ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК АС/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 2015 года по МПК C12N5/73 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии, и представляет собой сублинию внутривидовых гибридных клеток A₄C₂/9к для выделения, определения инфекционной активности и типовой принадлежности вируса африканской чумы свиней (АЧС).

Установлено, что лимфоцитоподобные клетки более чувствительны к вирусу АЧС, чем эпителиоподобные клетки. Кроме того, известны способы повышения титра вируса АЧС путем перевода культивирования клеток и вируса в питательную среду, содержащую сыворотку крови свиней [1].

Известна перевиваемая линия клеток A₄C₂, которая является гибридной линией клеток СПЭВ ТК^- и представлена 2-мя типами клеток: эпителиоподобные, лимфоцитоподобные. Эпителиоподобные клетки обладают высокими адгезивными свойствами. Лимфоцитоподобные - низкоадгезивными свойствами и накапливаются, кроме мультислоя, в культуральной жидкости на 3-6 сутки культивирования в концентрации 50-100 тыс. кл/мл. Основная среда культивирования для постоянного поддержания культуры клеток 199 или Игла - МЕМ с 10-20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота или телят-доноров. Линия клеток чувствительна к вирусам классической чумы свиней, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, энцефаломиокардита свиней и др. [2].

В вирусологии известны перевиваемые линии клеток чувствительные к вирусу африканской чумы свиней, такие как ПСГК-60, ППК-666, CV-1, COS-1 [3]. Однако они имеют ряд недостатков: необходима предварительная адаптация вируса к перевиваемой линии клеток, вирус АЧС размножается в них без проявления гемадсорбции.

Целью нашего изобретения являлось получение высокочувствительной линии клеток к вирусу АЧС методом направленной селекции клеток, по принципу увеличения числа лимфоцитоподобных клеток и с последующей их адаптацией к росту в питательной среде с сывороткой крови свиньи.

Поставленная цель достигается тем, что перевиваемая линия клеток A₄C₂ чувствительна к вирусу АЧС, и вирус накапливается в ней в титре 2,5-3,0 lg ГАЕ₅₀/см³.

Суть изобретения: получена сублиния внутривидовых гибридных клеток СПЭВ ТК^- с лимфоцитоподобными клетками свиньи. Сублиния позволяет выделить вирус африканской чумы свиней без предварительной адаптации в реакции гемадсорбции и обеспечивает его накопление в титре до 6,0-6,5 lg ГАЕ₅₀/см³.

Получение. Перевиваемую линию клеток A₄C₂ выращивали при температуре 37±0,5°C в течение 6-7 суток, поддерживая pH среды в пределах 7,2-7,6, с периодическим добавлением 7,5% NaHCO₃. Учитывая способность клеток переходить в суспензию по мере зарастания монослоя, количество их в популяции увеличивали путем осаждения. Культуральную среду центрифугировали 15 минут при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендировали в 5-6 см³ питательной среды и подсчитывали клетки. Концентрацию клеток доводили до посадочной 80-100 тыс. клеток/мл и культивировали в питательной среде Игла - MEM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Аналогично проводили 10 пассажей. В результате получена новая сублиния клеток, культуральные свойства которой оставались стабильными в течение следующих 20 пассажей (срок наблюдения).

Учитывая, что, как правило, вирус АЧС культивируют в поддерживающей среде, содержащей свиную сыворотку, осуществляли адаптацию культуры клеток к выращиванию в среде, постепенно увеличивая содержание сыворотки крови свиньи до полной замены фетальной сыворотки крупного рогатого скота на сыворотку крови свиньи с конечной концентрацией 10% в среде Игла - MEM.

В течение 15 последовательных пассажей культура сохранила свои основные цитоморфологические характеристики. Клетки при пересеве с коэффициентами 1:3, 1:5 формировали монослой на 2-3 сутки, который сохранялся без смены среды в течение 14 суток.

Морфологическая характеристика. Сублиния представлена лимфоцитоподобными клетками с плотными ядрами и узким ободком цитоплазмы, обладающие низкоадгезивными свойствами, и накапливаются в культуральной жидкости на 5 сутки культивирования в концентрации 500-550 тыс. кл/см³, а также эпителиоподобными клетками полигональной формой, плотно примыкают друг к другу, обладают высокими адгезивными свойствами. Культура представлена в монослое эпителиоподобными клетками до 30-40% и лимфоцитоподобными клетками 60-70% (таблица 1).

Модальное число хромосом 40 имеют 46% клеток популяции. Разброс числа хромосом составляет 38-45.

Таблица 1 Сравнительная характеристика перевиваемой линий клеток A₄C₂ и сублинии клеток A₄C₂/9к № п/п Характеристика A₄C₂ Сублиния A₄C₂/9к 1 процент лимфоцитоподобных клеток 30-40% 60-70% 2 посевная концентрация, тыс. клеток/мл 80-100 80-100 3 среда для культивирования Игла - MEM Игла - MEM 4 сыворотка крови фетальная КРС свиньи 5 накопление вируса АЧС, lg ГАЕ₅₀/см³ 3,0±0,12 6,5±0,14

Культуральные свойства. В качестве ростовой среды используется среда Игла - MEM с 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/см³. Для снятия клеток используют 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:9. Коэффициент пересева (1:3)-(1:5). Сбор клеток в суспензии осуществляют методом осаждения. Митотический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет 25-35.

Криоконсервацию культуры осуществляют в криозащитной среде, состоящей из 60% среды Игла, 30% сыворотки свиньи и 10% глицерина. Режим замораживания: эквилибрация при 4°C в течение 1 часа, далее снижение температуры до минус 70°C. Затем помещают в жидкий азот при минус 196°C. Количество жизнеспособных клеток после размораживания составляет 80-95%.

Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы, микроплазмы не обнаружены.

Пример 1. Культивирование сублинии клеток A₄C₂/9к

Культуру выращивают на питательной среде Игла - MEM, содержащей 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/см³. Для снятия клеток используют 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:9. Коэффициент пересева 1:3-1:5. Сбор клеток в суспензии осуществляют методом осаждения. Монослой формируется на 2 сутки культивирования.

Пример 2. Выделение эпизоотического вируса

Культуру клеток выращивают на чашках Карреля, инфицируют вирусом АЧС с адсорбцией вируса в течение 60 минут и заменой ростовой питательной среды на поддерживающую с 2% сыворотки крови свиньи. Через 24 часа вносят по 0,1 см³ 0,5% взвеси эритроцитов свиней. Инфицированные культуры клеток инкубируют при температуре 37±0,5°C в течение 5-7 суток. На поверхности инфицированных клеток отмечают специфическую гемадсорбцию, которая характеризуется многослойным прикреплением к ним эритроцитов свиней.

Сублиния клеток A₄C₂/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС по сравнению с другими перевиваемыми линиями CV-1, Vero, РК-15, кроме того, вирус АЧС размножается в нем с проявлением гемадсорбции.

Пример 3. Определение типовой принадлежности вируса АЧС

Культуру выращивают в 24 - луночных культуральных планшетах, инфицируют вирусом АЧС с множественностью заражения 0,1 ТЦД₅₀/кл с адсорбцией вируса в течение 60 минут, затем вносят поддерживающую среду Игла - MEM с 2% сыворотки крови свиньи и по 0,1 см³ специфической сыворотки и 0,1 см³ 0,5% взвеси эритроцитов свиней. Культуры клеток инкубируют при 37°C в течение 5-7 суток. Учет реакции проводят аналогично реакции задержки гемадсорбции в культуре клеток КМС.

Культура клеток костного мозга свиней является переживающей клеточной системой, и чувствительность клеток зависит от партии клеток. Сублиния клеток A₄C₂/9к является стабильной перевиваемой клеточной линией, которая обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС. Применение A₄C₂/9к для выявления, определения инфекционной активности и типовой принадлежности вируса АЧС позволяет оптимизировать условия и стандартизировать методы исследований.

Список использованных источников

1. Калантаенко Ю.Ф. Выращивание вируса африканской чумы свиней в культуре перевиваемых клеток: дис. … канд. вет. наук. 16.00.03 / Калантаенко Юрий Федорович. - Покров, 1982. - 57 с.

2. Патент РФ 2082758, C12N 5/06. Штамм внутривидовых гибридных клеток Suis Domestica, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней / Дьяконов Л.П., Майджи Е.В., Герасимов В.Н., Гальнбек Т.В.; Дудар Л.Н.; Солдатова Н.В.; Федорова Е.Е.; Егорова А.И.; ГНУ ВИЭВ. - №94026140/13; заявл. 14.07.1994; опубл. 27.06.1997.

3. Apoptosis induced in an early step of African swine virus entry into Vero cell does not require virus replication / A.L. Carrascosa, M.J. Bustos, M.L. Nogal [et al.] // J. Virol. - 2002. - Vol.294. - P.372-382.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается перевиваемой гибридной сублинии клеток A₄C₂/9к SUS SCROFA. Представленная сублиния клеток A₄C₂/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС. В качестве ростовой среды используется среда Игла - MEM с 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/мл. Митотический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет 25-35. Сублиния клеток депонирована в Специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии под №87. Охарактеризованное изобретение позволяет выделить вирус африканской чумы свиней без предварительной адаптации в реакции гемадсорбции и обеспечивает его накопление в титре до 6,0-6,5 lg ГАЕ₅₀/см³. 1 табл., 3 пр.

Перевиваемая гибридная сублиния клеток A4C2/9к SUS SCROFA, используемая для вирусологических исследований вируса африканской чумы свиней, депонирована в Специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии под №87.