ШТАММ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ 8-ГО СЕРОТИПА, АДАПТИРОВАННЫЙ К ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК COS-1 Российский патент 2016 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 C12R1/93 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению адаптированного к репродукции в перевиваемых клеточных линиях штамма вируса АЧС 8-го сероиммунотипа, и может быть использовано в научно-исследовательских и диагностических учреждениях при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований и разработке диагностических препаратов.

В работе использовали вирулентный штамм Волгоград-2012 вируса АЧС, полученный из музея ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, прошедший 2 пассажа в первичной культуре ККМС.

Для стандартизации проведения молекулярно-генетических исследований с изолятами и штаммами вируса АЧС, а также при разработке диагностических препаратов, как правило, используют культуральные вируссодержащие материалы, которые получают в перевиваемых культурах клеток.

Адаптацию вирулентного вируса АЧС 8 сероиммунотипа штамма Волгоград-2012 первоначально проводили в перевиваемой культуре клеток ПТП в присутствии 2,0% свиной сыворотки с инкубацией вируса при 38°C в течение 8-10 суток (4 пассажа). Далее пассировали в течение последовательных 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток COS-1 в присутствии 1,0% сыворотки крупного рогатого скота с инкубацией при 37°C в течение 6-8 суток. В процессе адаптации использовали культуральную жидкость предыдущего пассажа вируса в объеме 1 мл. Заражение на первом пассаже проводили в дозе 4,0-5,0 lg ГАЕ₅₀/мл. В первых 4 пассажах отмечали снижение титра вируса с 4,0-5,0 до 1,0-1,5 lg ГАЕ₅₀/мл., а после адаптации на уровне 10-14 пассажей его накопление составляло 7,5-8,5 lg ГАЕ₅₀/мл.

С использованием реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд), предложенной для серологического типирования штаммов, установлено 8 серотипов вируса АЧС, отличающихся между собой в иммунологической пробе, что обуславливает необходимость получения адаптированных штаммов для каждой сероиммуногруппы (1, 2).

Полученный адаптированный штамма Волгоград/14с вируса АЧС был проверен на соответствие по серотиповому признаку в реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд) и типируется в РЗГАд специфической референс-сывороткой 8-го сероиммунотипа, а по результатам генотипирования отнесен ко 2 генотипу.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является адаптированный в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии аттенуированный штамм КК-262 вируса АЧС, используемый для разработки диагностических и вакцинных препаратов. Штамм КК-262 типируется в РЗГАд специфической референс-сывороткой 2-го сероиммунотипа, а по результатам генотипирования отнесен к 1 генотипу.

Целью изобретения является получение адаптированного в перевиваемой культуре клеток штамма вируса 8-го сероиммунотипа, циркулирующего в настоящее время в РФ для проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований и разработки диагностических препаратов.

Получение вируссодержащего сырья вируса АЧС штамма Волгоград/14с в стационарном монослое перевиваемой культуры клеток COS-1

С этой целью культуру клеток, выращенную в матрасах вместимостью 0,5 или 1,0 дм³, заражают штаммом Волгоград/14c в дозе 10³-10⁵ ГАЕ₅₀/мл. В качестве ростовой среды при выращивании вируса применяют среду Игла MEM с 1,0% сыворотки крови крупного рогатого скота. Через 5-6 суток культивирования вируса при температуре (37,0±0,5)°C вирус накапливался до 7,5-8,5 lg ГАЕ₅₀/мл.

Штамм Волгоград/14с 8-го серотипа депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №3096.

Адаптированный штамм Волгоград/14с вируса АЧС обладает следующими свойствами.

Культуральные свойства. Размножается в перевиваемой культуре клеток COS-1, выращенной стационарным (матрасы) способом с характерными для вируса АЧС цитоплазматическими изменениями (ЦПИ) с последующей деструкцией монослоя. При этом он сохраняет способность размножаться в культуре ККМС и ЛС (лейкоцитов свиньи), вызывая в них выраженную гемадсорбцию и последующий лизис клеток, что дает возможность использовать эти культуры клеток для определения инфекционной активности вируса. Титр вируса, выращенного в культуре клеток COS-1 при стационарном способе культивирования, достигает 7,5-8,5 lg ГАЕ₅₀/мл.

Антигенные свойства.

Выявляется прямым методом флюоресцирующих антител с применением антигенспецифических ФИТЦ иммуноглоулинов (ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии) (Рис. 1).

Основные биологические свойства штамма Волгоград/14с вируса АЧС 8 серотипа приведены в табл. 1

Сероиммунобиологическая характеристика штамма Волгоград/14с

Как видно из таблицы, адаптированный штамм Волгоград/14с вируса АЧС 8 серотипа накапливается в перевиваемой культуре клеток COS-1 до 8,5 lg ГАЕ₅₀/мл, по результатам РЗГАд относится к 8 серотипу и по генотипированию ко 2 генотипу.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков

Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 20 пассажей культивирования в культуре клеток COS-1 и KMC (срок наблюдения). Адаптированный вирус Волгоград/14с обладает гемадсорбирующими свойствами в перевиваемой культуре клеток COS-1. Титр вируса определяется по наличию феномена гемадсорбции в ГАЕ₅₀/мл (Рис. 2).

Патогенность и вирулентность. При заражении подсвинков 3-4 месячного возраста адаптированным вариантом вируса АЧС Волгоград/14с отмечали подъем температуры до 41-42°C на третий день после заражения и гибель животных на 7-9 день. Таким образом, вирус АЧС штамм Волгоград/14с является патогенным и вирулентным.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Вирус не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и другими микроорганизмами.

Способ, срок хранения, периодичность пассажей

Штамм Волгоград/14с хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°C и «освежают» пассированием в культурах клеток COS-1 один раз в 3 года.

Для подтверждения преимущества настоящего изобретения приведены примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Адаптация вируса АЧС к перевиваемой культуре клеток COS-1. Адаптацию вируса к культуре клеток проводили путем инокуляции ее вирулентным штаммом Волгоград, выращенным в первичной культуре клеток KMC (первые 2 пассажа), а в последующих пассажах материалом предыдущего в культурах ПТП и COS-1. Инфицированную культуру клеток, выращенную в матрасах, инкубировали при (37,±0,5)°C в течение 5-6 суток. О размножении вируса в клетках судили по проявлению цитопатических изменений. На уровне 6-8-х пассажей специфическую дегенерацию у инфицированных клеток (30,0-40,0% монослоя) отмечали на 5-6 сутки, титр вируса на 6-7 сутки выращивания составлял 6,5-7,0 lg ГАЕ₅₀/мл. Репродукция вируса в последующих пассажах характеризовалась специфическими дегенеративными изменениями, появление которых отмечали на 4-5 сутки, и накопление вируса на 5-6 сутки составило 7,5-8,5 lg ГАЕ₅₀/мл.

Пример 2. Культивирование штамма Волгоград/14с вируса АЧС в перевиваемой культуре клеток COS-1 стационарным монослойным способом. В результате выполненных исследований были подобраны оптимальные параметры стационарного способа культивирования штамма, которыми являлись:

множественность заражения 3,0-5,0 lg ГАЕ₅₀/мл;

- содержание сыворотки крови КРС в среде Игла-MEM 1,0%;

- pH среды 7,2-7,4;

- длительность культивирования 6-8 суток;

- температурный режим (37,0±0,5)°C.

Данный режим культивирования позволяли получать вируссодержащий материал с активностью 8,0-8,5 lg ГАЕ₅₀/мл.

Полученные данные показывают, что адаптированный к перевиваемой культуре клеток COS-1 штамм Волгоград/14с, может быть использован в научно-исследовательских центрах для проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований вируса АЧС и разработки диагностических препаратов.

Источники информации

1. Моргунов Ю.П., Петров Ю.И. Изучение иммунобиологических свойств вируса африканской чумы свиней 5-го типа: выделение, типизация и определение референс-штамма // Научно-теоретический журнал ПБПЖ. 2010. №4. С. 104-112.

2. Моргунов Ю.П. и др. Адаптация вируса африканской чумы свиней различных сероиммунотипов к новым перевиваемым культурам клеток. 2013.

3. Прудникова Е.Ю. и др. Адаптация вируса африканской чумы свиней к перевиваемым культурам клеток. 2012.

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Представленный штамм вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейства Asfarviridae, род Asfivirus, адаптирован к перевиваемой культуре клеток COS-1 и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096. Изобретение может быть использовано для разработки диагностических препаратов и проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Штамм Волгоград/14с вируса африканской чумы свиней 8-го серотипа, семейство Asfarviridae, род Asfivirus, адаптированный к перевиваемой культуре клеток COS-1, депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №.3096 для разработки диагностических препаратов и проведения вирусологических, молекулярно-генетических исследований.