Аттенуированный штамм "СКА-2015 ВНИИВВиМ" вируса африканской чумы свиней VIII серотипа для вирусологических и молекулярно-генетических исследований Российский патент 2017 года по МПК C12N7/00 A61K39/187 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению аттенуированного штамма «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований, изучении иммуногенеза болезни, разработке диагностических и вакцинных препаратов.

При проведении исследований с вирусом АЧС в развитых странах мира используют вирулентные и аттенуированные штаммы вируса, размножающиеся в первичных культурах клеток костного мозга свиней (KMC) и лейкоцитов свиней (ЛС), а также в перевиваемых культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения (5). В настоящее время выделено и описано более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обладающих различными биологическими свойствами при изучении и классификации которых используют перекрестное заражение свиней, реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд), рестрикционный анализ, генотипирование и др. (3, 7, 9). В отечественной и зарубежной литературе описаны аттенуированные штаммы и варианты вируса АЧС: ЛК-111, КК-202, МК-200, 1455, L, Хинде-169, Мадейра-105 и др., которые характеризуются высокой реактогенностью или низкой иммуногенностью (4, 5, 8, 10).

С использованием РЗГАд, предложенной в РФ для серологического типирования штаммов, установлено 9 серотипов вируса АЧС, отличающихся между собой в иммунологической пробе, что указывает на необходимость получения аттенуированных штаммов для каждой сероиммуногруппы (6). Наиболее изученными, из имеющихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммов и изолятов вируса АЧС, являются штаммы I-IV серотипов. Так, в качестве вирулентных и аттенуированных референс-штаммов вируса АЧС I серотипа приняты соответственно «Лиссабон-57» и «ЛК-111», II - «Конго-49» и «КК-202», III - «Мозамбик-78» и «МК-200», IV - «Франция - 32» и «ФК - 135».

Циркулирующий в настоящее время на территории РФ вирус АЧС, который был занесен в страну в 2007 году из республики Грузия, относится к VIII серотипу, а на основании результатов секвенирования фрагментов гена, кодирующий структурный белок Р 72 - к II генотипу (2). В качестве вирулентного референс-штамма вируса АЧС VIII серотипа в настоящее время принят штамм «Ставрополь 01/08» (Ставрополь), выделенный в 2008 году в Ставропольском крае от павшей свиньи (1). Вместе с этим в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РАСХН не было паспортизированного аттенуированного штамма вируса VIII серотипа, полученного на основе циркулирующего в РФ и сопредельных странах вируса АЧС.

В связи с этим целью данного изобретения является получение на основе выделенного в РФ вируса АЧС аттенуированного референс-штамма VIII серотипа, обладающего стабильными биологическими свойствами.

Поставленная цель достигнута аттенуацией вирулентного штамм «Ставрополь 01/08» при серийном пассировании и селекции в первичной культуре клеток ЛС и перевиваемой гибридной линии клеток СПЭВ и ЛС (А₄С₂/9к). Полученному аттенуированному штамму вируса АЧС присвоено авторское название «СКА-2015 ВНИИВВиМ». Этот штамм депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РАСХН под №3147.

Аттенуированный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» имеет одинаковые для вируса АЧС морфологические и физико-химические характеристики и обладает следующими свойствами.

Культуральные свойства. Штамм размножается в первичных (KMC и ЛС) и перевиваемых (А₄С₂) и (А₄С₂/9к) культурах клеток, вызывая в них характерную гемадсорбцию и последующий лизис клеток. Титр вируса, выращенный в первичных культурах клеток KMC, ЛС и перевиваемой культуре клеток А₄С₂/9к при стационарном способе культивирования, достигает 7,0-7,5 и 5,0-6,0 lg ГАЕ₅₀/см³ соответственно. В перевиваемых культурах клеток ПСГК и CV-1 вирус размножается в более низких титрах после проведения 3-5 последовательных пассажей без проявления специфической ГАд.

Антигенные свойства. Культуральный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» выявляется в реакциях прямой иммунофлуоресценции, ТФ ИФА, иммуноблотинге и др.

Безвредность. Штамм безвреден для свиней при внутримышечном введении в максимальной (10^6,0-10^7,0 ГАЕ₅₀) дозе. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей и птицы) является не патогенным.

Контагиозность и реверсибельность. Вирус не передается при совместном содержании от привитых интактным свиньям.

Штамм не восстанавливает вирулентные свойства после проведения десяти последовательных пассажей в культурах клеток ЛС и А₄С₂/9к.

Реактогенность. Штамм слабореактогенен для свиней, при внутримышечном введении может вызывать у отдельных животных, привитых в дозе 10^6,0-10^7,5 ГАЕ₅₀, в течение 3-5 суток повышение температуры тела до 40,2-40,5°С.

Иммуногенные свойства. Штамм слабоиммуногенен, после двукратного внутримышечного введения в дозе 10^5,5-10^7,0 ГАЕ₅₀ вызывает защиту от гибели 50,0% свиней против вирулентного референс-штамма «Ставрополь 01/08».

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Вирус не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и другими патогенными микроорганизмами.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 20 пассажей культивирования в культурах клеток ЛС, KMC, A₄C₂/9к, ПСГК и CV-1 (срок наблюдения).

Способ, срок хранения, периодичность пассажей. Культуральный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°С и «освежают» пассированием в культурах клеток ЛС, KMC или А₄С₂ 9/к один раз в 10 лет.

Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Результаты определения типовой принадлежности штамма в РЗГАд с использованием референс-сыворотками вируса АЧС I-IX серотипов приведены в таблице 1

Как видно из таблицы 1, специфическая ЗГАд-сыворотка, полученная на референс-штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС VIII серотипа, вызывает задержку гемадсорбции штамма «СКА-2015 ВНИИВВиМ». На основании этих результатов полученный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» отнесен к VIII серотипу вируса АЧС.

Пример 2.

В таблице 2 приведены результаты культивирования штамма «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса АЧС в культурах клеток ЛС, А₄С₂/9к, ПСГК и CV-1 в течение 20 последовательных пассажей.

Как видно из табл. 2, в течение 20 последовательных пассажей (срок наблюдения) штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса АЧС стабильно размножается в монослое культур клеток ЛС и А₄С₂/9к с образованием специфической ГАд и накапливается в них в титрах 6,0-7,0 lg ГАЕ₅₀/см³ и 4,5-5,5 lg ГАЕ₅₀/см³ соответственно. В монослое перевиваемых культур клеток ПСГК и CV - 1 вирус размножался в более низких титрах-до 4,5-5,0 lg ГАЕ₅₀/см³ и 4,0-4,5 lg ГАЕ₅₀/см³ соответственно без проявления ГАд. При этом в культуре CV-1 штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» размножается без проявления цитопатогенного действия.

Пример 3.

На 6 подсвинках ж.м. 25-30 кг были изучены иммунобиологические свойства штамма «СКА-2015 ВНИИВВиМ».

В табл. 3 приведены результаты изучения иммунобиологических свойств штамма «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса АЧС при его внутримышечном введении в дозе 5,5-6,5 lg ГАЕ₅₀

Как видно из таблицы, аттенуированный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса АЧС является слабореактогенным и безвредным для свиней - на введение вируса в дозе 5,5-6,5 lg ГАЕ₅₀ у животных наблюдается незначительное повышение температуры тела в течение 3-5 суток до 40,2-40,5°С. Штамм слабо иммуногенен, после 2-кратной иммунизации в дозе 5,5-6,5 lg ГАЕ₅₀ защищал от контрольного заражения 3 из 6 (50%) подсвинков. У выживших животных в течение 3-6 суток отмечали угнетение и повышение температуры тела до 40,7-41,2°С. Контрольные животные погибали от АЧС с признаками острой формы болезни.

Пример 4

В таблице 4 приведены основные биологические характеристики штамма «СКА-2015 ВНИИВВиМ» в сравнении с вирулентным штаммом «Ставрополь 01/08» вируса АЧС, который был использован при получении аттенуированного вируса.

Как видно из представленных в таблице 4 результатов, аттенуированный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса АЧС по основным биологическим характеристикам отличается от вирулентного референс-штамма «Ставрополь 01/08» - температурной реакции и гибели свиней после внутримышечного инфицирования, выраженности клинических и патологоанатомических изменений, уровню виремии, характеру ГАд на инфицированных клетках.

Источники информации

1. Балышев В.М., Долбасов Д.В., Куриннов В.В., Далантаенко Ю.Ф., Жуков А.Н., Васильев А.П. Штамм Ставрополь 01/08 вируса АЧС для вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. // Патент на изобретение №2439152, 2012.

2. Балышев В.М., Куриннов В.В., Цыбанов С.Ж. и др. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации // Ветеринария - 2010. - №7. - С. 25-27.

3. Вишняков И.Ф, Митин Н.И., Курносов А.Н., Колосов В.М., Бадаев Ф.А., Федорищев И.В., Бурлаков В.А. Диагностика африканской чумы свиней // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С. 57-70.

4. Истомин С.В., Миколайчук С.В., Юрков Г.Г. Изучение напряженности иммунитета у поросят, полученных от свиноматок, вакцинированных против АЧС вакцинным штаммом «МК-200» // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1986. - Ч. 1. - С. 301-304.

5. Колбасов Д.В., Балышев В.М., Середа А.Д. Итоги разработки живых вакцин против африканской чумы свиней // Ветеринария. - 2014. - №8.- С. 3-8.

6. Болгова М.В., Балышев В.М., Пономарев В.Н., Неверовская Н.С. Паспортизация изолята «Девис» вируса африканской чумы свиней // Материалы междунар. Научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ, Ч. 1. - Покров, 2014. - С. 43-47.

7. Селянинов Ю.О., Балышев В.М., Цыбанов С.Ж. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С. 75-76.

8. Черятников Л.Л., Петров Ю.И., Митин Н.И. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса АЧС и их сравнительная оценка // // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ, 4.1. - Покров, 1992. - С. 56.

9. Bastos A.D., Penrith M.L., Cruciere С. et.al. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S // Arch. Virol - 2003. - Vol. 148. - P. 693-706.

10. Petuska N. Quelques aspects morfogennesis des suitesde 1a vaccination control 1a PPA (virose L) an Portugal // Bui. Off. Int. Epiz. 1965. Vol. 63. - 199-237.

Изобретение относится к вирусологии. Предложен аттенуированный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса африканской чумы свиней VIII-го серотипа. Штамм получен методом перемежающихся пассажей и селекцией вирулентного штамма «Ставрополь 01/08» в первичной культуре клеток ЛС и перевиваемой гибридной линии клеток А₄С₂/9к и депонирован в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под номером 1847. Штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» может быть использован при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований, изучении иммуногенеза болезни, разработке диагностических и вакцинных препаратов. 4 табл., 4 пр.

Аттенуированный штамм «СКА-2015 ВНИИВВиМ» вируса африканской чумы свиней VIII-го серотипа, семейство Asfarviridae, род Asfivirus, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии, №1847, может быть использован при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований, изучении иммуногенеза болезни, разработке диагностических и вакцинных препаратов.