СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ДОЗЫ ПРОТИВОЭПИЛЕПТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА И РИСКА РАЗВИТИЯ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/68 

Область техники.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, клинической генетике и фармакогеномике и может быть использовано в медицине, а именно в неврологии и психиатрии, для подбора лекарственной терапии при лечении эпилепсии и выявления риска развития побочных неблагоприятных эффектов.

Уровень техники.

В настоящее время при подборе противоэпилептической терапии используется комплексный подход, который включает в себя анамнез пациента, данные компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ), показатели электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и результаты биохимических анализов. Однако даже с учетом совокупности данных сведений лишь у небольшого процента пациентов (3-10%) удается добиться контроля над приступами, тогда как до 85% пациентов в России получают противоэпилептическую фармакотерапию [Зеньков Л.Р. Место вальпроатов (Депакин) в фармакотерапии эпилепсии XXI века // Российский Медицинский Журнал т. 17, №11, 2009 г.].

Столь низкий процент ремиссий объясняется, прежде всего, индивидуальной реакцией пациента на препарат. При этом одну из ведущих ролей в формировании ответа на терапию играют генетические факторы. В то же время, в соответствии с действующей на сегодня практикой, подбор препарата осуществляется методом проб и ошибок без учета генетического профиля пациента. При данном сценарии поиск наиболее эффективной терапии для конкретного пациента может занимать несколько месяцев, при этом определенный процент пациентов не будет получать адекватную терапию или будет испытывать серьезные побочные эффекты.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики индивидуальной чувствительности пациентов к противоэпилептическим препаратам (WO 2009/006793 A1, 15.01.2009) путем оценки аллельных вариантов гена SCN2, ассоциированных с резистентностью к противоэпилептической терапии, и суждения об ответе на противоэпилептическую терапию по наличию полиморфизма.

Однако выбор лишь одного гена (SCN2) и определение риска развития резистентности пациента ко всем противоэпилептическим препаратам не учитывает влияния полиморфизмов других генов, продукты которых связаны с фармакодинамическими характеристиками противоэпилептического препарата (ПЭП). Кроме того, для клинициста более важной является информация о диапазоне средней эффективной дозы для конкретного препарата, а также профиль переносимости препарата, что не учитывается при реализации этого способа. Следует также отметить, что в прототипе используется дорогостоящий метод микроэррей, что делает данный способ малодоступным для практического применения.

Раскрытие изобретения.

Задача настоящего изобретения заключалась в разработке способа диагностики индивидуальной чувствительности пациентов к противоэпилептическим препаратам, который обеспечивает выбор оптимальной дозы препарата, выявление риска развития побочных неблагоприятных эффектов для данного конкретного пациента.

При решении указанной задачи достигаются следующие технические результаты:

- уменьшение сроков проведения диагностики и подбора противоэпилептических препаратов;

- определение эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и риска развития побочных эффектов исходя из генотипа конкретного пациента и тендерного фактора;

- повышение процента пациентов, получающих адекватную противоэпилептическую терапию;

- снижение количества пациентов, испытывающих серьезные побочные эффекты при назначении противоэпилептических препаратов;

- выбор наиболее эффективного противоэпилептического препарата, за счет учета влияния полиморфизмов нескольких генов, продукты которых связаны с фармакодинамическими и (или) фармакокинетическими характеристиками противоэпилептического препарата;

- определение диапазона средней эффективной дозы конкретного противоэпилептического препарата;

- снижение стоимости диагностики за счет исключения дорогостоящих дополнительных исследований;

Для достижения указанных технических результатов у пациента проводят забор любого биологического материала, например крови или слюны, выделяют из этого материала ДНК и проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по определенным генам кандидатам (Таблица 1). Гены-кандидаты выбирают на основании имеющихся данных о зависимости ответа на терапию от аллельных вариантов генов, определяющих фармакокинетические и фармакодинамические характеристики противоэпилептического препарата. Затем проводят рестрикцию фрагментов выбранных генов кандидатов на выявление аллельных вариантов, присущих конкретному пациенту, и сопоставляют установленный аллельный вариант с эмпирически полученными данными об эффективной терапевтической дозе препарата и предрасположенностью пациента к развитию побочных эффектов и выносят суждение об оптимальной терапии.

В заявляемом способе, в качестве генов кандидатов (ДНК-маркеров), ассоциированных с расчетом эффективной терапевтической дозы ПЭП и риском прогнозирования побочных эффектов, предлагается использовать:

1) для противоэпилептических препаратов, относящихся к группе жирных кислот, на примере вальпроевой кислоты - ДНК-маркеры PPARy (Pro12Ala), PCKS1 (Ser690Thr) для выявления рисков развития побочных эффектов и FABP2 (Ala54Thr) для подбора и расчета адекватной терапевтической дозы;

2) для трициклических соединений с карбомоильной группой (производных иминостильбена), например карбамазепина - ДНК-маркер MDR1 (С3435Т) для подбора и расчета адекватной терапевтической концентрации;

3) для представителей блокаторов натриевых каналов, например ламотриджина - ДНК-маркер SCN1A (SCN1IVS5N (5G>A)) для подбора и расчета адекватной терапевтической дозы;

4) для противоэпилептических препаратов, относящихся к группе сахаров, например топирамата (производного фруктозы) - ДНК-маркеры Glut9 (Val253Ile), URAT1 (-788 Т>А), SERT (5HTTLPR), ТРН2 (rsl0748185) для выявления рисков развития побочных эффектов и UGT2B7 (С802Т) для подбора и расчета адекватной терапевтической дозы.

При разработке данных ДНК-маркеров было обследовано 400 пациентов старше 18 лет, принимавших противоэпилептические препараты такие как, например, топирамат, карбамазепин, вальпроевую кислоту или ламотриджин в режиме монотерапии с эффективным контролем над приступами (урежение приступов не менее чем на 50%). Все клинические эффекты, установленные в результате фармакогенетического тестирования и содержащиеся в описании способа, выдерживали уровень значимости p<0.05.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

У пациента производят забор биологического материала: 1 мл крови или 1 мл слюны и выделяют из него ДНК фенол-хлороформным методом (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Используя специфические праймеры к полиморфным локусам (Таблица 1) проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на термоциклерах, например, известных как Techne (UK), Perkin-Elmer Cetus (USA) или МС-2 "ДНК-технология" (Москва). Аллельные варианты определяют, например, путем рестрикционного анализа с последующим электрофорезом на горизонтальных пластинах 1-4% агарозного геля, приготовленного на буфере для электрофореза (Трис-ацетатный буфер ТАЕ) с добавлением бромистого этидия. Аллельные варианты определяют по критерию наличия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе с определенным молекулярным весом. Результаты визуализируют в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе или с помощью системы гель-документирования, например, известной как "Vilber Laurmat". Аллельный вариант каждого гена определяет индивидуальную чувствительность пациента к противоэпилептической терапии. Таким образом, путем сопоставления выявленного аллельного варианта исследуемого гена с эмпирически полученными данными об эффективной терапевтической дозе, соответствующей данному аллельному варианту, выносится суждение о средней расчетной эффективной дозе противоэпилептического препарата, необходимой для конкретного пациента. В отношении определения риска развития побочных эффектов также следует руководствоваться сопоставлением выявленного аллельного варианта с эмпирическими данными о зависимости риска развития побочных эффектов от определенного аллельного варианта.

i) При приеме вальпроевой кислоты генотипирование осуществляется по генам PPARy, PCKS1 для выявления наличия риска развития побочных эффектов и по гену FABP2 для подбора и расчета адекватной терапевтической дозы вальпроевой кислоты:

- При выявлении генетического полиморфизма Ala54Thr гена FAPB2 (генотипы АА и AG (А+)) экспериментально установлено, что эффективными были средние дозы в 910 мг/сут, тогда как при наличии генотипа GG средние эффективные дозы составили 1131 мг/сут. Это свидетельствует о том, что для достижения терапевтического эффекта пациентам с GG генотипом требуется более высокая доза вальпроевой кислоты.

- Наличие гомозиготного аллельного варианта (Pro12Pro) по гену PPARy у женщин (но не у мужчин) свидетельствовало о наличии неблагоприятных побочных эффектов, в частности предрасположенности к набору веса и развитию инсулинорезистентности на фоне приема вальпроевой кислоты. Наличие остальных аллельных вариантов (Pro12Ala и Ala12Ala) не ассоциировано с набором веса и развитием инсулинорезистентности.

- Наличие гомозиготного аллельного варианта (Ser690Ser) по гену PCKS1 у женщин (но не у мужчин) свидетельствовало о предрасположенности к набору веса и развитию инсулинорезистентности на фоне приема вальпроевой кислоты. Наличие остальных аллельных вариантов (Ser690Thr и Thr690Thr) не ассоциировано с набором веса и развитием инсулинорезистентности.

ii) При приеме карбамазепина генотипирование проводится по гену MDR1 для подбора и расчета адекватной терапевтической концентрации карбамазепина:

- Экспериментально установлено, что у носителей ТТ генотипа по гену маркеру MDR1 (C3435T) средняя максимальная концентрация карбамазепина в крови составила 9,6±1 мкг/мл, а для СС - 5,6±0,7 мкг/мл. Таким образом, для достижения клинически значимого эффекта, пациентам с ТТ генотипом необходима в 1,8 раз более высокая концентрация препарата, чем носителям СС генотипа.

iii) При приеме ламотриджина генотипирование проводят по гену SCN1A для подбора и расчета адекватной терапевтической дозы препарата:

- Для достижения клинически значимого эффекта требуется повышение дозы ламотриджина в ряду носителей GG→GA→AA генотипов по полиморфному маркеру SCN1IVS5N (5G>A). Для носителей генотипа GG средняя эффективная доза составила 50-100 мг/сут. Для носителей GA генотипа - 50-200 мг/сут, для носителей АА генотипа - 50-300 мг/сут.

iv) При назначении топирамата генотипирование осуществляется по генам Glut9, URAT1, SERT, ТРН2 для выявления рисков развития нежелательных побочных эффектов и по гену UGT2B7 для подбора и расчета адекватной терапевтической дозы топирамата.

- Ассоциация неблагоприятных побочных эффектов (ПЭ) при терапии топираматом с полиморфизмами соответствующих генов представлена в Таблицах 2-5.

v) Для расчета средней эффективной дозы топирамата проводят генотипирование по гену маркеру UGT2B7 (С802Т):

- Экспериментально установленная эффективная средняя доза топирамата для пациентов группы (СС и СТ) составила 192 мг/сут, что в 1,8 раза выше, чем в группе ТТ (105 мг/сут). Таким образом, пациентам с ТТ генотипом требуется меньшая эффективная доза топирамата, чем для носителей СС и СТ генотипов.

Осуществление изобретения.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1.

Больная Т., 19 лет, масса тела 68 кг. Диагноз: идиопатическая генерализованная эпилепсия с генерализованными судорожными приступами.

Жалобы: судорожные приступы с потерей сознания.

Анамнез заболевания. Больна с 17 лет, когда впервые появились генерализованные тонико-клонические приступы с выключением сознания. Приступы возникали ближе к вечеру. Частота приступов составляла 1-2 в месяц.

Анамнез жизни. Ребенок от первой физиологической беременности, роды самостоятельные, в срок. При рождении масса тела 3450 г, рост 47 см. Раннее развитие по возрасту. ЧМТ, нейроинфекции, фебрильные судороги отрицает. Семейный анамнез не отягощен.

Неврологический статус. Черепные нервы: в пределах нормы. Двигательная сфера: активные и пассивные движения конечностей в полном объеме, парезов нет. Мышечный тонус не изменен. Сухожильные и периостальные рефлексы с рук и ног живые, D=S. Координаторная сфера: координация не нарушена, в позе Ромберга устойчива. Чувствительная сфера: чувствительных нарушений нет. Интеллект сохранен.

Дополнительные методы исследования. МРТ: Очаговой патологии в веществе мозга больших полушарий, ствола и мозжечка не выявлено. ЭЭГ: На фоновой ЭЭГ определяются легкие общемозговые изменения в виде дезорганизации корковой ритмики с дисфункцией срединно-стволовых структур.

Лечение. Стартово больной был назначен депакин (активное вещество - вальпроевая кислота) 500 мг в сутки, без эффекта.

Для определения эффективной дозы вальпроевой кислоты у пациентки был произведен забор 1 мл крови с последующим выделением ДНК фенол-хлороформным методом [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. Затем проводили ПНР на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с использованием праймеров к гену FABP2 на выявление полиморфизма Ala54Thr: прямой - СТАCCGAGTТТТСТТСССАСС и обратный - ААТТАААССАТСCAATGAААТAGAGC. Реакционная смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 0.67 M Трис-HCl, pH 8.8; 16.7 мМ (NH4)2SO4; 0.01% твин-20; 0.2 мМ каждого dNTP; 0.1 мкг геномной ДНК; 20 пмолей каждого праймера; 2 ед. Taq полимеразы; MgCl₂ в концентрации 1,5 мМ. Амплификация состояла из предварительной денатурации при 95°C - 4 минуты; 36 циклов, состоящих из денатурации при 94°C - 20 с, отжига праймеров при 62°C - 20 с, синтеза продукта при 72°C - 10 с; затем следовала стадия заключительного синтеза при 72°C - 5 мин. Получившийся фрагмент длиной 375 п.о. расщепляли ферментом BstHH I при температуре 50°. В случае аллеля G (Ala) образовывались фрагменты 200 и 175 п.о. Препараты ДНК разделяли посредством электрофореза в 4% агарозном геле. В качестве стандарта использовали ДНК плазмиды pBR322, расщепленную рестриктазами Mva I. Гели красили бромистым этидием и визуализировали с помощью системы гель-документирования "Vilber Laurmat". В результате детектирования был установлен фрагмент длиной 375 п.о., что свидетельствовало об отсутствии сайта рестрикции и указывало на наличие генотипа АА гена FABP2. Сопоставив установленный генотип с эмпирически полученными данными, определили, что средняя расчетная доза препарата должна составлять 910 мг/сут, что в 2 раза больше, чем изначально назначенная доза депакина. При последующем повышении дозы депакина до 1000 мг в сутки отмечен хороший терапевтический эффект. Медикаментозная ремиссия 8 месяцев.

Пример 2.

Мужчина, 25 лет.

В анамнезе неоднократные черепно-мозговые травмы, обратился с жалобами на приступы потери сознания, сопровождающиеся тонической судорогой, прикусом языка. Указанных приступов у больного было 2 за последние 5 мес. При сборе анамнеза выяснилось, что в течение последнего года стал отмечать состояния, при которых не помнил, «что делал», длящиеся несколько секунд, но в последние время данные состояния участились и по времени стали длиться несколько минут до 1-2 р. в 2 нед. Со слов родственников, отмечался «остекленевший взгляд», выполнял нецеленаправленные действия в «виде перекладывания бумаги», «пытался мыть посуду». Во время указанных состояний не реагировал на обращенную речь.

В соматическом статусе, у пациента отмечалось ожирение 2 ст.

В биохимическом анализе увеличение показателей АЛТ, ACT.

Диагноз заболевания: Симптоматическая фокальная эпилепсия.

С учетом показателей биохимического анализа, больному был назначен Топирамат (Топамакс) в дозе 200 мг/сутки (по 100 мг - 2 р.д.), с постепенной титрацией дозы по 25 мг каждую неделю до указанных цифр.

На фоне приема Топирамата отмечалась положительная динамика в виде полного прекращения ВГС приступов и снижения количества сложно-парциальных приступов до 1 в месяц. Через 6 мес. после прима топирамата при контрольном анализе мочи у больного появились соли в общем анализе мочи.

Для выявления риска развития побочного эффекта, в частности нефролитиаза, у больного был произведен забор 1 мл крови с последующим выделением ДНК фенол-хлороформным методом [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. Затем проводили ПНР на амплификаторе "Тэрцик-2" («ДНК-технология», Россия) с использованием праймеров к гену URAT1 на выявление полиморфизма (-788 Т>А; rs11602903): прямой -GCTTGGCCCCTGGTGGAT и обратный - TCTCTGTGTGGGCTTGGGTC. Реакционная смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 0.67 M Трис-HCl, pH 8.8; 16.7 мМ (NH4)2SO4; 0.01% твин-20; 0.2 мМ каждого dNTP; 0.1 мкг геномной ДНК; 20 пмолей каждого праймера; 2 ед. Taq полимеразы; MgCl2 в концентрации 1,5 мМ. Амплификация состояла из предварительной денатурации при 94°C - 4 минуты; 35 циклов, состоящих из денатурации при 94°C - 20 с, отжига праймеров при 62°C - 20 с, синтеза продукта при 72°C - 10 с; затем следовала стадия заключительного синтеза при 72°C - 5 мин. Получившийся фрагмент в 363 п.о. расщепляли ферментом Bso31I (Сибэнзим) и проводили электрофорез в 4% агарозном геле с последующей визуализацией результата на трансиллюминаторе. В результате детектирования были обнаружены фрагменты длиной в 223 и 140 п.о., что свидетельствовало о наличии генотипа ТТ у данного пациента. Сопоставив установленный генотип пациента с тендерной принадлежностью и эмпирически полученными данными о зависимости риска развития нефролитиаза от генотипа, риск развития нефролитиаза при терапии топираматом у данного пациента был подтвержден и больной был переведен на леветирацетам 2000 мг в сутки. Это позволило устранить выявленный побочный эффект.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет:

- заранее прогнозировать фармакологический ответ на терапию;

- подобрать оптимальный препарат, который не только будет эффективен для конкретного пациента, но позволит избежать побочных эффектов даже у успешных в плане эффективности действия препаратов пациентов;

- снизить финансовые затраты, связанные с подбором препаратов;

- сократить период, в течение которого заболевание не поддается/плохо поддается контролю;

- сократить время подбора эффективной дозы препарата;

- снизить количество визитов к врачу, так как эффективность терапии будет проявляться раньше.

Существенным фактом значится и то, что фармакогенетическое тестирование выполняется однократно, так как его результаты в течение жизни остаются неизменными.

Таким образом, фармакогенетическое тестирование может стать дополнительным диагностическим инструментом при подборе адекватной терапии каждому конкретному пациенту. Фармакогенетическое тестирование дает возможность вычислить пациентов с высоким риском развития токсического эффекта (а также тех, для кого необходимы более низкие терапевтические дозы лекарственных препаратов) и определить пациентов, которые с высокой степенью вероятности получат желаемый терапевтический эффект от того или иного препарата.

Немаловажно, что благодаря небольшой стоимости анализа и относительной простоте и быстроте его проведения заявляемый способ может найти широкое применение в учреждениях практического здравоохранения.

Заявляемый способ позволяет оптимизировать подбор адекватного противоэпилептического препарата (ПЭП) для каждого конкретного пациента, а также сократить время подбора эффективной дозы препарата и период, в течение которого заболевание не поддается/плохо поддается контролю, а следовательно, и связанные с этим финансовые затраты. Снижается количество визитов к врачу, так как эффективность терапии будет проявляться раньше. Более того, фармакогенетическое тестирование выполняется однократно, так как его результаты в течение жизни остаются неизменными.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и риска развития побочных эффектов. Способ включает забор биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции по генам-кандидатам, последующий анализ их аллельных вариантов и, путем сопоставления выявленного аллельного полиморфизма с данными о его влиянии на эффективную терапевтическую дозу и возникновении побочных эффектов, расчет эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и определение риска развития побочных эффектов. Предложенное изобретение позволяет с высокой точностью определять эффективную терапевтическую дозу и наличие риска развития побочных эффектов. 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 2 пр.

1. Способ определения эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и риска развития побочных эффектов, включающий забор биологического материала, проведение полимеразной цепной реакции по генам-кандидатам, последующий анализ их аллельных вариантов и, путем сопоставления выявленного аллельного полиморфизма с данными о его влиянии на эффективную терапевтическую дозу и возникновении побочных эффектов, расчет эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и определение риска развития побочных эффектов.

2. Способ по п. 1, в котором в качестве генов-кандидатов для препаратов из группы жирных кислот выбирают PPARy (Pro12Ala), PCKS1 (Ser690Thr), FABP2 (Ala54Thr).

3. Способ по п. 1, в котором в качестве генов-кандидатов для препаратов из группы трициклических соединений с карбомоильной группой выбирают MDR1 (С3435Т).

4. Способ по п. 1, в котором в качестве генов-кандидатов для препаратов из группы блокаторов натриевых каналов выбирают SCN1A (SCN1IVS5N (5G>A)).

5. Способ по п. 1, в котором в качестве генов-кандидатов для препаратов из группы сахаров выбирают Glut9 (Val253Ile), URAT1 (-788 Т>А), SERT (5HTTLPR), ТРН2 (rs10748185), UGT2B7 (C802T).