ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛХАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АНЕМИИ И ДИСФУНКЦИИ КРАСНЫХ КРОВЯНЫХ КЛЕТОК Российский патент 2016 года по МПК A61K38/45 A61P7/06 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ЗАЯВКЕ НА ПАТЕНТ

[0001] Настоящей заявкой на патент заявляется о приоритете по Предварительной заявке на патент США, серийный номер 61/186,668, поданной 12 июня 2009, и по Предварительной заявке на патент США, серийный номер 61/241,223, поданной 9 сентября 2010. Полное содержание Предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/186,668 и Предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/241,223 включено в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Данное изобретение в целом относится к сфере медицины и, в частности, к лечению болезней, характеризующихся анемией и/или красными кровяными клетками, имеющими аномальные функции в отношении деформируемости, оксигенации, агрегации, метаболизма оксида азота или продолжительности жизни.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Качество и количество красных кровяных клеток (ККК), находящихся в кровотоке, часто снижается в периоды увеличенной физической нагрузки, что ведет к анемии и возрастанию риска заболеваемости и смертности. Физические нагрузки, которые связаны с развитием анемии, включают аутоиммунные заболевания, обширные оперативные вмешательства, травмы, инфекционные болезни, рак, критические заболевания, диабет, болезни печени, болезни почек, сердечную недостаточность и паразитарные болезни. Системное воспаление, о котором свидетельствуют повышенные уровни воспалительных цитокинов в кровотоке, является характерной общей чертой всех этих состояний. Даже у людей, предрасположенных к анемии из-за гемоглобинопатии, например серповидноклеточной болезни или талассемии, уровень воспалительных цитокинов часто увеличен и может обострять симптомы болезни, особенно во время кризисных эпизодов.

[0004] Одним из следствий повышенного уровня воспалительных цитокинов является сокращение производства печенью фермента лецитин-холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ). В норме ЛХАТ выделяется в плазму из печени, чтобы облегчить круговорот липидов в плазме и обеспечить баланс холестерина и фосфолипидов в крови и тканях, омываемых кровью. Избыточный холестерин удаляется из тканей, таких как артерии, и доставляется в печень для экскреции в составе желчи посредством процесса, известного как обратный транспорт холестерина (ОТХ). На первом этапе ОТХ холестерин переходит из тканевых клеток в липопротеины высокой плотности (ЛВП) в кровотоке. На втором этапе фермент ЛХАТ увеличивает способность ЛВП к переносу холестерина путем катализа трансэтерификации жирной кислоты от фосфатидилхолина (ФХ) (также известного как лецитин) до холестерина с формированием холестеринового эфира (ХЭ). Произведенный ХЭ накапливается в ядре ЛВП до тех пор, пока не удаляется ЛВП-рецепторами печени. ХЭ, доставленный ЛВП в печень, превращается в холестерин и желчные кислоты, которые выделяются в составе желчи.

[0005] Последствия для здоровья, вызванные уменьшением активности ЛХАТ в плазме, наиболее очевидны у людей с семейным дефицитом ЛХАТ (СДЛ), редким генетическим заболеванием, при котором активность ЛХАТ в плазме отсутствует. Отсутствие активности ЛХАТ в плазме ведет к значительному снижению содержания в плазме ХЭ, которое находит отражение в снижении ЛВП и липопротеина низкой плотности и в аккумуляции избыточного субстрата ЛХАТ в плазме. Главные последствия СДЛ для здоровья заключаются в ухудшении зрения в результате диффузного накопления липидов в роговице, возможного расстройства почек из-за аккумуляции липидов в почках (гломерулосклероз) и гемолитической анемии.

[0006] Отклонения в липидном составе липопротеинов плазмы из-за нарушений липидного обмена, таких как те, что являются результатом низкой активности ЛХАТ, связаны с изменениями в содержании липидов в ККК. Изменение липидов в ККК в ответ на изменения липидов в плазме, могут изменить функциональность и выживаемость ККК, т.к. эти свойства зависят от содержания липидов в клетке. Типы изменений липидов ККК, которые могут иметь место, обнаруживаются у пациентов, страдающих СДЛ, у которых ККК обогащены холестерином и ФХ и обеднены содержанием сфингомиелина (СМ). Свидетельство того, что эти аномалии липидов ККК зависят от липидных и липопротеиновых нарушений в плазме, являющихся результатом дефицита ЛХАТ, было получено в эксперименте, где временная нормализация содержания холестерина в ККК произошла после переливания больному СДЛ нормальной плазмы (Muryama et al., Амер. ж-л. Гематол. 16: 129-137, 1984). Эта временная нормализация липидов ККК могла произойти из-за пополнения ЛХАТ, ЛВП, аполипопротеина А-1 или других факторов плазмы, которые отсутствуют или значительно снижены у пациентов с СДЛ.

[0007] В менее тяжелых случаях уменьшения активности ЛХАТ в плазме не наблюдается связи между анемией и активностью ЛХАТ. Например, пациенты с заболеванием «рыбий глаз», мягкой формой дефицита ЛХАТ, проявляют активность ЛХАТ, составляющую менее 30% от нормальной активности ЛХАТ в плазме, но имеют нормальный гемоглобин и гематокрит (Rousset et al. Общепризнанные мнения в области иммунологии, Диабет, ожирение и обмен веществ, 16: 163-171, 2009). Сходным образом, при изучении пациентов с заболеваниями печени не найдено корреляции между пониженной активностью ЛХАТ и анемией (L.W.Powell et al. (1975) Австралийский и Новозеландский медицинский журнал, 5: 101-107) или между активностью ЛХАТ и аномалиями липидов ККК (RA Cooper et al. (1972) Журнал клинических исследований, 51: 3182-3192).

[0008] Хотя наблюдаются вредные изменения липидов ККК у тех, кто испытывает физический стресс, сходные с теми, которые обнаруживаются у пациентов с СДЛ, отсутствует явная связь между ЛХАТ и уровнем липидов в ККК. Примеры аномального состава липидов ККК включают сообщения об увеличенном отношении ФХ/СМ в ККК, выделенных из организма пациентов с заболеванием печени и пациентов с дислипидемией вследствие дефицита липопротеиновой липазы или болезнью Танжера. Мы (Фиг.1) и другие также обнаружили увеличение отношения ФХ/СМ в ККК пациентов с серповидноклеточной болезнью, не находящихся в кризисе. Кроме того, имеются сообщения об увеличении содержания холестерина в ККК у лиц, страдающих диабетом, болезнями сердца (включая острые коронарные синдромы), гиперхолестеринемией, серповидноклеточной анемией, и лиц после космического полета.

[0009] Последствия модификации липидного состава ККК не до конца известны, но в случае роста содержания в ККК холестерина доказано, что активность мембранных протеинов становится аномальной. Обогащенные холестерином ККК пациентов с заболеваниями печени показывают сниженную активность Mg++ АТФазы и ацетилхолинэстеразы. Обогащение холестерином связано с повышенным переносом фосфатидилсерина от внутренней стороны клеточной мембраны к внешней, что является сигналом для увеличения клиренса ККК ретикулоэндотелиальной системой. Увеличение холестерина ККК может снизить деформируемость ККК и стать причиной аномальной морфологии ККК, оба явления могут ухудшить прохождение эритроцитов через капилляры. Трансмембранный обмен газов, сущностная функция ККК, также подвергается воздействию повышения холестерина.

[0010] Современные данные говорят о том, что аномальный липидный состав ККК может иметь вредное влияние на функцию красных кровяных клеток, и, следовательно, есть потребность в способах нормализации липидного состава ККК и лечения дисфункции красных кровяных клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] В литературе нет единодушия относительно корреляции между ЛВП-X (холестерином липопротеинов высокой плотности) и эндогенной активностью ЛХАТ. Мы сделали неожиданное открытие, что увеличение уровня ЛХАТ в плазме путем инъекции рекомбинантной человеческой ЛХАТ вызывает быстрое удаление холестерина из тканей. Дополнительно, быстро увеличивалось содержание ЛВП-Х. Обусловленные равновесием, которое существует между ЛВП и ККК, эти неожиданные результаты означают, что инфузия ЛХАТ также может быть использована для быстрой коррекции липидных аномалий кровяных клеток и улучшить функцию кровяных клеток.

[0012] Часто сообщается, что уровни ЛВП-Х в плазме уменьшаются в случаях физического стресса, например: аутоиммунных заболеваний, обширных оперативных вмешательств, травм, инфекционных болезней, рака, критических заболеваний, диабета, болезней печени, болезней почек, сердечной недостаточности и паразитарных болезней, и могут быть важным фактором в возникновении отклонений липидного состава ККК, в свете прямого липидного обмена между ККК и липопротеинами. Анемия широко распространена в случаях, где наблюдается уменьшение ЛВП.

[0013] Настоящее раскрытие относится к способам модуляции содержания липидов в мембранах красных кровяных клеток путем увеличения концентрации ЛХАТ и/или активности до уровней, превышающих нормальную концентрацию и/или активность ЛХАТ в организме человека введением терапевтически эффективных доз ЛХАТ.

[0014] Одним из вариантов раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся дисфункцией красных кровяных клеток, введением ему терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0015] Другим вариантом является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся анемией или красными кровяными клетками со сниженной деформируемостью, пониженной оксигенацией, пониженной функцией оксида азота, увеличенной адгезией и/или агрегацией, или уменьшенным временем жизни, или любым сочетанием этих явлений, введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0016] В другом варианте, способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся анемией или красными кровяными клетками со сниженной деформируемостью, пониженной оксигенацией, пониженной функцией оксида азота, увеличенной адгезией и/или агрегацией, или уменьшенной продолжительностью жизни, или любым сочетанием этих явлений, включая определение исходной деформируемости ККК, или оксигенации ККК, или агрегации ККК, или адгезии ККК, или продолжительности жизни ККК; введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ; и определение изменений, вызванных введением ЛХАТ, где увеличение деформируемости ККК, или оксигенации ККК, или уменьшение агрегации или адгезии ККК, или увеличение продолжительности жизни ККК указывает на улучшение состояния.

[0017] В некоторых вариантах, состояние, при котором проводится лечение, представляет собой серповидноклеточную болезнь, диабет, талассемию, ревматоидную болезнь, аутоиммунное заболевание, артрит, болезнь печени, цирроз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, слабоумие, анемию или микрососудистые расстройства, воспалительные заболевания, паразитарное заболевание, эректильную дисфункцию, рак, преэклампсию, критическое заболевание или травму.

[0018] Другой вариант представляет способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся высоким уровнем ФХ в мембранах ККК, включающий введение пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Другой вариант представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся высоким уровнем ФХ в мембранах ККК, включая определение исходного отношения ФХ к ФЛ; назначением пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ; и определение соотношения ФХ к ФЛ, появляющегося после введения ЛХАТ, причем уменьшение отношения ФХ к ФЛ указывает на улучшение состояния. Другой вариант представляет собой способ уменьшения содержания ФХ в кровяных клетках пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0019] Другой вариант представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся увеличением соотношения ФХ/СМ в мембранах ККК, включающий в себя введение пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Другой вариант представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся увеличением соотношения ФХ/СМ в мембранах ККК, включающий определение исходного соотношения ФХ/СМ; введением пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ; и определение соотношения ФХ/СМ после введения ЛХАТ, где уменьшение отношения ФХ к СМ указывает на улучшение состояния. Другой вариант представляет собой способ уменьшения соотношения ФХ/СМ кровяных клеток пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0020] Фигура 1 показывает фосфолипидный состав ККК нормальных пациентов и пациентов с серповидноклеточной болезнью.

[0021] Фигура 2 представляет собой график, изображающий увеличение уровня ЛВП-Х в плазме трансгенных мышей с геном, кодирующим человеческий аполипопротеин А-1, после инъекции ЛХАТ.

[0022] Фигура 3 изображает содержание холестерина в тканях трансгенных мышей гибридной линии, у которых сочетается нокаут гена ЛХАТ и экспрессия аполипопротеина А-1, после инъекции рекомбинантной человеческой ЛХАТ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0023] Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в настоящем документе, означает количество ЛХАТ, введенное в соответствии с желательным режимом лечения, при котором будет выявлен желательный терапевтический эффект или отклик. Предпочтительное терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество ЛХАТ, которое увеличивает уровень значений ЛХАТ в плазме до значений, превышающих нормальные.

[0024] Используемый в настоящем документе термин «уровень ЛХАТ» относится к концентрации ЛХАТ в плазме.

[0025] Используемый в настоящем документе термин «нормальный уровень» ЛХАТ означает концентрацию ЛХАТ в плазме, которая присутствует в среднем здоровом субъекте, не проходившем лечения, не получающем в данный момент никаких медикаментов, которые могли бы изменить уровни ЛХАТ. «Нормальный уровень» и «эндогенный уровень» используются здесь взаимозаменяемым образом.

[0026] Чтобы избежать сомнения, имеющиеся в настоящем документе ссылки на «лечение» и «способ лечения» включают целебное, паллиативное и профилактическое лечение.

[0027] «Субъект» и «Пациент» используются взаимозаменяемым образом.

[0028] «Между» используется в настоящем документе со ссылкой на эффективное количество или объединенную дозу, включительно, например, «между 1 мг и 5000 мг» включает 1 мг и 5000 мг.

[0029] «От» используется в настоящем документе со ссылкой на эффективное количество или единую дозу, включительно, например, «от 1 мг до 5000 мг» включает 1 мг и 5000 мг.

[0030] «СХ» является аббревиатурой для свободного холестерина и в используемом в настоящем документе значении означает не-этерифицированный холестерин.

[0031] «Функция оксида азота» означает процессы, в которых ККК играют роль посредника и которые зависят от оксида азота, включая производство оксида азота, доставку оксида азота в микрососуды, ингибирование адгезии тромбоцитов и лейкоцитов, вазодилатацию, деформируемость ККК и выживаемость ККК.

[0032] «ФХ» является аббревиатурой для фосфатидилхолина.

[0033] «СМ» является аббревиатурой для сфингомиелина.

[0034] «Деформируемость ККК» означает способность клеток адаптировать свою форму к динамически меняющимся условиям течения в направлении минимизации их сопротивления течению и обеспечения их прохода через просвет мелких кровеносных сосудов. Пониженная деформируемость приравнивается к увеличенной жесткости.

[0035] «Вектор генной терапии» означает агент, который используется для внедрения и активизации экспрессии целевого гена в хромосомах клеток паренхимной ткани. Например, аденовирус, перестроенный, чтобы нести ген ЛХАТ человека.

[0036] «Осмотическая хрупкость» означает чувствительность клеток к разрыву из-за изменений окружающего осмотического давления.

[0037] «Агрегируемость ККК» означает способность формировать многоклеточные агрегаты, обычно в форме монетных столбиков, в присутствии белков плазмы или других макромолекул.

[0038] «ЛХАТ» используется взаимозаменяемым образом с «лецитин-холестерин ацилтрансфераза».

[0039] «ЖАТ» или «ЛХАТ полипептид», когда используются в настоящем документе, включают нативную последовательность ЛХАТ, варианты ЛХАТ, модифицированную ЛХАТ и химерную ЛХАТ. Чтобы точно определить позиции аминокислот в последовательности ЛХАТ, делается ссылка на последовательность SEQ ID NO: 1

Человеческая ЛХАТ SEQ ID NO: 1 (Код доступа Генбанка №ААВ34898)

[0040] Специфичные аминокислоты в белковой последовательности нативной человеческой ЛХАТ записаны с использованием однобуквенных обозначений аминокислот, следующих друг за другом в белковой последовательности, например, W2 означает, что позицию 2 занимает триптофан. Чтобы представить замещение в конкретной позиции, замещающая аминокислота ставится следующей в эту же позицию, например W2Y означает, что триптофан в позиции 2 замещен тирозином.

[0041] «Нативная последовательность ЛХАТ» включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, одинаковую с ЛХАТ, выделенной из природного объекта. Так, нативная последовательность ЛХАТ специфически включает в себя встречающиеся в природных условиях усеченные формы ЛХАТ, встречающиеся в природных условиях аллельные варианты ЛХАТ, встречающиеся в природе различные формы (например, формы, обязанные своим происхождением альтернативному сплайсингу). Предпочтительная нативная последовательность ЛХАТ - зрелая нативная последовательность ЛХАТ.

[0042] «Модифицированная ЛХАТ» означает полипептид, где одна или более аминокислот в нативном полипептиде ЛХАТ замещены другой аминокислотой, или одна или большее число аминокислот добавлены к части нативного полипептида, включая, не ограничиваясь ими, N-концевые и С-концевые аминокислоты. В качестве неограничивающего примера модифицированная ЛХАТ может быть представлена модифицированным белком ЛХАТ, описанным в Предварительной заявке на патент США №12/179,815. В других вариантах, одна или более аминокислот замещены путем консервативного замещения. Неограничивающие примеры консервативных замещений приведены в Таблице 2. В других вариантах, одна или более аминокислот замещены не встречающейся в природных условиях аминокислотой. Дополнительно, модифицированные полипептиды ЛХАТ включают производные ЛХАТ или модифицированную ЛХАТ. Эти производные могут, например, улучшать растворимость, абсорбцию, биологическую продолжительность полужизни полипептидов. Производные полипептидов хорошо известны специалистам в данной области. Специалисту в данной области будет известно, как изменить полипептиды, чтобы улучшить их фармакологические свойства.

ТАБЛИЦА 2 Исходный остаток Примерные консервативные замещения А G, S R K N Q, Н D Е С S Q N Е D G А, Р Н N, Q I L, V L I, V K R, Q, E M L, Y, I F М, L, Y S Т Т S W Y Tyr W, F Val I, L

[0043] Настоящее раскрытие направлено на способы лечения пациентов, имеющих состояния, характеризующиеся анемией или дисфункцией красных кровяных клеток, введением пациенту, нуждающемуся в этом, агента, который увеличивает активность ЛХАТ, или увеличивает уровень ЛХАТ в плазме, или оказывает оба эффекта. Уровень ЛХАТ и/или активность ЛХАТ могут быть увеличены любыми доступными способами. Это включает, без ограничения, прямое введение ЛХАТ, экспрессию ЛХАТ посредством генной терапии и направленную на повышение уровня регуляцию эндогенной ЛХАТ посредством введения лекарств.

[0044] В одном из примеров, уровень ЛХАТ и/или активность ЛХАТ увеличивается прямым введением ЛХАТ. Предпочтительно, ЛХАТ, которую вводят в способах согласно настоящему раскрытию, представляет собой продуцированную рекомбинантым путем человеческую ЛХАТ (например, с использованием животных, клеток млекопитающих, грибов, клеток насекомых или растений в качестве систем для экспрессии рекомбинантного белка). Способы производства белков рекомбинантным путем хорошо известны специалистам. ЛХАТ также может быть получена любым подходящим способом, например путем выделения из человеческой плазмы. ЛХАТ может быть подготовлена в формах постоянного объема или единой дозы. В одном из вариантов, уровень активности ЛХАТ увеличивается путем использования генной терапии. Используемый здесь термин «генная терапия» относится к переносу и, предпочтительно, устойчивой интеграции новой генетической информации в клетки субъекта. Способы увеличения уровней активности ЛХАТ путем генной терапии подразумевают трансфецирующие клетки с нуклеиновой кислотой, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экспрессию ЛХАТ. Трансфецированные клетки осуществляют экспрессию ЛХАТ и выделяют ее в плазму субъекта. Клетки трансфецируются в достаточном числе или таком, чтобы обеспечить экспрессию ЛХАТ, достаточную для увеличения количества ЛХАТ до терапевтически эффективного уровня. Гены, кодирующие ЛХАТ, могут быть введены субъекту любым подходящим способом. В одном из вариантов, гены внедряются в клетки индивида in-vivo с помощью векторов экспрессии. В другом варианте, гены вводятся в клетки ex-vivo, и трансфецированные клетки, которые осуществляют экспрессию и секрецию ЛХАТ, вводятся субъекту. В подходах in-vivo, мишенями трансфекции являются клетки печени. Клетки печени продуцируют ЛХАТ, т.к. они обладают возможностями для выработки рекомбинантного белка. Кроме того, векторы, инъецированные в кровоток, быстро проходят через печень, так что клетки печени быстрее других подвергаются воздействию векторов. Кроветворные стволовые клетки также используются в качестве мишеней для генной терапии, потому что они быстро размножаются, тем самым создавая большее количество клеток, способных продуцировать ЛХАТ. Подходы ex-vivo также привлекательны, т.к. они допускают больший контроль над процессом трансфекции. Например, трансфецированные клетки могут быть протестированы и выбраны те, которые осуществляют экспрессию ЛХАТ в наиболее высоких количествах. Кроветворные стволовые клетки могут быть взяты у субъекта, трансфецированы ex-vivo и повторно введены пациенту. Поэтому, в одном из вариантов, клетки представляют собой клетки субъекта. Способы трансфецировать гены в клетки млекопитающих, как in-vivo, так и ex-vivo, и добиться их экспрессии хорошо известны в данной области.

[0045] Данное раскрытие относится к способам модуляции содержания липидов мембран красных кровяных клеток путем повышения уровней содержания и/или активности ЛХАТ свыше нормальных уровней содержания ЛХАТ в человеческом организме. Одним из вариантов раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся дисфункцией красных кровяных клеток, включающий в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Другим вариантом воплощения данного раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся дисфункцией красных кровяных клеток, включающий в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества лекарства, которое увеличивает эндогенное продуцирование ЛХАТ или увеличивает активность ЛХАТ. В особых вариантах, лекарство представляет собой маленькую молекулу терапевтического агента.

[0046] Некоторые варианты направлены на способы нормализации содержания ФХ клеточных мембран ККК путем увеличения уровней ЛХАТ или активности ЛХАТ в организме пациента, который нуждается в этом. Один из вариантов согласно настоящему раскрытию представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся наличием ККК с увеличенным содержанием ФХ, путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ нуждающемуся в этом пациенту. Увеличение уровней ЛХАТ быстро вызывает чистый переход ФХ из ККК в ЛВП, таким образом изменяя состав мембраны ККК в направлении более текучего состояния. Это действие увеличивает оксигенацию ККК, улучшает реологию (увеличивает деформируемость, текучесть, уменьшает экстернализацию фосфатидилсерина, уменьшает склонность к адгезии и агрегации), уменьшает анемию (уменьшает механический стресс и деструкцию, связанные со снижением деформируемости, увеличивает длительность жизни ККК) и увеличивает способность ККК к оксигенации тканей, в особенности периферических тканей. В некоторых вариантах, эритропоэз увеличивается вследствие введения терапевтически эффективного количества ЛХАТ. В некоторых вариантах, функция оксида азота увеличивается после введения терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Существует много состояний, при которых клеточные мембраны ККК имеют повышенные уровни ФХ по отношению к уровням содержания фосфолипидов. Увеличение содержания ФХ в мембранах кровяных клеток присутствует при ряде болезненных состояний, включая, не ограничиваясь ими, серповидноклеточную болезнь, диабет, талассемию, ревматоидную болезнь, аутоиммунное заболевание, артрит, заболевание печени, цирроз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, деменцию, анемию или микрососудистые нарушения, воспалительные заболевания, паразитарные болезни, эректильную дисфункцию, рак, преэклампсию, критическое заболевание или травму.

[0047] Несмотря на отсутствие в этих заболеваниях первичной патологии, изменение состава и функции ККК ведет к обострению заболеваемости подчиненными расстройствами. Таким образом, одним из вариантов настоящего раскрытия является способ лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистыми нарушениями, воспалительными заболеваниями, паразитарными болезнями, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ пациенту, нуждающемуся в этом.

[0048] Мутации гена гемоглобина, такие как наблюдаемые при серповидноклеточной болезни (СКБ), талассемиях и формировании гемоглобина Е (Гб Е), могут выразиться во множестве патологий, которые уменьшают деформируемость ККК и их способность переносить/доставлять кислород. Например, СКБ представляет собой наследственное расстройство, вызываемое одиночным замещением аминокислоты в субъединице бета-глобулина гемоглобина (Гб С). В условиях низкого содержания кислорода, ГбС полимеризуется (подвергается агрегации), что приводит к изменению формы ККК из нормальной вогнутой в «серповидную». Формирование жестких полимеров ГбС уменьшает эластичность или деформируемость ККК, что вредит их функции, т.к. для оксигенации тканей они должны быть способны многократно проходить сквозь капилляры, в четыре раза меньше их собственного размера. Следовательно, серповидная форма ведет к вазоокклюзивному расстройству из-за окклюзии посткапиллярных венул всех размеров и увеличивает хрупкость ККК, приводя к лизису и гемолитической анемии. Хотя выработка серповидноклеточных эритроцитов при низком содержании кислорода вызывает острый кризис и главные проблемы, связанные с этим заболеванием, ККК пациентов, не подверженных серповидноклеточной деформации, при нормальном содержании кислорода, имеют более жесткие мембраны с пониженной деформируемостью и повышенной способностью к агрегации. Химический анализ мембран эритроцитов пациентов с СКБ также показывает увеличение содержания ФХ. Дополнительно эти пациенты имеют низкий уровень ЛВП с пониженным содержанием холестеринового эфира (ХЭ), подразумевающим пониженную активность ЛХАТ или функциональный дефицит ЛХАТ. Фактически, в одном из исследований было показано уменьшение на 30% активности ЛХАТ у пациентов с СКБ. Соответственно, один из вариантов настоящего раскрытия представляет способ лечения пациента, имеющего серповидноклеточную болезнь, введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0049] Инъецирование высоких уровней ЛХАТ, например количества, которое приводит к увеличению эндогенной активности ЛХАТ от двухкратного до 1000-кратного у пациентов с СКБ, вызвало бы выход ФХ из ККК и сопутствующее увеличение уровней ЛВП-Х в плазме. Снижение содержания ФХ в ККК привело бы к увеличению деформируемости ККК и улучшило бы уровень кислородного обмена. Улучшенная функция ККК может уменьшить случаи окклюзии, как из-за улучшенной способности крови к течению, так и из-за пониженного уровня выработки серповидноклеточных эритроцитов (благодаря лучшей ре-оксигенации ККК). В другом варианте, введение терапевтически эффективного количества ЛХАТ пациенту, нуждающемуся в этом, увеличивает деформируемость ККК и оксигенацию ККК. В некоторых вариантах, продолжительность жизни ККК увеличивается вследствие введения ЛХАТ.

[0050] В случае заболевания печени, содержание холестерина в ККК растет и часто возникает анемия. Терапия ЛХАТ будет нормализовать содержание холестерина в ККК, восстанавливать нормальную форму и функцию подвергшихся воздействию ККК, снижать деструкцию ККК, увеличивать продолжительность их жизни, тем самым уменьшая склонность к анемии. Таким образом, еще одним вариантом является способ лечения пациента, страдающего анемией, путем введения пациенту терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0051] Анемия мишеневидных клеток и шпоровидных клеток (акантоцитоз). Шпоровидные клетки и мишеневидные клетки имеют увеличенное содержание ФХ, ведущее к снижению функции и увеличению гемолиза и анемии.

[0052] В состояниях, таких как сепсис, ревматические болезни и воспалительные заболевания (включая анемию воспаления), существует множество патологий, таких как снижение деформируемости ККК и аномальная реология, которые ведут к дальнейшим осложнениям. Вред, нанесенный системам тканей и органов из-за пониженной оксигенации и увеличенной агрегации ККК, ведет к росту заболеваемости и смертности, начиная с инициального воспалительного удара. Следовательно, еще один вариант является способом уменьшения агрегируемости ККК путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ. ЛХАТ может также воздействовать на окисленные фосфолипиды, появляющиеся в период воспаления. Окисленные липиды очень реактивны и могут увеличить вред, наносимый клеткам и системам органов. Нормализация липидов мембран ККК улучшила бы течение крови и оксигенацию тканей и уменьшила бы концентрацию реактивных окисленных липидов. Это было бы полезно после оперативных вмешательств, где скрытые инфекции могут снижать функцию ККК, увеличивая время заживления ран.

[0053] Микрососудистые расстройства могут случаться, когда увеличивается содержание ФХ в ККК, таким образом вызывая твердость, увеличивая адгезию и агрегируемость ККК. Эти изменения увеличиваются при слабом течении (или низком давлении) крови, обнаруживаемом в капиллярах и венулах. Когда ККК не способны деформироваться правильно, их прохождение существенно замедляется в этих мелких сосудах. С увеличением склонности к агрегации и адгезии появляется высокая вероятность блокады периферических сосудов. В органах, где микрососуды являются критическими для нормального функционирования (например, глазах, ушах, мозге, почках, пенисе, легких), повторные ишемические события в этих сосудах могут вести к потере функции (например, слепоте, потере слуха, почечной недостаточности, ишемическому микрососудистому поражению мозга (например, деменции, болезни Альцгеймера), эректильной дисфункции). Лечение ЛХАТ уменьшило бы содержание ФХ в ККК, улучшило реологию ККК, снизило бы риск дальнейшего возникновения сосудистых блокад и прекратило бы повреждение органов.

[0054] Как показано в Примере 1 настоящего раскрытия, мыши с приблизительно 30-кратным нормальным уровнем активности ЛХАТ имели увеличенную массу ККК по сравнению с нормальными мышами, что показывает, что активность ЛХАТ является главным фактором в регуляции массы ККК и в связи с этим может лимитировать ее уровень.

[0055] Таким образом, введение высокой дозы ЛХАТ, например, в диапазоне от 1-кратной до 1000-кратной от эндогенного уровня ЛХАТ, или от 1-кратной до 500-кратной от эндогенного уровня ЛХАТ, или от 1-кратной до 100-кратной от эндогенного уровня ЛХАТ пациенту, имеющему состояние, характеризующееся аномальной реологией (анемия, пониженная деформируемость, увеличенная агрегация, пониженная текучесть, уменьшенная продолжительность жизни ККК) привело бы к улучшению состояния.

[0056] Таким образом, еще один вариант представляет способ лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистым расстройством, воспалительным заболеванием, паразитарной болезнью, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ. Еще одним вариантом настоящего раскрытия является способ лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистым расстройством, воспалительным заболеванием, паразитарной болезнью, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения лекарства, которое увеличивает активность ЛХАТ или уровень ее содержания. В предпочтительных вариантах, лекарство представляет собой маленькую молекулу, обладающую терапевтическим действием. В другом варианте, уровень ЛХАТ и/или активность ЛХАТ увеличиваются с помощью генной терапии.

[0057] Еще один вариант представляет собой способ лечения пациента, страдающего деменцией, связанной с болезнью Альцгеймера, путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ. Другой вариант представляет собой метод лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистым расстройством, воспалительным заболеванием, паразитарной болезнью, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения терапевтически эффективной дозы модифицированной ЛХАТ. В некоторых вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит консервативную аминокислотную замену. В некоторых вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит замещение в позиции F1, L3, N5, L7, С31, N384 или Е416. В различных вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит аминокислотное замещение в позиции ЗЕВ других вариантах воплощения, модифицированная ЛХАТ содержит C31Y замещение и замещение одного или более аминокислотных остатков F1, L4, L32, N34. В другом варианте воплощения, модифицированная ЛХАТ содержит замену C31Y и одну или более из следующих замен: F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F или L32H. В различных вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит одно или более из следующих замещений: F1A, F1G, F1I, F1L, F1M, F1P, FIV, F1Y, F1T, F1Q, F1N, F1H, F1D, L3I, L3F, L3C, L3W, L3Y, L4A, L4I, L4M, L4F, L4V, L4W, L4Y, L4T, L4Q, L4R, N5A, N5M, N5H, N5K, N5D, N5E, L7M, L7R, L7E, C31A, C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R, C31H, N384C, N384Q, или E416C. В других вариантах, уровень ЛХАТ у пациента увеличивается с использованием техники генной терапии. В других вариантах, экспрессия ЛХАТ повышается с помощью введения лекарства.

[0058] В способах, согласно настоящему раскрытию, ЛХАТ обычно вводится субъекту в составе фармацевтической композиции, которая включает фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Фармацевтическая композиция может быть создана в соответствии с обычными методиками, как фармацевтическая композиция, адаптированная к выбранному пути введения препарата, т.е. пероральным, парентеральным, внутривенным, внутримышечным или подкожным путем.

[0059] Фармацевтические композиции, подходящие для доставки соединений согласно настоящему раскрытию, и способы их приготовления легко могут быть найдены специалистами в данной области. Такие композиции и способы их приготовления могут быть найдены, например, в написанной Ремингтоном книге «Фармацевтические науки», 19-е издание (Mack Publishing Company, 1995).

[0060] Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы, эмульсии с масляным или водным носителем, и могут содержать специальные агенты, такие как суспендирующие, стабилизаторы и/или диспергаторы. В качестве альтернативы, активное вещество может иметь вид порошка для соединения перед использованием с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой. Обычно такие композиции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Композиции могут представлять собой герметически закупоренный контейнер, такой как ампула, шприц или флакон, с добавлением или без добавления консерванта.

[0061] Жидкий носитель может представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, включая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т.п.), растительные масла, нетоксичные глицериловые эфиры и подходящие смеси этих веществ. Нужная подвижность может быть достигнута, например, путем формирования липосом, создания требуемого размера частиц в случае дисперсии или путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть достигнуто использованием различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях было бы предпочтительно включать изотонические агенты, например сахара, буферы или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция композиций для инъекций может быть создана путем использования в качестве ингредиентов агентов, задерживающих абсорбцию, например алюминия моностеарата и желатина.

[0062] Согласно настоящему раскрытию, ЛХАТ может быть использована отдельно или в комбинированной терапии с другими лекарствами, используемыми для лечения при вышеуказанных состояниях. Такая терапия включает, не ограничиваясь этим, одновременное или последовательное применение подобранных лекарств. Например, ЛХАТ может быть введена вместе с лекарствами, которые обычно используются при конкретном состоянии. Например, ЛХАТ может вводиться вместе с агентами-стимуляторами эритропоэза (АСЭ), такими как эритропоэтин, метоксиполиэтилен-гликоль-эпоэтин бета, дарбепоэтин альфа, ромиплостим и эпоэтин альфа для лечения анемии. Или, например, ЛХАТ может быть введена в сочетании с гидроксимочевиной, гидроксикарбамидом, децитабином или бутиратом для лечения серповидноклеточной болезни.

[0063] В одном из вариантов, терапевтически эффективное количество ЛХАТ вводится в виде подкожной инъекции. В другом варианте, терапевтически эффективное количество ЛХАТ вводится в виде внутримышечной инъекции. В другом варианте, терапевтически эффективное количество ЛХАТ вводится в виде внутривенной инъекции или инфузии. В некоторых вариантах, терапевтически эффективное количество ЛХАТ составляет от 1 мг до 5000 мг, или от 1 мг до 2000 мг, или от 10 мг до 5000 мг, или от 10 мг до 1000 мг, или от 10 мг до 500 мг, или от 5 мг до 100 мг.

[0064] В некоторых вариантах, терапевтически эффективное количество ЛХАТ находится в диапазоне от 1 до 1000-кратного, от 25- до 1000-кратного, от 50- до 1000-кратного, от 1-до 100-кратного, от 50- до 500-кратного, от 1- до 500-кратного от эндогенного уровня ЛХАТ.

[0065] Используемая специфическая дозировка может варьировать. Например, дозировка может зависеть от ряда факторов, включая, не ограничиваясь ими, частоту дозирования, специфическую активность рекомбинантного фермента ЛХАТ, массу тела пациента, особые требования пациента, особые состояния пациента (например, аномальные функции почек или печени), состояние, которое подвергается лечению и т.д. Частота и сумма дозирования может, по усмотрению врача, выйти за пределы обычного диапазона, приведенного в настоящем документе. Эти дозы рассчитаны на среднего человеческого субъекта, имеющего вес около 60-70 кг. Способы определения оптимальных доз для конкретного пациента хорошо известны специалистам. Врач будет способен легко определить дозы субъектам, чей вес выходит за указанные пределы, таким как дети и пожилые люди.

[0066] В зависимости от расстройства и пациента, подвергающегося лечению, специалист (т.е. врач) может установить, что подходящей является начальная доза, которая выше, чем последующие дозы. Например, пациенту с серповидноклеточной болезнью в состоянии кризиса может быть введена начальная доза, в 30 раз превышающая «нормальный» уровень. Как только уровень оксигенации ККК пациента достигает желаемого уровня, доза может быть уменьшена, например, до 3-кратного «нормального» уровня.

[0067] Эффективность особой дозы может быть определена ссылкой на биомаркеры или улучшение отдельных физиологических параметров. Подходящие биомаркеры включают, но не ограничиваясь ими, отношение FC к PL, FC к мембранному белку, ФХ к СМ или уровни ЛВП-Х. Подходящие физиологические параметры включают, не ограничиваясь ими, уменьшение анемии, улучшение реологии, измеряемое как увеличение ККК, деформируемости ККК, текучести крови и/или агрегируемости ККК, осмотическую хрупкость или уровень оксигенации ККК, увеличение любого из этих параметров свидетельствует об улучшении. Измерение уровней биомаркеров и параметров, описанных выше, может быть произведено с использованием способов, хорошо известных в науке. Например, уменьшение анемии может быть измерено по увеличению гематокрита или гемоглобина или продуктов распада гемоглобина (например, неконъюгированного билирубина), измеренных стандартными, хорошо обоснованными клиническими методами. Деформируемость может быть измерена путем фильтрации, вискозиметрии, эктацитометрии и путем применения микропипеток. Агрегация может быть измерена с помощью различных инструментов, включая эктацитометры и агрегометры. Оксигенация ККК может быть измерена путем стандартной пульсоксиметрии и анализа газов крови. Оксигенация тканей может быть измерена прямым зондированием с использованием тонометров из силастика, с кислородными сенсорами. Специалист поймет значение результатов и сможет выбрать дозу, отрегулированную на основании определений, таких как описанные выше.

[0068] Как описано в Примере 4 и показано на фигуре 2, в результате введения ЛХАТ трансгенным мышам, в организме которых присутствует ген человеческого полипротеина А-1, увеличились уровни ЛПВ-Х в плазме. Увеличение произошло неожиданно быстро; уровни ЛПВ-Х в плазме увеличились примерно на 70% от контроля за 4 часа и примерно на 120% за 24 часа. Таким образом, другим вариантом раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся анемией или дисфункцией красных кровяных клеток, включая введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ, когда уровни ЛПВ-Х в плазме субъекта быстро увеличиваются после введения ЛХАТ. В особом варианте, уровень ЛПВ-Х в плазме у субъекта 4 часа спустя после введения ЛХАТ увеличивается по меньшей мере на 30%, или, по меньшей мере, на 40%, или, по меньшей мере, на 50%, или, по меньшей мере, на 70%, или, по меньшей мере, на 80% по сравнению с уровнем ЛВП-Х в плазме перед введением ЛХАТ. В еще одном варианте, уровень ЛВП-Х в плазме субъекта через 12 часов после введения ЛХАТ увеличивается, по меньшей мере, на 40% или, по меньшей мере, на 50%, или, по меньшей мере, на 60%, или, по меньшей мере, на 70%, или, по меньшей мере, на 80%, или, по меньшей мере, на 90%, или, по меньшей мере, на 100%, или, по меньшей мере, на 110%, или, по меньшей мере, на 120% по сравнению с уровнем ЛВП-Х в плазме перед введением ЛХАТ. В еще одном варианте, уровень ЛВП-Х в плазме субъекта через 24 часа после введения ЛХАТ увеличивается, по меньшей мере, на 40% или, по меньшей мере, на 50%, или, по меньшей мере, на 60%, или, по меньшей мере, на 70%, или, по меньшей мере, на 80%, или, по меньшей мере, на 90%, или, по меньшей мере, на 100%, или, по меньшей мере, на 110%, или, по меньшей мере, на 120%, или, по меньшей мере, на 130%, или, по меньшей мере, на 140%, или, по меньшей мере, на 150% по сравнению с уровнем ЛВП-Х в плазме перед введением ЛХАТ.

[0069] Как описано в примере 5 и показано на фигуре 3, введение ЛХАТ трансгенным мышам с геном аполипопротеина А-1 и нокаутом гена ЛХАТ приводит к увеличению содержания холестерина в тканях (аорты и печени) и увеличению уровней холестерина в плазме. Сводные данные примеров 4 и 5 показывают, что инъекция ЛХАТ быстро перераспределяет липиды из тканей в ЛПВ плазмы. При условии влияния инъекции ЛХАТ на содержание холестерина в печени и аорте, можно ожидать, что сходное изменение быстро произойдет в красных кровяных клетках.

[0070] Переход ФХ из ККК к ЛВП должен изменить состав мембраны ККК в сторону более нормального состояния. Это действие увеличит оксигенацию ККК, улучшит реологию (увеличит деформируемость, текучесть, уменьшит склонность к адгезии и агрегации), уменьшит анемию (уменьшит механический стресс и деструкцию, связанную со снижением деформируемости, увеличит время жизни ККК) и увеличит способность ККК оксигенировать ткани, особенно периферические ткани.

[0071] В некоторых вариантах, введение ЛХАТ осуществляется пациентом самостоятельно путем подкожной или внутримышечной инъекции. Самостоятельное введение является предпочтительным вариантом для лечения хронических заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, пациентов, страдающих серповидноклеточной болезнью, диабетом, ревматоидным заболеванием или гепатитом.

Пример 1

Влияние ЛХАТ на гематокрит у мышей.

[0072] Были взяты пробы крови у трех групп мышей: с дефицитом ЛХАТ (ЛХАТ-КО), с вызванной трансгенным путем избыточной экспрессией ЛХАТ (примерно в 30 раз превосходящей нормальную активность ЛХАТ) и контрольные С57/b6 мыши. Из проб крови были выделены мембраны ККК, и измерен уровень фосфолипидов, содержащих холин (Ваш фосфолипиды Б, Ричмонд), в качестве заменителя массы ККК или гематокрита. Масса ККК у ЛХАТ-дефицитных мышей была значительно ниже, чем у нормальных мышей (402±22.0 мкг/мл всей крови против 486±25.7 мкг/мл всей крови, соответственно). Показанная здесь анемия у ЛХАТ-дефицитных мышей сходна по степени с анемией, наблюдаемой у пациентов с СДЛ. Неожиданно, масса ККК была существенно повышенной у трансгенных мышей с избыточной экспрессией ЛХАТ по сравнению с мышами с нормальной активностью ЛХАТ (556±20.1 мкг/л всей крови против 486±25.7 мкг/мл всей крови, соответственно). Эти результаты показывают наличие положительной взаимосвязи между уровнями ЛХАТ и гематокритом. Дополнительно и наиболее важно, что уровни ЛХАТ, превосходящие нормальные, могут увеличивать гематокрит у животных, не считаемых анемичными. Эти исследования показывают, что повышенные уровни являются возможным вариантом выбора в терапии пациентов с анемией, вызванной различными причинами, даже у пациентов с нормальной активностью ЛХАТ.

Пример 2

Фосфолипидный состав внешних мембран ККК, выделенных из организма нормальных и страдающих СКБ пациентов (не в состоянии кризиса)

[0073] Образцы отмытых ККК в фосфатном солевом буфере были приготовлены из свежей крови, взятой у нормальных субъектов (n=7) и пациентов с СКБ (n=6). Аликвоты объемом пятьдесят микролитров собранных ККК были суспендированы в 0.95 мл фосфатного солевого буфера. Липиды были экстрагированы путем соединения 0,4 мл аликвоты каждой суспензии ККК с 20 мкл раствора, содержащего 1 мг/мл 1-эйкосанола в смеси этил-ацетапацетон (2:1) (внутренний стандарт) и 2 мл смеси этил-ацетат:ацетон:метанол (6:3:1) в стеклянных пробирках. Закрытые пробирки встряхивали в течение 2 минут и затем центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут. Верхняя органическая фаза была перенесена в пузырьки 12×32 мм для HPLC. Испарение растворителя осуществлялось из пузырьков под потоком азота и последующего применения в течение, по крайней мере, 1 часа сильного вакуума. Высушенные липиды были восстановлены в 200 мкл смеси триметилпентан:метанол:тетрагидрофуран, (95:5:2). Мембранные липиды были хроматографированы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с силикатной колонкой. Обнаружение и определение количества фосфатидилхолина (ФХ) и сфингомиелина (СМ) произведено с помощью испарительного детектора рассеянного света. Результаты показывают, что липиды ККК у пациентов с СКБ обогащены ФХ при уменьшенном содержании СМ, в сравнении с нормальными субъектами (ФИГ.1), что приводит к увеличению отношения ФХ/СМ с 0.67 до 0.98 для контрольной группы и пациентов с СКБ, соответственно. ККК пациентов с СКБ, проанализированные в этом исследовании, проявили характер фосфолипидного состава, который отличается от состава нормальных ККК. Состав липидов ККК при СКБ аналогичен тому, о котором сообщается в других случаях низкой активности ЛХАТ в плазме.

Пример 3

Приготовление рекомбинантной человеческой ЛХАТ

[0074] Плазмида pCMV6-XL4/LCAT, кодирующая белок человеческой ЛХАТ, была приобретена у Ориген Технолоджис (Роквилл, Мэриленд) и встроена в pcDNA3.1/Hygro (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). Вектор pcDNA3.1 был трансфецирован в клетки HEK293f. Стабильно трансфецированные клетки были выбраны с помощью раствора, содержащего 200 мкг/мл гигромицина Б, и выращены в бессывороточной среде Freestyle 293 (Инвитроген) во встряхиваемых флаконах емкостью 10 л в течение 4 дней. Рекомбинантная человеческая ЛХАТ была выделена из культуральной среды путем осаждения с хлоридом цинка, с последующим захватом и элюцией с фенилсефарозой.

Пример 4

Увеличение ЛПВ-Х в организме трансгенных мышей с человеческим аполипопротеином А-1, инъецированных ЛХАТ

[0075] Самцы трансгенных мышей, осуществляющих экспрессию гена человеческого аполипопротеина А-1 (лаборатория Джексона), содержались на обычном рационе, без ограничений. Мыши получили однократную инъекцию через ретро-орбитальный синус солевого раствора или рекомбинантной человеческой ЛХАТ в солевом растворе (4 мг/кг). Кровь отбирали у животных, анестезированных изофлураном через орбитальный плексус, спустя 0, 1, 4, 24, 48 и 72 часа после инъекции. Концентрация холестерина в плазме была определена с помощью коммерческого комплекта ферментативного анализа. Количество холестерина в ЛВП (ЛВП-Х) было определено методом гель-электрофореза с агарозой, используя SPIFE систему от лабораторий Хелена (Helena Labs). Фигура 2 показывает, что мыши, которым была введена ЛХАТ, показали значительное увеличение уровней ЛВП-Х в плазме, порядка 120% от контроля. Уровень ЛВП-Х остается повышенным в течение всего срока эксперимента (72 часа). Повышение ЛВП в плазме было удивительно быстрым, показав около 70% от контроля через 4 часа и около 120% от контроля через 24 часа.

Пример 5

Влияние инъекции ЛХАТ на содержание холестерина в тканях трансгенных мышей с нокаутом гена ЛХАТ/экспрессией гена аполипопротеина А-1

[0076] Трансгенные мыши, осуществляющие экспрессию человеческого аполипопротеина А-1 (лаборатория Джексона) были скрещены с LCAT-KO мышами для получения LCAT-КО/ароА-1-Tg мышей (с нокаутом гена ЛХАТ и экспрессией гена аполипопротеина А-1). Мыши линии LCAT-KO/apoA-1-Tg содержались на обычном для грызунов рационе, без ограничений. Внутривенные инъекции (ВИ) солевого раствора или 0.4 мг ЛХАТ производились ежедневно в течение 4 дней через ретроорбитальный синус. Животные были подвергнуты исследованию на пятый день. Животные были анестезированы и обескровлены путем перфузии гепаринизированного солевого раствора. У каждого животного были удалены доля печени и аорта и подвергнуты экстракции раствором хлороформа и метанола. Холестерин в липидах, полученных из экстрагированных тканей, был измерен с помощью коммерческого комплекта ферментативного анализа.

[0077] Фигура 3 показывает содержание холестерина в (А) печени, (В) аорте и (С) плазме мышей, инъецированных солевым раствором (Контроль) или ЛХАТ (Опыт). Лечение ЛХАТ значительно уменьшает уровни холестерина в печени и аорте и значительно повышает уровень холестерина в плазме. Сводные данные примеров 4 и 5 показывают, что инъекция ЛХАТ быстро перераспределяет липиды из тканей к ЛПВ плазмы. Данное влияние инъекции ЛХАТ на содержание холестерина в печени и аорте позволяет ожидать, что сходное изменение можно было бы наблюдать в красных кровяных клетках.

Пример 6

[0078] Ребенок (30 кг) с серповидноклеточной болезнью поступает в больницу в состоянии кризиса. Наряду со стандартным лечением, ему производят инфузию рекомбинантной человеческой ЛХАТ (рчЛХАТ) в количестве 5 мг/кг, в течение часа, при общем количестве солевого раствора 100 мл. После лечения измеряют уровни кислорода в крови и находят улучшение. Когда кризис стихает, измеряются морфология красных кровяных клеток и их физические характеристики (деформируемость ККК, агрегируемость ККК и осмотическая хрупкость) и результаты сопоставляются с результатами исследования проб крови, взятых при поступлении. Улучшения физических характеристик и оксигенации ККК достигаются при еженедельных подкожных инъекциях рчЛХАТ в дозе 0.5 мг/кг.

Пример 7

[0079] 35-летняя женщина (55 кг), страдающая ревматоидным артритом, имеет анемию с уровнем гемоглобина 9 г/дл (нормальный уровень 12-14 г/дл). Взята проба крови, которая показывает, что ее красные кровяные клетки менее способны к деформации и легче агрегируются, чем нормальные красные кровяные клетки. Пациентке прописаны еженедельные инъекции рчЛХАТ в дозе 1 мг/кг для введения подкожно. После 6 еженедельных инъекций измеряются уровни гемоглобина и гематокрита и обнаруживается увеличение на 20%. После 6 месяцев лечения гемоглобин составляет 14 г/дл. Врач решает поддерживать пациентку на рчЛХАТ в дозе 1 мг/кг, вводимой раз в две недели.

Пример 8

[0080] 65-летний мужчина (80 кг) запланирован на четверное шунтирование. Пациенту рекомендуется прекратить прием клопидогрела за пять дней до операции, чтобы уменьшить вероятность послеоперационного кровотечения. Для того чтобы снизить риск активации тромбоцитов, тромбоза, или агрегации ККК, пациента приводят в кабинет врача для инфузии рчЛХАТ в дозе 1 мг/кг за 5 дней до операции. Пациенту вводят 1 мг/кг рчЛХАТ прямо после операции, через 7 дней после операции и через 14 дней после операции. По окончании восстановительного периода (через 21 день после операции) пациент возвращается к постоянному лечению клопидогрелом.

Пример 9

Трансфер генов для специфической избыточной экспрессии ЛХАТ в печени

[0081] Имеется пациент с ревматоидным артритом, сопровождающимся хронической анемией. Пациенту вводится доза 4×10¹² аденовирусных частиц (АдрЛХАТ)/кг путем инъекции через интрапортальный катетер. Производится еженедельный мониторинг уровней ЛХАТ после лечения. Через 4 недели после лечения пациент имеет уровень концентрации ЛХАТ 10 мг/л или приблизительно в два раза больший, чем у субъекта, у которого нет артрита. Спустя 8 недель после лечения мониторинг производится ежемесячно. Если уровень ЛХАТ у пациента падает ниже 5 мг/л, процедуру повторяют.

Пример 10

[0082] Ребенок (30 кг) с серповидноклеточной болезнью в состоянии кризиса поступает в больницу. Наряду со стандартным лечением, ему произведена инфузия рекомбинантной человеческой ЛХАТ (рчЛХАТ) в дозе 5 мг/кг в течение 1 часа при общем объеме солевого раствора 100 мл. После лечения измерялись уровни кислорода в крови и найдено улучшение. Когда кризис стихает, измеряются морфология красных кровяных клеток и их физические характеристики (деформируемость ККК, агрегируемость ККК и осмотическая хрупкость) и результаты сопоставляются с результатами исследования проб крови, взятых при поступлении. Затем над пациентом производится процедура, при которой под кожу помещается медицинское устройство. Медицинское устройство заключает в себе клетки млекопитающих, подготовленные путем клеточной инженерии для секреции активной ЛХАТ. ЛХАТ, выделяемой клетками, достаточно, чтобы поднять эндогенную активность ЛХАТ до уровня, составляющего более 100% от нормального.

[0083] Необходимо принять во внимание, что масштаб этого изобретения определяется его формулой и не ограничивается вариантами и примерами, конкретно описанными в настоящем документе.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения анемии или дисфункции красных кровяных клеток у пациента, имеющего состояние, где указанное состояние выбрано из группы, состоящей из серповидноклеточной болезни и ревматоидной болезни. Для этого вводят пациенту терапевтически эффективное количество лецитин-холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ). Изобретение позволяет увеличить массу и число красных кровяных клеток у пациентов с серповидноклеточной болезнью или ревматоидной болезнью. 5 з.п. ф-лы., 3 ил., 2 табл., 10 пр.

1. Способ лечения анемии или дисфункции красных кровяных клеток у пациента, имеющего состояние, характеризующееся анемией или дисфункцией красных кровяных клеток, где указанное состояние выбрано из группы, состоящей из серповидноклеточной болезни и ревматоидной болезни, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества лецитин-холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ).

2. Способ по п.1, где состояние характеризуется пониженным гематокритом, пониженным уровнем гемоглобина, красными кровяными клетками с пониженной способностью к деформации, сниженной оксигенацией, повышенной агрегацией и адгезией, пониженной функцией оксида азота, уменьшенной продолжительностью жизни или любой комбинацией перечисленных явлений.

3. Способ по п.1, где количество ЛХАТ представляет собой такое количество, которое увеличивает концентрацию ЛХАТ до уровня, превышающего нормальный уровень ЛХАТ, или увеличивает активность ЛХАТ до уровня, превышающего нормальную активность ЛХАТ.

4. Способ по п.1, где количество вводимой ЛХАТ составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 5000 мг.

5. Способ по п.1, где количество вводимой ЛХАТ составляет от 1-кратного до 1000-кратного нормального уровня ЛХАТ.

6. Способ по п.4, где количество вводимой ЛХАТ составляет от приблизительно 10 мг до приблизительно 1000 мг.