ШТАММ "КАЛУГА-2014" ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ ДЛЯ МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИЗУЧЕНИЯ ПАТОГЕНЕЗА БОЛЕЗНИ Российский патент 2016 года по МПК C12N7/00 G01N33/53 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней, и может быть использовано при проведении мониторинговых исследований с новыми изолятами вируса, выделенными на территории РФ от кабанов и домашних свиней, а также при изучении патогенеза вызванной ими болезни.

Африканская чума свиней (АЧС) - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными, дистрофическими, некротическими изменениями в различных органах, а также высокой смертностью свиней всех пород и возрастных групп. Заболевание вызывает ДНК-содержащий вирус семейства Asfaviridae рода Asfavirus.

Впервые АЧС описал английский исследователь Р. Монтгомери, который в начале XX века наблюдал гибель европейских пород свиней, завезенных в Восточную Африку. До 1957 г. АЧС регистрировали только в африканских странах. В 1957 г. заболевание впервые было занесено на европейский континент - в Португалию, а затем в Испанию, которые оставались неблагополучными по АЧС около 30 лет. Вспышки этой болезни регистрировали и в других европейских странах - Франции, Италии, Мальте, Бельгии, Голландии и бывшем СССР. На острове Сардиния по настоящее время АЧС регистрируют у кабанов с признаками хронического и бессимптомного течения болезни [1].

Начало новой эпизоотии АЧС в Европе связано с заносом возбудителя болезни в 2007 году в Грузию, затем Армению, Абхазию и Россию (Чеченскую республику) [2]. Несмотря на жесткие меры борьбы с болезнью, связанные с убоем всех свиней в очаге болезни и первой угрожаемой зоне, АЧС была занесена и в другие регионы РФ, в т.ч. и в Центральный Федеральный округ, где в эпизоотический процесс в настоящее время вовлечены кабаны.

В странах Африканского, Американского и Европейского континентов выделены изоляты вируса АЧС, обладающих различными биологическими свойствами. Для их классификации используют реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) в культуре клеток костного мозга свиней (KMC) или лейкоцитов свиней (ЛС), рестрикционный анализ ДНК, генотипирование вируса и др. [3, 4, 5].

На основании разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ серотиповой классификации, имеющиеся в коллекции института паспортизированные штаммы вируса АЧС отнесены к 9 серотипам, а на основании секвенирования фрагментов гена, кодирующего структурный белок Р 72 к 5 генотипам - I, II, V, VIII и X [6, 7].

Циркулирующий в н.в. на территории России вирус АЧС отнесен к VIII серотипу и II генотипу, по этим показателям он отличается от вируса, вызвавшего эпизоотию АЧС в Европе в 1957 году [2].

Согласно данным Россельхознадзора в 2014 г. АЧС регистрировали в 13 регионах РФ в которых было выявлено 77 вспышек болезни (30 у домашних свиней и 47 у кабанов) [8]. Это указывает на возможность образования при пассировании в популяции кабанов слабопатогенных изолятов вируса АЧС, что существенно затруднит диагностику и борьбу с болезнью.

Близким аналогом предлагаемого изобретения является вирулентный штамм «Ставрополь 01/08», выделенный в 2008 году в начале эпизоотии АЧС в РФ от павшей домашней свиньи в Ставропольском крае. Патентуемый штамм отличается от аналога по ряду фенотипических признаков - длительности течения болезни, выраженности патологоанатомических изменений, характеру ГАд в культуре клеток и др., которые приведены в таблице 3.

Цель изобретения - получение нового со стабильными биологическими свойствами вирулентного штамма вируса АЧС, циркулирующего в Российской Федерации в популяции диких свиней - кабанов, который может быть использован в качестве референтного при проведении мониторинговых исследований с изолятами вируса, выделенными от кабанов и домашних свиней, а также при изучении патогенеза вызванной ими болезни.

Поставленная цель достигнута путем выделения вируса АЧС от убитого кабана в охотхозяйстве «Озерное» Медынского района Калужской области в 2014 г., который является новым, ранее не известным штаммом, длительно циркулирующим в популяции диких свиней - кабанов.

Полученный вирулентный штамм вируса АЧС получил название «Калуга-2014» и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3115.

Новый вирулентный штамм характеризуется следующими основными характеристиками:

Морфологические и молекулярно-генетические свойства. При электронной микроскопии обнаруживают округлые вирионы диаметром 175-215 нм, состоящие из плотного нуклеотида, 2-слойного икосаэдрического капсида и наружной оболочки. Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1.19-1.24 г/см³, коэффициент седиментации 1800-8000 S. Нуклеотид содержит ДНК, белок и окружен электронно-прозрачным слоем.

Геном вируса представлен неинфекционной, двуспиральной, линейной молекулой ДНК, состоящей из 170-190 тыс. пар нуклеотидов.

На основании результатов секвенирования фрагментов гена, кодирующего структурный белок Р 72, штамм отнесен к 2 генотипу вируса АЧС. Нуклеотидные последовательности генов E183L(p54), EP402R(СД2v) и межгенного участка I17/1329RL штамма «Калуга-2014» идентичны указанным последовательностям генов референс-штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС.

Антигенные свойства. Вирусспецифические антигены выявляются в реакциях преципитации, связывания комплемента, иммуноферментного анализа, иммунофлуоресценции, гемадсорбции и др.

Типовая принадлежность. По результатам РЗГАд с использованием имеющихся в Коллекции ВНИИВВиМ типовых референс-сывороток штамм «Калуга-2014» отнесен к вирусу АЧС VIII серотипа, что подтверждено постановкой биопробы на иммунных животных.

Культуральные свойства. Штамм размножается в первичных (KMC и ЛС) и перевиваемых (A₄C₂, A₄C₂/9к) культурах клеток, репродукция вируса сопровождается специфической адсорбцией эритроцитов свиней (феномен гемадсорбции) на инфицированных клетках на 3-5 сутки культивирования и их лизисом через 4-6 суток. Гемадсорбция (ГАд) имеет «плотный» и «рыхлый» характер, о чем свидетельствует соответственно многослойная и однослойная адсорбция эритроцитов свиней на инфицированных клетках. Это указывает на наличие в исходной вирусной популяции вирионов, обладающих различной патогенностью для свиней. Накопление вируса в эти сроки в культурах клеток KMC, ЛС составляет 6,0-7,0 lgГАЕ₅₀/см³, A₄C₂ и A₄C₂/9к - 4,5 -5,5 lgГАЕ₅₀/см³. В течение 10 серийных пассажей в культурах клеток (срок наблюдения) штамм «Калуга 2014» сохраняет эти свойства. Без предварительной адаптации штамм не репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки поросенка (РК-15, ПСГК), тестикул поросенка (ПТП), почки сайги (ПС), и почки африканской зеленой мартышки (CV-1).

Патогенные свойства. Штамм патогенен только для домашних и диких свиней всех пород и возрастных групп. При внутримышечном заражении в дозе 1000 ГАЕ₅₀ и выше вызывает их гибель на 9-11 сутки после инфицирования с признаками острой формы болезни. У заболевших свиней на 4-8 сутки после заражения отмечают повышение температуры тела до 41,2-41,7°C, угнетение, отказ от корма, одышку, нарушение координации движений, парез задних конечностей.

Патологоанатомические изменения. На серозных оболочках внутренних органов имеются кровоизлияния, в грудной и брюшной полостях скопление серозно-геморрагического экссудата, междольковая ткань легких отечна с признаками серозно-геморрагической пневмонии. Лимфоузлы: подчелюстные, средостенные мезентериальные не увеличены или увеличены незначительно, с кровоизлияниями, желудочные и портальные - сильно увеличены, геморрагически воспалены, темного цвета, имеют вид сгустка крови, «дряблые». Селезенка незначительно увеличена, естественного цвета, под капсулой единичные точечные кровоизлияния. Печень и почки без выраженных патологических изменений, характерных для АЧС.

Контагиозность. Штамм контагиозен для свиней. Интактные свиньи заболевают АЧС при совместном содержании с инфицированными штаммом «Калуга - 2014» животными.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Способ получения и условия хранения. Штамм хранят при минус 50°C в виде лиофилизированной или гепаринизированной вируссодержащей крови, которую получают от внутримышечно зараженных свиней, находящихся в атональном состоянии. Периодичность освежения штамма - один раз в 10 лет, при активности штамма выше 4,5 lg ГАЕ₅₀/см³ срок хранения продлевается.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

В таблице 1 приведены сведения по культивированию штамма «Калуга -2014» вируса АЧС в культурах клеток ЛС, A₄C₂/9к, РК - 15, и CV-1 в течение 10 последовательных пассажей.

Как видно из табл. 1, в течение 10 последовательных пассажей (срок наблюдения) штамм «Калуга -2014» вируса АЧС стабильно размножается в монослое культур клеток ЛС и A₄C₂/9к с образованием специфической ГАд и накапливается в них в титрах 6,0-7,0 lg ГАЕ₅₀/см³ и 4,0-5,5 lg ГАЕ₅₀/см³ соответственно. В монослое перевиваемых культур клеток РК-15 и CV-1 вирус не размножался.

Пример 2.

Результаты определения типовой принадлежность штамма в РЗГАд со специфическими референс-сыворотками I-IX серотипов приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, специфическая ЗГАд - сыворотка, полученная на референс-штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС VIII серотипа, вызывает задержку гемадсорбции штамма «Калуга-2014». На основании этих результатов штамм «Калуга - 2014» отнесен к VIII серотипу вируса АЧС.

Пример 3

Основные биологические свойства штамма «Калуга-2014», которые должны использоваться при проведении мониторинговых исследований с новыми изолятами вируса АЧС, циркулирующими на территории РФ, приведены в таблице 3.

Биологические характеристики штамма «Калуга 2014» вируса АЧС приведены в сравнительном аспекте с аналогичными свойствами референс-штамма «Ставрополь 01/08», выделенного в 2008 г. от павшей домашней свиньи в Ставропольском крае, и штаммом «Чечня 02/07», выделенным от павшего кабана в 2007 г. в Республике Чечня.

Как видно из представленных в таблице 3 результатов, штамм «Калуга-2014» вируса АЧС по некоторым биологическим характеристика отличается от референс-штамма «Ставрополь 01/08» и штамма «Чечня 02/07» - по срокам гибели свиней после внутримышечного заражения, характеру ГАд на инфицированных клетках и выраженности патологоанатомических изменений у павших свиней.

Эти и другие представленные в таблице 3 характеристики штамма «Калуга 2014», должны учитываться при проведении мониторинговых исследований с новыми изолятами вируса АЧС, циркулирующими среди кабанов, а также выделенными от домашних свиней в РФ.

Источники информации

1. Инфекционная патология животных. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Е.А. Непоклонов и др. - Москва, 2005. - С. 806-821.

2. Балышев В.М., Калантаенко Ю.Ф., Болгова М.В., Прудникова Е.Ю. Сероиммунологическая принадлежность вируса африканской чумы свиней, выделенного в российской Федерации // Доклады РАСХН. 2011. 54. С. 52-53.

3. Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, А.Н. Курносов, В.М. Колосов, Ф.А. Бадаев, И.В. Федорищев, В.А. Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С. 57-70.

4. Селянинов Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О. Селянинов, В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С. 75-76.

5. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol. 148, - P. 693-706.

6. Паспортизация изолята «Девис» вируса африканской чумы свиней / Болгова М.В., Балышев В.М., Пономарев В.Н., Неверовская Н.С. // Материалы междунар. научно.-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ, часть 1, Покров 2014. - С. 43-47.

7. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / Балышев В.М., Куриннов В.В., Цыбанов С.Ж. и др. // Ветеринария - 2010. - №7. - С. 25-27.

8. Эпизоотическая ситуация по АЧС на территории Российской Федерации в 2014 г. [Электронный ресурс]. Режим доступа: www fsvps/ru/ - Загл. с экрана/

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается штамма вируса африканской чумы свиней. Штамм выделен от убитого кабана в охотхозяйстве «Озерное» Медынского района Калужской области в 2014 г., паспортизирован с названием «Калуга-2014» и депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3115. Штамм обладает высокой инфекционной активностью, накапливается в культурах клеток костного мозга свиней и лейкоцитах свиней в титре 6,0-7,0 lgГАЕ₅₀/см³. Гибель зараженных свиней наступает с признаками острой формы АЧС через 6-8 суток после проявления клинических признаков болезни. Изобретение может быть использовано в качестве референс-штамма при проведении мониторинговых исследований в РФ с новыми изолятами вируса, циркулирующими в популяции кабанов, а также выделенными от домашних свиней. 3 табл., 3 пр.

Штамм «Калуга-2014» вируса АЧС семейства Asfarviridae рода Asfivirus, депонированный в Государственной Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3115, для проведения мониторинговых исследований и изучения патогенеза болезни.