СИМБИОНТНЫЙ ШТАММ Corynebacteriae diphtheriae tox - № 108, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА, СОЗДАЮЩЕГО НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ВИРУСНОЙ ПРИРОДЫ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 C12R1/16 A61K39/05 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к симбионтному штамму Corynebacterium diphtheriae, который может быть использован в качестве биоматериала для получения препарата - иммуномодулятора, предназначенного для профилактики и лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Бактериальные препараты - пробиотики используются в ветеринарии для лечения и профилактики многих инфекционных заболеваний. Широко известно применение бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек, энтерококков и других представителей нормальной микрофлоры человека и животных для приготовления пробиотиков, биологически активных добавок к пище для профилактики и лечения в основном кишечных инфекций и дисбиозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [1, 2, 3, 4]. Известны иммуномодуляторы из штаммов коринебактерий Corynebacterium Krestovnikova - Troitskaya ГИСК №225 и ГИСК №226, которые не нашли широкого применения в практике [5, 6]. Препараты из штаммов коринеформных бактерий усиливают иммунологическую потенцию организма. Вакцины из коринеморфных бактерий повышают резистентность организма против различных форм новообразований: лейкозов, рака желудка, молочной железы и яичников. Эти штаммы не реактогенны и обладают малой аллергенностью. Одним из гипотетических механизмов действия данных вакцин является активация клеточного иммунитета конкретно нормальных К-клеток, благодаря активности которых происходит элиминация клеток супрессоров. Проведено экспериментальное исследование вакцины на лабораторных животных и лечение онкологических больных - добровольцев аутовакцинами из данного вида коринеформных бактерий [7]. Суть этого способа заключается в раздельном выращивании двух штаммов коринеформных бактерий на плотной модифицированной питательной среде, в смывании выросших культур хлоридом натрия, доведении путем разведения этим же раствором (Na Cl) культур до определенной концентрации и объединением двух суспензий в равном объеме. Затем объединенные суспензии прогревали на водяной бане до 80°С в течение одного часа, после чего раствор стерильно разливали по ампулам, которые затем запаивали. Полученный таким способом препарат предлагается в качестве иммуномодулятора для иммунокоррекции онкологических больных.

Однако способ получения неспецифического инактивированного жидкого иммуностимулятора из коринеформных бактерий (Corynebacterium Krestovnikova - Troitskaya) представляет собой биомассу целых клеток двух штаммов коринеформных бактерий, выделенных из крови онкологических больных. Этот вид коринебактерий относится к коринеморфным коринебактериям, которые не являются симбионтными, а следовательно, препараты из них не являются пробиотическими. Предлагаемые штаммы обладают небольшими, но аллергическими свойстами, их иммунногенность испытана на лабораторных животных и пациентах добровольцах (больные онкологическими заболеваниями), которые вакцинировались другими своими аутоштаммами.

Известен штамм бактерий Rodococcus equi ВИЭВ N 2, используемый как иммуностимулятор при изготовлении бактериальных вакцин. Штамм при введении с бактериальной вакциной против сальмонеллеза овец уменьшает реактогенность сальмонелл и стимулирует в организме выработку антител против основного возбудителя. Штамм апробирован с положительным результатом при изготовлении противосальмонеллезной вакцины [8].

Известно также использование псевдобактерийной палочки Corinebacterium parvum для получения ацетилированных экстрактов, обладающих иммуностимулирующим действием и усиливающим сопротивление к инфекциям вирусного происхождения. Этот вид коринебактерий относится к коринеморфным коринебактериям, которые не являются симбионтными, а препарат из них не является пробиотическим [9].

Задачей настоящего изобретения является выявление симбионтного штамма Corynebacterium diphtheriae tox ^- №108 с целью получения безопасного препарата иммуномодулятора, при использовании которого в профилактике и лечении инфекционных заболеваний повышается неспецифическая резистентность молодняка (телят и поросят) и взрослых особей сельскохозяйственных животных и исключаются вредные побочные явления.

Технический результат от реализации изобретения заключается в создании неспецифической резистентности сельскохозяйственных животных против инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, что позволяет снизить заболеваемость у сельскохозяйственных животных, сократить применение других лечебных препаратов, в том числе реактогенных вакцин и антибиотиков, приводящих к сенсибилизации организма, вторичным иммунодефицитам, нарушениям микроэкологии кишечника (дисбиозы) и к увеличению плотности циркуляции высокопатогенных антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов. Кроме этого введение иммуномодулятора в организм животных способствует получению экологически безопасного мясомолочного продукта и предлагает безопасную схему производственного процесса.

Штамм Corynebacterium diphtheriae tox ^- (нетоксигенный) №108 выделен из бактерионосителя - больной ангиной в ИКБ №1 г.Москва.

Предлагаемый штамм Corynebacterium diphtheriae tox ^- №108 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №381.

Штамм Corynebacterium diphtheriae tox ^- №108 имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

Согласно определителю бактерий Берджи [10] и Методическим Указаниям 4.2.698-98 98 «Лабораторная диагностика нетоксигенных и токсигенных коринебактерий дифтерии» [11] клетки штамма Corynebacterium diphtheriae tox ^- №108 принадлежат к виду Corynebacteriim diphtheriae, токсин не продуцируют. Клетки представляют собой на сывороточном агаре после 18 часов роста полиморфные палочки длиной от 1 до 5 мкм, толщиной от 0,3 до 0,6 мкм.

На мясном бульоне с добавлением сыворотки крупного рогатого скота клетки представляют собой после 18 ч роста с аэрацией однородные палочки длиной от 0,8 до 3 мкм, толщиной от 0,3 до 0,6 мкм.

На кровяно-теллуритовой плотной среде клетки растут в виде гладких, черно-серых колоний, на бульоне в пробирке в виде мелких гранул, выпадающих в осадок.

При посеве уколом в среду Пизу образуется почернение среды, по ходу укола и вокруг него образуется характерное «облачко» темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности.

Отношение к кислороду. Факультативный аэроб. Оптимум роста при 37°С.

Отношение к углеводам. Разлагает глюкозу, крахмал, не расщепляет сахарозу.

Проба на цистиназу - положительная, на уреазу - отрицательная.

Серологические свойства. Не типируется агглютинирующими сыворотками 1-11

серовариантов (схема Сусловой).

Штамм С.diphtheriae tox ^- №108 хранится в лиофилизированном состоянии в ампулах при +4°С (в холодильнике). В качестве наполнителя при сушке культуры используется обычная сахарозо-желатиновая среда (СЖ). Размножается штамм на мартеновском агаре, содержащем 10% сыворотки крупного рогатого скота, в течение 18 ч при температуре 37°С.

Отношение к фагам. По типированию коринефагами по схеме М.Д.Крыловой относится к группе три фаговара К.

Пример №1. Получение препарата - иммуномодулятора из штамма С.diphtheriae tox ^- №108.

Штамм С.diphtheriae tox ^- №108 выращивают в течение 16 ч на плотной питательной среде на основе рыбного гидролизата с добавлением сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37°С. Затем культуру смывают жидкой питательной средой на основе гидролизата казеина и после 5 ч культивирования вносят в рабочие емкости с той же жидкой питательной средой. Проводят выращивание биомассы при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 16 ч. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают физиологическим раствором при центрифугировании в режиме 5000 g в течение 20 мин. Влажный осадок взвешивают, суспендируют в забуференном физиологическом растворе с рН 7,2 до концентрации клеток 5%. Затем целые клетки дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм и охлаждении (льдом или водой) до 30°С. Полученную после ультразвуковой обработки гомогенную суспензию дезинтеграта центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок.

Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. Осадок, представляющий собой препарат клеточных стенок, ресуспендируют в физиологическом растворе и снова центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. Отмывание клеточных стенок от примеси цитоплазмы и питательной среды повторяют 3 раза. Отмытые клеточные стенки ресуспендируют в дистиллированной воде, полученный маточный раствор стерилизуют при температуре 100°С, и подвергают лиофильному высушиванию. Полученный сухой препарат - порошок беловатого цвета, после разведения в физиологическом растворе образует суспензию.

Возможность использования штамма С.diphtheriae tox ^- №108 при приготовлении иммуномодулятора, создающего неспецифическую резистентность животных против инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы у сельскохозяйственных животных, подтверждается следующими примерами.

Пример 2. Клиническая характеристика состояния иммунорезистентности у иммунизированных телят, а также у телят, родившихся от иммунизированных коров. Антигенная активность и безвредность препарата иммуномодулятора, полученного из штамма С.diphtheriae tox ^- №108 представлена в таблице 1.

Таблица 1 Группы животных Кол-во Наблюдение за состоянием телят (1-4 мес) падеж болели здоровые средний суточный привес за 3 мес (гр) абс /% Телята в возрасте 3-4 мес Здоровые телята, иммунизированные препаратом
Здоровые телята неиммунизированные препаратом (контроль) 35 0/0 1/2,8 31/97,0 745 170 9/5,3 34/20,0 127/74,7 656 Здоровые стельные коровы Телята, родившиеся от коров, иммунизированных препаратом
Телята, родившиеся от коров, неиммунизированных препаратом (контроль) 40 0/0 2/5,0 38/95,0 736           170 23/13,5 3/1,8 144/84,7 530

При иммунизации препаратом, полученным из штамма С.diphtheriae tox ^- №108, стельных коров и телят он проявляет себя как абсолютно безвредный (атоксичный, ареактогенный, легко переносимый, с отсутствием местных реакций). Выживаемость иммунизированных телят составляет 100%, в то время как в контрольной группе неиммунизированных телят падеж молодняка достигает 5,3 и 13,5%. Аналогичная картина наблюдается при показателях заболеваемости, при этом средний привес у вакцинированных животных выше, чем у животных контрольной неиммунизированной группы. Использование иммуномодулятора из симбионтного штамма С.diphtheriae tox ^- №108 для профилактической иммунизации животных приводит к снижению заболеваемости инфекциями, падежу, способствует увеличению среднесуточного привеса.

Пример №3. Одним из факторов показателей неспецифической резистентности макроорганизма является активность нейтрофилов, которые представляют первую линию защиты от внедрения возбудителей различных инфекций. Повышение неспецифической активности нейтрофилов представлено в таблице 2.

Таблица 2   Нейтрофильный фагоцитоз НСТ - тест   спонтанный индуцированный До иммунизациии 35,6±10,2% 0,2±0,1 0,29±0,1 После иммунизации 60,0±12,0% 1,7±0,48 1,6±0,3

Повышение неспецифической противоинфекционной резистентности после иммунизации животных препаратом из штамма С.diphtheriae tox ^- №108 отражается в увеличении активности поверхностных рецепторов иммунокомпетентных клеток (в тесте нейтрофильного дрожжевого фагоцитоза и НСТ - тесте). Необходимо отметить, что помимо прямой функции фагоцитарной активности, нейтрофилы выполняют в организме ряд других важных функций, непосредственно связанных с процессом неспецифической защиты. Таким образом, иммуномодулятор из штамма С.diphtheriae tox ^- №108 стимулирует увеличение функциональной значимости нейтрофилов.

Пример №4. Показатели эффективности профилактической иммунизации свиноматок препаратом, полученным из штамма С.diphtheriae tox ^- №108, представлены в таблице 3.

Таблица 3 № п/п Группа Свиноматки Поросята кол-во голов схема вакцинации * кол-во новорожденных поросят кол-во свиноматок с подсадкой средняя масса, (кг) новорожденные 2-мес 1 Опытная - иммунизированные свиноматки 14 ППД+ 140 5 1,27 19,2     ППД+             Препарат             (4 мкг)+             Препарат             (4 мкг)         2 Контрольная - неиммунизированные свиноматки 14 ППД+ 141 2 1,21 17,7 ППД+ ППД * ППД - комплексная вакцина против сальмонеллеза, пастериллеза и энтерококковой инфекции поросят, ассоциированная инактивированная.

Как видно из таблицы №3 свиноматки опытной группы иммунизировались по схеме введения вакцины ППД с заменой последней прививки на иммуномодулятор, с повторной ревакцинацией препаратом за 7 дней до опороса. Контрольная группа животных прививалась вакциной ППД по обычной схеме 3-х кратно. Наблюдения за новорожденными поросятами проводились в течение 3-х месяцев, количество новорожденных поросят в опытной и контрольной группе было одинаковым и равнялось 140 и 141 голов соответственно. Заболеваемость свиноматок в опытной и контрольной группах на обследуемый период (2 мес) не зарегистрирована. Показана безвредность препарата, отсутствие поствакцинальных реакций, хорошая его переносимость. Хорошее физиологическое состояние взрослых животных в опытной группе подтверждается дополнительной подсадкой поросят 5-и вакцинированным свиноматкам, в то время как в контрольной группе аналогичных свиноматок было 2. Средний вес новорожденных поросят в обеих группах был одинаковым и составил 1,27 кг в опытной и 1,26 кг в контрольной. К 2-месячному возрасту зарегистрирован прирост веса у поросят опытной группы на 1,5 кг выше, чем в контрольной.

Таким образом, показана безвредность препарата иммуномодулятора, полученного из штамма С.diphtheriae tox ^- №108, возможность отмены одной иммунизации свиноматок вакциной ППД, улучшение общего состояния здоровья иммунизированных свиноматок и поросят от них, что подтверждается увеличением их привеса к 2-месячному возрасту по сравнению с поросятами контрольной группы.

Пример №5. Показатели здоровья поросят до 2-месячного возраста в опытной (2-кратно вакцинированных иммуномодулятором) и в контрольной (невакцинированных иммуномодулятором) группах *. Эффективность проведения профилактической иммунизации поросят препаратом иммуномодулятором, полученным из штамма С.diphtheriae tox ^- №108, представлена в таблице 4.

Таблица 4 №
п/п Группы Кол-во голов новорожденных поросят, (%) Кол-во голов, (%) до 2-мес возраста Средняя масса (кг) поросят Кратность увеличения привеса погибло выжило новорожд. к 2-мес возрасту 1 поросята от иммунизированных свиноматок: опытная - двухкратное введение препарата - иммуномодулятора 77(100) 2(3) 75(97) 1,27 21,7 17 2 (400 мкг + 400 мкг)
контрольная - неиммунизированные 71(100) 22(31) 49(69) 1,26 19,2 15,2 3 контрольная - поросята, неиммунизированные от неиммунизированных свиноматок 144(100) 19(14) 125(8) 1,21 17,7 14,6 * двухкратное введение иммуномодулятора через 14 и 21 день после опороса в дозе 400 мкг подкожно.

В опытной группе 77 голов поросят, родившиеся от иммунизированных свиноматок, были вакцинированы по схеме: вакцина ППД и препарат - иммуномодулятор, с интервалом в 7 дней. В 1-ю контрольную группу вошли 71 новорожденный поросенок от иммунизированных препаратом свиноматок, без последующего введения иммуномодулятора. Во 2-ю группу контроля вошли 144 новорожденных поросенка от неиммунизированных свиноматок, которым так же, как и в первой группе, в дальнейшем иммуномодулятор не вводился.

Двухкратная иммунизация (после опороса) поросят значительно (от 11 до 28%) повысила к 2-месячному возрасту выживаемость поросят опытной группы (97%) по сравнению с неиммунизированными поросятами (контроль 1-69% и контроль 2-86%).

Двухкратное введение препарата - иммуномодулятора новорожденным поросятам способствует улучшению их общего состояния здоровья, что отразилось в значительных средних показателях привеса к 2-месячному возрасту по сравнению с поросятами контрольных групп (на 2,54 кг).

Из приведенных примеров видно, что использование изобретения в ветеринарии позволит снизить заболеваемость у сельскохозяйственных животных, сократить применение других лечебных препаратов, в том числе реактогенных вакцин и антибиотиков, приводящих к сенсибилизации организма, вторичным иммунодефицитам, нарушениям микроэкологии кишечника (дисбиозы) и к увеличению плотности циркуляции высокопатогенных антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов.

Таким образом, иммунизация сельскохозяйственных животных безвредным препаратом - иммуномодулятором, приготовленным из штамма С.diphtheriae tox ^- №108, будет способствовать увеличению выхода натурального экологически чистого целевого продукта - мяса и молока, безопасного для потребления людьми и без аллергического компонента в его составе. Использование препарата - иммуномодулятора в профилактических целях позволяет снизить возникновение (особенно в период осенне-зимних вспышек) инфекционных эпизоотий, исключить побочные явления при иммунизации животных (интоксикацию, аллергические реакции, иммунную супрессию и т.д.), которые, как правило, выявляются при использовании специфических вакцин, этиотропных препаратов и препаратов антибиотиков.

Список литературы

1. RU 2314819 С1, 20.01.2008.

2. RU 2233320 С2, 27.04.2003.

3. RU 2284354 С2, 27.09.2006.

4. RU 2067114 С1, 27.09.1996.

5. RU 2027755 С1, 27.01.1995.

6. RU 2027756 С1,27.01.1995.

7. RU 2127119 C1, 10.03.1999.

8. RU 2092551 С1, 12.10.1997.

9. SU 710503, 18.01.1980.

10. Bergey's Mannual of determinative Bacteriology - 9, 1994.

11. Методические Указания 4.2.698-98 «Лабораторная диагностика нетоксигенных и токсигенных коринебактерий дифтерии».

Изобретение относится к области биотехнологии. Симбионтный штамм Corynebacterium diphtheriae tox ^- №108 выделен из бактерионосителя - больной ангиной в ИКБ №1 г.Москва. Штамм безвредный, нереактогенный, не обладающий аллергическими свойствами, антигены которого повышают сопротивляемость макроорганизма против инфекцинных заболеваний. Штамм Corynebacterium diphtheriae tox ^- №108 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора» под №381. Изобретение обеспечивает создание неспецифической резистентности сельскохозяйственных животных против инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы. 4 табл., 5 пр.

Симбионтный штамм Corynebacterium diphtheriae tox - № 108 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора» под № 381, используемый для приготовления иммуномодулятора, создающего неспецифическую резистентность против инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы у сельскохозяйственных животных.