АНТИАНГИОГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАНЕЕ ПОДВЕРГАВШЕГОСЯ ЛЕЧЕНИЮ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/395 A61K31/337 A61K31/7068 A61K31/475 A61K45/06 A61P35/04 

Родственная заявка

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки Соединенных Штатов № 61/266343, зарегистрированной 3 декабря 2009 г., и предварительной заявки Соединенных Штатов № 61/234281, зарегистрированной 15 августа 2009 г., описания которых включены в настоящий документ в их полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Это изобретение в целом относится к лечению заболеваний и патологических состояний человека. Более конкретно, изобретение относится к антиангиогенной терапии, либо самой по себе, либо в сочетании с другими видами противораковой терапии для лечения ранее подвергавшегося лечению рака молочной железы.

Известный уровень техники

Рак остается одной из наиболее смертельных угроз здоровью человека. В США рак поражает около 1,3 миллиона новых больных каждый год и является второй ведущей причиной смерти после заболевания сердца, являясь причиной приблизительно 1 из 4 смертей. Предсказывается также, что рак может превысить сердечнососудистые заболевания, став причиной номер один смерти в пределах 5 лет. За большинство из этих смертей ответственны солидные опухоли. Хотя достигнуты существенные успехи в медицинском лечении определенных типов рака, в целом 5-летний коэффициент выживаемости для всех типов рака улучшен только приблизительно на 10% в последние 20 лет. Типы рака или злокачественные опухоли неконтролируемым образом быстро метастазируют и растут, делая крайне трудным своевременное выявление и лечение.

Рак молочной железы представляет собой заболевание, которое каждый год убивает много женщин в Соединенных Штатах. По данным американского ракового общества приблизительно 40000 женщин умрет от этого заболевания в 2008 г. Более 180000 новых случаев рака молочной железы диагностируется ежегодно, и подсчитано, что у одной из восьми женщин возникнет рак молочной железы. Эти цифры указывают на то, что рак молочной железы является одним из наиболее опасных заболеваний, с которым сталкиваются женщины в настоящее время. Метастатический рак молочной железы является обычно неизлечимым, и только у небольшого количества больных достигается долгосрочная выживаемость после стандартной химиотерапии. Greenberg et al., J. Clin. Oncol. 14:2197-2205 (1996).

Знания основ биологии рака молочной железы экспоненциально развиваются в течение трех последних десятилетий, причем некоторые вносят вклад в его лечение. На фазе II многонационального отрытого клинического испытания на 222 женщинах с метастатическим раком молочной железы, гиперэкспрессирующим HER2, выявлен показатель ответной реакции, составляющий 15%, с шестью подтвержденными полными ответами при использовании рекомбинантного гуманизированного моноклонального антитела (трастузумаба, также известного как герцептин®, Genentech, South San Francisco), направленного против HER2 (Cobleigh et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17:97 (1998)). На фазе III рандомизированного испытания оценены безопасность и эффективность добавления герцептина к первой линии химиотерапии либо паклитакселом, либо сочетанием доксорубицина и циклофосфамида. Суммарный показатель ответной реакции и время до прогрессирования заболевания существенно улучшались при добавлении герцептина к химиотерапии по сравнению только с химиотерапией (Slamon et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17:98 (1998)). Добавление герцептина пролонгировало выживание в целом (Norton et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 18:127a (1999)).

Хотя трастузумаб является первым новым биологически обоснованным терапевтическим агентом, одобренным для лечения субпопуляции больных раком молочной железы, имеющих типы рака с гиперэкспрессией HER2, продемонстрированы перспективы некоторых других подходов и их введения в клинику. Однако подсчитано, что у 75 процентов женщин с недавно диагностированным метастатическим раком молочной железы он является HER2-негативным. Соединения, которые ингибируют ангиогенез, вызывают особый интерес в плане охвата дополнительных популяций больных раком молочной железы и являлись и являются предметом клинических испытаний, как в США, так и в других странах.

Так как рак все еще является одной из наиболее смертельных угроз, необходимы дополнительные способы лечения рака у больных. Изобретение направлено на эти и другие потребности, как будет ясно из рассмотрения последующего раскрытия.

Краткое изложение сущности изобретения

Предлагаются варианты применения антитела против VEGF для эффективного лечения больных раком молочной железы, ранее подвергавшихся лечению метастатического рака молочной железы. В частности в изобретении предоставлены данные по фазе III рандомизированного клинического испытания бевацизумаба (AVASTIN®) в сочетании со схемами химиотерапии индивидуумов, ранее подвергавшихся лечению метастатического рака молочной железы у индивидуумов человека. Такие схемы химиотерапии включают лечение таксанами (например, паклитакселом каждые 3 недели или еженедельно, частицами паклитаксела, связанного с белком (например, Abraxane®) или доцетакселом), гемцитабином, винорелбином или лечение капецитабином. Успех испытания показывает, что добавление антитела против VEGF к химиотерапии обеспечивает статистически значимые и клинически показательные преимущества в качестве терапии второй линии для больных, ранее подвергавшихся лечению рака молочной железы.

Результаты, полученные в клинических исследованиях по использованию бевацизумаба у индивидуумов человека с метастатическим раком молочной железы, показывают, что при оценке по выживаемости без прогрессирования заболевания (PFS) эффективность была положительной особенно при сравнении с данными по PFS при лечении только химиотерапевтическими агентами. Индивидуумы, которые в клинических испытаниях получали бевацизумаб в сочетании с химиотерапией (терапия таксанами, капецитабином, гемицитабином или винорелбином) имели повышенное выживание без прогрессирования заболевания по сравнению с индивидуумами, которых лечили только с помощью химиотерапии. Различие было статистически значимым.

Соответственно, в изобретении предлагается способ лечения больного с диагнозом ранее подвергавшегося лечению метастатического рака молочной железы, включающий получение больным схемы лечения, сочетающей химиотерапию с введением эффективного количества антитела против VEGF. Схема лечения, сочетающая химиотерапию с введением антитела против VEGF, эффективно увеличивает выживание без прогрессирования заболевания (PFS) у больного.

В определенных вариантах осуществления PFS увеличивается приблизительно на 0,5 месяца, 1 месяц, 1,2 месяца, 2 месяца, 2,1 месяца, 2,2 месяца, 2,8 месяца, 3 месяца и т.д. В одном варианте осуществления PFS увеличивается приблизительно на 2,1 месяца. В одном варианте осуществления PFS увеличивается приблизительно на 2,2 месяца. В одном варианте осуществления PFS увеличивается приблизительно на 2,8 месяца.

Любой химиотерапевтический агент, проявляющий противораковую активность, может быть использован по изобретению. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пиримидина, аналогов пурина и родственных ингибиторов, алкалоидов барвинка, эпидофиллотоксинов, антибиотиков, L-аспарагиназы, ингибитора топоизомеразы, интерферонов, координационных комплексов с платиной, замещенной антрацендионом мочевины, производных метилгидразина, суппрессорного агента для коры надпочечников, адренокортикостероидов, прогестинов, эстрогенов, антиэстрогена, андрогенов, антиандрогена и аналога гонадотропин-рилизинг гормона. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтический агент представляет собой, например, капецитабин, таксан, паклитаксел, доцетаксел, частицы паклитаксела, связанного с белком (например, Abraxane®), гемцитабин, винорелбин или их сочетания. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтический агент представляет собой, например, капецитабин, таксан, паклитаксел, доцетаксел, частицы паклитаксела, связанного с белком (например, Abraxane®), гемцитабин или их сочетания. В определенных вариантах осуществления химиотерапевтический агент представляет собой, например, капецитабин, таксан, паклитаксел, доцетаксел, частицы паклитаксела, связанного с белком (например, Abraxane®), или их сочетания. Два или более химиотерапевтических агента могут быть использованы в смеси, предназначенной для введения в сочетании с антителом против VEGF.

Клинические преимущества способов лечения по изобретению могут быть измерены, например, по продолжительности выживания без прогрессирования заболевания (PFS), времени до несостоятельности лечения, объективному показателю ответной реакции и продолжительности ответа.

Соответственно в изобретении представлен способ инструктирования индивидуума-человека, ранее подвергавшегося лечению рака, например, молочной железы, путем предоставления инструкций по получению лечения антителом против VEGF, с тем, чтобы повысить выживание индивидуума без прогрессирования заболевания, снизить риск рецидива рака у индивидуума или повысить вероятность выживания у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает предоставление инструкций по получению лечения, по меньшей мере, с одним химиотерапевтическим агентом. Лечение антителом против VEGF может проводиться одновременно с лечением химиотерапевтическим агентом или последовательно по отношению к нему. В определенных вариантах осуществления индивидуума лечат, как предписывается способом инструктирования.

В изобретении представлен также способ продвижения, включающий продвижение введения антитела против VEGF для лечения индивидуума-человека, ранее подвергнутого лечению рака, например, молочной железы. В некоторых вариантах осуществления метод дополнительно включает продвижение введения, по меньшей мере, одного химиотерапевтического агента. Введение антитела против VEGF может проводиться одновременно с введением химиотерапевтического агента или последовательно по отношению к нему. Продвижение может проводиться любым из доступных средств. В некоторых вариантах осуществления продвижение осуществляется с помощью рекламного вкладыша в упаковку, сопровождающего продаваемый состав антитела против VEGF. Продвижение также может осуществляться с помощью рекламного вкладыша в упаковку, сопровождающего продаваемый состав химиотерапевтического агента. Продвижение может быть в виде письменной или устной информации врачу или работнику здравоохранения. В некоторых вариантах осуществления продвижение осуществляется с помощью рекламного вкладыша в упаковку, где в рекламном вкладыше предоставляются инструкции по получению лечения антителом против VEGF. В некоторых вариантах осуществления за продвижением следует лечение индивидуума антителом против VEGF с химиотерапевтическим агентом или без него.

В изобретении предлагается способ ведения бизнеса, включающий маркетинг антитела против VEGF для лечения индивидуума-человека, ранее подвергавшегося лечению рака, например, молочной железы, с тем, чтобы повысить период выживания индивидуума без прогрессирования заболевания или снизить вероятность рецидива рака у индивидуума, или повысить вероятность выживания у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает маркетинг химиотерапевтического агента для использования в сочетании с антителом против VEGF. В некоторых вариантах осуществления за маркетингом следует лечение индивидуума антителом против VEGF с химиотерапевтическим агентом или без него.

Предлагается также способ ведения бизнеса, включающий маркетинг химиотерапевтического агента в сочетании с антителом против VEGF для лечения индивидуума-человека, ранее подвергавшегося лечению рака, например, молочной железы, с тем, чтобы повысить период выживания индивидуума без прогрессирования заболевания или снизить вероятность рецидива рака у индивидуума, или повысить вероятность выживания у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления за маркетингом следует лечение индивидуума сочетанием химиотерапевтического агента и антитела против VEGF.

В каждом из способов по изобретению антитело против VEGF может быть заменено специфическим антагонистом VEGF, например, молекулой рецептора VEGF или молекулой гибридного рецептора VEGF, как описано ниже. В определенных вариантах осуществления способов по изобретению антитело против VEGF представляет собой бевацизумаб. Антитело против VEGF или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой моноклональное антитело, гибридное антитело, антитело полностью от человека или гуманизированное антитело. Примеры антител, пригодных для способов по изобретению, включают бевацизумаб (AVASTIN®), антитело G6, антитело B20 и их фрагменты. В определенных вариантах осуществления антитело против VEGF имеет вариабельную область тяжелой цепи, включающую следующую аминокислотную последовательность:

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO:1)

и вариабельную область легкой цепи, включающую следующую аминокислотную последовательность:

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO:2).

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может также представлять собой антитело, в котором отсутствует часть Fc, структура F(ab')₂, Fab или Fv.

В одном варианте осуществления лечение представляет собой сочетание специфичного для VEGF антагониста, например, антитела против VEGF, и, по меньшей мере, одного химиотерапевтического агента.

Каждый из способов по изобретению может быть осуществлен на практике в отношении лечения типов рака, включая, но, не ограничиваясь этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких типов рака включают рак молочной железы, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, сквамозную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак простаты, почечный рак, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, рак желудка, меланому и различные типы рака головы и шеи. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает HER2-негативным метастатическим, ранее подвергавшимся лечению, раком молочной железы.

Каждый из указанных выше аспектов может дополнительно включать контролирование состояния индивидуума на предмет рецидива рака. Контролирование может осуществляться, например, с помощью оценки продолжительности выживания без прогрессирования заболевания (PFS), или общего выживания (OS), или объективного показателя ответной реакции (ORR). В одном варианте осуществления PFS, или OS, или ORR оценивается после начала лечения.

В зависимости от типа и тяжести заболевания в настоящем документе описываются предпочтительные дозировки антитела против VEGF, например, бевацизумаба, и они могут находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая, но, не ограничиваясь этим, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг или 15 мг/кг. Частота введения должна варьироваться в зависимости от типа и тяжести заболевания. Для повторных введений в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния лечение поддерживают до тех пор, пока рак лечится или достигается желаемый терапевтический эффект при измерении методами, описанными в настоящем документе или известными в данной области техники. В одном примере антитело против VEGF по изобретению вводят один раз каждую неделю, каждые две недели или каждые три недели в диапазоне доз от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая, но, не ограничиваясь этим, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг или 15 мг/кг. Однако могут быть использованы другие схемы дозирования. Ход терапии по изобретению легко прослеживается с помощью общепринятых методов и тестов.

В дополнительных вариантах осуществления каждого из указанных выше аспектов специфичный для VEGF антагонист, например, антитело против VEGF, вводят местно или системно (например, перорально или внутривенно). В других вариантах осуществления одним аспектом лечения является лечение специфичным для VEGF антагонистом в виде лечения с пролонгированной фазой или поддерживающей терапии, как оценивается врачом или описывается в настоящем документе.

В других вариантах осуществления лечение специфичным для VEGF антагонистом ранее подвергавшегося лечению метастатического рака молочной железы осуществляется в сочетании с дополнительной противораковой терапией, включая, но, не ограничиваясь этим, хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, дифференцированную терапию, биотерапию, иммунную терапию, лечение ингибитором ангиогенеза, цитотоксическим агентом и антипролиферативным соединением. Лечение специфичным для VEGF антагонистом может также включать любое сочетание указанных выше типов терапевтических схем. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический агент и специфичный для VEGF антагонист вводят совместно.

В вариантах осуществления, которые включают дополнительную противораковую терапию, индивидуума можно добавочно лечить дополнительной противораковой терапией до, в течение (например, одновременно) или после введения специфичного для VEGF антагониста. В одном варианте осуществления специфичный для VEGF антагонист, вводимый либо одиночно, либо с противораковой терапией, можно вводить в виде поддерживающей терапии.

Другие особенности и преимущества изобретения будут ясны из последующего подробного описания, фигур и формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен исследовательский дизайн испытания при лечении ранее подвергавшегося лечению метастатического рака молочной железы с использованием бевацизумаба (группа A) или плацебо (группа B) с различными вариантами химиотерапии.

На фиг.2 изображен анализ основного конечного показателя PFS в исследовании, представленном на фиг.1.

На фиг.3 изображены анализы PFS в исследовании, представленном на фиг.1, специфичные для когорт больных.

На фиг.4 изображен объективный показатель ответной реакции в исследовании, представленном на фиг.1.

Подробное описание

1. Определения

Термин «VEGF» или «VEGF-A» используется для обозначения 165-аминокислотного фактора роста эндотелиальных клеток сосудов человека и родственных 121-, 145- 189- и 206-аминокислотных факторов роста эндотелиальных клеток сосудов человека, как описано, например, Leung et al. Science, 246:1306 (1989) и Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), вместе с их природными аллельными формами и формами их процессинга. VEGF-A является частью семейства генов, включающего VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F и P1GF. VEGF-A в первую очередь связывается с двумя высокоаффинными рецепторными тирозинкиназами, VEGFR-1 (Flt-1) и VEGFR-2 (Flk-1/KDR), причем последняя является основным фактором передачи митогенных сигналов VEGF-A в эндотелиальных клетках сосудов. Кроме того, нейропилин-1 был идентифицирован как рецептор изоформ VEGF-A, связанных с гепарином, и он может играть роль в развитии сосудов. Термин «VEGF» или «VEGF-A» также относится к VEGFs от видов, не относящихся к человеку, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF от конкретных видов указывается с помощью таких терминов как hVEGF для VEGF человека или mVEGF для мышиного VEGF. Термин «VEGF» также используется для обозначения укороченных форм или фрагментов полипептида, включающих аминокислоты с 8 по 109 или с 1 по 109 из 165-аминокислотного фактора роста эндотелиальных клеток сосудов человека. Ссылка на любую из таких форм VEGF может быть идентифицирована в заявке, например, как «VEGF (8-109)», «VEGF (1-109)» или «VEGF165». Положения аминокислот у нативного «укороченного» VEGF нумеруются, как указано в нативной последовательности VEGF. Например, аминокислота в 17 положении (метионин) в укороченном нативном VEGF занимает 17 положение (метионин) также в нативном VEGF. Укороченный нативный VEGF обладает связывающим сродством к рецепторам KDR и Flt-1, сопоставимым с нативным VEGF.

«Антитело против VEGF» представляет собой антитело, которое связывается с VEGF с достаточным сродством и специфичностью. Выбранное антитело должно обычно иметь связывающее сродство к VEGF, например, антитело может связывать hVEGF с величиной Kd между 100 нМ - 1 пМ. Величины сродства антитела могут быть определены, например, с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (такого как анализ на BIAcore, как описано в опубликованной заявке PCT № WO2005/012359); иммуноферментного анализа (ELISA); и тестов на основе конкурентного анализа (например, РИА). В определенных вариантах осуществления антитело против VEGF по изобретению может быть использовано в качестве терапевтического агента для направленного действия и вмешательства в заболевания или состояния, в которые вовлечена активность VEGF. Антитело может быть также подвергнуто тестам на другие типы биологической активности, например, для оценки его эффективности в качестве терапевтического агента. Такие тесты известны в данной области техники и зависят от антигена-мишени и планируемого использования антитела. Примеры включают, но не ограничиваются этим, тест ингибирования HUVEC; тесты ингибирования роста опухолевых клеток (как описано, например, в патенте WO89/06692). Антитело против VEGF обычно не связывается ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF.

«Антагонист VEGF» обозначает молекулу, способную нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, снижать или препятствовать активности VEGF, включая его связывание с одним или более рецепторов VEGF. Антагонисты VEGF включают антитела против VEGF и их антигенсвязывающие фрагменты, рецепторные молекулы и производные, которые специфически связываются с VEGF, тем самым отделяя его от связывания с одним или более рецепторами, антитела против рецепторов VEGF и антагонисты рецепторов VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR.

Полипептид с «нативной последовательностью» включает полипептид, имеющий ту же самую аминокислотную последовательность, что и полипептид из природного источника. Таким образом, нативная последовательность полипептида может иметь аминокислотную последовательность природного полипептида от любого млекопитающего. Такой полипептид с нативной последовательностью может быть выделен из природного источника или может быть получен с помощью рекомбинантных методов или методов синтеза. Термин полипептид с «нативной последовательностью» конкретно охватывает существующие в природе укороченные или секретируемые формы полипептида (например, последовательность внеклеточного домена), существующие в природе варианты форм (например, формы альтернативного сплайсинга) и существующие в природе аллельные варианты полипептида.

«Вариант» полипептида обозначает биологически активный полипептид, имеющий, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности с природной последовательностью полипептида. Такие варианты включают, например, полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков добавлены или удалены на N- или С-конце полипептида. Обычно вариант должен иметь, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90% идентичность аминокислотной последовательности и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95% идентичность аминокислотной последовательности с природной последовательностью полипептида.

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и включает моноклональные антитела (включая полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультивалентные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител (см. ниже), до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность.

Во всем описании и формуле изобретения нумерация остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина осуществляется по индексу EU, как раскрыто в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), специально включенной в настоящее описание в качестве ссылки. «Индекс EU по Kabat» обозначает EU-нумерацию остатков антитела IgG1 человека.

«Kd» или «величина Kd» по настоящему изобретению в одном варианте осуществления измеряется с помощью анализа связывания радиоактивно меченного VEGF (РИА), выполняемого с Fab вариантом антитела и молекулой VEGF, как описано в следующем методе, в котором в растворе измеряют связывающее сродство Fabs к VEGF путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (¹²⁵I)-меченного VEGF(109) в присутствии серий титрования немеченого VEGF, с последующим захватом связанного VEGF на планшете, покрытом антителами против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). В одном примере для определения условий метода планшеты для микротитрования (Dynex) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающим антителом против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6) и затем блокируют 2% (масс./об.) бычьим сывороточным альбумином в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620), 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I]VEGF(109) смешивают с серийными разведениями интересующего Fab, например, Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Интересующий Fab затем инкубируют в течение ночи; однако инкубация может продолжаться в течение 65 часов для уверенности в достижении равновесия. После этого смесь переносят на захватывающий планшет для инкубации при комнатной температуре в течение одного часа. Раствор затем удаляют, и планшет промывают восемь раз 0,1% твином-20 в PBS. Когда планшеты высохнут, добавляют 150 мкл/лунка сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard), и проводят подсчет на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые дают связывание, меньшее или равное 20% от максимального, выбирают для использования в анализах конкурентного связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления Kd или величину Kd измеряют с применением методов поверхностного плазмонного резонанса, используя BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с иммобилизованными чипами hVEGF (8-109) CM5 при ~10 единиц ответа (RU). Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. VEGF человека разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед введением при скорости тока 5 мкл/минута для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) присоединенного белка. После введения VEGF человека вводят 1 М этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0,05% твином 20 (PBST) при 25°C при скорости тока приблизительно 25 мкл/минута. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитывают, используя простую модель связывания Ленгмюра один к одному (BIAcore Evaluation Software version 3.2) с помощью одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение k_off/k_on. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10⁶ М^-1S^-1 по указанному выше методу поверхностного плазмонного резонанса, то скорость ассоциации может быть определена с использованием метода гашения флуоресценции, в котором измеряется повышение или понижение интенсивности эмиссии флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C 20 нМ антитела против VEGF (в форме Fab) в PBS, рН 7,2, в присутствии повышающихся концентраций короткой формы VEGF человека (8-109) или мышиного VEGF при измерении на спектрометре, таком как спектрофотометр, оборудованный системой остановки потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр 8000-серий SLM-Aminco (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой. «Kd» или «величину Kd» по настоящему изобретению в одном варианте осуществления измеряют с помощью методов, известных в данной области техники.

«Блокирующее» антитело или антитело-«антагонист» представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Например, специфичное для VEGF антитело-антагонист связывает VEGF и ингибирует способность VEGF индуцировать пролиферацию клеток эндотелия сосудов или индуцировать проницаемость сосудов. Предпочтительные блокирующие антитела или антитела-антагонисты полностью ингибируют биологическую активность антигена.

Если не указано иначе, выражение «мультивалентное антитело» используется в этом описании для обозначения антитела, включающего три или более антигенсвязывающих сайта. Например, мультивалентное антитело конструируется как содержащее три или более антигенсвязывающих сайта и обычно не является нативной последовательностью антитела IgM или IgA.

«Фрагменты антитела» включают только часть интактного антитела, обычно включая антигенсвязывающий сайт интактного антитела и, следовательно, сохраняя способность связывать антиген. Примеры фрагментов антитела, охватываемых настоящим изобретением, включают: (i) Fab фрагмент, имеющий домены VL, CL, VH и CH1; (ii) Fab' фрагмент, который представляет собой Fab фрагмент, имеющий один или более цистеиновых остатков на C-конце домена CH1; (iii) Fd фрагмент, имеющий домены VH и CH1; (iv) Fd' фрагмент, имеющий домены VH и CH1 и один или более цистеиновых остатков на C-конце домена CH1; (v) Fv имеющий домены VL и VH одного плеча антитела; (vi) dAb фрагмент (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который состоит из домена VH; (vii) выделенные области CDR; (viii) F(ab')₂ фрагменты, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab' фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ix) молекулы одноцепочечных антител (например, одноцепочечный Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); и Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) «диатела» с двумя антигенсвязывающими сайтами, включающие вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одну и ту же полипептидную цепь (см., например, патенты EP 404097; WO93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) «линейные антитела», включающие пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с полипептидами комплементарных легких цепей образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); и патент США № 5641870).

Применяемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против единственного антигена. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единичной детерминанты на антигене. Определение «моноклональное» не истолковывается как требующее получения антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела для использования по изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных, например, в Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) или Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Фрагмент «Fv» представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт, узнающий и связывающий антиген. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи, находящихся в прочной связи, которая может быть ковалентной природы, например, в scFv. Именно в этой конфигурации три CDRs каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности димера V_H-V_L. Совместно шесть CDRs или их подгруппа придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три CDRs, специфичная для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя обычно с более низким сродством, чем полный связывающий сайт.

Применяемый в настоящем описании термин «вариабельный домен антитела» относится к частям легких и тяжелых цепей молекул антитела, которые включают аминокислотные последовательности областей, определяющих комплементарность (CDRs; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), и области каркаса (FRs). V_H обозначает вариабельный домен тяжелой цепи. V_L обозначает вариабельный домен легкой цепи. В соответствии с методами, используемыми в настоящем изобретении, положения аминокислот, установленные для CDRs и FRs, могут быть определены по Кабату (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)). Нумерация аминокислот антител или антигенсвязывающих фрагментов также соответствует нумерации по Кабату.

Применяемый в настоящем описании термин «области, определяющие комплементарность» (CDRs; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которых необходимо для связывания антигена. Каждый вариабельный домен обычно имеет три области CDR, идентифицированные как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая область, определяющая комплементарность, может включать аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность», как определено Кабатом (т.е. приблизительно остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или те остатки из «гипервариабельной петли» (т.е. приблизительно остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). В некоторых случаях область, определяющая комплементарность, может включать аминокислоты как из области CDR, определенной по Кабату, так и из гипервариабельной петли. Например, CDRH1 тяжелой цепи антитела 4D5 включает аминокислоты с 26 по 35.

«Области каркаса» (в настоящем описании далее FR) представляют собой те остатки вариабельных доменов, которые отличаются от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно имеет четыре FRs, идентифицированные как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDRs определяются по Кабату, остатки FR легкой цепи расположены приблизительно как остатки 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), и остатки FR тяжелой цепи расположены приблизительно как остатки 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. Если CDRs включают аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, остатки FR легкой цепи расположены приблизительно как остатки 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи и остатки FR тяжелой цепи расположены приблизительно как остатки 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых случаях, когда CDR включает аминокислоты как из CDR, определенной по Кабату, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, остатки FR должны быть соответственно подогнаны. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты H26-H35, остатки тяжелой цепи FR1 находятся в положениях 1-25, и остатки FR2 находятся в положениях 36-49.

«Fab» фрагмент содержит вариабельный и константный домен легкой цепи и вариабельный домен, и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. F(ab')₂ фрагменты антитела включают пару Fab фрагментов, которые обычно ковалентно соединены в области их карбоксильных концов с помощью цистеинов шарнира между ними. Другие химические соединения фрагментов антител также известны в данной области техники.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антитела включают домены V_H и V_L антитела, где эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. Обычно Fv полипептид дополнительно включает полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В качестве обзора scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H и V_L). С помощью использования линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждают образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создают два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более полно, например, в патентах EP 404097; WO93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Выражение «линейные антитела» относится к антителам, описанным в Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела включают пару тандемных сегментов Fd (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифичными или моноспецифичными.

Моноклональные антитела в настоящем описании особо включают «гибридные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остаток цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

«Гуманизированные» формы антител, происходящих не от человека, (например, мышиных) представляют собой гибридные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую от иммуноглобулина, не относящегося к человеку. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области (антитела-донора) от видов, не относящихся к человеку, таких как мышь, крыса, кролик или нечеловекообразный примат, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки Fv области каркаса (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, происходящими не от человека. Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации создаются для дополнительного улучшения характеристики антитела. В целом, гуманизированное антитело должно включать по существу все, по меньшей мере, из одного и обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям иммуноглобулина, происходящего не от человека, и все или по существу все области FR представляют собой области последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также может включать, по меньшей мере, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека. Для дополнительных подробностей см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

«Антитело человека» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или создано с использованием любого из методов получения антител человека, как раскрыто в настоящем описании. Это определение антитела человека специально исключает гуманизированное антитело, включающее антигенсвязывающие остатки, происходящие не от человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области техники. В одном варианте осуществления антитело человека выбрано из фаговой библиотеки, где эта фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Антитела человека могут быть также получены путем введения локусов иммуноглобулинов человека трансгенным животным, например, мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. При нагрузке наблюдается продукция антител человека, которые крайне сходны с антителами, выявляемыми у людей, во всех отношениях, включая перегруппировку генов, сборку и репертуар антител. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016, и в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Альтернативно антитело человека может быть получено путем иммортализации В-лимфоцитов человека, продуцирующих антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть получены от индивидуума, или их можно иммунизировать in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); и патент США № 5750373.

Антитело со «зрелой аффинностью» представляет собой антитело с одним или более изменениями в одной или более его CDRs, которые приводят к улучшению аффинности антитела по отношению к антигену по сравнению с родительским антителом, которое не обладает этим(и) изменением(ями). Предпочтительные антитела со зрелой аффинностью должны иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности по отношению к антигену-мишени. Антитела со зрелой аффинностью получают способами, известными в данной области техники. В статье Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано созревание аффинности в результате перетасовки доменов VH и VL. Описан случайный мутагенез остатков CDR и/или каркаса: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

«Функциональный антигенсвязывающий сайт» антитела представляет собой сайт, который способен связывать антиген-мишень. Аффинность связывания антигена антигенсвязывающим сайтом необязательно является такой же высокой, как у родительского антитела, из которого происходит антигенсвязывающий сайт, но способность связывать антиген должна быть измеримой с использованием любого из множества способов, известных для оценки связывания антитела с антигеном. Более того, аффинность связывания антигена каждым из антигенсвязывающих сайтов мультивалентного антитела по настоящему описанию необязательно должна быть одинаковой количественно. В случае мультимерных антител по настоящему описанию количество функциональных антигенсвязывающих сайтов может быть оценено с использованием анализа на основе ультрацентрифугирования, как описано в примере 2 публикации патентной заявки США № 20050186208. Согласно этому методу анализа антиген-мишень и мультимерное антитело объединяют в разных соотношениях и рассчитывают среднюю молекулярную массу комплексов, допуская различающееся число функциональных сайтов связывания. Эти теоретические величины сравнивают с полученными реальными экспериментальными значениями, чтобы оценить число функциональных сайтов связывания.

Антитело, обладающее «биологической характеристикой» указанного антитела, представляет собой антитело, которое обладает одной или более биологическими характеристиками этого антитела, которые отличают его от других антител, которые связываются с тем же самым антигеном.

Чтобы провести скрининг антител, которые связываются с эпитопом на антигене, связываемом представляющим интерес антителом, может быть выполнен обычный анализ перекрестного блокирования, такой как анализ, описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).

«Антитело, зависимое от вида», представляет собой антитело, которое обладает более сильной аффинностью связывания для антигена из первого вида млекопитающих, чем она составляет для гомолога этого антигена из второго вида млекопитающих. Обычно антитело, зависимое от вида, «специфически связывается» с антигеном человека (например, имеет величину связывающего сродства (K_d) не более приблизительно 1×10^-7 М, или не более приблизительно 1×10^-8 М, или не более приблизительно 1×10^-9 М), но имеет связывающее сродство для гомолога антигена из второго вида млекопитающих, которое является, по меньшей мере, приблизительно в 50 раз, или, по меньшей мере, приблизительно в 500 раз, или, по меньшей мере, приблизительно в 1000 раз более слабым, чем его связывающее сродство к антигену человека. Антитело, зависимое от вида, может представлять собой любое из различных типов антител, как определено выше, но обычно представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека.

«Мутантное антитело» или «вариант антитела» при применении в настоящем описании относится к варианту аминокислотной последовательности антитела, зависимого от вида, где один или более аминокислотных остатков антитела, зависимого от вида, модифицированы. Такие мутанты обязательно имеют идентичность или сходство последовательности с антителом, зависимым от вида, менее 100%. В одном варианте осуществления мутантное антитело может иметь аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75% идентичности или сходства аминокислотной последовательности вариабельного домена либо тяжелой, либо легкой цепи с антителом, зависимым от вида, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется в настоящем описании как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными (т.е. тот же остаток) или сходными (т.е. аминокислотный остаток из той же самой группы на основе общих свойств боковых цепей, см. ниже) с остатками антитела, зависимого от вида, после выравнивания последовательностей и введения по необходимости пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Ни N-концевые, ни C-концевые, ни внутренние расширения, делеции или вставки в последовательность антитела вне вариабельного домена не должны истолковываться как влияющие на идентичность или сходство последовательностей.

Чтобы увеличить время полужизни антител или полипептида, содержащих аминокислотные последовательности по настоящему изобретению, можно присоединить к антителу эпитоп связывания рецептора спасения, как описано, например, в патенте США 5739277. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая эпитоп связывания рецептора спасения, может быть соединена в рамке считывания с нуклеиновой кислотой, кодирующей последовательность полипептида по настоящему изобретению, так чтобы гибридный белок, экспрессируемый созданной молекулой нуклеиновой кислоты, включал эпитоп связывания рецептора спасения и полипептидную последовательность по настоящему изобретению. Применяемый в настоящем описании термин «эпитоп связывания рецептора спасения» относится к эпитопу области Fc молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), который ответственен за увеличение времени полужизни молекулы IgG в сыворотке in vivo (например, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), таблица 1). Антитела с заменами в их Fc области и повышенным временем полужизни в сыворотке описаны также в патентах WO00/42072, WO02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). В другом варианте осуществления время полужизни в сыворотке может быть также увеличено, например, путем присоединения других полипептидных последовательностей. Например, антитела или другие полипептиды, пригодные для способов по изобретению, могут быть присоединены к сывороточному альбумину или к части сывороточного альбумина, которая связывается с рецептором FcRn, или к сывороточному альбуминсвязывающему пептиду, так что сывороточный альбумин связывается с антителом или полипептидом, например, таким как полипептидные последовательности, раскрытые в патенте WO01/45746. В одном варианте осуществления пептид сывороточного альбумина, который присоединяют, включает аминокислотную последовательность DICLPRWGCLW. В другом варианте осуществления с помощью этих методов повышают время полужизни Fab. В отношении последовательностей альбуминсвязывающего пептида сыворотки см. также Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

«Гибридный белковый рецептор VEGF» представляет собой молекулу рецептора VEGF, имеющую аминокислотные последовательности, происходящие, по меньшей мере, от двух различных белков, по меньшей мере, один из которых представляет собой белковый рецептор VEGF. В определенных вариантах осуществления гибридный белковый рецептор VEGF способен связываться с VEGF и ингибировать его биологическую активность.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое идентифицируют и отделяют и/или получают из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые должны мешать диагностическому и терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В определенных вариантах осуществления антитело должно быть очищено (1) до более 95% по массе антитела при определении по методу Лоури и наиболее предпочтительно до более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся сосудом, или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окраски голубым кумасси или серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, так как, по меньшей мере, один компонент природного окружения антитела не должен присутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело должно быть получено с помощью, по меньшей мере, одной стадии очистки.

Под «фрагментом» подразумевается часть полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительно, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более полной длины реперной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100, 200, 300, 400, 500, 600 или более нуклеотидов или 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 или более аминокислот.

«Антиангиогенный агент» или «ингибитор ангиогенеза» относится к веществу низкой молекулярной массы, полинуклеотиду, полипептиду, выделенному белку, рекомбинантному белку, антителу или их конъюгатам или гибридным белкам, которые ингибируют ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов либо прямо, либо опосредованно. Должно быть понятно, что антиангиогенный агент включает те агенты, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, антиангиогенным агентом является антитело или другой антагонист ангиогенного агента, как определено в настоящем описании или известно в данной области техники, например, но, не ограничиваясь этим, антитела к VEGF-A, или к рецептору VEGF-A (например, к рецептору KDR и/или рецептору Flt-1), манок VEGF, ингибиторы анти-PDGFR, такие как Gleevec™ (иматиниба мезилат). Антиангиогенные агенты включают также нативные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (например, таблицу 3, в которой перечисляется лечение антиангиогенными агентами при злокачественной меланоме); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблицу 2, в которой перечисляются известные антиангиогенные факторы); и Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (например, таблицу 1, в которой перечислены антиангиогенные агенты, применяемые в клинических испытаниях).

«Поддерживающая» доза в настоящем описании относится к одной или более дозам терапевтического агента, вводимого больному в течение или после периода лечения. Обычно поддерживающие дозы вводят в интервалы лечения с перерывами, такие как приблизительно каждую неделю, приблизительно каждые 2 недели, приблизительно каждые 3 недели или приблизительно каждые 4 недели.

«Выживание» относится к времени, когда больной остается живым, и включает продолжительность выживания без прогрессирования заболевания (PFS) и общее выживание (OS). Выживание может быть определено по методу Каплана-Мейера, и любые различия в выживании вычисляются с использованием стратифицированного логарифмического рангового критерия.

«Выживание без прогрессирования заболевания (PFS)» относится к времени от лечения (или рандомизации) до первой прогрессии заболевания или смерти. Например, это период времени, когда больной остается живым без возвращения рака, например, в течение определенного периода времени, такого как приблизительно 0,5 месяца, 1 месяц, 2 месяца, 2,1 месяца, 2,2 месяца, 2,8 месяца, 3 месяца и т.д. от начала лечения или от первоначального диагноза. В одном варианте осуществления PFS увеличивается приблизительно на 2,1 месяца. В одном аспекте изобретения PFS может быть оценена с помощью критериев оценки ответов солидных опухолей (RECIST).

«Общее выживание» относится к времени, когда больной остается живым в течение определенного периода времени, таком как приблизительно 1 год, приблизительно 2 года, приблизительно 3 года, приблизительно 4 года, приблизительно 5 лет, приблизительно 10 лет и т.д. от начала лечения или от первоначального диагноза.

Под «продленным выживанием» или «увеличенной вероятностью выживания» понимается повышение PFS и/или OS у больного, получавшего лечение, относительно больного, не получавшего лечение, (т.е. относительно больного, не получавшего лечение VEGF-специфическим антагонистом, например, антителом против VEGF) или относительно протокола контрольного лечения, такого как лечение только химиотерапевтическим агентом, таким как агенты, используемые для лечения рака молочной железы. Выживание прослеживается в течение, по меньшей мере, одного месяца, двух месяцев, четырех месяцев, шести месяцев, девяти месяцев или, по меньшей мере, приблизительно 1 года, или, по меньшей мере, приблизительно 2 лет, или, по меньшей мере, приблизительно 3 лет, или, по меньшей мере, приблизительно 4 лет, или, по меньшей мере, приблизительно 5 лет, или, по меньшей мере, приблизительно 10 лет и т.д., после начала лечения или после первоначального диагноза.

Коэффициент риска (HR) представляет собой статистическое определение показателей событий. Для цели настоящего изобретения коэффициент риска определяется как представляющий возможность события в экспериментальной группе, деленную на возможность события в контрольной группе в любую конкретную точку времени. «Коэффициент риска» при анализе выживаемости без прогрессирования заболевания представляет собой сумму различий между двумя кривыми выживаемости без прогрессирования заболевания, представляющую снижение риска смерти при лечении по сравнению с контролем в течение периода наблюдения.

Термин «одновременно» используется в настоящем описании для обозначения введения двух или более терапевтических агентов, где, по меньшей мере, часть введений перекрывается во времени. Соответственно, одновременное введение включает схему дозирования, при которой введение одного или более агента(тов) продолжается после прекращения введения одного или более другого(гих) агента(тов).

Под «поддерживающей терапией» подразумевается схема терапии, которая назначается для снижения вероятности рецидива или прогрессирования заболевания. Поддерживающую терапию можно предоставить в течение любого временного периода, включая длительные периоды времени до продолжительности жизни индивидуума. Поддерживающую терапию можно предоставить после первоначального лечения или в сочетании с первоначальным и дополнительным лечением. Дозировки, используемые для поддерживающей терапии, могут варьироваться и могут включать уменьшенные дозы по сравнению с дозами, используемыми для других типов лечения.

Термины «рак» и «злокачественный» относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. В это определение включаются доброкачественные и злокачественные опухоли, а также опухоли в состоянии покоя или микрометастазы. Примеры рака включают, но не ограничиваются этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких типов рака включают рак молочной железы, сквамозноклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и сквамозную карциному легкого), рак брюшины, гепатоклеточный рак, желудочный рак или рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки или почечный рак, рак печени, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (включая фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL) низкой степени злокачественности; мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL; фолликулярную NHL средней степени злокачественности; диффузную NHL средней степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами высокой степени злокачественности; NHL с массивной опухолевой массой; лимфому из клеток мантийной зоны; связанную со СПИДом лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрома); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); лейкоз ворсистых клеток; хронический миелобластный лейкоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозом, эдемой (такой как эдема, связанная с опухолями головного мозга) и синдромом Мейгса.

Под «метастазом» подразумевается распространение рака из его первичного места локализации в другие места организма. Раковые клетки отделяются от первичной опухоли, проникают в лимфатические и кровеносные сосуды, циркулируют в кровотоке и растут (метастазируют) в отдаленном очаге в нормальных тканях в любом другом месте организма. Метастаз может быть местным или отдаленным. Метастазирование является последовательным процессом, зависящим от опухолевых клеток, отделяющихся от первичной опухоли, путешествующих в кровотоке и задерживающихся в отдаленном месте. На новом месте клетки создают кровоснабжение и могут расти, образуя угрожающую жизни массу. Это поведение регулируется в опухолевой клетке как стимулирующими, так и ингибирующими молекулярными путями, и значение имеют также взаимодействия между опухолевой клеткой и клетками-хозяевами в отдаленном месте.

Под «индивидуумом» подразумевается млекопитающее, включающее без ограничения человека или млекопитающего, не являющегося человеком, такого как коровы, лошади, собачьи, овцы или кошачьи. Предпочтительно индивидуум является человеком. В настоящем описании больные также являются индивидуумами.

Для способов по изобретению термин предмет «инструктирования» обозначает предоставление указаний для применяемой терапии, препаратов, лечения, схем лечения и тому подобного любыми способами, но предпочтительно в письменной форме, такой как в форме рекламного вкладыша в упаковку или другого письменного материала для продвижения.

Для способов по изобретению термин «продвижение» обозначает предоставление, рекламирование, реализацию или описание конкретного лекарства, сочетания лекарств или способа лечения с помощью любых средств, включая письменную форму, такую как форму рекламных вкладышей в упаковки. В настоящем описании продвижение относится к продвижению терапевтического агента, такого как антагонист VEGF, например, антитело против VEGF, или химиотерапевтического агента, по показанию, такому как лечение рака молочной железы, где такое продвижение санкционировано Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) как продемонстрировавшее связь со статистически значимой терапевтической эффективностью и допустимой безопасностью у популяции индивидуумов.

Применяемый в настоящем описании термин «маркетинг» используется для описания продвижения, реализации или распространения продукта (например, лекарства). Маркетинг конкретно включает упаковку, рекламирование и любую коммерческую активность с целью промышленного внедрения продукта.

«Популяция» индивидуумов относится к группе индивидуумов с раком, такой как группа в клиническом испытании, или такой как группа, находящаяся под наблюдением онкологов после одобрения FDA по конкретному показанию, такому как лечение рака молочной железы.

Термин «противораковая терапия» относится к терапии, пригодной для лечения рака. Примеры противораковых терапевтических средств включают, но не ограничиваются этим, например, хирургическое вмешательство, химиотерапевтические агенты, агенты, ингибирующие рост, цитотоксические агенты, агенты, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные агенты, агенты, вызывающие апоптоз, агенты против тубулина и другие агенты для лечения рака, такие как антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®), ингибиторы фактора роста из тромбоцитов (например, Gleevec™ (иматиниба мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела, низкомолекулярные ингибиторы и т.д.), которые связываются с одним или более из следующих мишеней - ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA или рецептор(ы) VEGF, VEGF, TRAIL/Apo2, и другие биоактивные и органические химические агенты и т.д. Их сочетания также включаются в изобретение.

Применяемый в настоящем описании термин «цитотоксический агент» относится к веществу, которое ингибирует функцию или препятствует функционированию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин предназначен для включения радиоактивных изотопов (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтических агентов и токсинов, таких как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, происходящие из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты.

«Химиотерапевтический агент» представляет собой химическое соединение, применяемое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают химическое соединение, применяемое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и CYTOXAN® циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (особенно, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилмустин; производные нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин-гамма II и калихеамицин-омега II (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин A; бисфофонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN® доксорубицин (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; агенты, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; мейтанзиноиды, такие как мейтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно, токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц, свободных от кремофора ABRAXANE® (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; иринотекан (Camptosar, CPT-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX); лапатиниб (Tykerb®); ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva®)) и VEGF-A, которые снижают клеточную пролиферацию, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого агента, из указанных выше.

Также в указанное определение включены антигормональные агенты, которые действуют, регулируя или ингибируя гормональное действие на опухоли, такие как антиэстрогены и избирательные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует продукцию эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат мегестрола MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, PKC-альфа, Raf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANDIOZYME®) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины для генной терапии, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX® и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше агентов.

Термин «цитокин» является родовым названием белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. К цитокинам относится гормон роста, такой как гормон роста человека, N-метионил-гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеидные гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); эпидермальный фактор роста; фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухолей-альфа и -бета; антимюллеров гормон; мышиный ассоциированный с гонадотропином пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-альфа; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма, колониестимулирующие факторы (CSFs), такие как CSF макрофагов (M-CSF), CSF гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и CSF гранулоцитов (G-CSF); интерлейкины (ИЛ), такие как ИЛ-1, ИЛ-1-альфа, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12; фактор некроза опухолей, такой как TNF-альфа или TNF-бета; и другие полипептидные факторы, включая LIF и лиганд kit (KL). Применяемый в настоящем описании термин цитокин включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

«Ингибирующий рост агент» при использовании в настоящем описании относится к соединению или композиции, которые ингибируют рост клетки in vitro и/или in vivo. Таким образом, ингибирующим рост агентом может быть агент, который в значительной степени уменьшает процентное содержание клеток в S-фазе. Примеры ингибирующих рост агентов включают агенты, которые блокируют прогрессию клеточного цикла (в другой фазе, отличной от S-фазы), такие как агенты, которые индуцируют остановку в G1-фазе и остановку в M-фазе. Классические блокаторы M-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), TAXOL® и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те агенты, которые останавливают цикл в G1, также распространяют свое действие на остановку в S-фазе, например, алкилирующие ДНК агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., в главе 1, озаглавленной «Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs» by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно на стр.13.

Термин «пролекарство», используемый в данной заявке, относится к форме предшественника или производного фармацевтически активного вещества, которая является менее цитотоксической по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с родительским лекарством и способна подвергаться ферментативной активации или превращению в более активную родительскую форму. См., например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по изобретению включают, но не ограничиваются этим, пролекарства, содержащие фосфат, пролекарства, содержащие тиофосфат, пролекарства, содержащие сульфат, пролекарства, содержащие пептид, пролекарства, модифицированные D-аминокислотами, гликозилированные пролекарства, пролекарства, содержащие β-лактам, пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид, или пролекарства, содержащие необязательно замещенный фенилацетамид, пролекарства, содержащие 5-фторцитозин и другие 5-фторуридины, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое свободное лекарство. Примеры цитотоксических лекарств, которые могут быть дериватизированы в пролекарственную форму для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются этим, те химиотерапевтические агенты, которые описаны выше.

Под «лучевой терапией» подразумевается использование направленных гамма-лучей или бета-лучей для индукции достаточного повреждения клетки так, чтобы ограничить ее способность нормально функционировать или совсем разрушить клетку. Должно быть понятно, что существует много способов, известных в данной области техники, для определения дозы и продолжительности лечения. Обычно лечение проводится как однократное назначение, и типичный диапазон доз составляет от 10 до 200 единиц (Грей) в день.

Под «снижением или ингибированием» подразумевается способность предотвращать/задерживать или вызывать итоговое снижение на 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше, и наиболее предпочтительно на 75%, 85%, 90%, 95% или больше. Снижение или ингибирование может относиться к симптомам нарушения, подвергаемого лечению, присутствию или размеру метастазов или микрометастазов, размеру первичной опухоли, присутствию или размеру покоящейся опухоли, или к размеру и количеству кровеносных сосудов при ангиогенных нарушениях.

Термин «внутривенная инфузия» относится к введению лекарства в вену больного животного или человека в течение периода времени, более длительного, чем 5 минут, предпочтительно приблизительно от 30 до 90 минут, хотя, согласно настоящему изобретению, альтернативно внутривенная инфузия проводится в течение 10 часов или менее.

Термин «внутривенное болюсное введение» или «внутривенное нагрузочное введение» относится к введению лекарства в вену животного или человека так, чтобы лекарство было воспринято организмом в пределах приблизительно 15 минут или менее, предпочтительно 5 минут или менее.

Термин «подкожное введение» относится к введению лекарства под кожу больного животного или человека предпочтительно в карман между кожей и нижележащей тканью при относительно медленной поддерживаемой доставке из кармана, вмещающего лекарство. Карман может быть создан с помощью защемления или оттягивания кожи вверх и от нижележащей ткани.

Термин «подкожная инфузия» относится к введению лекарства под кожу больного животного или человека предпочтительно в карман между кожей и нижележащей тканью при относительно медленной поддерживаемой доставке из кармана, вмещающего лекарство, в течение периода времени, включая, но, не ограничиваясь этим, 30 минут или менее или 90 минут или менее. Необязательно инфузия может быть осуществлена с помощью подкожной имплантации лекарственной помпы для доставки, имплантируемой под кожу больного животного или человека, где помпа осуществляет доставку предварительно определенного количества лекарства в течение предварительно определенного периода времени, такого как 30 минут, 90 минут, или период времени, охватывающий продолжительность схемы лечения.

Термин «подкожное болюсное введение» относится к введению лекарства под кожу больного животного или человека, где болюсная доставка лекарства составляет предпочтительно менее приблизительно 15 минут, более предпочтительно менее 5 минут, и наиболее предпочтительно менее 60 секунд. Введение осуществляется предпочтительно в карман между кожей и нижележащей тканью, где карман создается, например, с помощью защемления или оттягивания кожи вверх и от нижележащей ткани.

«Нарушение» представляет собой любое состояние, при котором может быть полезно лечение антителом. Такое нарушение включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые обусловливают предрасположенность млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений, подвергаемых лечению согласно настоящему изобретению, включают рак; доброкачественные и злокачественные опухоли; лейкозы и лимфоидные злокачественные новообразования; нейронные, глиальные, астроглиальные, гипоталамические и другие нарушения, затрагивающие железы, макрофаги, эпителий, строму и бластоцель; и воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарства, эффективному для лечения заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарства может уменьшить количество раковых клеток; снизить размер опухоли; ингибировать (т.е. в определенной степени замедлить и предпочтительно остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. в определенной степени замедлить и предпочтительно остановить) метастазирование опухоли; в определенной степени ингибировать рост опухоли; и/или в определенной степени ослабить один или более симптомов, связанных с нарушением. В зависимости от степени, в которой лекарство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. В случае терапии рака эффективность in vivo можно, например, измерить, оценивая продолжительность выживания, продолжительность выживания без прогрессирования заболевания (PFS), показатели ответной реакции (RR), продолжительность ответа и/или качество жизни.

«Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. К индивидуумам, нуждающимся в лечении, относятся индивидуумы, уже имеющие нарушение, а также индивидуумы, у которых надо предотвратить нарушение.

Слово «метка» при использовании в настоящем описании относится к регистрируемому соединению или композиции, которые прямо или опосредованно конъюгированы с полипептидом. Метку можно регистрировать как таковую (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки), или, в случае ферментативной метки, она может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое регистрируется.

II. Антитела против VEGF и антагонисты

(i) Антиген VEGF

Антиген VEGF, предназначенный для использования при продукции антител, может представлять собой, например, молекулу VEGF₁₆₅, а также другие изоформы VEGF или его фрагмент, содержащий желаемый эпитоп. Другие формы VEGF, пригодные для выработки антител против VEGF по изобретению, должны быть очевидны специалистам в данной области техники.

VEGF человека был получен сначала путем скрининга библиотеки кДНК, полученной из клеток человека, с использованием кДНК VEGF быка в качестве гибридизационного зонда. Leung et al. (1989) Science, 246:1306. Одна кДНК, идентифицированная таким образом, кодирует белок из 165 аминокислот, имеющий более чем 95% гомологию с VEGF быка; этот белок из 165 аминокислот обычно обозначается как VEGF человека (hVEGF) или VEGF₁₆₅. Митогенная активность VEGF человека была подтверждена путем экспрессии кДНК VEGF человека в клетках-хозяевах млекопитающих. Среды, кондиционированные клетками, трансфецированными кДНК VEGF человека, стимулировали пролиферацию эндотелиальных клеток капилляров, тогда как контрольные клетки не вызывали этот эффект. Leung et al. (1989) Science, выше.

Хотя фактор роста эндотелиальных клеток сосудов для последующего терапевтического применения может быть выделен и очищен из природных источников, относительно низкие концентрации белка в фолликулярных клетках и высокая стоимость получения VEGF, как в плане усилий, так и затрат, доказывает несостоятельность таких коммерческих усилий. Соответственно, были предприняты дальнейшие попытки для клонирования и экспрессии VEGF с помощью методов рекомбинантной ДНК. (См., например, Ferrara, Laboratory Investigation 72:615-618 (1995) и цитируемые там ссылки).

VEGF экспрессируется в разнообразных тканях в виде множественных гомодимерных форм (121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот на мономер), происходящих в результате альтернативного сплайсинга РНК. VEGF₁₂₁ представляет собой растворимый митоген, который не связывает гепарин; более длинные формы VEGF связывают гепарин с прогрессивно более высоким сродством. Связывающие гепарин формы VEGF могут быть расщеплены на карбоксильном конце плазмином с высвобождением способной(ных) к диффузии форм(ы) VEGF. Секвенирование аминокислот карбоксиконцевого пептида, идентифицированного после расщепления плазмином, дает Arg₁₁₀-Arg₁₁₁. Аминоконцевой «каркасный» белок, VEGF (1-110), выделенный в виде гомодимера, связывается нейтрализующими моноклональными антителами (такими как антитела, обозначенные как 4.6.1 и 3.2E3.1.1) и растворимыми формами рецепторов VEGF со сродством, сходным со сродством гомодимера интактного VEGF₁₆₅.

Недавно также идентифицировано несколько молекул, структурно сходных с VEGF, включая фактор роста плаценты (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Ferrara and Davis-Smyth (1987) Endocr. Rev., выше; Ogawa et al. J. Biological Chem. 273:31273-31281(1998); Meyer et al. EMBO J., 18:363-374(1999). Рецепторная тирозинкиназа Flt-4 (VEGFR-3) идентифицирована в качестве рецептора VEGF-C и VEGF-D. Joukov et al. EMBO. J. 15:1751(1996); Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1988-1992(1996); Achen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:548-553. VEGF-C, как показано, вовлечен в регуляцию лимфатического ангиогенеза, Jeltsch et al. Science 276:1423-1425(1997).

(ii) Антитела против VEGF

Антитела против VEGF, которые пригодны в способах по этому изобретению, включают любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью и могут снижать или ингибировать биологическую активность VEGF. Антитело против VEGF обычно не может связываться ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF.

В определенных вариантах осуществления этого изобретения антитела против VEGF включают, но не ограничиваются этим, моноклональное антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и моноклональное антитело против VEGF A4.6.1, продуцируемое гибридомой ATCC HB 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, созданное по Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. В одном варианте осуществления антитело против VEGF представляет собой «бевацизумаб (BV)», также известное как «rhuMAb VEGF» или AVASTIN®. Оно включает области каркаса мутантного IgG1 человека и антигенсвязывающие области, определяющие комплементарность, от мышиного моноклонального антитела A.4.6.1 против hVEGF, которые блокируют связывание VEGF человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая наибольшую часть областей каркаса, происходит от IgG1 человека и приблизительно 7% последовательности происходит от мышиного антитела A.4.6.1.

Бевацизумаб и другие гуманизированные антитела против VEGF дополнительно описаны в патенте № 6884879, опубликованном 26 февраля 2005 г. Дополнительные антитела включают серии антител G6 или B20 (например, G6-31, B20-4.1), как описано в публикации PCT № WO2005/012359, публикации PCT № WO2005/044853 и опубликованной патентной заявке США US2009-0142343, содержание этих патентных заявок специально включено в настоящее описание в качестве ссылок. В отношении дополнительных антител см. патенты США №№ 7060269, 6582959, 6703020; 6054297; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; опубликованные патентные заявки США №№ 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 и 20050112126; и Popkov et al, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). Другие антитела включают антитела, которые связываются с функциональным эпитопом на VEGF человека, включающим остатки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 и C104, или, альтернативно, включающим остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

В одном варианте осуществления этого изобретения антитело против VEGF имеет вариабельную область тяжелой цепи, включающую следующую аминокислотную последовательность:

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO:1)

и вариабельную область легкой цепи, включающую следующую аминокислотную последовательность:

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO:2).

«Антитело серий G6» по настоящему изобретению представляет собой антитело против VEGF, которое происходит из последовательности антитела G6 или антитела, происходящего из G6, в соответствии с любой из фигур 7, 24-26 и 34-35 публикации PCT № WO2005/012359, полное раскрытие которой специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. См. также публикацию PCT № WO2005/044853, полное раскрытие которой специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. В одном варианте осуществления антитело серий G6 связывается с функциональным эпитопом VEGF человека, включающим остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.

«Антитело серий B20» по настоящему изобретению представляет собой антитело против VEGF, которое происходит из последовательности антитела B20 или антитела, происходящего из B20, в соответствии с любой из фигур 27-29 публикации PCT № WO2005/012359, полное раскрытие которой специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. См. также публикацию PCT № WO2005/044853 и опубликованную патентную заявки США US2009-0142343, содержание этих патентных заявок специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. В одном варианте осуществления антитело серий B20 связывается с функциональным эпитопом VEGF человека, включающим остатки F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 и C104.

«Функциональный эпитоп» по настоящему изобретению относится к аминокислотным остаткам антигена, которые вносят энергетический вклад в связывание антитела. Мутация любого из остатков антигена, вносящих энергетический вклад (например, мутация VEGF дикого типа с заменой на аланин или гомологичная мутация), будет нарушать связывание антитела, так что отношение относительного сродства (IC50 мутанта VEGF/IC50 VEGF дикого типа) антитела будет выше 5 (см. пример 2 патента WO2005/012359). В одном варианте осуществления отношение относительного сродства определяется по связыванию фагового дисплея в растворе с помощью ELISA. Вкратце, 96-луночные иммунопланшеты Maxisorp (NUNC) покрывают в течение ночи при 4°С Fab формой антитела, подвергаемого тестированию, в концентрации 2 мкг/мл в PBS и блокируют PBS, 0,5% BSA и 0,05% твином 20 (PBT) в течение 2 часов при комнатной температуре. Серийные разведения фагового дисплея мутантов hVEGF с точечными заменами на аланин (форма с остатками 8-109) или hVEGF дикого типа (8-109) в PBT сначала инкубируют в планшетах, покрытых Fab, в течение 15 минут при комнатной температуре, и планшеты промывают PBS, 0,05% твином 20 (PBST). Связанный фаг определяют с помощью моноклонального антитела против M13, конъюгированного с пероксидазой хрена (Amersham Pharmacia), в разведении 1:5000 в PBT, при развитии окраски субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) в течение приблизительно 5 мин, реакцию останавливают 1,0 М H3PO4, и результат считывают спектрофотометрически при 450 нм. Отношение величин IC50 (IC50,ala/IC50,wt) показывает степень снижения связывающего сродства (относительное связывающее сродство).

(iii) Молекулы рецептора VEGF

Идентифицировано два рецептора VEGF, Flt-1 (также называемый VEGFR-1) и KDR (также называемый VEGFR-2). Shibuya et al. (1990) Oncogene 8:519-527; de Vries et al. (1992) Science 255:989-991; Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579-1586. Специфичность каждого рецептора для каждого члена семейства VEGF варьируется, но VEGF-A связывается как с Flt-1, так и с KDR. Нейропилин-1, как показано, является селективным рецептором VEGF, способным связывать изоформы VEGF, связывающие гепарин (Soker et al. (1998) Cell 92:735-45). Как Flt-I, так и KDR принадлежат к семейству рецепторных тирозинкиназ (RTKs). RTKs включают большое семейство трансмембранных рецепторов с разнообразной биологической активностью. В настоящее время идентифицировано, по меньшей мере, девятнадцать (19) отдельных подсемейств RTK. Семейство рецепторных тирозинкиназ (RTK) включает рецепторы, которые являются ключевыми для роста и дифференцировки различных клеточных типов (Yarden and Ullrich (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:433-478; Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61:243-254). Присущая RTKs функция активируется при связывании лиганда, которое ведет к фосфорилированию рецептора и множества клеточных субстратов, что впоследствии приводит к разнообразным ответам клетки (Ullrich & Schlessinger (1990) Cell 61:203-212). Таким образом, передача сигнала, опосредованная рецепторной тирозинкиназой, инициируется внеклеточным взаимодействием со специфическим фактором роста (лигандом), за которым обычно следует димеризация рецепторов, стимуляция собственной тирозинкиназной активности белка и перекрестное фосфорилирование рецепторов. В результате этого создаются связывающие сайты для молекул, участвующих в передаче внутриклеточного сигнала, что ведет к образованию комплексов со спектром цитоплазматических сигнальных молекул, что способствует соответствующему клеточному ответу (например, клеточному делению, дифференцировке, метаболическим эффектам, изменениях во внеклеточном микроокружении), см. Schlessinger and Ullrich (1992) Neuron 9:1-20. Структурно как Flt-1, так и KDR имеют во внеклеточном домене семь иммуноглобулиноподобных доменов, один трансмембранный домен и консенсусную тирозинкиназную последовательность, которая прерывается вставочным для киназы доменом. Matthews et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030; Terman et al. (1991) Oncogene 6:1677-1683.

Молекулы рецептора VEGF или его фрагмента, которые специфически связываются с VEGF, могут быть использованы в способах по изобретению для связывания и отделения белка VEGF, тем самым препятствуя его сигнализации. В определенных вариантах осуществления молекула рецептора VEGF или ее связывающий VEGF фрагмент находится в растворимой форме, такой как sFlt-1. Растворимая форма рецептора оказывает ингибиторное влияние на биологическую активность белка VEGF в результате связывания с VEGF, что тем самым препятствует его связыванию с его природными рецепторами, присутствующими на поверхности клеток-мишеней. Включенными являются также гибридные рецепторные белки для VEGF, примеры которых описываются ниже.

Гибридный рецепторный белок для VEGF представляет собой рецепторную молекулу, обладающую аминокислотными последовательностями, происходящими, по меньшей мере, из двух различных белков, по меньшей мере, одна из которых представляет собой рецепторный белок (например, рецептор flt-1 или KDR), который способен связываться с VEGF и ингибировать его биологическую активность. В определенных вариантах осуществления гибридные рецепторные белки для VEGF по изобретению состоят из аминокислотных последовательностей, происходящих только из двух различных рецепторных молекул для VEGF; однако, аминокислотные последовательности, включающие один, два, три, четыре, пять, шесть или все семь Ig-подобных доменов внеклеточной лигандсвязывающей области рецептора flt-1 и/или KDR, могут быть соединены с аминокислотными последовательностями других неродственных белков, например, последовательностями иммуноглобулинов. Другие аминокислотные последовательности, к которым присоединяют Ig-подобные домены, должны быть без труда ясны специалистам в данной области техники. Примеры гибридных рецепторных белков для VEGF включают, например, Flt-1/Fc, KDR/Fc или FLt-1/KDR/Fc (также известный как манок VEGF). (См., например, опубликованную заявку PCT № WO97/44453).

Растворимый рецепторный белок для VEGF или гибридные рецепторные белки для VEGF по изобретению включают рецепторные белки для VEGF, которые не фиксированы на поверхности клеток через трансмембранный домен. По существу растворимые формы рецептора VEGF, включая гибридные рецепторные белки, при способности связываться с VEGF и инактивировать его не включают трансмембранного домена и, следовательно, обычно не становятся связанными с клеточной мембраной клеток, в которых экспрессируется молекула.

III. Терапевтическое использование антител против VEGF

Изобретением охватывается антиангиогенная терапия, новая стратегия лечения рака, направленная на подавление развития кровяных сосудов в опухоли, необходимых для снабжения питательными веществами, поддерживающими рост опухоли. Поскольку ангиогенез участвует в росте и первичной опухоли, и метастазов, предлагаемое в изобретении антиангиогенное лечение способно подавлять неопластический рост опухоли в месте исходной локализации, а также предотвращать метастазирование опухолей во вторичных участках, обеспечивая тем самым атакующее действие на опухоли других терапевтических агентов.

Конкретно, в изобретении предлагается метод лечения больного с диагностированным и ранее подвергнутым лечению метастатическим раком молочной железы, включающий применение к больному схемы лечения, сочетающей химиотерапию с введением эффективного количества антитела против VEGF.

Формы сочетанной терапии

Изобретение отличается использованием сочетания, по меньшей мере, одного специфичного антагониста VEGF с одним или более дополнительных противораковых лечебных агентов. Примеры противораковых лечебных агентов включают, но не ограничиваются этим, хирургическую операцию, рентгенотерапию (радиотерапию), биотерапию, иммунотерапию, химиотерапию или сочетание этих видов терапии. Кроме того, в сочетании со специфичным антагонистом VEGF могут быть использованы цитотоксические агенты, антиангиогенные и антипролиферативные агенты.

В определенных аспектах изобретения предлагается метод лечения подвернутого ранее лечению рака молочной железы путем введения эффективных количеств антитела против VEGF и одного или более химиотерапевтических агентов больному, предрасположенному к метастатическому раку или с диагностированным метастатическим раком, ранее подвернутым лечению. В методах по изобретению сочетанного лечения может быть использовано множество химиотерапевтических агентов. Иллюстративный и неограничивающий перечень рассматриваемых химиотерапевтических агентов представлен в настоящем описании в разделе «Определение» или описан в настоящем описании.

В одном примере изобретение отличается использованием специфичного антагониста VEGF с одним или более химиотерапевтическими агентами (например, смесью) или их любым сочетанием. Сочетанное введение включает одновременное введение, использование отдельных составов или единого фармацевтического состава, последовательное введение в любом порядке, при котором предпочтительно имеется период времени, когда оба (или все) активные агенты оказывают свое биологическое действие одновременно. Получение и режимы дозирования таких химиотерапевтических агентов могут быть использованы в соответствии с инструкциями производителей или определены эмпирически практикующим врачом. Получение и режимы дозирования для химиотерапии описаны также в Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992). Химиотерапевтический агент может предшествовать или следовать за введением специфичного антагониста VEGF или может быть введен одновременно с ним.

В некоторых других аспектах другие терапевтические агенты, пригодные для сочетанной терапии опухоли антителом изобретения, включают антагонисты других факторов, вовлеченных в опухолевый рост, таких как, но, не ограничиваясь этим, EGFR, ErbB2 (также известным как Her2) ErbB3, ErbB4 или TNF. Иногда может быть выгодно также введение больному одного или более цитокинов. В одном варианте осуществления антитело против VEGF вводят совместно с агентом, подавляющим рост. Например, сначала можно вводить агент, подавляющий рост, а затем антитело против VEGF. Однако предусматривается и одновременное введение или введение антитела против VEGF первым. Подходящими дозами для агента, подавляющего рост, являются дозы, используемые в настоящее время, и они могут быть снижены благодаря сочетанному действию (синергизму) агента, подавляющего рост, и антитела против VEGF.

Состав в настоящем описании также может содержать более одного активного соединения, если это необходимо по конкретным показаниям для лечения, предпочтительно соединения с комплементарными типами активности, которые не оказывают неблагоприятного действия друг на друга. Например, может быть желательным дополнительное введение антител, которые связываются с EGFR, VEGF (например, антитело, которое связывает другой эпитоп на VEGF), VEGFR или ErbB2 (например, Herceptin®), в одном составе. Альтернативно или дополнительно композиция может включать цитотоксический агент, цитокин, агент, подавляющий рост, и/или низкомолекулярный антагонист VEGFR. Такие молекулы предпочтительно находятся в сочетании в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели.

В определенных аспектах другие терапевтические агенты, пригодные для сочетанной с антителом по изобретению терапии рака, включают другие антиангиогенные агенты. Было выявлено и известно в данной области техники много антиангиогенных агентов, включая те, которые перечислены Carmeliet и Jain (2000). В одном варианте осуществления антитело против VEGF по изобретению используют в сочетании с другим антагонистом VEGF или антагонистом рецептора VEGF, такими как варианты VEGF, растворимые фрагменты рецептора VEGF, аптамеры, способные блокировать VEGF или VEGFR, нейтрализующие антитела против VEGFR, низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR или любыми их сочетаниями. Альтернативно или дополнительно больному можно вводить совместно два или более антитела против VEGF.

Для профилактики или лечения заболевания подходящая доза специфичного антагониста VEGF должна зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, как определено выше, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли специфичный антагонист VEGF для целей профилактики или лечения, предшествующей терапии, истории болезни больного, ответа на специфичный антагонист VEGF и выбора лечащего врача. Специфичный антагонист VEGF соответственно вводят больному однократно или с помощью серии введений. При схеме сочетанной терапии специфичный антагонист VEGF и один или более противораковых терапевтических агентов вводят в терапевтически эффективном или синергичном количестве. В настоящем описании терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество, которое при совместном введении специфичного антагониста VEGF и одного или более противораковых терапевтических агентов или при введении композиции по изобретению вызывает уменьшение или подавление рака, как описано выше. Терапевтически синергичное количество представляет собой количество специфичного антагониста VEGF и одного или более противораковых терапевтических агентов, необходимое для синергичного или значительного снижения или устранения состояний или симптомов, связанных с конкретным заболеванием.

Специфичный антагонист VEGF и один или более противораковых терапевтических агентов можно вводить одновременно или последовательно в количестве и на протяжении периода, достаточных для снижения или устранения наличия или повторного появления опухоли, опухоли в неактивной стадии или микрометастазов. Специфичный антагонист VEGF и один или более противораковых терапевтических агентов можно вводить в качестве поддерживающей терапии для профилактики или снижения вероятности повторного появления опухоли.

Как должно быть ясно специалистам в данной области техники, подходящие дозы химиотерапевтических агентов или других противораковых агентов обычно должны быть приблизительно такими же, какие уже используются в клинической терапии, например, при введении химиотерапевтических агентов раздельно или в сочетании с другими химиотерапевтическими агентами. Доза должна, вероятно, зависеть от состояния, подлежащего лечению. Врач, назначающий лечение, должен быть способен определить подходящую дозу для отдельного индивидуума.

Дополнительно к указанным выше терапевтическим схемам больной может быть подвергнут рентгенотерапии.

В определенных вариантах осуществления вводимое антитело против VEGF представляет собой интактное антитело как таковое. Однако антитело против VEGF может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом. В определенных вариантах осуществления конъюгированное антитело и/или антиген, с которым оно связано, интернализуется/интернализуются клеткой, что приводит к повышению терапевтической эффективности конъюгата в плане уничтожения раковой клетки, с которой оно связывается. В одном варианте осуществления цитотоксический агент повреждает нуклеиновую кислоту или интерферирует с ней в раковой клетке. Примеры цитотоксических агентов включают мейтансиноиды, калихеамицины, рибонуклеазы и ДНК-эндонуклеазы.

Изобретение также отличается методом инструктирования индивидуума-человека, ранее лечившегося от рака молочной железы, путем предоставления инструкций по получению лечения антителом против VEGF с тем, чтобы увеличить время выживания без прогрессирования заболевания, снизить риск рецидива рака у индивидуума или повысить вероятность выживания индивидуума. В некоторых вариантах осуществления метод дополнительно включает предоставление инструкций по лечению, по меньшей мере, одним терапевтическим агентом. Лечение антителом против VEGF может осуществляться одновременно с лечением химиотерапевтическим агентом или после него. В определенных вариантах осуществления индивидуума лечат в соответствии с указаниями метода инструктирования. Лечение рака молочной железы путем введения антитела против VEGF совместно с химиотерапией или без нее может продолжаться до рецидива рака или смерти.

В изобретении дополнительно предлагается способ продвижения, включающий продвижение введения антитела против VEGF для лечения ранее подвергнутого лечению рака молочной железы у индивидуума-человека. В некоторых вариантах осуществления метод дополнительно включает продвижение введения, по меньшей мере, одного химиотерапевтического агента. Введение антитела против VEGF может проводиться одновременно с введением химиотерапевтического агента или после него. Продвижение может проводиться любым из доступных средств. В некоторых вариантах осуществления продвижение осуществляется с помощью рекламного вкладыша в упаковке, сопровождающего продаваемый состав антитела против VEGF. Продвижение также может осуществляться с помощью рекламного вкладыша в упаковке, сопровождающего продаваемый состав химиотерапевтического агента. Продвижение может быть в виде письменного или устного сообщения врачу или работнику здравоохранения. В некоторых вариантах осуществления продвижение осуществляется с помощью рекламного вкладыша в упаковке, где в рекламном вкладыше предоставляются инструкции по получению лечения антителом против VEGF. В дополнительном варианте осуществления рекламный вкладыш в упаковке включает некоторые или все результаты примера 1. В некоторых вариантах осуществления за продвижением следует лечение индивидуума антителом против VEGF и химиотерапевтическим агентом или без него.

В изобретении предлагается способ ведения бизнеса, включающий маркетинг антитела против VEGF для лечения ранее подвергнутого лечению рака молочной железы у индивидуума-человека с тем, чтобы увеличить время выживания без прогрессирования заболевания, снизить риск рецидива рака у индивидуума или повысить вероятность выживания индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает маркетинг химиотерапевтического агента для использования в сочетании с антителом против VEGF. В некоторых вариантах осуществления за маркетингом следует лечение индивидуума антителом против VEGF и химиотерапевтическим агентом или без него.

Предлагается также способ ведения бизнеса, включающий маркетинг химиотерапевтического агента в сочетании с антителом против VEGF для лечения ранее подвергнутого лечению рака молочной железы у индивидуума-человека с тем, чтобы увеличить время выживания без прогрессирования заболевания, снизить риск рецидива рака у индивидуума или повысить вероятность выживания индивидуума. В некоторых вариантах осуществления за маркетингом следует лечение индивидуума сочетанием химиотерапевтического агента и антитела против VEGF.

IV. Дозы и продолжительность

Композиция специфичного антагониста VEGF должна быть составлена, дозирована и введена способом, соответствующим хорошей медицинской практике. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретный индивидуум, подлежащий лечению, клиническое состояние конкретного больного, причину нарушения, место доставки агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим клиницистам. «Терапевтически эффективное количество» специфичного антагониста VEGF для введения должно зависеть от таких факторов и представляет собой минимальное количество, необходимое для профилактики, облегчения или лечения или стабилизации рака; для увеличения времени до наступления прогрессирования (длительности выживания без прогрессирования заболевания) или для лечения или профилактики наличия или рецидива опухоли, опухоли в неактивной стадии или микрометастазов ранее подвергнутого лечению рака. Для специфичного антагониста VEGF нет необходимости составления с одним или более агентами, используемыми в настоящее время для профилактики или лечения рака или риска развития рака, но такое составление возможно по выбору. Эффективное количество таких иных агентов зависит от количества специфичного антагониста VEGF, находящегося в составе, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Их обычно используют в тех же дозах и при тех же путях введения, какие использовались ранее, или приблизительно от 1 до 99% от использовавшихся до этого доз.

В зависимости от типа и тяжести заболевания исходная предлагаемая доза специфичного антагониста VEGF для введения больному составляет приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) при введении, например, либо путем одного или более отдельных введений, либо непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. Особенно желаемые дозы включают, например, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг. Для повторных введений на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение поддерживают до тех пор, пока производится лечение рака, оцениваемого описанными выше или известными в данной области техники методами. Однако могут быть пригодны другие режимы доз. В одном примере, когда специфичный антагонист VEGF представляет собой антитело, антитело по изобретению вводят раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели в диапазоне доз от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая, но не ограничиваясь этим, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг или 15 мг/кг. Успешность терапии по изобретению легко отслеживать с помощью традиционных методов и анализов. В других вариантах осуществления такой режим дозирования используют в сочетании с режимом химиотерапии в качестве второй линии терапии для лечения ранее подвергнутого лечению метастатического рака молочной железы. Дополнительная информация относительно подходящих доз представлена в примере ниже.

Терапию обычно продолжают на протяжении времени, соответствующего медицинским показаниям или до достижения желаемого терапевтического эффекта (например, одного из описанных в настоящем описании).

Специфичные антагонисты VEGF по изобретению вводят индивидууму, например, больному человеку в соответствии с известными методами, такими как внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузии на протяжении некоторого периода времени, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрь спинного мозга, подкожный, внутрисуставный, интрасиновиальный, интратекальный, пероральный, местный или ингаляционный пути введения. Местное введение особенно желательно, если с антагонизмом VEGF связаны значительные побочные эффекты или токсичность. Для терапевтического применения также может быть использована стратегия ex vivo. В стратегиях ex vivo используется трансфекция или трансдукция клеток, полученных от индивидуума, полинуклеотидом, кодирующим антагонист VEGF. Трансфецированные или трансдуцированные клетки затем возвращают в организм индивидуума. Клетки могут относиться к любому типу из широкого спектра типов клеток, включая, но не ограничиваясь этим, гематопоэтические клетки (например, клетки костного мозга, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, T-клетки или B-клетки), фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты или мышечные клетки.

Например, если специфичный антагонист VEGF представляет собой антитело, антитело вводят с помощью любых подходящих способов, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение и, если это желательно для местного иммунодепрессивного лечения, введение внутрь повреждения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитело соответственно вводят с помощью импульсной инфузии, особенно снижающимися дозами антитела. Предпочтительно дозу вводят путем инъекций, наиболее предпочтительно путем внутривенных или подкожных инъекций, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или хроническим.

В другом примере соединение, являющееся специфичным антагонистом VEGF, вводят местно, например, путем прямых инъекций, когда нарушение или локализация опухоли это позволяет, и инъекции могут периодически повторяться. Специфичный антагонист VEGF может также доставляться системно индивидууму или прямо к опухолевым клеткам, например, к опухоли или ложу опухоли после хирургического удаления опухоли для профилактики или снижения местного рецидива или метастаза, например, опухоли в неактивной стадии или микрометастазов.

Альтернативно, к соответствующим клеткам индивидуума может быть доставлена молекула ингибирующей нуклеиновой кислоты или полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей специфичный антагонист VEGF. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота может быть направлена к самой опухоли.

Нуклеиновая кислота может быть введена в клетки способами, соответствующими используемому вектору. Многие такие методы хорошо известны в данной области техники (Sambrook et al., выше, и Watson et al., Recombinant DNA, Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992). Примеры методов доставки генов включают опосредуемую липосомами трансфекцию, электропорацию, методы с использованием фосфата кальция/ДЭАЭ-декстрана, генную пушку и микроинъекцию.

V. Фармацевтические составы

Терапевтические составы антител, используемых по изобретению, получают для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизованных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примеры лиофилизованных составов антитела против VEGF описаны в патенте WO97/04801, специально включенном в настоящее описание в качестве ссылки.

Необязательно состав содержит фармацевтически приемлемую соль, обычно, например, хлорид натрия, и часто в приблизительно физиологических концентрациях. Необязательно составы по изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый консервант. В некоторых вариантах осуществления концентрация консерванта варьирует от 0,1 до 2,0%, обычно об./об. Подходящие консерванты включают консерванты, известные в фармацевтической области техники. Примерами консервантов являются бензиловый спирт, фенол, м-крезол, метилпарабен и пропилпарабен. Необязательно составы по изобретению могут включать фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,005 до 0,02%.

В одном варианте осуществления для терапевтического использования предоставляется бевацизумаб в сосудах для однократного применения со 100 мг и 400 мг бевацизумаба без консерванта для доставки 4 или 16 мл бевацизумаба (25 мг/мл). 100 мг продукта составлены с 240 мг α,α-трегалозы дегидрата, 23,2 мг фосфата натрия (одноосновного, моногидрата), 4,8 мг фосфата натрия (двухосновного, безводного), 1,6 мг полисорбата 20 и водой для инъекций, USP. 400 мг продукта составлены с 960 мг α,α-трегалозы дегидрата, 92,8 мг фосфата натрия (одноосновного, моногидрата), 19,2 мг фосфата натрия (двухосновного, безводного), 6,4 мг полисорбата 20 и водой для инъекций, USP. См. также этикетку для бевацизумаба. В настоящее время бевацизумаб имеется в продаже в некоторых странах.

Состав по настоящему описанию может также содержать более одного активного соединения, если это необходимо по конкретным показаниям для лечения, предпочтительно соединения с комплементарными типами активности, которые не оказывают неблагоприятное действие друг на друга. Например, может быть желательным дополнительное предоставление антител, которые связываются с EGFR, VEGF (например, антитела, которое связывает другой эпитоп на VEGF), VEGFR или ErbB2 (например, Herceptin®) в одном составе. Альтернативно или дополнительно композиция может включать цитотоксический агент, цитокин, агент, ингибирующий рост и/или антагонист VEGFR (например, низкомолекулярный ингибитор, полипептид и т.д.). Такие молекулы, соответственно, находятся в сочетании в количествах, которые являются эффективными для желаемой цели.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсул и поли-(метилметакрилатных) микрокапсул, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарства (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Могут быть получены препараты с непрерывным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с непрерывным высвобождением включают полупроницаемые матриксы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матрицы находятся в определенной форме, например, форме пленок или микрокапсул. Примеры матриц с непрерывным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразрушаемый этилен-винилацетат, разрушаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^TM (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. В то время как такие полимеры, как этилен-винилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, способны высвобождать молекулы в течение около 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. В том случае, когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации, в зависимости от вовлекаемого механизма. Например, если обнаружено, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной S-S-связи в результате тиодисульфидного обмена, то стабилизация может быть достигнута посредством модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, регуляцией влагосодержания, использованием соответствующих добавок и разработкой специальных композиций на основе полимерного матрикса.

Составы, предназначенные для введения in vivo, могут быть стерильными. Это легко осуществить путем фильтрования через мембраны для стерильного фильтрования.

VI. Эффективность лечения

Основным преимуществом лечения по изобретению является возможность получения выраженных противораковых эффектов у больного человека без проявления значительной токсичности или побочных эффектов, в результате чего больной выигрывает от лечения во всех отношениях. Эффективность лечения по изобретению можно измерить на основе разных конечных показателей, обычно используемых для оценки лечения рака, включая, но не ограничиваясь этим, регрессию опухоли, уменьшение массы или размера опухоли, время до прогрессирования, продолжительность выживания, выживание без прогрессирования, общий показатель ответа, продолжительность ответа и качество жизни. Поскольку мишенью антиангиогенных агентов по изобретению является сосудистая система опухоли и, необязательно, сами неопластические клетки, то эти агенты представляют собой уникальный класс противораковых лекарственных агентов и поэтому для них может иметься необходимость в специальных критериях и определениях клинических ответов на лекарственные агенты. Например, сокращение опухоли более чем на 50% при 2-мерном анализе является стандартным предельным значением для утверждения о наличии ответа. Однако антитело против VEGF по изобретению может вызывать ингибирование распространения метастазов без сокращения первичной опухоли или может просто проявлять стабилизирующее действие на опухоль. Соответственно, необязательно можно использовать новые подходы к определению эффективности антиангиогенной терапии, включающие, например, измерение маркеров ангиогенеза в плазме или моче и измерение ответа посредством радиологической визуализации.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаются методы повышения выживания без прогрессирования заболевания больного человека, склонного к развитию рака или с диагностированным раком, ранее подвергнутым лечению. Время прогрессирования заболевания определяют как время от момента введения лекарства до прогрессирования болезни или смерти. В одном варианте осуществления сочетанное лечение по изобретению с использованием антитела против VEGF и одного или более химиотерапевтических агентов значительно повышает выживание без прогрессирования, по меньшей мере, приблизительно на 0,5 месяца, 1 месяц, 2 месяца, 2,1 месяца, 2,2 месяца 2,8 месяца или более. В одном варианте осуществления сочетанное лечение по изобретению с использованием антитела против VEGF и одного или более химиотерапевтических агентов значительно повышает выживание без прогрессирования на от приблизительно 1 до приблизительно 5 месяцев по сравнению с лечением только химиотерапией. В одном варианте осуществления медиана PFS составляет 7,2 месяцев у больных, лечившихся бевацизумабом, в сравнении с 5,1 месяцами при терапии без бевацизумаба с HR 0,775, величина p (логарифмическое ранжирование) 0,0072. В другом варианте осуществления PFS в месяцах представлен на фиг.3.

В еще одном варианте осуществления лечение по изобретению значительно повышает показатель ответа в группе больных людей, предрасположенных к развитию рака или с диагностированным раком, ранее подвергнутым лечению, которых лечат различными лекарственными агентами. Показатель ответа определяется как процент подвергнутых лечению больных, реагирующих на лечение. В одном аспекте сочетанное лечение по изобретению с использованием антитела против VEGF и одного или более химиотерапевтических агентов значительно повышает показатель ответа в группе подвергнутых лечению больных по сравнению с группой, подвергнутой лечению только химиотерапией.

В одном аспекте в изобретении предлагаются методы увеличения продолжительности ответа у больного человека или в группе больных людей, предрасположенных к развитию рака или с диагностированным раком. Продолжительность ответа определяется как время от начала ответа до прогрессирования заболевания.

В одном варианте осуществления изобретение может быть использовано для увеличения продолжительности выживания больного человека, предрасположенного к развитию рака или с диагностированным раком.

VII. Получение антитела

(i) Поликлональные антитела

Поликлональные антитела предпочтительно вырабатываются у животных путем множественных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/б) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может быть полезным конъюгирование соответствующего антигена с белком, который является иммуногенным для иммунизируемых видов, например, с гемоцианином моллюска фиссуреллии, сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгирование через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂ или R¹N=C=NR, где R и R¹ представляют собой разные алкильные группы.

Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных сочетанием, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъецируя раствор внутрикожно во множество мест. Спустя месяц животных подвергают бустерной иммунизации, используя от 1/5 до 1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда посредством подкожной инъекции во множество мест. Через 7-14 дней у животных берут кровь и анализируют сыворотку в отношении титра антител. Животных подвергают бустерной иммунизации вплоть до выхода титра на плато. Обычно животное подвергают бустерной иммунизации конъюгатом того же самого антигена, но конъюгированного с другим белком, и/или полученного с помощью другого поперечно сшивающего реагента. Конъюгаты также могут быть получены в культуре рекомбинантных клеток в виде гибридных белков. Также соответствующим образом используют агрегирующие агенты, такие как квасцы, для усиления иммунного ответа.

(ii) Моноклональные антитела

В данной области техники имеются различные методы для получения моноклональных антител настоящего описания. Например, моноклональные антитела могут быть получены с помощью метода гибридом, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или с помощью методов рекомбинантной ДНК (патент США № 4816567).

В методе гибридом мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомячок или макака, иммунизируют, как описано выше в настоящем описании, чтобы вызвать появление лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфично связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или жизнеспособность неслитых исходных клеток миеломы. Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом обычно должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), и такие вещества предотвращают рост клеток с недостаточностью HGPRT.

Предпочтительными миеломными клетками являются такие клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают на стабильно высоком уровне продукцию антитела отобранными продуцирующими антитело клетками и чувствительны к такой среде, как среда HAT. Примерами таких линий клеток миеломы являются линии клеток миеломы мышей, такие как линии, полученные из опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11, доступные из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные из Американской коллекции типов культур, Rockville, Maryland USA. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека также были описаны для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, анализируют в отношении продукции моноклональных антител, направленных против антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, предпочтительно определяют с помощью иммунопреципитации или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

После идентификации клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы способами лимитирующего разведения и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие культуральные среды для указанной цели включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены in vivo в виде асцитных опухолей у животного.

Моноклональные антитела, секретируемые подклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки традиционными способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография с использованием протеина A-сефарозы, гидроксилапатита, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют, используя обычные способы (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат в качестве источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы получить синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная продукция антител будет более подробно описана ниже.

В другом варианте осуществления антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, созданных с использованием способов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В последующих публикациях описано получение высокоаффинных (нМ-диапазон) антител человека с помощью перетасовки цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и рекомбинации in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, указанные способы являются приемлемыми альтернативами традиционным способам на основе продуцирующих моноклональные антитела гибридом для выделения моноклональных антител.

ДНК также может быть модифицирована, например, подстановкой кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (патент США № 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) или ковалентным присоединением к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид.

Обычно такими неиммуноглобулиновыми полипептидами заменяют константные домены антитела или ими заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего участка антитела, чтобы создать гибридное бивалентное антитело, содержащее один антигенсвязывающий участок, имеющий специфичность по отношению к антигену, и другой антигенсвязывающий участок, имеющий специфичность по отношению к другому антигену.

(iii) Гуманизированные и человеческие антитела

Гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который отличен от человека. Эти отличные от человеческих аминокислотные остатки часто называют «импортируемыми» остатками, которые обычно берут из «импортируемого» вариабельного домена. Гуманизацию можно, по существу, выполнить, следуя способу Винтера и соавторов (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), заменой CDRs или последовательностями CDR грызунов соответствующих последовательностей антитела человека. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела являются гибридными антителами (патент США № 4816567), в которых значительно меньшая часть, чем интактный вариабельный домен человека, была заменена соответствующей последовательностью вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов человека как легкой, так и тяжелой цепи, используемых для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. Согласно так называемому способу «оптимальной подгонки» последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу по сравнению с полной библиотекой известных последовательностей вариабельных доменов человека. Человеческую последовательность, которая наиболее близка последовательности грызуна, затем берут в качестве человеческого каркаса (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В другом способе используют особый каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно использовать для нескольких разных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности по отношению к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения указанной цели, по одному варианту осуществления гуманизированные антитела получают, проводя анализ исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и показывают возможные трехмерные конформационные структуры отобранных для исследования последовательностей иммуноглобулина. Исследование таких изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании отобранной для исследования последовательности иммуноглобулина, т.е. анализировать остатки, которые влияют на способность отобранного для исследования иммуноглобулина связывать соответствующий ему антиген. Таким образом могут быть отобраны и объединены остатки FR из реципиентных и импортируемых последовательностей так, чтобы добиться требуемых характеристик антитела, таких как повышенная аффинность по отношению к антигену(нам)-мишени(ням). В общем, остатки CDR непосредственно и в наибольшей степени влияют на связывание антигена.

Гуманизированные антитела против VEGF и их варианты со зрелой аффинностью описаны, например, в патенте США № 6884879, опубликованном 26 февраля 2005 г.

В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена соединяющей области тяжелой цепи (J_H) антитела у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека в таких мутантных по зародышевой линии мышей должен приводить к продукции антител человека при антигенной стимуляции. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Duchosal et al. Nature 355:258 (1992).

Альтернативно, для получения антител человека и фрагментов антител in vitro может быть использована методология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) с использованием репертуаров генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов от неиммунизированных доноров. Согласно указанному методу гены V-доменов антител клонируют в единой рамке считывания с геном либо основного, либо минорного белка оболочки нитчатого бактериофага, такого как M13 или fd, и выводят в виде функциональных фрагментов антител на поверхность фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит одноцепочечную копию ДНК фагового генома, селекция на основе функциональных свойств антитела также приводит к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства B-клетки. Фаговый дисплей может быть выполнен во многих форматах, обзор которых приведен, например, в Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея можно использовать несколько источников участков V-генов. Например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили широкий спектр антител против оксазолона из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар V-генов неиммунизированных людей-доноров и можно выделить антитела к широкому спектру антигенов (включая аутоантигены), по существу следуя способу, описанному Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См. также патенты США №№ 5565332 и 5573905.

Как обсуждалось выше, антитела человека также могут быть образованы активированными in vitro B-клетками (см. патенты США 5567610 и 5229275).

Моноклональные антитела человека против VEGF описаны в патенте США № 5730977, опубликованном 24 марта 1998 г.

(iv) Фрагменты антител

Были разработаны различные способы получения фрагментов антител. Традиционно такие фрагменты получали в результате протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако в настоящее время такие фрагменты могут непосредственно продуцироваться рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно извлечены из клеток E.coli и химически связаны с образованием F(ab')₂-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу F(ab')₂-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие способы получения фрагментов антител должны быть ясны специалисту в данной области техники. В других вариантах осуществления предпочтительное антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO93/16185.

(vi) Другие модификации аминокислотных последовательностей

Предусматривается модификация(модификации) аминокислотной последовательности описанных в настоящем описании антител. Например, может быть желательным улучшение сродства связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают путем введения соответствующих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту антитела или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечного конструкта может быть использовано любое сочетание делеции, вставки и замены, предлагаемое так, чтобы конечный конструкт обладал желаемыми свойствами. Изменения аминокислот могут также влиять на посттрансляционный процессинг антитела, например, изменяя количество или положение сайтов гликозилирования.

Подходящим методом для идентификации определенных остатков или областей, которые являются предпочтительными местами для мутагенеза, служит так называемый «аланиновый сканирующий мутагенез», описанный Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). В настоящем описании идентифицируют остаток или группу целевых остатков (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для воздействия на взаимодействие аминокислот с антигеном. Те положения аминокислот, которые проявляют функциональную чувствительность к заменам, затем уточняют путем введения дополнительных или других вариантов в сайты замены или вместо них. Так, хотя сайт введения изменения в аминокислотную последовательность является заранее определенным, природа мутации как таковая не обязательно предопределена. Например, для анализа эффективности мутации по данному сайту проводят сканирующий ala или случайный мутагенез кодона- или области-мишени, и экспрессированные варианты антитела подвергают скринингу на желаемую активность.

Вставки включают присоединение к амино- и/или карбоксильному концу аминокислотных последовательностей, варьирующих по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки от одного до множества остатков внутри последовательности. Примеры вставок по концам включают антитело с N-концевым остатком метионина или антитело, являющееся гибридом с цитотоксическим полипептидом. Другие варианты со вставками в молекулу антитела включают гибрид по N- или C-концу антитела с ферментом (например, в случае ADEPT) или полипептидом, который повышает период полужизни антитела в сыворотке.

Вариант другого типа представляет собой вариант с аминокислотной заменой. Эти варианты содержат, по меньшей мере, один аминокислотный остаток в молекуле антитела, замененный другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для мутагенеза с использованием замен, включают гипервариабельные области, но предусматриваются также изменения FR.

Значительные модификации в биологических свойствах антитела завершаются отбором замен, которые существенно отличаются по своему действию на поддержание (a) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (c) объема боковой цепи. Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии со сходством свойств их боковых цепей (в A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) кислые: Asp (D), Glu (E)

(4) основные: Lys (K), Arg (R), His(H)

Альтернативно, природные остатки могут быть разделены на группы на основе общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены должны вызывать замену члена одного из этих классов членом другого класса.

Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также может быть заменен, обычно серином, для улучшения устойчивости к окислению молекулы и предотвращения неправильной поперечной сшивки. И, наоборот, в антитело может быть добавлена цистеиновая связь(зи) для улучшения его стабильности (в особенности тогда, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент).

Пример варианта с заменами включает замену одного или более остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). В целом, отобранный вариант(ы) для дальнейшего усовершенствования должны обладать улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, от которого они берут начало. Удобный путь для создания таких вариантов с заменами включает созревание сродства с использованием фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) подвергают мутациям с получением всех возможных аминокислотных замен по каждому сайту. Полученные таким образом варианты антитела выставляются однотипным образом частицами нитчатого фага в виде гибридов с продуктом гена III M13, упакованного в каждую частицу. Выставленные фагом варианты затем подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, сродства связывания), как раскрыто в настоящем описании. Для идентификации кандидатных сайтов гипервариабельной области для модификации может быть произведен аланиновый сканирующий мутагенез для выявления остатков гипервариабельной области, вносящих существенный вклад в связывание антигена. Альтернативно или дополнительно может оказаться выгодным проведение анализа кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и VEGF человека. Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются кандидатами для замены в соответствии с методами, разработанными в настоящем описании. После создания таких вариантов набор вариантов подвергают скринингу, как описано в настоящем описании, и антитела с наилучшими свойствами в одном или более соответствующих тестах могут быть отобраны для дополнительного усовершенствования.

В другом типе аминокислотного варианта антитела изменяется исходный паттерн гликозилирования антитела. Под изменением понимается делеция одной или более углеводных частей, обнаруживаемых в антителе, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антителе.

Гликозилирование антител обычно обеспечивается либо N-присоединением, либо O-присоединением. N-присоединение относится к прикреплению углеводной части к боковой цепи остатка аспарагина. Последовательностями, узнаваемыми при ферментативном присоединении углеводной части к боковой цепи аспарагина, являются трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. Гликозилирование посредством O-присоединения относится к прикреплению одного из сахаров - N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы - к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя могут быть использованы также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы она содержала одну или более из описанных выше трипептидных последовательностей (для сайтов гликозилирования с N-присоединением). Изменение также может быть произведено путем добавления одного или более остатков серина или треонина к последовательности или замены этими остатками в последовательности исходного антитела (для сайтов гликозилирования с O-присоединением).

Когда антитело включает область Fc, присоединенный к ней углевод может быть изменен. Например, в патентной заявке США № US 2003/0157108 A1, Presta, L. описаны антитела со зрелой углеводной структурой, в которой отсутствует фукоза, присоединенная к области Fc. См. также US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитела с ветвящим N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) в углеводе, присоединенном к области Fc антитела, упоминаются в WO03/011878, Jean-Mairet et al. и патенте США № 6602684, Umana et al. Об антителах, содержащих, по меньшей мере, один остаток галактозы в олигосахариде, присоединенном к области Fc антитела, сообщается в WO97/30087, Patel et al. См. также WO98/58964 (Raju, S.) и WO99/22764 (Raju, S.) относительно антител с измененным углеводом, присоединенным к их области Fc.

Может быть желательна модификация антитела по изобретению в отношении эффекторной функции, например, так, чтобы усилить зависимую от антигена опосредуемую клетками цитотоксичность (ADCC) и/или зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) антитела. Этого можно добиться введением одной или более аминокислотных замен в область Fc антитела. Альтернативно или дополнительно в область Fc может быть введен остаток(остатки) цистеина, обеспечивая тем самым образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредуемой комплементом способностью вызывать гибель клеток и зависимой от антитела клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью могут быть также получены с помощью гетеробифункциональных сшивающих линкеров, как описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое содержит удвоенную область Fc и в результате обладает усиленными способностями к лизису комплемента и ADCC. См. Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

В патенте WO00/42072 (Presta, L.) описываются антитела с улучшенной функцией ADCC в присутствии эффекторных клеток человека, где антитела включают аминокислотные замены в их области Fc. Предпочтительно антитела с улучшенной ADCC включают замены в положениях 298, 333 и/или 334 области Fc (нумерация остатков Eu). Предпочтительно измененная область Fc представляет собой область Fc IgG1 человека, включающую или состоящую из замен в одном, двух или трех из этих положений. Такие замены необязательно сочетаются с заменой(заменами), которая повышает связывание C1q и/или CDC.

Антитела с измененными связыванием C1q и/или зависимой от комплемента цитотоксичностью (CDC) описаны в WO99/51642, патенте США № 6194551B1, патенте США № 6242195B1, патенте США № 6528624B1 и патенте США № 6538124 (Idusogie et al). Антитела включают аминокислотную замену в одном или более положениях аминокислот 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 и/или 334 в своей области Fc (нумерация остатков Eu).

Для повышения периода полужизни антитела в антитело (в особенности во фрагмент антитела) можно включить эпитоп связывания с рецептором для утилизации, как описано, например, в патенте США 5739277. Используемый в настоящем описании термин «эпитоп связывания с рецептором для утилизации» относится к эпитопу области Fc молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), который ответственен за повышение полужизни молекулы IgG в сыворотке in vivo.

Антитела с улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn) и повышенной полужизнью описаны в WO00/42072 (Presta, L.) и US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Эти антитела включают область Fc с одной или более заменами в ней, которые улучшают связывание области Fc с FcRn. Например, область Fc может содержать замены в одном или более положениях 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 или 434 (нумерация остатков Eu). В одном варианте осуществления вариант антитела, содержащий область Fc с улучшенным связыванием FcRn, включает замены в одном, двух или трех положениях 307, 380 и 434 в его области Fc (нумерация остатков Eu). В одном варианте осуществления антитело содержит мутации 307/434.

Предусматриваются также сконструированные антитела с тремя или более (предпочтительно четырьмя) функциональными сайтами связывания антигена (заявка США № US2002/0004587 A1, Miller et al.).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей варианты аминокислотной последовательности, получают с помощью многих методов, известных в данной области техники. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, выделение из природного источника (в случае существования природных вариантов аминокислотной последовательности) или осуществление опосредуемого олигонуклеотидами (или сайт-специфического) мутагенеза, мутагенеза с помощью ПЦР и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или невариантной версии антитела.

(v) Иммуноконъюгаты

Изобретение также относится к иммуноконъюгатам, включающим антитело, описанное в настоящем описании, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, токсин (например, ферментативно активный токсин, имеющий бактериальное, грибковое, растительное или животное происхождение, или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

Химиотерапевтические агенты, пригодные для создания таких иммуноконъюгатов, были описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают цепь A дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь A экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор горькой дыни, курцин, кротин, ингибитор мыльнянки лекарственной, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для получения радиоконъюгатных антител доступно множество радионуклидов. Примеры включают ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают, используя множество бифункциональных соединяющих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат·HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta et al. Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгирования радионуклида с антителом. См. патент WO94/11026.

В другом варианте осуществления антитело конъюгируют с «рецептором» (например, стрептавидином) для использования для предварительного нацеливания на опухоль, когда конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровообращения с использованием отмывающего агента и введением затем «лиганда» (например, авидина), который конъюгируют с цитотоксическим агентом (например, радионуклидом).

(vi) Иммунолипосомы

Раскрытое в настоящем описании антитело также может быть составлено в виде иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области техники, такими как способы, описанные в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980) и патентах США №№ 4485045 и 4544545. Липосомы с повышенным периодом циркуляции описаны в патенте США № 5013556.

Особенно пригодные липосомы могут быть созданы способом обращенно-фазового выпаривания с использованием жидкой композиции, включающей фосфатидилхолин, холестерин и дериватизованный ПЭГ фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор с получением липосом требуемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела по изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982), посредством реакции дисульфидного обмена. В липосоме необязательно содержится химиотерапевтический агент. См. Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989).

VIII. Промышленные изделия и наборы

В другом варианте осуществления изобретения предлагается промышленное изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения описанных выше нарушений. Промышленное изделие включает контейнер, этикетку и рекламный вкладыш в упаковке. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из множества материалов, таких как стекло или пластмасса. В контейнере содержится композиция, которая является эффективной для лечения состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок с внутривенным раствором или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, одним активным агентом в композиции является антитело против VEGF. Ярлык на контейнере или прикрепленный к контейнеру указывает, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Изделие производства может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Изделие может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы. Кроме того, промышленное изделие включает рекламные вкладыши в упаковке с инструкциями по применению, включая, например, инструктирование пользователя композиции по введению композиции антитела против VEGF и химиотерапевтического агента больному, ранее подвергнутым лечению рака молочной железы, необязательно HER2-отрицательным. В определенных вариантах осуществления у больного имеется метастатический рак. В некоторых вариантах осуществления у больного имеется ранее подвергнутый лечению метастатический рак молочной железы, являющийся HER2-отрицательным. Рекламный вкладыш в упаковке может необязательно содержать часть результатов или все результаты, обнаруженные в примере 1.

Специфичный антагонист VEGF может быть упакован отдельно или в сочетании с другими противораковыми терапевтическими соединениями в виде набора. Набор может включать необязательные компоненты, которые облегчают введение единицы дозы больным, такие как флаконы для восстановления порошковых форм, шприцы для инъекций, системы в/в доставки по заказу, ингаляторы и т.д. Кроме того, набор с единицей дозы может содержать инструкции по подготовке и введению композиций. В определенных вариантах осуществления инструкции включают инструкции по применению, включая, например, инструктирование пользователя композиции по введению композиции антитела против VEGF и химиотерапевтического агента больному, ранее подвергнутым лечению рака молочной железы, необязательно HER2-отрицательным. В определенных вариантах осуществления у больного имеется метастатический рак. В некоторых вариантах осуществления у больного имеется ранее подвергнутый лечению метастатический рак молочной железы, являющийся HER2-отрицательным. Инструкции могут необязательно содержать часть результатов или все результаты, обнаруженные в примере 1. Набор может быть произведен в виде единицы дозы для однократного применения у одного больного, многократного применения у отдельного больного (при постоянной дозе или дозе, в которой эффективность индивидуальных соединений может меняться по ходу терапии); или набор может содержать множество доз, пригодных для введения множеству больных («упаковка навалом»). Компоненты набора могут быть собраны в картонные коробки, блистерные упаковки, бутыли, тюбики и тому подобное.

Депозит материалов

Следующая гибридомная клеточная линия была депонирована в соответствии с условиями Будапештского договора в Американской коллекции типов культур (ATCC), Manassas, VA, USA:

Обозначение антитела ATCC № Дата депозита A4.6.1 ATCC HB-10709 29 марта 1991 г.

Следующий пример предназначен лишь для иллюстрации осуществления изобретения и не предлагается с целью ограничения. Раскрытия всех патентных и научных публикаций, цитированных в настоящем описании, специально включены в их полном объеме в качестве ссылки.

Пример

Пример 1

Бевацизумаб в сочетании со схемами химиотерапии у индивидуумов, ранее подвергавшихся лечению метастатического рака молочной железы

Метастатический рак молочной железы (MBC) является неизлечимым заболеванием, и большинство больных становятся жертвами своего заболевания через 2 года после диагностики. См. Greenberg, et al., 1996, J. Clin. Oncol. 14:2197-205. Приблизительно у 60% больных со стадией прогрессирования заболевания имеется местный рецидив и у 40% отдаленный метастаз после адъювантной терапии. Только 10% больных имеют метастатическое заболевание при первичном диагнозе. См. Ryberg et al., 2001 Ann. Oncol. 12:81-7.

Алгоритм лечения больных с MBC основывается на нескольких факторах, которые включают клиническую, патологическую и гистологическую характеристики, такие как амплификация эпидермального фактора роста человека (HER2), статус гормональных рецепторов, предшествующий ответ на гормональные агенты и/или его отсутствие, количество конкретных мест метастазов заболевания и история лечения как метастазов, так и с помощью адъювантной терапии. Многочисленные цитотоксические химиотерапевтические агенты проявляют активность при MBC, включая антрациклины, таксаны, гемцитабин, капецитабин и винорелбин. Показатели ответной реакции и интервалы без прогрессирования заболевания, наблюдаемые при использовании этих агентов, варьируются в зависимости от продолжительности и типа предшествующей терапии и продолжительности метастатических заболеваний. В целом, сочетанная терапия на основе антрациклинов и таксанов (паклитаксела и доцетаксела) показала наибольшую активность при метастатическом протекании процесса с показателями ответной реакции 40-50% и медианой периода выживания без прогрессирования заболевания (PFS) приблизительно 6-9 месяцев у больных без предшествующей экспозиции с агентами адъювантной терапии и без предшествующей экспозиции с химиотерапией для лечения метастатического заболевания. См., Hamilton and Hortobagyi 2005 J. Clin. Oncol. 23:1760-75. Как предполагается, больные, у которых наблюдалось прогрессирование заболевания после или в течение первого лечения, имеют более короткий период без прогрессирования заболевания (4-6 месяцев) и выживание (8-12 месяцев). Таким образом, существует необходимость поиска дополнительных способов лечения, которые могут быть включены в схемы, что должно продлить как период без прогрессирования заболевания, так и выживание больных с рецидивом заболевания.

При терапии второй линии, установленной для MBC, активность продемонстрировали многие агенты, включая антитубулиновые лекарства (таксаны, винорелбин) и антиметаболиты (капецитабин, гемцитабин). По сравнению с митомицином и винбластином доцетаксел был первым одиночным агентом, существенно увеличивающим время до прогрессирования заболевания (4,4 по сравнению с 2,5 месяцев; p=0,001) и выживание (11,4 по сравнению с 8,7 месяцами; p=0,0097) в большом исследовании фазы III больных с MBC, которые ранее получали лечение антрациклинами. См., Nabholtz et al., 1999 J. Clin. Oncol. 17:1413-24. Добавление капецитабина к доцетакселу по сравнению с одним доцетакселом приводило к дополнительным улучшениям во времени до прогрессирования заболевания (6,1 по сравнению с 4,2 месяцами; коэффициент риска=0,652) и выживание (14,5 по сравнению с 11,5 месяцами: коэффициент риска=0,775) у больных, которые ранее получали антрациклины или не были кандидатами для такого лечения; однако наблюдалось существенное увеличение токсичности этого сочетания. См., O'Shaughnessy et al., 2002 J Clin. Oncol. 20:2812-23. При дополнительных исследованиях либо одиночных агентов, либо их сочетания не удалось продемонстрировать четкие преимущества в выживаемости. См., Hamilton and Hortobagyi 2005 J. Clin. Oncol. 23:1760-75. На основе испытания многих агентов, используемых по одиночке или в сочетании, в настоящее время парадигмой лечения является последовательная терапия одиночными агентами с выбором конкретного(ных) агента(тов), определяемым рядом факторов, включая предшествующую терапию, период без лечения, профиль токсичности и предпочтение больного.

Несмотря на доступность этих многочисленных агентов, существует необходимость в дополнительных способах лечения больных MBC при установке терапии второй линии. Новые способы лечения, направленные на задержку прогрессирования заболевания при избегании системной токсичности, должны предоставлять существенное преимущество при лечении этих больных.

На фазе III исследования (RIBBON 2) Avastin® (бевацизумаба) в сочетании с химиотерапией повышалось время, в течение которого женщины с метастатическим HER2-негативным раком молочной железы, чья первоначальная химиотерапия была остановлена, продолжали жить без ухудшения заболевания (выживание без прогрессирования заболевания или PFS) по сравнению с одной химиотерапией. Доктора, лечившие женщин в исследовании, выбирали тип химиотерапии, используемой в сочетании с авастином, и типы химиотерапии оценивались совместно при анализе основного конечного показателя. Побочные эффекты совпадали с эффектами, ранее описанными для авастина, и никаких новых сигналов об опасности авастина в исследовании не наблюдалось.

Ribbon 2 представляло собой международное, многоцентровое, рандомизированное, двойное слепое, контролируемое плацебо клиническое исследование, в которое включено 684 больных метастатическим HER2-негативным раком молочной железы, которые получали ранее химиотерапию, направленную на их метастатическое заболевание. См. протокол исследования в таблице 1 и характеристики больных в таблице 2. В испытании оценивали добавление либо Avastin® (бевацизумаба), либо плацебо к химиотерапии, выбранной исследователем. В исследовании использовали следующие схемы химиотерапии: таксаны: паклитаксел, связанный с белком паклитаксел или доцетаксел; гемцитабин; капецитабин или винорелбин.

Таблица 1
Протокол исследования Когорта для химиотер. Таксаны Гемцитабин Капецитабин Винорелбин Включенные, n (%) 304 (44,4) 160 (23,4) 144 (21,1) 76 (11,1) Бевацизумаб (BV) 201 108 97 53 Плацебо (PL) 103 52 47 23

Пригодность для исследования включала следующее:

Пригодный возраст для исследования: 18 лет и старше

Пол, пригодный для исследования: оба

Принятие здоровых волонтеров: нет

Критерии включения в исследование включали следующее:

Подписанная форма информированного согласия

≥18 лет

Гистологически подтвержденная карцинома молочной железы с измеряемым или неизмеряемым метастатическим заболеванием, которое находится в состоянии прогрессирования (больные с историей метастазов в мозг принимаются для участия в исследовании [только для США], до тех пор, пока их метастазы в мозг подвергаются лечению, и они не имеют очевидного прогрессирования или геморрагии после лечения и не требуют текущего лечения дексаметазоном)

Прогрессирование заболевания в течение или после введения одной схемы химиотерапии (не связанной с исследованием), вводимой при установке терапии первой линии

Функциональный статус 0 или 1 по ECOG

Для женщин, способных к деторождению, использование эффективных средств негормональной контрацепции

Ожидаемая продолжительность жизни ≥3 месяца

Готовность и способность соблюдать правила исследования и последующих процедур

Критерии исключения из исследования включали следующее:

Предшествующая гормональная терапия только в качестве лечения метастатического заболевания без химиотерапии. Больные должны получать химиотерапию для их метастатического заболевания как установку терапии первой линии. Использование только гормональной терапии не разрешается.

Для индивидуумов, которые получали до этого терапию на основе антрациклинов, документированное подтверждение фракции выброса левого желудочка <50% либо с помощью многопроекционной визуализации сердца (MUGA), либо с помощью эхокардиограммы (ECHO)

Лечение MBC более одной предшествующей схемой цитотоксической химиотерапии

HER2-позитивный статус (больные, у которых статус HER2 неизвестен и для которых определение статуса HER2 невозможно, пригодны для этого исследования)

Неизвестный статус ER и PR

Лучевая терапия, отличная от паллиативной, или метастазы в мозг, биологическая терапия или химиотерапия MBC в пределах 21 дня до дня 0

Предшествующая терапия бевацизумабом или другая терапия, направленная на путь сигнализации VEGF

Не подвергавшиеся лечению метастазы в мозг

Недостаточно контролируемая гипертензия

Нестабильная стенокардия

CHF степени II или выше по оценке нью-йоркской ассоциации по болезням сердца

История инфаркта миокарда в пределах 6 месяцев до дня 0 (день первой инфузии бевацизумаба/плацебо)

История удара или транзиторной ишемической атаки в пределах 6 месяцев до дня 0

Клинически значимое заболевание периферических сосудов

Подтверждение геморрагического диатеза или коагулопатии

Большое хирургическое вмешательство, открытая биопсия или существенное травматическое повреждение в пределах 28 дней перед днем 0; ожидание необходимости рекомендуемой большой хирургической манипуляции в течение исследования

Малые хирургические процедуры, тонкоигольные пункционные биопсии или толстоигольные биопсии в пределах 7 дней перед днем 0

История абдоминальной фистулы, прободения желудочно-кишечного тракта или внутриабдоминального абсцесса в пределах 6 месяцев до дня 0

Серьезная незаживающая рана, язва или перелом костей

История анафилактической реакции на лечение моноклональным антителом, не контролируемой схемой премедикации

История других злокачественных опухолей в пределах 5 лет до дня 0, за исключением опухолей с незначительным риском метастазирования или смерти, таких как адекватно контролируемая базальноклеточная карцинома или сквамозноклеточная карцинома кожи или карцинома шейки матки in situ

Неадекватная функция органов

Беременность (положительный сывороточный тест на беременность) или лактация

Любые другие заболевания, метаболическая дисфункция, данные физикального обследования или клинические лабораторные данные, дающие обоснованное подозрение на заболевание или состояние, которое является противопоказанием для использования исследуемого лекарства или которое может повлиять на интерпретацию результатов или привести больного в состояние высокого риска осложнений лечения

Бевацизумаб (5 мг/кг еженедельный эквивалент)

15 мг/кг IV каждые 3 недели; или

10 мг/кг IV каждые 2 недели

Плюс

Химиотерапия

Таксан

Паклитаксел (например, Taxol®): 90 мг/м² IV каждую неделю в течение 3 недель с последующей 1 неделей отдыха; или

Паклитаксел (например, Taxol®): 175 мг/м² IV каждые 3 недели; или

Частицы связанного с белком паклитаксела (Abraxane®): 260 мг/м² IV каждые 3 недели; или

Доцетаксел (Taxotere®): 75-100 мг/м² IV каждые 3 недели; или

Гемцитабин (Gemzar®): 1250 мг/м² IV на 1 и 8 день каждого 3-недельного цикла; или

Винорелбин (Navelbine®): 30 мг/м² IV каждую неделю; или

Капецитабин (Xeloda®): 1000 мг/м² перорально два раза в день на 1-14 дни каждого 3-недельного цикла

В исследовании PFS определяли как время от рандомизации до прогрессирования заболевания или смерти по оценке лечащих врачей, принимавших участие в исследовании (по оценке исследователей). Вторичные конечные показатели включали объективный показатель ответной реакции, продолжительность ответа, коэффициент выживаемости в течение одного года, суммарное выживание, оценку PFS по типу химиотерапии и безопасности. Результаты показали продление PFS, основного конечного показателя в суммарной когорте больных, получавших авастин+химиотерапию (HR=0,775; величина p (логарифмический ранговый критерий)=0,0072). Медиана PFS (95% С1) составляла 7,2 месяца (6,5, 7,6) в группе бевацизумаб/химиотерапия (группа A на фиг.1, n=459) по сравнению с 5,1 месяцами (4,1, 6,0) в группе плацебо/химиотерапия) (группа B на фиг.1, n=225). См. таблицу 3 анализа основной эффективности PFS и фиг.2 (основной конечный показатель PFS), а также фиг.3 (специфичные для когорт анализы PFS). Результаты по PFS в целом согласовывались между когортами с вариантами химиотерапии за исключением маленькой подгруппы с винорелбином. Другие подгруппы (возрастные, с тройным негативным раком и т.д.) в целом совпадали с результатами по основному показателю PFS. Наблюдаемое улучшение суммарной PFS подкреплялось вторичным конечным показателем эффективности ORR. См. таблицу 4 для промежуточного анализа эффективности OS. В исследовании не наблюдалось никаких новых признаков, касающихся безопасности бевацизумаба. См., например, таблицу 5, выводы по безопасности, безопасность в популяции, таблицу 6, выбранные AEs, безопасность в популяции, и таблицу 7, выводы по безопасности у когорт с химиотерапией, безопасность в популяции. Бевацизумаб был полезен больным как лечение второй линии.

Таблица 2
Характеристики больных, популяция ITT   Химиотер./PL
(n=225) Химиотер./BV
(n=459) Возраст, лет     Медиана 55,0 55,0 Среднее (диапазон)
≥65, % 55 (23-90)
19,6 55,6 (25-86)
22,0 PS 1 по ECOG, % 50,9 50,2 Количество мест метастазов     Среднее (диапазон) 2,5 (0-6) 2,5 (0-6) ≥3 мест, % 47,1 44,5 Заболевание только в костях, % 9,8 6,8 Висцеральное заболевание, % 25,3 26,8 Позитивное по HR, % 73,3 71,7 Тройное негативное, % 20,9 24,4 Интервал от диагностики MBC до первого PD
≥6 мес., % 70,7 72,5 HER2-негативное, % 85,3 83,9 Неизвестно, % 13,8 14,6 Измеряемое заболевание, % 79,6 78,9 BV=бевацизумаб, HR=гормональный рецептор, PD=прогрессирование заболевания, PL=плацебо.

Таблица 3
Анализ основной эффективности PFS, популяция ITT   Химиотер./PL
(n=225) Химиотер./BV
(n=459) Количество событий, n (%) 184 (81,8) 372 (81,0) Наиболее раннее дополнительное событие, n (%) Прогрессирование заболевания 170 (75,6) 341 (74,3) Смерть 14 (6,2) 31 (6,8) PFS (месяцы) Медиана
(95% CI) 5,1
(4,1-6,0) 7,2
(6,5-7,6) Стратифицированный анализ
HR (95% CI) 0,78 (0,64-0,93) Величина p (логарифмический ранговый критерий) 0,0072

Таблица 4
Промежуточной анализ эффективности OS∗, популяция ITT   Химиотер./PL (n=225) Химиотер./BV (n=459) Количество смертей, n (%) 109 (48,4) 206 (44,9) OS (мес.) Медиана
(95% CI) 16,4
(14,6-20,2) 18,0
(17,1-20,2) Стратифицированный анализ
HR (95% CI) 0,90 (0,71-1,14) Величина p (логарифмический ранговый критерий) 0,3741 Показатель выживаемости в течение 1 года (%) 66,2 69,5 ∗ Это промежуточный анализ 57% информации (315 событий).

Таблица 5
Выводы по безопасности, безопасность в популяции n (%) Химиотер./PL
(n=221) Химиотер./BV
(n=458) Выбранные AEs∗ (стадия ≥3) 50 (22,6) 163 (35,6) SAE 39 (17,6) 112 (24,5) AE, ведущий к прекращению лечения/смерти 16 (7,2) 61 (13,3) AE, ведущий к смерти 5 (2,3) 6 (1,3) AE=побочный эффект, BV=бевацизумаб, PL=плацебо, SAE=серьезный побочный эффект.
∗AEs - ранее показано, что ассоциировано с BV

Таблица 6
Выбранные AEs (стадия ≥3), безопасность в популяции n (%) Химиотер./PL (n=221) Химиотер./BV (n=458) Нейтропения 32 (14,5) 81 (17,7) Гипертензия 1 (0,5) 41 (9,0) Сенсорная нейропатия 13 (5,9) 30 (6,6) Протеинурия 1 (0,5) 15 (3,3) Лихорадочная нейтропения 6 (2,7) 10 (2,2) Явления кровотечения 0 (0) 8 (1,7) Систолическая дисфункция левого желудочка 0 (0) 4 (0,9) ATE 3 (1,4) 3 (0,7) Перфорация ЖКТ 0 (0) 3 (0,7) Расхождение раны 0 (0) 3 (0,7) RPLS 0 (0) 0 (0) ATE=явление артериального тромбоза, ЖКТ=желудочно-кишечный тракт, RPLS=синдром задней обратимой лейкоэнцефалопатии.

Таблица 7
Выводы по безопасности у когорт с химиотерапией, безопасность в популяции n (%) Такс./PL (n=101) Такс./BV (n=200) Гем./PL (n=52) Гем./BV
(n=108) Выбранные AE (стадия ≥3) 29 (28,7) 79 (39,5) 5 (9,6) 34 (31,5) SAE 12 (11,9) 53 (26,5) 8 (15,4) 25 (23,1) AE, ведущий к прекращению BV/PL или к смерти 4 (4,0) 12 (6,0) 4 (7,7) 6 (5,6) AE, ведущий к смерти 0 (0) 3 (1,5) 2 (3,8) 2 (1,9) n (%) Капец./PL (n=46) Капец./BV (n=97) Вин./PL (n=22) Вин./BV
(n=53) Выбранные AE (стадия ≥3) 2 (4,3) 20 (20,6) 14 (63,6) 30 (56,6) SAE 12 (26,1) 18 (18,6) 7 (31,8) 16 (30,2) AE, ведущий к прекращению BV/PL или к смерти 4 (8,7) 6 (6,2) 1 (4,5) 4 (7,5) AE, ведущий к смерти 2 (4,3) 1 (1,0) 1 (4,5) 0 (0) AE=побочный эффект, SAE=серьезный побочный эффект, Такс.=таксан, Гем.=гемцитабин, Капец.=капецитабин, Вин.=винорелбин.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения больного с диагнозом ранее подвергавшегося лечению тройного негативного метастатического рака молочной железы. Предложен способ, включающий получение больным схемы лечения, сочетающей химиотерапию с введением эффективного количества антитела против VEGF, где схема лечения с помощью химиотерапии включает введение, по меньшей мере, одного химиотерапевтического средства, выбранного из группы, включающей таксаны, капецитабин, гемцитабин и винорелбин. Изобретение обеспечивает повышение выживания без прогрессирования заболевания за счет лечения индивидуума антителом против VEGF, в частности бевацизумабом, в сочетании с химиотерапией. 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 1 пр.

1. Способ лечения больного с диагнозом ранее подвергавшегося лечению тройного негативного метастатического рака молочной железы, включающий получение больным схемы лечения, сочетающей химиотерапию в качестве терапии второй линии с введением эффективного количества антитела против VEGF, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующую аминокислотную последовательность:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 1)
и вариабельную область легкой цепи, содержащую следующую аминокислотную последовательность:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEQ ID NO: 2),
где схема лечения с помощью химиотерапии включает введение, по меньшей мере, одного химиотерапевтического средства, выбранного из группы, включающей таксаны, капецитабин, гемцитабин и винорелбин, и где схема лечения эффективно увеличивает период выживания без прогрессирования заболевания у больного.

2. Способ по п.1, где указанное антитело против VEGF связывается с тем же самым эпитопом, что и моноклональное антитело против VEGF А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709.

3. Способ по п.1, где антитело против VEGF представляет собой гуманизированное антитело.

4. Способ по п.2, где антитело против VEGF представляет собой гуманизированное антитело А4.6.1 или его фрагмент.

5. Способ по п.1, где антитело против VEGF представляет собой бевацизумаб.

6. Способ по п.1, в котором химиотерапия в качестве терапии второй линии выбрана из группы, включающей таксаны, капецитабин, гемцитабин и винорелбин.

7. Способ по п.1, в котором больной не имеет прободений желудочно-кишечного тракта.