Способ ингибирования изомеризации восстанавливающего сахарида при тепловой обработке Российский патент 2023 года по МПК A23C7/04 

Настоящее изобретение относится к способам, включающим тепловую обработку водного раствора, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид. Более конкретно, данное изобретение относится к способам предотвращения изомеризации восстанавливающего сахарида в водном растворе при термической обработке водного раствора, содержащего данный восстанавливающий сахарид.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Поддержание стерильной среды часто является предпосылкой для культивирования клеток в процессах биотехнологического производства. Однако данные процессы часто склонны к чужеродному росту заносных бактерий, грибков или вирусов. Загрязнение заносными микроорганизмами оказывает серьезное воздействие на производственный процесс, так как оно ухудшает продуктивность (пониженная эффективность производства из-за деградации или модификации сырья, желательного продукта или желательной биомассы, и длительные периоды выключения биореактора для удаления загрязнения), качество продукта и безопасность продукта (посредством загрязнений конечного продукта из-за самого чужеродного роста и/или из-за метаболитов, продуцируемых нежелательными микроорганизмами).

Предупреждение чужеродного роста на биологическом продукте, а также в процессе его производства представляет сложность из-за вездесущей природы микроорганизмов и многих точек поступления микробов в производственный процесс. Для стерилизации оборудования (например, внутреннего пространства ферментера), ростовых сред, а также любых добавок в ростовые среды, которые необходимо использовать в процессе биотехнологического производства, разработали разные способы.

Для стерилизации соединений или композиций известно несколько способов, и они используются для устранения заносных микроорганизмов из сырья, подлежащего применению в процессах биотехнологического производства. Такие способы включают газовую стерилизацию (например, озоном или этиленоксидом), стерилизацию излучением (например, ультрафиолетовым излучением или гамма-излучением), стерилизацию ярким светом/импульсным светом, а также стерилизующую фильтрацию жидкостей и растворов, в частности, жидкостей и растворов, которые являются чувствительными к нагреванию или содержат по меньшей мере одно соединение, чувствительное к нагреванию.

Известно, что обработка нагреванием любых устойчивых к нагреванию материалов является самым надежным и эффективным способом стерилизации, и влажное тепло чаще всего используется для достижения тепловой стерилизации. Влажная тепловая (паровая) стерилизация подразумевает подвергание компонентов, подлежащих стерилизации, воздействию пара под давлением в течение некоторого времени. Типичными протоколами влажной тепловой стерилизации, которые используются для стерилизации оборудования и сырья, являются подвергание их воздействию насыщенного пара под высоким давлением при 115°С - 140°С в течение примерно 3-60 минут. Данные протоколы стерилизации могут варьировать, в зависимости от биологической нагрузки и природы сырья, раствора или поверхности, подлежащих стерилизации.

По существу, повреждение компонента неподходящим способом стерилизации может влиять на качество, безопасность или продуктивность процесса биотехнологического производства, таким образом, его необходимо избегать. Особенно жидкости могут подвергаться разным химическим реакциям из-за способов стерилизации с использованием нагревания, излучения или химических веществ.

Сложность таких химических реакций иллюстрируется примером термической обработки молока, которая обычно используется для уменьшения микробной нагрузки или для инактивации ферментов в молоке и, следовательно, для продления срока хранения молока. Известно, что происходят реакции Майяра, которые влияют на цвет и вкус молока, при его традиционной стерилизации при 121°С в течение 20 минут. Кроме того, известно, что из-за термической обработки молока происходит денатурация или инактивация белков или витаминов, а также реакции альдосахаров с аминокислотами или веществами, содержащими аминогруппу. Кроме того, также хорошо известно, что лактоза (4-O-β-D-галактопиранозил-D-глюкопираноза, номер CAS: 63-42-3) - важный компонент молока - изомеризуется до лактулозы (4-О-β-D-галактопиранозил-D-фруктофураноза, номер CAS: 4618-18-2) из-за термической обработки и далее деградирует до глюкозы и галактозы, а также до других продуктов деградации, таких как кислоты. Данному типу изомеризации благоприятствует основной рН, и он также известен как превращение Лобри де Брюйна-Альберда ван Экенштейна.

В попытках ограничить нежелательное влияние нагревания на качество и состав молока, используются альтернативные способы стерилизации, такие как «обработка ультравысокой температурой», при которой молоко подвергают воздействию температуры 140°С в течение времени от пары секунд до нескольких минут, или «низкотемпературная пастеризация», при которой молоко нагревают до температуры вплоть до 74°С. Тем не менее во время данных альтернативных способов стерилизации также происходят нежелательные реакции, опосредованные нагреванием, хотя и в меньшей степени.

Это могло бы быть дополнительно улучшено корректированием значений рН сырого обезжиренного молока, имеющего исходный рН 6,70, до значений от 6,59 до 6,72 перед его стерилизацией при 120°С в течение 10 минут. Это приводило к меньшему на 28% образованию лактулозы при рН 6,59 и к большему на 9% образованию лактулозы при рН 6,72 по сравнению с образованием лактулозы в исходном молоке.

При биотехнологическом производстве олигосахаридов человеческого молока, таких как 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, 3'-сиалиллактоза или 6'-сиалиллактоза, лактоза, как правило, используется в качестве исходной акцепторной молекулы для стадий дальнейшего гликозилирования, приводящих к производству желательного НМО (олигосахарид человеческого молока). Для предотвращения чужеродного роста в ферментационном бульоне, поставляемая лактоза должна быть стерилизована. Однако следует избегать присутствия лактулозы в ферментационном бульоне, так как она является известным слабительным, которое не должно присутствовать в молочной смеси первого уровня или в любом другом питательном продукте, дополняемом указанными НМО. Кроме того, лактулоза могла бы использоваться бактериями, продуцирующими НМО, в качестве альтернативной акцепторной молекулы, таким образом, приводя к олигосахаридам, которые не присутствуют в природе.

В качестве альтернативы термической обработке можно стерилизовать раствор лактозы посредством фильтрования. Типично стерилизующей фильтрации подвергают растворы, содержащие от 1 мМ до 1 М лактозы. Однако осуществление стерилизации большого количества раствора посредством фильтрования, что необходимо для производства в промышленном масштабе, является дорогим, времязатратным и менее надежным по сравнению с тепловой стерилизацией. Следовательно, необходим надежный, более удобный способ стерилизации лактозы без превращения или с превращением лишь крошечного количества лактозы до лактулозы.

Данная цель была достигнута способом, при котором кислотный рН раствора лактозы корректируется перед и/или по ходу подвергания нагреванию раствора лактозы, несмотря на то, что идея подкисления раствора сахара перед его термической обработкой также может применяться к сахаридам, отличным от лактозы.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ ингибирования изомеризации восстанавливающего сахарида в водном растворе, содержащем указанный восстанавливающий сахарид, при термической обработке указанного водного раствора посредством подкисления водного раствора перед и/или по ходу его термической обработки.

Во втором аспекте согласно настоящему изобретению предложен подвергнутый термической обработке водный раствор, содержащий по меньшей мере один восстанавливающий сахарид.

В третьем аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение подвергнутого термической обработке водного раствора, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, в биотехнологическом производстве биологического продукта.

В четвертом аспекте согласно данному изобретению предложены способы производства биологического продукта, в которых используется термически обработанный водный раствор, содержащий по меньшей мере один восстанавливающий сахарид.

В пятом аспекте согласно данному изобретению предложен биологический продукт, полученный биотехнологическим производством с использованием подвергнутого термически обработанного водного раствора, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложено применение биологического продукта, произведенного биотехнологическим производством с использованием термически обработанного водного раствора, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, для изготовления препарата.

В другом дополнительном аспекте согласно данному изобретению предложен препарат, содержащий биологический продукт, который был получен биотехнологическим производством с использованием подвергнутого тепловой обработке водного раствора, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показаны хроматограммы водного раствора, содержащего лактозу, (А) перед тепловой стерилизацией и (Б) после тепловой стерилизации. Водный раствор не подкисляли перед его тепловой стерилизацией. На ФИГ. 1В показана хроматограмма разных конкретных сахаридов, использованных в качестве стандартов.

На ФИГ. 2 показаны хроматограммы водного раствора, содержащего лактозу, (А) перед тепловой стерилизацией и (Б) после тепловой стерилизации. Водный раствор подкисляли перед его тепловой стерилизацией добавлением серной кислоты в данный водный раствор, содержащий лактозу. На ФИГ. 2В показана хроматограмма разных конкретных сахаридов, использованных в качестве стандартов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту предложен способ ингибирования изомеризации восстанавливающего сахарида в водном растворе, содержащем указанный восстанавливающий сахарид (водный раствор сахарида), при термической обработке указанного водного раствора сахарида, причем данный способ включает стадию подкисления водного раствора сахарида перед и/или по ходу его термической обработки.

Термин «восстанавливающий сахарид» в том виде, в контексте данного документа, относится к любому сахару или сахариду, который способен действовать в качестве восстановителя, так как он имеет свободную альдегидную группу. Данный восстанавливающий сахарид включает моносахариды, дисахариды и олигосахариды. Все моносахариды представляют собой восстанавливающие сахара, они могут классифицироваться на альдозы, которые имеют альдегидную группу, и кетозы, которые имеют кетоновую группу. Кетозы должны сначала таутомеризоваться до альдоз перед тем, как они могут действовать в качестве восстанавливающих Сахаров. Дисахариды образуются из двух моносахаридных остатков, и олигосахариды образуются из трех-семи моносахаридных остатков.

Дисахариды и олигосахариды могут классифицироваться как либо восстанавливающие, либо невосстанавливающие. Восстанавливающие дисахариды, подобные лактозе и мальтозе, имеют только один из их двух аномерных углеродов, участвующий в гликозидной связи, означая то, что они могут превращаться в формы с открытой цепью с альдегидной группой.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении восстанавливающий сахарид выбран из группы, состоящей из альдоз, дисахаридов и олигосахаридов.

Термин «альдоза» в в контексте данного документа относится к моносахаридам, которые содержат только одну альдегидную группу на молекулу. Примерами альдоз являются: D-(+)-глицеральдегид, D-(-)-эритроза, D-(-)-треоза, D-(-)-рибоза, D-(-)-арабиноза, D-(+)-ксилоза, D-(-)-ликсоза, D-(+)-аллоза, D-(+)-альтроза, D-(+)-глюкоза, D-(+)-манноза, D-(-)-гулоза, D-(-)-идоза, D-(+)-галактоза и D-(+)-талоза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении дисахарид выбран из группы, состоящей из лактозы, мальтозы, трегалозы, целлобиозы, хитобиозы, койибиозы, нигерозы, изомальтозы, софорозы, ламинарибиозы, гентибиозы, туранозы, матулозы, палатинозы, гентибиозы, маннобиозы, мелибиозы, мелибиулозы, рутинозы, рутинулозы и ксилобиозы.

Термин «олигосахарид» в контексте данного документа относится к сахаридам, состоящим из 3, 4, 5, 6 или 7 моносахаридных остатков и, таким образом, включает трисахариды, тетрасахариды, пентасахариды, гексасахариды и гептасахариды.

Для получения водного раствора сахарида, определенное количество по меньшей мере одного восстанавливающего сахарида растворяют в источнике воды. Указанная вода может быть выбрана из группы, состоящей из дистиллированной воды, бидистиллированной воды, деионизированной воды, грунтовой воды, речной воды, морской воды, водопроводной воды, воды для коммунальных нужд и воды, содержащей соли. Термин «вода, содержащая соли» в контексте данного документа, относится к водному раствору одной или более чем одной соли. В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор сахарида не содержит одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из белков, полипептидов, нуклеиновых кислот (таких как ДНК и/или РНК) и липидов (таких как жирные кислоты, моно-, ди- и/или триглицериды).

В одном воплощении данного способа водный раствор сахарида подкисляют до рН, имеющего значение от примерно 1 до примерно 6, предпочтительно до рН, имеющего значение от примерно 2 до примерно 5, и, более предпочтительно, до рН, имеющего значение от примерно 3 до примерно 4. Обнаружили то, что рН водного раствора сахарида, имеющий значение от примерно 3 до примерно 5, является особенно предпочтительным, так как изомеризация восстанавливающего сахарида ингибируется или даже предотвращается, тогда как образование продуктов деградации указанного восстанавливающего сахарида является пренебрежимо малым.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор сахарида подкисляют добавлением кислоты в водный раствор сахарида. Данная кислота может представлять собой любую кислоту, которая не приводит к нежелательной химической реакции с восстанавливающим сахаридом. Примером такой нежелательной химической реакции является образование муциновой кислоты, при добавлении азотной кислоты в водный раствор лактозы.

Данная кислота может быть выбрана из группы органических кислот и неорганических кислот, при условии, что неорганическая кислота не является азотной кислотой (или азотистой кислотой), если восстанавливающий сахарид представляет собой галактозу или галактозосодержащий сахарид, так как окисление галактозы или галактозосодержащих соединенй, таких как лактоза, азотной кислотой приводит к муциновой кислоте.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере одна кислота для подкисления водного раствора сахарида представляет собой неорганическую кислоту или минеральную кислоту. Неорганическая кислота представляет собой подходящую неорганическую кислоту, которая - в количестве, подлежащем добавлению в водные растворы сахаридов - самопроизвольно не реагирует с сахаридом. Например, добавление азотной кислоты в водный раствор лактозы может приводить к образованию муциновой кислоты. Неорганическая кислота предпочтительно выбрана из группы, состоящей из соляной кислоты, серной кислоты, сернистой кислоты, фосфорной кислоты, борной кислоты, фтористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, хлорной кислоты, перйодной кислоты и угольной кислоты.

В одном воплощении, в котором неорганическая кислота представляет собой угольную кислоту, водный раствор сахарида может быть подкислен тем, что водный раствор сахарида насыщают газом - диоксидом углерода - в контейнере под давлением.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере одна кислота для подкисления водного раствора сахарида представляет собой органическую кислоту. Органическая кислота может быть выбрана из группы, состоящей из монокарбоновых кислот, дикарбоновых кислот и трикарбоновых кислот.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении монокарбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из карбоновой кислоты, муравьиной кислоты (метановая кислота), уксусной кислоты (этановая кислота), пропионовой кислоты (пропановая кислота), масляной кислоты (бутановая кислота) и валериановой кислоты (пентановая кислота), но не ограничивается ими.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении дикарбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из щавелевой кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, глутаровой кислоты, адипиновой кислоты, малеиновой кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, глутаконовой кислоты, муконовой кислоты и цитраконовой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении трикарбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из лимонной кислоты, изолимонной кислоты и аконитовой кислоты.

Корректировка рН раствора сахарида до кислотного значения допускает термическую обработку восстанавливающего сахарида в водном растворе без или по меньшей мере с пониженной изомеризацией восстанавливающего сахарида.

Термин «термическая обработка» в контексте данного документа, охватывает нагревание или разогрев и/или поддержание водного раствора сахарида при повышенной температуре, т.е. при температуре выше комнатной температуры (21°С). Термическая обработка водного раствора сахарида включает нагрев водного раствора сахарида после подкисления и/или во время подкисления до температуры примерно 30°С, примерно 40°С, примерно 50°С, примерно 60°С, примерно 70°С или даже примерно 80°С и также включает поддержание водного раствора сахарида при такой температуре - возможно после того, как он был нагрет до даже более высоких температур - в течение длительного периода времени, т.е. в течение нескольких часов или даже суток, как, например, в течение примерно 20 часов, примерно 30 часов, примерно 40 часов, примерно 50 часов, примерно 60 часов, примерно 72 часов, но не ограничиваясь ими, или даже дольше.

Нагревание и/или поддержание водного раствора, содержащего восстанавливающий сахарид, при таких повышенных температурах без изомеризации или со значительно пониженной изомеризацией восстанавливающего сахарида дает многочисленные преимущества, такие как, например, возможность растворения большего количества сахарида в данном количестве воды, увеличивая, посредством этого, концентрацию сахарида в водном растворе и уменьшая объем водного раствора сахарида, подлежащего к введению в партию, для получения желательной конечной концентрации сахарида. Дополнительно и/или альтернативно, вязкость водного раствора сахарида может быть понижена нагреванием/поддержанием водного раствора сахарида при повышенной температуре, облегчая, посредством этого, обращение и/или прокачку водного раствора сахарида, например, через мембранный фильтр.

Термин «термическая обработка» в контексте данного документа также включает нагрев и/или поддержание водного раствора сахарида в течение некоторого времени при повышенной температуре, которая подходит для стерилизации водного раствора сахарида. Следовательно, «термическая обработка» также включает нагревание водного раствора сахарида до температуры в интервале примерно от 115°С до 150°С, но не ограничиваясь им, и поддержание данной темературы в течение вплоть до примерно 60 минут.

В одном воплощении тепловой обработки для стерилизации водного раствора сахарида данный водный раствор сахарида стерилизуют автоклавированием. Автокпавирование представляет собой один из самых важных способов разрушения микробов, в котором используется насыщенный перегретый пар. Конденсация пара на объекте, подлежащем стерилизации, высвобождает энергию, которая вызывает необратимое повреждение микроорганизмов. С данной целью внутренний объем автоклава вентилируется во время исходного повышения температуры. При осуществлении этого атмосферный воздух вытесняется из внутреннего объема и замещается насыщенным, перегретым паром. Вентиляция происходит с использованием поточного процесса или посредством фракционной вентиляции; как только вентиляция завершается, вентилирующий клапан закрывается. Это отмечает начало времени компенсации. После данного периода каждая точка объекта, подлежащего стерилизации, достигает требующейся температуры из-за эффекта насыщенного пара. После этого начинается фаза фактической стерилизации. Продолжительность стерилизации зависит как от микробной нагрузки, так и от температуры стерилизации. Автокпавирование при 121,1°С (250°F) в течение от 15 минут до 30 минут рассматривается как стандарт. Вегетативные формы, включающие прокариотические и эукариотические организмы, а также вирусы/бактериофаги, обычно могут инактивироваться в пределах нескольких минут при температурах 65°С-100°С, тогда как такие формы выживания, как споры, возможно должны обрабатываться при температурах вплоть до 140°С. Прионы требуют по меньшей мере 30 минут при 132°С-134°С и давлении 300 кПа для того, чтобы быть инактивированными или разрушенными. Последующая фаза охлаждения и, таким образом, конец цикла автоклавирования, начинается после времени стерилизации.

В альтернативном воплощении тепловой обработки для стерилизации водного раствора сахарида водный раствор сахарида стерилизуют способом, именуемым «обработка ультравысокой температурой» - способом непрерывной стерилизации, который включает нагревание водного раствора до температуры 130°С-150°С со 140°С в качестве главной точки. Соответствующее время поддерживания может варьировать от 8 до 40 секунд, иногда вплоть до 5 минут, в зависимости от свойств раствора, подлежащего стерилизации.

В еще одном воплощении термической обработки для стерилизации водного раствора сахарида данный водный раствор сахарида подвергают высокотемпературной/кратковременной (HTST) пастеризации, при которой данный раствор нагревают до температуры от 71,5°С до 74°С, предпочтительно до 72°С, в течение от примерно 15 секунд до примерно 30 секунд, и приводят в движение в контролируемом непрерывном потоке, в то же самое время подвергая указанной термической обработке.

В еще одном воплощении термической обработки для стерилизации водного раствора сахарида данный водный раствор сахарида подвергают «мгновенной пастеризации», при которой водный раствор сахарида подвергают воздействию температуры 71,7°С в течение 15 секунд.

Подкисление водного раствора восстанавливающего сахарида перед подверганием данного водного раствора сахарида любой из этих термических обработок и/или по ходу его термической обработки для стерилизации водного раствора сахарида ингибирует или даже предотвращает изомеризацию восстанавливающего сахарида в водном растворе при его тепловой обработке.

Таким образом, согласно второму аспекту предложен термически обработанный водный раствор, содержащий по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, полученный способом по первому аспекту, т.е. способом ингибирования изомеризации указанного восстанавливающего сахарида в водном растворе указанного восстанавливающего сахарида, включающим подкисление водного раствора сахарида до и/или в процессе термической обработки указанного водного раствора сахарида.

Термически обработанный водный раствор, содержащий по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, полученный подкислением данного водного раствора сахарида перед и/или в процессе его термической обработки, не содержит или содержит по меньшей мере меньшие количества нежелательных продуктов изомеризации указанного по меньшей мере одного восстанавливающего сахарида по сравнению с аналогичным водным раствором того же самого восстанавливающего сахарида, который не был подкислен до идентичной термической обработки.

В одном воплощении второго аспекта водный раствор, содержащий восстанавливающий сахарид, представляет собой стерильный водный раствор. Данный стерильный водный раствор, содержащий восстанавливающий сахарид, получают способом ингибирования изомеризации указанного восстанавливающего сахарида, как описано в данном документе ранее, включая термическую обработку указанного водного раствора сахарида для стерилизации указанного водного раствора сахарида. Таким образом, водный раствор был стерилизован термической обработкой.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор, содержащий восстанавливающий сахарид, имеет повышенную температуру, т.е. температуру примерно 30°С, примерно 40°С, примерно 50°С, примерно 60°С, примерно 70°С или даже примерно 80°С, и содержит восстанавливающий сахарид в количестве, которое выше, чем количество указанного восстанавливающего сахарида, который может быть растворен в воде при комнатной температуре. Например, предоставляется водный раствор, содержащий лактозу в концентрации, большей или равной 10 мМ, предпочтительно в концентрации, большей или равной 100 мМ, более предпочтительно в концентрации, большей или равной 0,66 М, наиболее предпочтительно в концентрации, большей или равной 1 М, если температура подкисленного водного раствора лактозы поддерживается при от примерно 40°С до примерно 60°С.

Водный раствор сахарида, содержащий по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, такой как, например, лактоза, в количестве, которое выше, чем количество сахарида, который может быть растворен в воде при комнатной температуре, может представлять собой стерильный водный раствор лактозы, который был стерилизован посредством термической обработки для стерилизации, как описано в данном документе ранее, и обеспечил охлаждение до желательной повышенной температуры, при которой поддерживается данный стерильный водный раствор сахарида.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения, предложено применение термически обработанного водного раствора, содержащего восстанавливающий сахарид, как описано в данном документе ранее, в биотехнологическом производстве биологического продукта. Производство биологического продукта

В одном воплощении применение термически обработанного водного раствора, содержащего восстанавливающий сахарид, в биотехнологическом производстве биологического продукта включает применение в процессе биокаталитического производства.

Понятно, что термин «процесс биокаталитического производства» в том виде, в котором он здесь используется, относится к процессу производства биологического продукта, в котором один или более чем один очищенный или выделенный фермент приводят в контакт с одним или более эдуктами в реакции in vitro для превращения одного или более эдуктов до желательного биологического продукта.

В альтернативном воплощении применение термически обработанного водного раствора, содержащего восстанавливающий сахарид, включает применение в процессе ферментативного производства. Термин «процесс ферментативного производства» в контексте данного документа относится к способу, в котором микроорганизмы выращивают в среде или бульоне с целью производства биологического продукта или специального продукта, который синтезируется микроорганизмами.

Применение термически обработанного водного раствора, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, где данный водный раствор сахарида был подкислен, как описано в данном документе ранее, перед и/или в процессе термической обработки водного раствора сахарида, является полезным, среди прочего, в том, что не присутствуют или присутствует меньше нежелательных продуктов изомеризации восстанавливающего сахарида в водном растворе сахарида, и что в процесс биотехнологического производства не поставляются или поставляется меньше нежелательных продуктов изомеризации по сравнению с аналогичным водным раствором сахарида, который не был подкислен перед его тепловой обработкой. Таким образом, нет необходимости удалять нежелательные продукты изомеризации из термически обработанного водного раствора сахарида до того, как его можно будет использовать в способе биотехнологического производства.

Согласно четвертому аспекту в данном изобретении предложены способы биотехнологического производства биологического продукта.

В одном воплощении способа биотехнологического производства биологического продукта данный способ представляет собой способ биокаталитического производства. Данный способ включает следующие стадии:

- предоставление по меньшей мере одного очищенного фермента;

- приведение в контакт по меньшей мере одного очищенного фермента с одним или более эдуктами в присутствии термически обработанного водного раствора сахарида, который был подкислен, как описано в данном документе ранее, перед и/или в процессе термической обработки, с реакцией для превращения одного или более эдуктов до желательного биологического продукта; и

- возможно очистка данного биологического продукта.

В одном воплощении по меньшей мере один восстанавливающий сахарид водного раствора сахарида представляет собой продукт извлечения способа биокаталитического производства.

В альтернативном воплощении способа биотехнологического производства данный способ представляет собой способ ферментативного производства.

Термины «ферментация» или «ферментативный» относятся к объемному росту микроорганизмов на или в ростовой среде (ферментационном бульоне) с целью производства конкретного химического продукта - «биологического продукта». С этой целью клетки одного или ограниченного числа штаммов микроорганизмов выращиваются в биореакторе (ферментере) при оптимальных условиях для того, чтобы данные микроорганизмы осуществляли желательную продукцию с ограниченной продукцией нежелательных примесей. Условия среды внутри биореактора, такие как температура, концентрации питательных веществ, рН и растворенные газы (особенно кислород для аэробных ферментаций), влияют на рост и продуктивность организмов и, следовательно, отслеживаются, контролируются и корректируются, если это необходимо.

Таким образом, способ ферментативного производства биологического продукта включает следующие стадии:

- предоставление клетки, которая способна продуцировать биологический продукт;

- культивирование по меньшей мере одной клетки в ферментационном бульоне, содержащем и/или дополняемым подвергнутым тепловой обработке водным раствором, содержащим по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, для того, чтобы по меньшей мере одна клетка продуцировала биологический продукт; и

- возможно очистка биологического продукта от ферментационного бульона.

В одном воплощении применения согласно третьему аспекту и/или способа согласно четвертому аспекту указанная живая клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку. Подходящие клетки включают клетки дрожжей, бактерий, архебактерий, грибов, насекомых, растительные клетки и животные клетки, включая клетки млекопитающих (такие как человеческие клетки и линии клеток).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении прокариотическая клетка представляет собой бактериальную клетку, предпочтительно выбранную из рода, выбранного из группы, состоящей из Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, видов рода Sporolactobacillus, видов рода Micromomospora, видов рода Micrococcus, видов рода Rhodococcus и Pseudomonas. Подходящими видами бактерий являются Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium celiulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Enterococcus thermophiles, Escherichia coil, Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus easel, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii, Lactococcus lactis, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus thermophiles и Xanthomonas campestris.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении эукариотическая клетка представляет собой дрожжевую клетку, клетку насекомого, растительную клетку или клетку млекопитающего. Дрожжевая клетка предпочтительно выбрана из группы, состоящей из видов рода Saccharomyces, в частности, Saccharomyces cerevisiae, видов рода Saccharomycopsis, видов рода Pichia, в частности, Pichia pastoris, видов рода Hansenula, видов рода Kluyveromyces, видов рода Yarrowia, видов рода Rhodotorula и видов рода Schizosaccharomyces.

В одном воплощении применения согласно третьему аспекту и/или способа согласно четвертому аспекту указанный биологический продукт представляет собой олигосахарид человеческого молока. Олигосахарид человеческого молока может быть выбран из группы, состоящей из следующих: 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, 2',3-дифукозиллактоза, лакто-N-триоза II, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-неофукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V, лакто-N-неофукопентаоза V, лакто-N-дифукогексаоза I, лакто-N-дифукозилгексаоза II, пара-лакто-N-фукозилгексаоза, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза b, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, дисиалил-лакто-N-фукопентаоза, 3-фукозил-3'-сиалиллактоза, 3-фукозил-6'-сиалиллактоза, лакто-N-неодифукогексаоза I, 3'-сиалиллактоза, 6'-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраозы LST-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраоза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении применения согласно третьему аспекту и/или способа согласно четвертому аспекту указанный восстанавливающий сахарид представляет собой лактозу. Данное воплощение имеет особое преимущество, где лактоза должна поставляться в ферментационный бульон для живых клеток для производства желательного олигосахарида человеческого молока. При способности уменьшать или избегать образования лактулозы при тепловой стерилизации водного раствора лактулозы способом по первому аспекту устраняется необходимость в удалении лактулозы из препарата НМО, когда препарат НМО должен использоваться для изготовления питательной смеси, особенно молочной смеси первого уровня, лечебного питания или пищевой добавки.

Применение термически обработанного водного раствора сахарида, содержащего по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, где водный раствор сахарида был подкислен, как описано в данном документе ранее, перед и/или в процессе его термической обработки в способе ферментативного производства дает дополнительные преимущества. Во-первых, настоящее изобретение обеспечивает стерилизацию водного раствора, содержащего восстанавливающий сахарид, посредством способов тепловой стерилизации без или с пониженной изомеризацией данного восстанавливающего сахарида. Следовательно, водный раствор, содержащий восстанавливающий сахарид, не должен быть стерилизован стерилизующей фильтрацией, которая является менее надежной, чем тепловая стерилизация (например, в отношении устранения бактериофагов), в частности, если необходимо стерилизовать большие объемы водного раствора сахарида, такие как несколько кубических метров. Кроме того, тепловая стерилизация больших объемов является более экономичной, чем стерилизующая фильтрация. Во-вторых, настоящее изобретение обеспечивает предоставление водных растворов сахарида, содержащих по меньшей мере один восстанавливающий сахарид, где концентрации по меньшей мере одного восстанавливающего сахарида выше, чем насыщающая концентрация по меньшей мере одного восстанавливающего сахарида при комнатной температуре, так как данный водный раствор сахарида можно нагревать и поддерживать при повышенной температуре, т.е. при температуре выше комнатной температуры. Кроме того, поддерживание водного раствора сахарида при повышенной температуре уменьшает вязкость водного раствора сахарида, что, в свою очередь, облегчает манипулирование с водным раствором сахарида, например, при прокачивании данного водного раствора сахарида через трубу или шланг. В третьих, возможность давать водный раствор сахарида, имеющий повышенную концентрацию сахарида, обеспечивает получение более высоких выходов продукта в способе ферментативного производства. Это происходит из-за того, что объем ферментера является ограниченным, и объем ферментационного бульона в ферментере возрастает во время процесса фементации из-за поставки, среди прочих, водного раствора сахарида в ферментационный бульон, причем водный раствор сахарида требуется для продукции желательного биологического продукта культивируемыми клетками. Чем выше концентрация сахарида в водном растворе сахарида, тем меньше объем водного раствора сахарида, который необходимо добавлять в ферментационный бульон для того, чтобы получать и/или поддерживать заданную концентрацию по меньшей мере одного восстанавливающего сахарида в данном ферментационном бульоне. Таким образом, при применении водного раствора сахарида согласно изобретению, имеющего повышенную концентрацию сахарида, в ферментационном бульоне в данном ферментере может достигаться более высокая концентрация сахарида или может поддерживаться заданная концентрация сахарида в течение более длительного периода времени, так как доступный для подпиток объем ферментера исчерпывается медленнее. Это, в свою очередь, предоставляет больше восстанавливающего сахарида клеткам для продукции желательного биологического продукта и, следовательно, увеличивает выход желательного биологического продукта, который может быть получен в ферментации с одной подпиткой. Следовательно, желательный биологический продукт может быть получен - в конце ферментационного процесса - в количестве, большем или равном 100 г/л в ферментационном бульоне, предпочтительно в количестве, большем или равном 150 г/л в ферментационном бульоне, более предпочтительно в количестве, большем или равном 200 г/л в ферментационном бульоне. Например, получали количества 2'-фукозиллактозы больше, чем 100 г/л, а именно: примерно 150 г/л, при использовании подкисленного 0,66 М водного раствора лактозы, который стерилизовали нагреванием, и можно получать даже более высокие выходы при дальнейшем увеличении концентрации лактозы в водном растворе, подлежащем подпитке в ферментационный бульон.

В еще одном воплощении применения согласно третьему аспекту и/или способа согласно четвертому аспекту по меньшей мере одним восстанавливающим сахаридом является лактоза, и указанный биологический продукт выбран из группы, состоящей из лактосахарозы и лактобионовой кислоты.

Таким образом, согласно четвертому аспекту в данном изобретении предложен биологический продукт, который был получен одним из способов согласно четвертому аспекту.

В одном воплощении данный биологический продукт представляет собой олигосахарид человеческого молока, предпочтительно олигосахарид человеческого молока, выбранный из группы, состоящей из следующих: 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, 2',3-дифукозиллактоза, лакто-N-триоза II, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-неофукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V, лакто-N-неофукопентаоза V, лакто-N-дифукогексаоза I, лакто-N-дифукозилгексаоза II, пара-лакто-N-фукозилгексаоза, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза b, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, дисиалил-лакто-N-фукопентаоза, 3-фукозил-3'-сиалиллактоза, 3-фукозил-6'-сиалиллактоза, лакто-N-неодифукогексаоза I, 3'-сиалиллактоза, 6'-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраозы LST-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраоза.

В альтернативном воплощении биологический продукт выбран из группы, состоящей из лактосахарозы и лактобионовой кислоты или производных вышеупомянутых олигосахаридов человеческого молока.

Согласно другому аспекту в данном изобретении предложено применение биологического продукта для изготовления препарата.

В одном воплощении применения биологического продукта для изготовления препарата данный биологический продукт представляет собой олигосахарид человеческого молока, выбранный из группы, состоящей из следующих: 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, 2',3-дифукозиллактоза, лакто-N-триоза II, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-неофукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V, лакто-N-неофукопентаоза V, лакто-N-дифукогексаоза I, лакто-N-дифукозилгексаоза II, лара-лакто-N-фукозилгексаоза, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза b, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, дисиалил-лакто-N-фукопентаоза, 3-фукозил-3'-сиалиллактоза, 3-фукозил-6'-сиалиллактоза, лакто-N-неодифукогексаоза I, 3'-сиалиллактоза, 6'-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраозы LST-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраоза. Препарат в данном воплощении выбран из группы, состоящей из питательных препаратов, предпочтительно молочной смеси первого уровня, лечебного питания и пищевых добавок.

При условии, что восстанавливающий сахарид представляет собой лактозу, способ ингибирования изомеризации согласно первому аспекту может предоставлять стерилизованный нагреванием раствор лактозы без или с пониженными количествами лактулозы для ферментативного производства олигосахарида человеческого молока. Указанный олигосахарид человеческого молока можно тогда использовать в изготовлении питательного препарата, предпочтительно молочной смеси первого уровня, которая не содержит или содержит меньшее количество эпилактозы, лактулозы и/или производного лактулозы, такого как фукозиллактулоза (без необходимости удаления лактулозы или ее производных из препарата НМО).

Согласно другому аспекту предложены препараты, содержащие по меньшей мере один биологический продукт, который был получен способом биотехнологического производства, как описано в данном документе ранее. Указанный препарат предпочтительно выбран из группы, состоящей из питательных препаратов, предпочтительно молочной смеси первого уровня, лечебного питания и пищевых добавок.

Настоящее изобретение будет описано в отношении конкретных воплощений и со ссылкой на графические материалы, но данное изобретение не ограничивается ими, но только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобные в описании и в формуле изобретения используются для различения между аналогичными элементами и не обязательно для описания последовательности, либо во времени, либо в пространстве, при ранжировании или в любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми при подходящих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, могут работать в других последовательностях, чем описанные или проиллюстрированные в данном документе.

Следует отметить то, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует интерпретировать как ограниченный значениями, перечисленными далее; он не исключает другие элементы или стадии. Таким образом, его следует интерпретировать как определяющего присутствие заявленных характеристик, целых чисел, стадий или компонентов в том виде, в котором на них дается ссылка, но он не исключает присутствия или добавления одной или более чем одной другой характеристики, целого числа, стадии или компонента, или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и Б» не должен ограничиваться устройствами, состоящими только из компонентов А и Б. Оно означает то, что по отношению к настоящему изобретению единственными релевантными компонентами устройства являются А и Б.

Ссылка во всем данном описании изобретения на «одно воплощение» или на «воплощение» означает то, что конкретное свойство, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включаются по меньшей мере в одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему данному описанию изобретения не обязательно все относятся к тому же самому воплощению, но могут относиться к нему. Кроме того, конкретные свойства, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим способом, как было бы очевидным обычному специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более чем одном воплощении.

Аналогичным образом, следует понимать то, что в описании типичных воплощений изобретения разные характеристики изобретения иногда группируются вместе в одном воплощении, графическом материале или его описании с целью оптимизации описания изобретения и помощи в понимании одного или более чем одного из разных изобретательских аспектов. Этот способ раскрытия, однако, не следует интерпретировать как отражающий замысел о том, что для заявленного изобретения требуется больше характеристик, чем прямо перечислено в каждом пункте формулы изобретения. Скорее, как отражают следующие пункты формулы изобретения, изобретательские аспекты находятся меньше, чем во всех характеристиках одного воплощения, раскрытого далее. Таким образом, формула изобретения, следующая за подробным описанием, является тем самым прямо включенной в данное подробное описание, причем каждый пункт формулы изобретения имеет собственную ценность в качестве отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не другие характеристики, включенные в другие воплощения, подразумевается то, что комбинации характеристик разных воплощений находятся в пределах объема данного изобретения и образуют разные воплощения, как было бы понятно специалистам в данной области. Например, в следующей формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описываются в данном документе в качестве способа или комбинации элементов способа, которые могут применяться процессором компьютерной системы или другими средствами осуществления данной функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для проведения такого способа или элемента способа формирует средство для осуществления данного способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения прибора представляет собой пример средства для осуществления функции, осуществляемой данным элементом с целью осуществления изобретения.

В предоставленных в данном документе описании и графических материалах излагаются многочисленные конкретные детали. Однако понятно то, что воплощения данного изобретения могут воплощаться на практике без данных конкретных деталей. В других случаях хорошо известные способы, структуры и методики не были подробно показаны для того, чтобы не мешать пониманию данного описания.

Данное изобретение теперь будет описываться посредством подробного описания нескольких воплощений данного изобретения. Понятно то, что могут быть скомпонованы другие воплощения данного изобретения согласно знаниям специалистов в данной области без отступления от истинной сущности или технической идеи данного изобретения, причем данное изобретение ограничивается только терминами приложенной формулы изобретения.

Пример 1 - подкисление лактозы органическими кислотами до тепловой стерилизации

0,66 М раствор лактозы получали растворением 226 г лактозы в воде. Конечный объем данного раствора составлял 1 литр. При температуре от 30°С до 35°С корректировали рН с использованием 50%-ного (масс./об.) цитрата или 99%-ной (об./об.) уксусной кислоты. Затем данный раствор стерилизовали в вертикальном автоклаве (Systec VX-65, Linden, Германия) при 121°С в течение 20 минут.Образцы отбирали до и после тепловой стерилизации и хранили замороженными до анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). ВЭЖХ проводили с использованием детектора показателя преломления RID-10A (Shimadzu, Германия) и амидной колонки Waters XBridge 3,5 мкм (250 × 4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенной с системой ВЭЖХ Shimadzu. Изократическую элюцию проводили с использованием 30% растворителя А (50%-ный (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1% (об./об.) NH₄OH) и 70% растворителя Б (80%-ный (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1% (об./об.) NH₄OH) при 35°С и скорости тока 1,4 мл мин^-1. Образцы осветляли твердофазной экстракцией на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). На колонку наносили десять микролитров образца (разведение 1:5). Наконец, определяли относительное количество выявленных Сахаров. Как показано в Таблицах 1 и 2, индуцированная тепловой стерилизацией изомеризация лактозы снижалась со снижением значений рН растворов перед тепловой обработкой. Образование лактулозы не могло наблюдаться при рН от 3,0 до 4,0 или рН 3,0 при проведении подкисления цитратом или уксусной кислотой соответственно. Катализируемая кислотой деградация лактозы до ее моносахаридов увеличивалась при меньших значениях рН, но не выявлялась при рН 4,5.

Пример 2 - подкисление лактозы неорганическими кислотами перед тепловой стерилизацией 0,66 М раствор лактозы получали растворением 226 г лактозы в воде. Конечный объем раствора составлял 1 литр. При температуре от 30°С до 35°С корректировали рН с использованием 37%-ной (об./об.) соляной кислоты, 50%-ной (об./об.) фосфорной кислоты или 96%-ной (об./об.) серной кислоты. Затем данный раствор стерилизовали в вертикальном автоклаве (Systec VX-65, Linden, Германия) при 121°С в течение 20 минут. Образцы отбирали до и после тепловой стерилизации и хранили замороженными до анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). ВЭЖХ проводили с использованием детектора показателя преломления RID-10A (Shimadzu, Германия) и амидной колонки Waters XBridge 3,5 мкм (250 × 4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенной с системой ВЭЖХ Shimadzu. Изократическую элюцию проводили с использованием 30% растворителя А (50%-ный (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1% (об./об.) NH₄OH) и 70% растворителя Б (80%-ный (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1% (об./об.) NH₄OH) при 35°С и скорости тока 1,4 мл мин^-1. Образцы осветляли твердофазной экстракцией на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). На колонку наносили десять микролитров образца (разведение 1:5). Наконец, определяли относительное количество выявленных сахаров. Как показано в Таблицах 3, 4 и 5, индуцированная тепловой стерилизацией изомеризация лактозы снижалась вследствие повышенного подкисления растворов перед тепловой обработкой. Образование лактулозы не могло наблюдаться при рН от 3,0 до 3,5. В отличие от этого, катализируемая кислотой деградация лактозы до ее моносахаридов увеличивалась при меньших значениях рН, но отсутствовала при значениях рН от 4,0 до 4,5 или от 4,0 до 5,0 при использовании для подкисления фосфорной кислоты и серной или соляной кислоты соответственно.

Показано процентное количество сахаров (площадь под кривой - AUC), выявленное ВЭЖХ.

проводили с использованием 96%-ной (об./об.) серной кислоты. Показано процентное количество сахаров (площадь под кривой - AUC), выявленное ВЭЖХ.

Пример 3 - улучшенный способ производства 2'-фукозиллактозы Согласно Европейской патентной заявке 16196486 использовали генетически модифицированный штамм Е. coli BL21 (DE3) ΔnagAb ΔwcaJ ΔfuclK ΔpfkA, сверхэкспрессирующий ферменты синтеза de novo ГДФ-фукозы (ManB, ManC, Gmd, WcaG), бифункциональную L-фукокиназу/L-фукозо-1-фосфатгуанилтрансферазу Bacteroides fragilis, ген 2-фукозилтрансферазы wbgL из Е, соli:O126, ген лактозопермеазы lacY, выводящий переносчик сахаров yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri АТСС 43970, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазу (fbaB) и гетерологичную фруктозо-1,6-бисфосфат фосфатазу (fbpase) из Pisum sativum.

Штамм Е, coli культивировали в 3 л ферментере при 33°С в среде минеральных солей, которая содержит 3 г/л KН₂РO₄, 12 г/л K₂НРO₄, 5 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,3 г/л лимонной кислоты, 2 г/л MgSO₄ × 7Н₂O, 0,1 г/л NaCl и 0,015 г/л CaCl₂ × 6Н₂O с 1 мл/л раствора микроэлементов (54,4 г/л цитрата аммония Fe(III), 9,8 г/л MnCl₂ × 4Н₂O, 1,6 г/л CoCl₂ × 6Н₂O, 1 г/л CuCl₂ × 2Н₂O, 1,9 г/л Н₃ВO₃, 9 г/л ZnSO₄ × 7Н₂O, 1,1 г/л Na₂MoO₄ × 2Н₂O, 1,5 г/л Na₂SeO₃, 1,5 г/л NiSO₄ × 6Н₂O), 2% (об./об.) глицерина в качестве единственного источника углерода и энергии, а также 60 мМ стерилизованную нагреванием лактозу, которую подкисляли до рН 3,0 96%-ной (об./об.) серной кислотой перед стерилизацией. рН поддерживали при 7,0 посредством титрования 25%-ным аммиаком. Ферментер инокулировали до ОП₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм) 0,1 предкультурой, выращенной в описанной среде, но не содержащей лактозу. После выхода из фазы подпитки, на который указывает увеличение уровня растворенного кислорода, начинали подпитку глицерином (60% об./об.), а также 0,66 М лактозой (подкисленной до рН 3,0 с использованием 96%-ной (об./об.) серной кислоты перед тепловой стерилизацией). Концентрацию лактозы 10-40 мМ поддерживали на протяжении всей фазы продукции ферментационного процесса, регулируя согласно анализам ВЭЖХ. Глицерин (60% об./об.) подпитывали со скоростями тока 6-8 мл/л/ч (относительно исходного объема). Ферментацию останавливали при достижении максимума объема заполнения емкости. В данной точке в супернатанте культуры бульона определяли титр 2'-фукозиллактозы 146 г/л.

В ходе способов ферментации 2'-фукозиллактозы с использованием подвергнутой стерилизующей фильтрации лактозы, вместо подкисленной, подвергнутой тепловой стерилизации лактозы, достигались сопоставимые титры 2'-фукозиллактозы. Кроме того, вид и количества побочных продуктов, выявленных в культуральном бульоне ферментаций, проведенных с использованием подвергнутой стерилизующей фильтрации или тепловой стерилизации (подкисленной) лактозы, были сравнимыми. Ни один из побочных продуктов типа лактулозы, эпилактозы, фукозиллактулозы или фукозилэпилактозы, а также других побочных продуктов, которые могут образоваться в результате добавления лактозы, стерилизованной нагреванием, не был выявлен в бульоне при предоставлении для ферментации подкисленной, стерилизованной нагреванием лактозы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ ингибирования изомеризации восстанавливающего сахарида в водном растворе при термической обработке, проводимой для стерилизации водного раствора сахарида, который включает стадию подкисления водного раствора сахарида до термической обработки путем добавления по меньшей мере одной кислоты в водный раствор сахарида до рН от 1 до 6. Термическая обработка включает нагревание водного раствора сахарида до температуры в диапазоне от 115 до 150°С и поддержание этой температуры в течение 60 минут, или автоклавирование водного раствора сахарида при 121,1°С в течение интервала от 15 до 30 минут, или нагревание водного раствора до температуры в интервале от 130 до 150°С и поддерживание этой температуры вплоть до 5 минут, или подвергание водного раствора воздействию температуры в диапазоне от 71,5 до 74°С в течение периода от 15 до 30 секунд. Восстанавливающий сахарид представляет собой лактозу. Изобретение обеспечивает высокую эффективность при реализации. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 3 пр.

1. Способ ингибирования изомеризации восстанавливающего сахарида в водном растворе, содержащем указанный восстанавливающий сахарид, при термической обработке, проводимой для стерилизации указанного водного раствора сахарида, причем данный способ включает стадию подкисления водного раствора сахарида до термической обработки, причем водный раствор сахарида подкисляют добавлением по меньшей мере одной кислоты в указанный водный раствор сахарида до значения рН между 1 и 6; причем термическая обработка включает нагревание водного раствора сахарида до температуры в диапазоне от 115°С до 150°С и поддержание этой температуры в течение вплоть до 60 минут, или автоклавирование водного раствора сахарида при 121,1°С в течение интервала от 15 до 30 минут, или нагревание водного раствора до температуры в интервале от 130 до 150°С и поддерживание этой температуры вплоть до 5 минут, или подвергание водного раствора воздействию температуры в диапазоне от 71,5 до 74°С в течение периода от 15 до 30 секунд; и причем восстанавливающий сахарид представляет собой лактозу.

2. Способ по п. 1, в котором водный раствор сахарида подкисляют до рН, имеющего значение от примерно 2 до примерно 5, и более предпочтительно до рН, имеющего значение от примерно 3 до примерно 4.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором кислота представляет собой неорганическую кислоту, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из соляной кислоты, серной кислоты, сернистой кислоты, фосфорной кислоты, борной кислоты, фтористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, хлорной кислоты, йодистоводородной кислоты и угольной кислоты.

4. Способ по п. 1 или 2, в котором кислота представляет собой органическую кислоту, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из монокарбоновых кислот, дикарбоновых кислот и трикарбоновых кислот.

5. Применение стерильного водного раствора, содержащего по меньшей мере лактозу в качестве восстанавливающего сахарида, полученного способом по любому из пп. 1-4, в способе биотехнологического производства олигосахарида человеческого молока, причем указанный способ включает следующие стадии:

- предоставление по меньшей мере одной клетки, которая способна продуцировать олигосахарид человеческого молока;

- культивирование по меньшей мере одной клетки в ферментационном бульоне, содержащем и/или дополняемым стерильным водным раствором олигосахарида, причем лактоза находится в стерильном растворе в концентрации, большей или равной 0,66 М, для того, чтобы по меньшей мере одна клетка продуцировала олигосахарид человеческого молока; и

- возможно, очистку указанного олигосахарида человеческого молока от ферментационного бульона.

6. Применение по п. 5, где лактоза находится в стерильном водном растворе в концентрации, равной или больше 1 М, и стерильный водный раствор представляет собой стерилизованный влажным теплом водный раствор.

7. Применение по п. 5 или 6, где олигосахарид человеческого молока получают в количестве, большем или равном 100 г/л, в ферментационном бульоне, предпочтительно в количестве, большем или равном 150 г/л, в ферментационном бульоне, более предпочтительно в количестве, большем или равном 200 г/л, в ферментационном бульоне, в конце процесса ферментации.

8. Применение по любому из пп. 5-7, где олигосахарид человеческого молока выбран из группы, состоящей из следующего: 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, 2',3-дифукозиллактоза, лакто-N-триоза II, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-неофукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V, лакто-N-неофукопентаоза V, лакто-N-дифукогексаоза I, лакто-N-дифукозилгексаоза II, пара-лакто-N-фукозилгексаоза, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза b, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, фукозил-лакто-N-сиалилпентаоза с, дисиалил-лакто-N-фукопентаоза, 3-фукозил-3'-сиалиллактоза, 3-фукозил-6'-сиалиллактоза, лакто-N-неодифукогексаоза I, 3'-сиалиллактоза, 6'-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраозы LST-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраоза.