СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДИФТЕРИЙНЫХ МИКРОБОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может использовано для культивирования дифтерийных микробов на искусственных двухфазных питательных средах.

Заболеваемость дифтерией в современных условиях носит спорадический характер (Маркина С.С. и др. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в России в настоящее время // Вакцинация. - 2006, №3. С. 7-9). По мере снижения заболеваемости дифтерией роль больных как источников инфекции уменьшается, переходя к носителям, поэтому ликвидация дифтерии невозможна, не смотря на проводимую вакцинацию (Иванова В.В. и др. Бактерионосительство токсигенных коринебактерий дифтерии на эпидемическом спаде заболеваемости дифтерией // Российский медицинский журнал. - 2003, №5. С. 38-41). Система эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией в России предусматривает наблюдение за биологическими свойствами дифтерии - токсигенными Corynebacterium diphtheriae (С.Ю. Комбарова и др. Наблюдение за циркуляцией штаммов Corynebacterium diphtheriae, различающихся по признаку токсигенности // Эпидемиология. - 2009, №2. С. 108-111). В связи с этим необходимо разрабатывать не только новые методы диагностики дифтерийной инфекции и питательные среды, но и способы культивирования дифтерийных микробов, которые позволили бы выявлять возбудителя дифтерии не только у больных, но и носителей, при незначительным их содержании в исследуемом материале.

Таким образом, разработка новых высокоэффективных способов культивирования дифтерийных микробов является актуальной задачей современной медицинской микробиологии.

Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе найден способ культивирования дифтерийных микробов (МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 9 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.) на плотной питательной среде - кровяном теллуритовом агаре (КТА), принятый нами за прототип.

Способ культивирования дифтерийных микробов предусматривает посев исследуемого материала и его инкубацию при температуре +37°С. Порядок взятия исследуемого материала регламентируется МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 7-8 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.). Посев исследуемого материала производят в чашки Петри на плотную питательную среду КТА (МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 9 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.). Инкубацию засеянного материала в чашках с плотной питательной средой проводят однократно в течение 24 часов.

По данным МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 9-10 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.) появление видимого роста штаммов Corynebacterium diphtheriae наблюдается через 24-48 часов их культивирования. При высеве 0,1 мл взвеси дифтерийных микробов из разведения 10^-7 (100 м.т./мл) на плотной питательной среде (КТА) должна вырастать хотя бы одна колония (МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 24 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.).

Учет количества колоний Corynebacterium diphtheriae, выросших после культивирования согласно прототипу, проводят визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического.

Таким образом, недостатком прототипа является недостаточная эффективность способа культивирования, обусловленная длительным временем культивирования дифтерийных микробов, а также незначительным количеством или отсутствием вообще, колоний дифтерийных микробов на питательной среде, при их малом содержании в исследуемом материале.

Задачей предлагаемого решения является разработка высоэффективного способа культивирования дифтерийных микробов.

Техническим результатом, проявляющимся при реализации данного способа культивирования дифтерийных микробов, является сокращение времени культивирования и увеличение количества колоний дифтерийных микробов, при их малом содержании в исследуемом материале.

Технический результат достигается посевом исследуемого материала в емкость с двухфазной питательной средой для культивирования дифтерийных микробов, содержащей жидкую и твердую фазы в объемном соотношении 1:3, при этом исследуемый материал вносят в жидкую фазу двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов. Посев инкубируют трехкратно, первый раз - в течение 4,0 часов, при вертикальном положении емкости. Затем содержимое жидкой фазы перемешивают, емкость с двухфазной питательной средой устанавливают в наклонное положение таким образом, чтобы жидкая фаза питательной среды полностью смачивала всю поверхность твердой фазы. Далее посев при наклонном положении емкости повторно инкубируют в течение 0,5 часа. После этого емкость с посевом устанавливают в вертикальное положение и инкубируют в третий раз в течение 12,5 часов.

Подробное описание способа.

Для культивирования дифтерийных микробов используют двухфазную питательную среду, например, двухфазную питательную среду для культивирования дифтерийных микробов, защищенную патентом РФ №2455351 (опубликован 10.07.2012), содержащую жидкую и твердую фазы в объемном соотношении 1:3.

В качестве емкости для культивирования дифтерийных микробов в двухфазной питательной среде могут быть использованы, например, флаконы, объемом 100 мл, или биологические пробирки П-2-16-150 (ГОСТ 25336-82).

В качестве исследуемого материала могут быть использованы либо клинический материал, взятый из ротоглотки и носа обследуемого (МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 7 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.), либо микробная взвесь штаммов Corynebacterium diphtheriae, например, штамм Corynebacterium diphtheriae tox+665, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научно-медицинский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» (ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

Порядок взятия клинического материала регламентируется МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 7-8 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.).

Посев исследуемого материала - 0,1 мл микробной взвеси, например, штамма Corynebacterium diphtheriae tox+ 665, производят из разведений 10^-7 и 10^-8, содержащих 100 и 10 м.к./мл, соответственно, приготовленных согласно МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 24 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.).

Исследуемый материал вносят в жидкую фазу двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, защищенную патентом РФ №2455351 (опубликован 10.07.2012).

Инкубацию выполняют трехкратно при температуре +37°С в термостате, например, в термостате ТС-1/20 СПУ (производитель: Смоленское СКТБ СПУ, ОАО, Россия). Первый раз посев инкубируют в течение 4,0 часов при вертикальном положении емкости. После этого содержимое жидкой фазы перемешивают, емкость с двухфазной питательной средой устанавливают в наклонное положение таким образом, чтобы жидкая фаза питательной среды полностью смачивала всю поверхность твердой фазы. Затем посев при наклонном положении повторно инкубируют в течение 0,5 часа. Далее емкость с посевом устанавливают в вертикальное положение и инкубируют третий раз в течение 12,5 часов. Таким образом, общее время культивирования дифтерийных микробов согласно заявляемому способу культивирования составляет 17,0 часов.

Учет количества колоний Corynebacterium diphtheriae, выросших после их культивирования согласно заявляемому способу, производят, например, визуально.

Практическая реализуемость способа культивирования дифтерийных микробов на двухфазной питательной среде иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1: для культивирования дифтерийных микробов, согласно заявляемому способу культивирования дифтерийных микробов, была использована двухфазная питательная среда для культивирования дифтерийных микробов, защищенная патентом РФ №2455351 (опубликован 10.07.2012), содержащая 10 мл жидкой и 30 мл твердой фазы, т.е. в объемном соотношении 1:3, соответственно. В качестве емкости для двухфазной питательной среды использовали флаконы, объемом 100 мл. Исследуемым материалом была взвесь штамма Corynebacterium diphtheriae tox+ 665, полученного из ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Посев 0,1 мл микробной взвеси производили из разведений 10^-7 и 10^-8, содержащих 100 и 10 м.к./мл, соответственно, приготовленных согласно МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 24 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.).

Исследуемый материал вносили в жидкую фазу двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов.

Инкубацию выполняли трехкратно при температуре +37°С. Первый раз посев инкубировали в течение 4,0 часов при вертикальном положении емкости. После этого содержимое жидкой фазы перемешивали, емкость с двухфазной питательной средой устанавливали в наклонное положение таким образом, чтобы жидкая фаза питательной среды полностью смачивала всю поверхность твердой фазы. Затем посев при наклонном положении емкости повторно инкубировали в течение 0,5 часа. Далее емкость с посевом устанавливали в вертикальное положение и инкубировали третий раз в течение 12,5 часов. Общее время культивирования дифтерийных микробов составило 17,0 часов.

Учет количества колоний дифтерийных микробов, выросших после их культивирования согласно заявляемому способу, производили визуально.

Были получены следующие результаты: при времени культивирования 17 часов количество колоний из разведения 10^-7 составило 124 колонии, из разведения 10^-8 - 5 колонии.

Пример 2: для культивирования дифтерийных микробов, согласно заявляемому способу культивирования дифтерийных микробов, была использована двухфазная питательная среда для культивирования дифтерийных микробов, защищенная патентом РФ №2455351 (опубликован 10.07.2012), содержащая 10 мл жидкой и 30 мл твердой фазы, т.е. в объемном соотношении 1:3, соответственно. В качестве емкости для двухфазной питательной среды использовали флаконы, объемом 100 мл. Исследуемым материалом была взвесь штамма Corynebacterium diphtheriae tox+ 665, полученного из ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Посев 0,1 мл микробной взвеси производили из разведений 10^-7 и 10^-8, содержащих 100 и 10 м.к./мл, соответственно, приготовленных согласно МУК 4.2.3065-13.4.2. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Методические указания», с. 24 (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013 г.).

Исследуемый материал вносили в жидкую фазу двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов.

Инкубацию выполняли трехкратно при температуре +37°С. Первый раз посев инкубировали в течение 4,0 часов при вертикальном положении емкости. После этого содержимое жидкой фазы перемешивали, емкость с двухфазной питательной средой устанавливали в наклонное положение таким образом, чтобы жидкая фаза питательной среды полностью смачивала всю поверхность твердой фазы. Затем посев при наклонном положении емкости повторно инкубировали в течение 0,5 часа. Далее емкость с посевом устанавливали в вертикальное положение и инкубировали третий раз в течение 12,5 часов. Общее время культивирования дифтерийных микробов составило 17,0 часов.

Учет количества колоний дифтерийных микробов, выросших после их культивирования согласно заявляемому способу, производили визуально.

Были получены следующие результаты: при времени культивирования 17 часов количество колоний из разведения 10^-7 составило 87 колонии, из разведения 10^-8 - 3 колоний.

Для определения эффективности заявленного способа культивирования дифтерийных микробов нами было проведено 21 исследование. При культивировании взвеси взвесь штамма Corynebacterium diphtheriae tox+ 665, полученного из ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича, на двухфазной питательной среде, защищенной патентом РФ №2455351 (опубликован 10.07.2012) в течение 17,0 часов, из разведения микробной взвеси 10^-7 количество выросших колоний варьировало от 87 до 124, из разведения 10^-8 - от 3 до 5.

Для сравнительной характеристики мы параллельно проводили исследования способа культивирования дифтерийных микробов согласно прототипу. При времени культивирования взвеси дифтерийных микробов на КТА в течение 24 часов, из разведения микробной взвеси 10^-7 количество выросших колоний варьировало от 0 до 5, из разведения 10^-8 - рост дифтерийных микробов отсутствовал.

Таким образом, по сравнению с прототипом, время культивирования дифтерийных микробов согласно заявляемому способу сокращается более чем на 29% при значительном увеличении количества выросших колоний дифтерийных микробов из разведений 10^-7 и 10^-8.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов на искусственных двухфазных питательных средах. Способ предусматривает посев исследуемого материала в емкость с двухфазной питательной средой, содержащей жидкую и твердую фазы в объемном соотношении 1:3. Исследуемый материал вносят в жидкую фазу двухфазной питательной среды и посев инкубируют трехкратно. Первый раз - в течение 4,0 часов. Затем содержимое жидкой фазы перемешивают. Емкость с двухфазной питательной средой устанавливают в наклонное положение таким образом, чтобы жидкая фаза питательной среды полностью смачивала всю поверхность твердой фазы, и посев в наклонном положении повторно инкубируют в течение 0,5 часа. Затем емкость с посевом устанавливают в вертикальное положение и инкубируют в третий раз в течение 12,5 часов. Изобретение позволяет сократить время культивирования и увеличить количество колоний дифтерийных микробов при их малом содержании в исследуемом материале. 2 пр.

Способ культивирования дифтерийных микробов, включающий посев исследуемого материала и его инкубацию при температуре +37°С, отличающийся тем, что посев исследуемого материала производят в емкость с двухфазной питательной средой для культивирования дифтерийных микробов, содержащей жидкую и твердую фазы в объемном соотношении 1:3, причем исследуемый материал вносят в жидкую фазу двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, инкубацию выполняют трехкратно, причем первый раз посев инкубируют в течение 4,0 часов, после чего содержимое жидкой фазы перемешивают, емкость с двухфазной питательной средой устанавливают в наклонное положение таким образом, чтобы жидкая фаза питательной среды полностью смачивала всю поверхность твердой фазы, затем посев в наклонном положении повторно инкубируют в течение 0,5 часа, далее емкость с посевом устанавливают в вертикальное положение и инкубируют третий раз в течение 12,5 часов.