (реакция агглютинации), РСК (реакция связывания комплемента). Все пробы молока были исследованы на мастит с применением препарата Алтест согласно его инструкции. Исследование сывороток крови овец в РА и РСК и молока в КР проводили согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных», РИГА - в соответствии с Инструкцией по применению «Набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)», утвержденной Россельхознадзором (2006 г.).

Молоко у животных сдаивали в пробирку с обоих долей вымени. Для постановки КР с молоком овец и коз брали 2 мл исследуемого молока и добавляли к нему 0,2 мл позитивной бруцеллезной сыворотки, встряхивали и ставили в термостат при t 37-38°С на 30 мин, затем выдерживали 15-20 мин при комнатной температуре.

Для определения специфичности и возможности использования КР с молоком как метода диагностики бруцеллеза у лактирующих овцематок и козематок было исследовано 80 голов мелкого рогатого скота из благополучного по данной инфекции хозяйства. Параллельно с КР проводились исследования сывороток крови в РНГА, РА и РСК, а также исследования молока на субклинический мастит. Во всех случаях получены отрицательные результаты, что свидетельствует о специфичности данного метода диагностики бруцеллеза в молоке.

С целью определения чувствительности КР с молоком диагностическим исследованиям было подвергнуто 139 голов овец и коз из личного подсобного хозяйства в Карабудахкентском районе (табл.2).

Как видно из таблицы 2, КР с молоком дала положительную реакцию в двух пробах, которые полностью совпали с данными серологических реакций и были отрицательными при исследовании на мастит.

Следует отметить, что под №24 была овцематка и КР с молоком у нее выглядела не классическим образом, образуя синее кольцо в верхней части пробирки, а иначе, кольцо образовалось на дне пробирки, упало в осадок. Это объясняется тем, что жировые шарики в молоке у овцематки маленькие.

Так проба под №42 (коза) дала положительную реакцию в КР и исследовании сыворотки крови (РИГА 1:400+++, РА 50#, РСК 1:10+++), отрицательно реагировала при исследовании на субклинический мастит. Проведенными исследованиями установлена специфичность КР с молоком при диагностике бруцеллеза у лактирующих овец и коз.

Таким образом, представленные данные подтверждают повышение чувствительности и пригодности использования КР для выявления бруцеллезных агглютининов в молоке мелкого рогатого скота, которые подтверждены серологическими исследованиями сывороток крови этих животных. Доказано, что применение этой реакции позволяет диагностировать бруцеллез в молоке у лактирующих овец и коз.

Литература

1. Бруцеллез мелкого рогатого скота / Щ.А. Турдиев, М.И. Искандаров, А.М. Гулюкин [и др.]. - Новосибирск: ООО "Сибирская академическая книга", 2019. - 426 с.

2. Бруцеллез как повод для серьезных опасений // Эффективное животноводство. - 2020. - №2(159). - С. 55-57.

3. Кабахова П.М. Сравнительное изучение кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза овец и коз с традиционными серологическими методами исследования / Кабахова П.М., Михаилов М.М., Яникова Э.А., Халиков А.А., Гулиева А.Т., Шехилалиева Г.М. //Горное сельское хозяйство. 2019. №1. С. 98-101.

4. Попова Т.Г. Диагностическое значение кольцевой реакции с молоком при бруцеллезе крупного рогатого скота / Т.Г. Попова, П.К. Аракелян, А.А. Новицкий [и др.] // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - №9. - С. 61-64.

Изобретение относится к области ветеринарной экспертизы, а именно к методу исследования молока овец и коз на бруцеллез. Способ экспресс-диагностики бруцеллеза в овечьем и козьем молоке включает постановку кольцевой реакции, предусматривающей использование серологических пробирок Флоринского для контрольных проб в дозе 2 мл молока от заведомо здорового животного и испытываемых проб смеси молока от здорового животного в количестве 2 мл с позитивной бруцеллезной сывороткой, помещение их в термостат или водяную баню при температуре 37-38°С, выдерживание при комнатной температуре и визуальный учет результатов реакции, причем предварительно, сырое молоко проверяют на кислотность, если кислотность козьего молока соответствует 14°Т, а кислотность овечьего молока - 25±1°Т, то проводят постановку кольцевой реакции. В серологические пробирки Флоринского с испытываемыми пробами молока добавляют позитивную бруцеллезную сыворотку в дозе не более 0,2 мл, помещают в термостат или водяную баню на 30 мин, выдерживают не более 15 мин при комнатной температуре и осуществляют учет результатов реакции. Изобретение обеспечивает повышение точности диагностирования бруцеллеза в молоке овец и коз при сокращении времени на проведение кольцевой реакции. 2 табл.

Способ экспресс-диагностики бруцеллеза в овечьем и козьем молоке, предназначенном для реализации на сельскохозяйственном рынке, включающий постановку кольцевой реакции, предусматривающей использование серологических пробирок Флоринского для контрольных проб в дозе 2 мл молока от заведомо здорового животного и испытываемых проб смеси молока от здорового животного в количестве 2 мл с позитивной бруцеллезной сывороткой, помещение их в термостат или водяную баню при температуре 37-38°С, выдерживание при комнатной температуре и визуальный учет результатов реакции, отличающийся тем, что предварительно, сырое молоко проверяют на кислотность, если кислотность козьего молока соответствует 14°Т, а кислотность овечьего молока - 25±1°Т, то проводят постановку кольцевой реакции, при этом в серологические пробирки Флоринского с испытываемыми пробами молока добавляют позитивную бруцеллезную сыворотку в дозе не более 0,2 мл, помещают в термостат или водяную баню на 30 мин, выдерживают не более 15 мин при комнатной температуре и осуществляют учет результатов реакции.