СПОСОБ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2016 года по МПК C07K7/00 A61K38/10 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности, к терапии злокачественной опухоли, за счет раскрытия новой терапевтической мишени для разработки лекарственных средств против злокачественных опухолей. Эти лекарственные средства, в связи с их большей избирательностью и эффективностью, вносят вклад в улучшение современных способов лечения пациентов со злокачественными опухолями. Описан способ лечения злокачественной опухоли посредством экспрессии и накопления белка COMMD1 в ядре клетки злокачественной опухоли. Химические модификации, вводимые в первичную структуру пептида HARIKPTFRRLKWKYKGKFW, увеличивают ядерную локализацию белка COMMD1 и противоопухолевую активность этого пептида in vitro и in vivo.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Несмотря на значительные успехи в терапии злокачественных опухолей, существует большой интерес к разработке новых средств против злокачественных опухолей с новым механизмом действия, по причине развития опухолевыми клетками устойчивости к существующим лекарственным средствам против злокачественных опухолей. Пептиды все еще представляют большой интерес в качестве новых терапевтических лекарственных средств в связи с ролью медиаторов важных биологических функций и присущих им уникальных свойств, которые делают их особенно привлекательными терапевтическими средствами. Пептиды проявляют высокую биологическую активность, связанную с низкой токсичностью и высокой специфичностью. Польза, происходящая от этих признаков, включает высокую специфичность связывания с желаемой мишенью, минимизацию нежелательного взаимодействия лекарственное средство - лекарственное средство и подтвержденное более низкое накопление в тканях, снижающее риск осложнений в связи с промежуточными метаболитами (Vlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56). В настоящее время существуют способы терапии злокачественных опухолей, в которых используют пептиды и/или низкомолекулярные соединения с избирательностью связывания со специфическим целевым белком, который имеет важную биологическую функцию в развитии злокачественной опухоли. В первом сценарии имеют место способы терапии, которые могут быть нацелены на то, чтобы ингибировать функцию конкретного белка и вызывать апоптоз клетки злокачественной опухоли, например: Inhibitors of Heat Shock Proteins (HSP) (Subbarao et al., 2004, Pharmacology & Therapeutics, 101:227-257); Tyrosine kinase inhibitors (Garrido et al., 2007, Rev Med Chil, 10:1327-1332). В большинстве ситуаций эти белки считают аберрантными в процессе озлокачествления по сравнению с нормальной тканью.

Во втором сценарии лекарственное средство связывается с белковой мишенью, которая может быть или может не быть аберрантной в процессе озлокачествления по сравнению с нормальной тканью, в этом случае происходит поражение путей передачи сигнала, активация которых происходит в процессе злокачественного новообразования, например: ингибиторы репликации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), ингибиторы сборки микротрубочек и ингибиторы фактора транскрипции NFκB. Несмотря на то, что первый сценарий высоко эффективен в определенных гематопоэтических злокачественных новообразованиях, большинство этих способов терапии обладают ограниченной эффективностью в комплексности солидных опухолей. В отличие от этого, второй сценарий включает некоторые из наиболее эффективных и более токсичных лекарственных средств против злокачественных опухолей в онкологической фармакопее. По этой причине прогресс нуждается в поисках новых лекарственных средств, которые становятся более избирательными и эффективными, минимизируя их токсичность. В этом отношении идентификация новых терапевтических мишеней и понимание их роли в развитии злокачественных опухолей будет помогать идентифицировать новые механизмы устойчивости к лекарственным средствам и облегчать разработку новых лекарственных средств, которые сохраняют более высокую активность и которые можно комбинировать с существующими лекарственными средствами, снижая их токсичность и повышая качество жизни пациентов со злокачественными опухолями. Белок COMMD1, ранее известный как MURR1 (van de Sluis et al., 2002, Human Molecular Genetics, 11:165-173), относится к новому семейству белков, известных под их аббревиатурой COMMD (домен гена метаболизма меди MURR1, сокращенно COMMD). Десять членов семейства белков высоко консервативны в многоклеточных организмах и повсеместно экспрессируются, но биологические функции большинства его членов неизвестны. Ключевая характеристика этого семейства состоит в присутствии домена COMM (домен метаболизма меди Murr1), консервативного и уникального, содержащего аминокислотные остатки 110-190 C-концевой области (Burstein et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry, 280:22222-22232). COMMD1 вовлечен в различные биологические процессы, такие как: контроль метаболизма меди (Tao et al., 2003, Journal of Biological Chemistry, 278:41593-41596), регуляция внутриклеточного транспорта натрия (Biasio et al., 2004, Journal of Biological Chemistry, 279:5429-5434), ингибирование фактора транскрипции NFκB (Maine et al., 2007, The EMBO Journal, 26:436-447), ингибирование экспрессии генов, регулируемых индуцируемым гипоксией фактором (HIF)-1α (van de Sluis et al., 2007, Molecular and Cellular Biology, 27:4142-4156).

COMMD1 демонстрирует физическое взаимодействие с RelA (p65), субъединицей из транскрипционного фактора NFκB, с каталитической-α субъединицей из фактора HIF-1α и с ΔENaC в натриевых каналах эпителия. Во всех случаях это взаимодействие ведет к разрушению этих «обслуживаемых» белков через механизм, который включает пути убиквитинилирования и разрушения протеосом. Показано, что домен COMM участвует в белок-белковых взаимодействиях, как для «обслуживаемых» белков COMMD1, а также для взаимодействия среди членов семейства. Существует предположение о трехмерной структуре N-концевой области COMMD1, но все еще не доступна третичная структура для домена COMM (Sommerhalter et al., 2007, Journal of Molecular Biology, 365:715-721).

Убиквитинилирование и разрушение протеосом управляют базальной экспрессией COMMD1 в клетке через серию остатков лейцина, расположенных в домене COMM (Maine et al., 2009, Biochemical Journal, 417:601-609). Недавно сообщалось о том, что COMMD1 имеет конститутивный механизм транспорта цитоплазма-ядро через сигналы ядерного экспорта (NES), также расположенные в его домене COMM. Сообщалось, что разрушение лейциновой последовательности и/или средства, которые ингибирует разрушение протеосом, создают увеличение экспрессии COMMD1 в клетках. Вдобавок, разрушение последовательностей NES в COMMD1 увеличивает подавление транскрипционной активности факторов NFκB и HIF-1α (Muller et al., 2009, Traffic, 10:514-527).

Клетки злокачественной опухоли, сверхэкспрессирующие различные белки, такие как белок XIAP (X-связанный ингибитор апоптоза) и секреторный кластерин (sCLU). Оба белка способствуют разрушению COMMD1 и облегчают активацию NFκB и выживаемости опухолевых клеток. Сообщалось, что ингибиторы протеосом, такие как MG132 (Shirley et al., 2005, Neoplasia, 7:1104-1111; Zhou et al., 2009, Cancer Research, 21:333-339) демонстрировали противоопухолевый эффект посредством ингибирования механизма убиквитинилирования и разрушения протеосом. Соединения, которые связываются с XIAP, индуцируют апоптоз посредством блокирования ингибирующего эффекта этого белка, оказываемого на активацию каспазы-3 и каспазы-9 (Vogler et al., Cancer Research, 2009, 69:2425-2434). Предполагают, что интерферирующая рибонуклеиновая кислота (RNAi), разработанная для того, чтобы ингибировать функцию sCLU, обладает противоопухолевым эффектом за счет стабилизации цитоплазматического ингибитора фактора NFκB, известного как I-kB (Zoubeidi et al., 2010, Molecular Cancer Research, 8:19-30).

В международной патентной заявке WO 07/095867 сущность изобретения связана с пептидами, получаемыми из области 32-51 белка LALF (антилипополисахаридный фактор Limulus), в которых замены аминокислот создавали для того, чтобы гарантировать нарушение ЛПС-связывающей способности и увеличить противоопухолевую и иммуномодулирующую активности. Один из этих пептидов представляет собой пептид, называемый L2. Вдобавок, в другом изобретении (международная заявка PCT/CU2008/000006) показана способность указанных выше пептидов проникать в клетки. Однако в таких изобретениях механизм действия таких пептидов не раскрыт и не даны предположения относительно него. В настоящее время существует множество способов терапии для лечения злокачественной опухоли (химиотерапия, лучевая терапия, иммунотерапия и т.п.), многие из которых находятся в клинических исследованиях. Однако все еще имеют место недостатки, связанные с этими способами терапии, такие как: низкая избирательность, токсичность и развитие устойчивости к лекарственным средствам. Другой важный аспект для рассмотрения в данной области состоит в выборе биологических маркеров, которые можно использовать в качестве диагностических средств и/или в качестве прогностических факторов эффективности лекарственного средства. Следовательно, сохраняется необходимость исследовать и изучать новые молекулы, которые можно использовать в лечении и/или диагностике злокачественной опухоли, и разрабатывать лекарственные средства, более избирательные и эффективные при меньшей токсичности.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение решает указанную выше проблему посредством описания способа лечения злокачественной опухоли посредством увеличения ядерной локализации белка COMMD1. Это увеличение вызывает снижение или блокировку пролиферации клеток злокачественной опухоли.

В этом изобретении в первый раз выявлено, что пептид L2 (с последовательностью HARIKPTFRRLKWKKYKGKFW, SEQ ID №1) и COMMD1 взаимодействуют в клетках и что ядерная локализация COMMD1 ассоциирована с гибелью клеток злокачественной опухоли. Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию белка COMMD1 в идентификации соединений с противоопухолевой активностью, которые способствуют ядерной локализации и накоплению COMMD1.

Предоставленные в этом изобретении данные показывают, что пептид L2 взаимодействует с COMMD1, в частности, в области между аминокислотами 110-190. Вдобавок, пептид L2 вызывает ядерное накопление COMMD1. Кроме того, в первый раз в этом изобретении сообщается о том, что экспрессия белка COMMD1, несущего последовательности ядерной локализации (NLS), является достаточной для того, чтобы индуцировать гибель клеток. Следовательно, в настоящем изобретении продемонстрировано использование COMMD1 в качестве терапевтической мишени в лечении злокачественных опухолей.

Вдобавок, пептид L552 (SEQ ID №3) оптимизировали, начиная от пептида L2 (SEQ ID №1), для того, чтобы способствовать накоплению белка COMMD1 в ядре клетки злокачественной опухоли и увеличить противоопухолевый эффект этого пептида. Пептид L552 (SEQ ID №3), описанный в этом изобретении, которые улучшали для того, чтобы содействовать ядерной локализации COMMD1, имеет следующую последовательность:

Ac-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW SEQ ID №3

Оптимизация основана на химических модификациях, выполняемых посредством замены природной аминокислоты неприродными аминокислотами (D-аминокислоты) в конкретных положениях (представленных в нижнем регистре и жирном начертании в последовательности, включенной выше) и посредством защиты N-конца ацетилированием (обозначают как Ac- в последовательности, включенной выше). Эти модификации, выполненные в пептиде L2 (SEQ ID №1), которые дали начало пептиду L552 (SEQ ID №3), обеспечивают самое высокое накопление белка COMMD1 в ядрах клеток и увеличение противоопухолевой активности пептида L552 относительно исходного пептида L2. Следовательно, пептид L552 представляет собой новый класс молекул, которые взаимодействуют с COMMD1, содействуя его ядерной локализации и ингибируя пролиферацию клеток злокачественной опухоли.

Другая цель данного изобретения состоит в применении средств, которые увеличивают ядерную локализацию белка COMMD1, в изготовлении лекарственных средств для терапии злокачественной опухоли. Среди средств или соединений, которые способствуют ядерному накоплению COMMD1, включены, например: белки (включая антитела), мутеины, пептиды, полинуклеотиды, аптамеры, нуклеиновые кислоты и малые органические молекулы. Эти соединения можно выделять из природных источников, получать синтетически или посредством рекомбинантной технологии или любого их сочетания. В конкретном варианте осуществления средство, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1, представляет собой пептид L552 (SEQ ID №3). В контексте данного изобретения увеличивать или усиливать ядерную локализацию белка COMMD1 и накапливать COMMD1 в ядрах клеток имеет одинаковое значение. В другом конкретном варианте осуществления средство, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1, может представлять собой нуклеиновую кислоту определенного типа, например, экспрессирующий вектор, в клетках млекопитающих, который содержит последовательность ДНК, которая кодирует белок COMMD1, который содержит введенные NLS. Вектор этого типа можно использовать в качестве генной терапии.

Также частью изобретения является фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей, содержащих средство, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит эффективное количество средства, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1 (определяемое посредством его ингибирующей концентрации 50 (IC₅₀), и эксципиенты или фармацевтически приемлемые носители. Композицию можно вводить посредством парентерального или топического пути.

Введение фармацевтической композиции, содержащей средство, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1, составляет способ лечения или профилактики солидной опухоли у субъекта, где способ включает введение эффективного количества средства, которое способствует ядерной локализации COMMD1, чтобы снизить или блокировать рост опухолевых клеток. В одном из вариантов осуществления изобретения средство, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1, можно вводить пациентам с лейкозом, в частности, с миелоцитарным лейкозом, чтобы блокировать пролиферацию клеток злокачественной опухоли. Это средство может быть эффективным даже в присутствии воспалительного стимула, такого как бактериальный липополисахарид (ЛПС).

В настоящем изобретении показано, что пептид L552 можно использовать в комбинации со стандартной химиотерапией для получения синергического эффекта и снижения дозы цитостатиков, таких как цисплатин и 5-фторурацил (5-FU). Следовательно, также цель данного изобретения заключается в фармацевтической комбинации для лечения злокачественных опухолей, содержащей одно или несколько средств, которые увеличивают ядерную локализацию белка COMMD1, и одно или несколько лекарственных средств, специфичных для химиотерапии злокачественной опухоли. В одном из вариантов осуществления изобретения таким средством является пептид L552 и специфичное лекарственное средство для стандартной химиотерапии выбирают между цисплатином и 5-FU. В этой фармацевтической комбинации средства и лекарственные средства, включенные в нее, можно вводить одновременно, отдельно или последовательно во время лечения. С другой стороны, последние данные расширили идею о том, что воспаление является решающим компонентом в развитии опухоли. Сегодня воспалительное микроокружение каталогизировано в качестве характерного признака опухоли, который занимает место среди шести наиболее важных признаков злокачественной опухоли, описанных авторами Hanahan and Weinbergs (Perwez et al., 2007, Int J Cancer, 121:2373-2380).

Данные, предоставленные в этом изобретении, показывают, что пептид L552 эффективен при блокировании роста клеток злокачественной опухоли в присутствии воспалительного стимула. Аналогичным образом, белок GFP-NCOMMD1 (несущий последовательности ядерной локализации), которым временно трансфицированы клетки злокачественной опухоли, обеспечивает такой же эффект, что и пептид L552. Более конкретно, результаты демонстрируют, что пептид L552 способствует гибели клеток злокачественной опухоли в присутствии воспалительного стимула, такого как ЛПС и TNF (фактор некроза опухоли α). Аналогичным образом, экспериментальные данные демонстрируют эффективность пептида в модели опухоли ободочной кишки на мышах, в которой мышей стимулировали воспалительным стимулом посредством инъекции ЛПС.

По этой причине настоящее изобретение также относится к способу ингибирования развития опухолей, ассоциированных с воспалением, и их метастазов, который включает введение пептида L552 субъекту, нуждающемуся в этом. Среди опухолей, ассоциированных с воспалением и метастазами, находят, например, следующие злокачественные опухоли: толстой кишки, пищевода, легких, предстательной железы, груди, поджелудочной железы и печени.

Также введение пептида L552 можно использовать профилактически для предотвращения развития злокачественной опухоли, ассоциированной с хроническим воспалением, таким как болезнь Крона, язвенный колит, панкреатит, цирроз и т.д. Следовательно, также цель данного изобретения заключается в способе предупреждения злокачественной опухоли, ассоциированной с хроническим воспалением, который отличается введением пептида L552 или композиции, содержащей указанный пептид, субъекту, нуждающемуся в этом.

В отношении дозы и схемы лечения, чтобы придерживаться композиций, содержащих пептид L552, в качестве средства, которое увеличивает ядерную локализацию белка COMMD1, специалист может легко определить дозу и схему лечения (профилактического или терапевтического). Эффективное количество может варьироваться в зависимости от относительной активности отдельных композиций, и можно его вычислять, основываясь на молекулярной массе пептида и IC₅₀ in vitro или в исследованиях на животных. Например, зная молекулярную массу соединения (химическую структуру) и эффективную экспериментальную дозу (IC₅₀), дозу в мг/кг можно вычислить обычным способом. В целом, дозы составляют от 0,2 до 4 мг/кг масса. Пептид или композицию, содержащую его, можно вводить один или несколько раз, еженедельно или даже в течение нескольких месяцев.

Изобретение также относится к использованию COMMD1 в качестве нового прогностического маркера для пациентов со злокачественными опухолями посредством определения присутствия или отсутствия ядерной локализации белка COMMD1 в образце.

Аналогичным образом пептид L552 предоставляет активное средство для лечения заболеваний, где белки COMM играют определенную роль или участвуют в развитии заболевания. Это возможно, например, при заболеваниях, в которых количество любого члена семейства COMMD увеличено или снижено и/или его активность увеличена или снижена, и это вызывает заболевание. Способность пептида L552 связывать домен COMM, содержащийся между аминокислотными остатками 110-190 C-конца белков COMMD, подтверждает его терапевтическую активность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. На фигуре проиллюстрировано физическое взаимодействие между пептидом L2 и COMMD1. Это осуществляли способом с двумя гибридами в дрожжах. В качестве отрицательных контролей использовали скрещивание штамма дрожжей AH109, трансформированного пустым вектором (pGBKT7), и штамма Y187, трансформированного фрагментами COMMD1. Для идентификации взаимодействия, осуществляли скрещивание штамма AH109, трансформированного вектором, несущим последовательность L2, и каждого фрагмента COMMD1, трансформированного в штамм Y187. В качестве положительного контроля использовали скрещивание pCL1, несущего фактор транскрипции GAL4. Как можно отметить, взаимодействие возникает с плазмидами, несущими полную последовательность гена COMMD1, и конструкцию, содержащую аминокислоты 110-190 белка COMMD1.

Фиг.2. (A) на фигуре проиллюстрировано подтверждение взаимодействия пептида L2 с COMMD1 посредством иммунопреципитации (осаждения) в клетках SW948. В этом эксперименте показаны 100 мкг общего белка (ОБ), рекомбинантный белок COMMD1, получаемый в Escherichia coli, (COMMD1 r) и стандарт молекулярной массы (MW). (B) На фигуре проиллюстрирована субклеточная локализация COMMD1 в клетках SW948, которые обрабатывали пептидом L2: экспрессия COMMD1 в ядре (N), экспрессия COMMD1 в цитоплазме (C), необработанные клетки (NT). β-актин показан в качестве контроля цитоплазматической фракции, а рибонуклеарный белок человека (hnRPN) в качестве контроля ядерной фракции.

Фиг.3. (A) На фигуре проиллюстрировано более высокое ядерное накопление COMMD1 за счет оптимизированного пептида L552. Белки β-актин и hnRNP использовали в качестве контроля цитозольной и ядерной фракции, соответственно. (B) на фигуре показано взаимодействие между пептидом L552 и белком COMMD1 в различных линиях опухолевых клеток в экспериментах иммунопреципитации (осаждения). Взаимодействие не обнаруживали при использовании белка куллин 7 (CUL7). Присутствие β-актина показано в экстрактах общего белка из нескольких клеточных линий.

Фиг.4. Антипролиферативный эффект пептидов в опухолевых клетках различного гистологического происхождения, L⌀ (лимфоциты человека, выделенные из периферической крови).

Фиг.5. Противоопухолевый эффект пептида L552 в модели опухоли TC-1. (A) Показаны кривые ингибирования опухолевого роста. (B) Показан кумулятивный процент выживаемости различных экспериментальных групп.

Фиг.6. Экспрессия белка COMMD1, несущего последовательности ядерной локализации (NLS), достаточна для того, чтобы индуцировать гибель клеток. Показана процентная доля нежизнеспособных клеток, временно трансфицированных: зеленым флуоресцентным белком (GFP) в качестве отрицательного контроля и генетическими конструкциями GFP-COMMD1 и GFP-N-COMMD1.

Фиг.7. (A) показана хемочувствительность к 5-FU в клетках карциномы ободочной кишки HT-29, трансфицированных GFP-N-COMMD1. Показаны значения IC₅₀. (B) проиллюстрирован эффект воспалительного окружения добавления ЛПС и TNF-α от IC₅₀.

Фиг.8. Проиллюстрирован эффект пептида L552, оказываемый на пролиферацию клеток злокачественной опухоли в присутствие другого воспалительного стимула. (A) Клетки миелолейкоза человека (THP-1) и (B) карциномы ободочной кишки мыши (CT-26), обработанные с использованием ЛПС и TNF-a. Приведены значения IC₅₀.

Фиг.9. Противоопухолевый эффект пептида L552 в модели злокачественной опухоли ободочной кишки на мышах BALB/с, которых подвергали воспалительному стимулу посредством инъекции ЛПС. (A) Показан кумулятивный процент выживаемости различных экспериментальных групп. (B) Показан средний объем опухоли для каждой экспериментальной группы.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Физическое взаимодействие между пептидом L2 и COMMD1.

Чтобы идентифицировать взаимодействия противоопухолевого пептида L2 и белка, использовали двухгибридную дрожжевую систему. Для клонирования последовательностей, соответствующих пептиду, олигонуклеотиды конструировали следующим образом:

L2F:

CATGCACGCTAGAATCAAGCCAACCTTCAGAAGATTGAAGTGGAAGTACAAGGGTAAGTTCTGGTAA

L2R:

GATCTTACCAGAACTTACCCTTGTACTTCCACTTCAATCTTCTGAAGGTTGGCTTGATTCTAGCGTG

в соответствии с последовательностью пептида L2: HARIKPTFRRLKWKYKGKFW

Для клонирования этих последовательностей в векторе pGBKT7 NcoI-BamHI, последовательности, комплементарные этим участкам, добавляли на концы олигонуклеотидов. Рекомбинантную плазмиду pGBKL2-1, которая несет последовательность пептида L2, верифицировали посредством рестрикционного анализа и секвенирования. Плазмиду трансформировали в штамм дрожжей AH109 способом с ацетатом лития и растили в среде SD-Trp. Верифицировано, что он не может активировать сам себя, когда его выращивают на чашках SD-Trp-His. Для скрининга взаимодействий использовали библиотеку кДНК печени человека, трансформированную в штамм Y187. Для формирования диплоида и отбора взаимодействий, 5×10⁸ клеток AH109, содержащих плазмиду pGBKL2-1, выращивали с 5×10⁸ клеток Y187, содержащих библиотеку ДНК печени человека, в течение 4 часов, на твердой среде YPDA при 30°C. Десять мл стерильной воды добавляли на поверхность чашек YPDA и клетки осторожно суспендировали шпателем и переносили в 15 чашек с минимальной средой SD-Trp-Leu-His-Ade и растили при 30°C в течение 7 суток. Полученные 74 колонии переносили в жидкую SD-Trp-Leu в глубокие 96-луночные планшеты. После наблюдения роста в жидкой среде, осуществляли очистку ДНК дрожжей. Каждую отдельную ДНК трансформировали в штамм E. coli DH10B, их ДНК очищали и хранили при -20°C. Каждый отдельный клон трансформировали в штамм дрожжей Y187 и взаимодействие верифицировали посредством скрещивания со штаммом AH109, трансформированным плазмидами pGBKT7 и pGBKL2-1. ДНК положительных клонов секвенировали. Анализ последовательностей с использованием программы Blast (Altschul et al., 1990. J Mol Biol, 215:403-410) показал, что один из клонов (L2-21) соответствует последовательности гена, кодирующего аминокислоты 6-190 белка COMMD1, и что этот клон способен взаимодействовать с плазмидой, содержащей последовательность пептида L-2. Чтобы конкретно идентифицировать область белка COMMD1, отвечающую за это взаимодействие, осуществляли делеции в плазмиде pGBKL2-1, создавая клоны: pGBKL2 (6-110), pGBKL2 (6-70), pGBKL2 (71-190), pGBKL2 (110-190). Как показано на фиг. 1, взаимодействие сохранено только в плазмиде pGBKL2 (110-190), содержащей домен COMM, отвечающий за взаимодействия белков, описанные для семейства COMMD. Этот результат показывает, что пептид L2 конкретно связывает область аминокислотами 110-190.

Пример 2. Эксперименты по иммунопреципитации (осаждению) и определению ядерной локализации COMMD1 в клетках злокачественной опухоли, обработанных пептидом L552.

Эксперименты разделили на два блока:

(A) Синтетический пептид L2 (SEQ ID №1), синтезированный с использованием твердофазной процедуры, биотинилировали и использовали в качестве «наживки», прикрепленной к стрептавидиновой сефарозной смоле. Белок общего экстракта из SW948 (клеточная линия карциномы ободочной кишки человека) использовали в качестве «добычи». Эти эксперименты известны как «осаждение». Белок общего экстракта получали из 2×10⁷ клеток с использованием буфера для экстрагирования (Triton X-100 0,5% 25 мМ HEPES, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 1 мМ дитиотреитол (DTT), и ингибитора протеаз). Биотинилированный пептид (300 мкг) инкубировали с 50 мкл стрептавидиновой сефарозной смолы (GE Healthcare), в течение 1 часа и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS 1×) плюс 1 мМ DTT. Затем, 500 мкл общего белка инкубировали с 50 мкл смолы, содержащей биотинилированный пептид, при комнатной температуре в течение 5 часов. Впоследствии смолу промывали тщательно в PBS 1× и 1 мМ DTT. Белки, оставшиеся прикрепленными к смоле, представляют собой белки, которые взаимодействуют с пептидом, и их суспендировали в 25 мкл буфера для электрофореза (62,5 мМ Tris HCl, pH 6,9, 0,1 M DTT, 20% додецилсульфат натрия (SDS), 10% глицерин и 0,01% бромфенол синий). Чтобы обнаружить белок, представляющий интерес, осуществляли электрофорез в полиакриламидном геле (7,5%), за чем следовало иммунодетекция посредством Вестерн-блоттинга. Чтобы обнаружить белок COMMD1, использовали моноклональное антитело к белку COMMD1 (Sigma, clone 2A12). Экстракт общего белка (100 мкг) и рекомбинантный белок COMMD1, полученный в E. coli, использовали в качестве положительного контроля. Результаты, представленные на фиг.2A, показывают, что пептид L2 концентрирует белок COMMD1 в эксперименте по осаждению, когда его сравнивают с экстрактом общего белка. Это показывает взаимодействие между L2 и COMMD1.

(B) Клетки SW948 (3×10⁶ клеток) инкубировали в течение 5 часов при 37°C и 5% CO₂ с пептидом L2 (50 мкМ). Впоследствии цитозольные и ядерные белки получали, как сообщалось (Vancurova et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276: 19746-19752). Обнаружение COMMD1 осуществляли посредством Вестерн-блоттинга с использованием антитела против COMMD1. На фиг.2B показана ядерная локализация COMMD1 в клетках SW948, обработанных пептидом L2. β-актин использовали в качестве контроля для цитоплазматической фракции, а рибонуклеопротеин человека (hnRNP) в качестве контроля ядерной фракции.

Пример 3. Оптимизация пептида L552 для ядерного накопления COMMD1.

Учитывая то, что пептид L2 и COMMD1 имеют физическое взаимодействие, и это коррелирует с ядерной локализацией COMMD1, несколько пептидов конструировали, начиная от L2 (SEQ ID №1), с целью усиления ядерного накопления COMMD1. Пептиды по данному изобретению синтезировали с использованием твердофазной процедуры. Неочищенный пептид экстрагировали с использованием раствора 30% уксусной кислоты; его лиофилизировали и затем очищали посредством хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ ОФ). Молекулярную массу очищенных пептидов верифицировали посредством масс-спектрометрии. Получаемый препарат является неантигенным, непирогенным и фармацевтически приемлемым для введения животным и человеку. В определенных точках выполняли замены, вводящие D-аминокислоты в конкретные положения в исходном пептиде L2, последовательность которого представляет собой HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ ID №1), как показано в таблице 1. В одном случае N-конец также блокировали посредством ацетилирования.

Таблица 1
Последовательность пептидов, использованных в изобретении Пептид Аминокислотная последовательность SEQ ID № Признаки L2 HARIKPTFRRLKWKYKGKFW 1 Пептид предварительно описан в заявке WO 07/095867 L551 HARIKpTFRRIKWKYKGKFW 2 Пептид с D-аминокислотами в положениях P-6 и L-11 L552 Ac-HARIKpTFRRIKWKYKGKFW 3 Пептид с D-аминокислотами в положениях P-6 и L-11, и ацетилированный на N-конце L553 HARIKPTFRRLKWkYKgKFW 4 Пептид с D-аминокислотами в положениях K-14 и G-17 L554 HArIKpTFRRLKWKYKGKFW 5 Пептид с D-аминокислотами в положениях R-3 и P-6. Примечание: аминокислоты в жирном начертании и нижнем регистре обозначают D-аминокислотные замены.

В этом эксперименте цель состояла в том, чтобы идентифицировать пептид с более высокой способностью к накоплению COMMD1 в ядрах клеток. Клетки SW948 (3×10⁶ клеток) инкубировали в течение 5 часов при 37°C и 5% CO₂ с пептидами L2, L551, L552, L553 и L554 (50 мкМ). Впоследствии выделение цитозольных и ядерных белков осуществляли, как описано в примере 2. Обнаружение COMMD1 осуществляли посредством вестерн-блоттинга с использованием антитела против COMMD1. На фиг.ЗА показана ядерная локализация COMMD1 в клетках SW948, обработанных указанными выше пептидами. Результаты показывают, что пептид L552 индуцирует наибольшее накопление COMMD1 в ядрах клеток злокачественной опухоли. Кроме того, они демонстрируют взаимодействие между пептидом L552 и COMMD1 посредством экспериментов по иммуноблоттингу (осаждению) в различных опухолевых линиях, фиг.3B. Эти результаты подтверждают взаимодействие между L552 и COMMD1. Также взаимодействие связано с облегчением ядерного накопления COMMD1.

Пример 4. Иллюстрировать увеличение антипролиферативного эффекта пептида L552 в различных опухолевых линиях

Для этого анализа опухолевые клетки человеческого происхождения H-82 (мелкоклеточный рак легких), H-125 (немелкоклеточный рак легких), MCF-7 (аденокарцинома груди), MDA-MB231 (позитивная по рецептору эпидермального фактора роста аденокарцинома груди), LS174T (аденокарцинома толстой кишки) и HT-29 (аденокарцинома толстой кишки, устойчивая к химиотерапии) высевали в 96-луночные планшеты (Costar) с плотностью 1×10⁴ клеток/мл в RPMI 1640 (Gibco) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco). После 24 часов пептиды добавляли в среду для культивирования в диапазоне доз между 9 мкМ и 300 мкМ. Инкубацию осуществляли в течение 48 часов в присутствие 5% CO₂ и после этого времени выявляли их с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5 дифенилтетразолий бромида (MTT) (Gray MJ et al., 2008, Natl Cancer Inst, 100:109-20). В конце планшеты считывали при поглощении 492 нм. Каждую точку выполняли дважды и эксперименты осуществляли независимо по меньшей мере два раза. Значения IC₅₀ получали из соответствующих кривых клеточной пролиферации. Результаты показаны на фиг.4. Результаты показывают, что ацетилирование на N-конце и D-аминокислотная замена в конкретных положениях гарантируют увеличение антипролиферативного эффекта пептида L552. Однако эффект не наблюдали на лимфоцитах человека, выделенных из периферической крови. Этот результат показывает, что пептид L552, цель данного изобретения, усиливает избирательный цитотоксический эффект на опухолевых клетках, не вызывая увеличенной токсичности в здоровых клетках. Представленные результаты демонстрируют, что пептид L552 оптимизирован для взаимодействия с белком COMMD1, чтобы способствовать его дополнительному накоплению в ядре и увеличивать избирательный антипролиферативный эффект, оказываемый на клетки злокачественной опухоли.

Пример 5. Противоопухолевый эффект пептида L552 в модели опухоли TC-1 на мышах

В этих анализах использовали самок C57BL/6 в возрасте между 8 и 10 неделями (n=10 животных на экспериментальную группу). Для имплантации опухоли в этой модели использовали клетки TC-1, полученные из клеток эпителия легких из озлокачествленных C57BL/6, которые суспендировали в физиологическом растворе (PBS). Клетки в количестве 5×10⁴ в объеме 200 мкл инокулировали мышам подкожно в правую заднюю ногу. Пять доз пептидов (L2, L552 и L551) вводили с интервалами в 2 суток, подкожно в правую заднюю ногу, как только опухоли достигли объема 100 мм³. В этом исследовании оценивали дозу 0,2 мг пептида на кг массы (4 мкг/мышь). Оцениваемыми параметрами для измерения противоопухолевого эффекта пептидов, представляющих интерес, были выживаемость животных и опухолевая масса, как показано на фиг.5A и 5B. Пептид L552 был более эффективен с точки зрения способности ингибировать развитие опухоли и увеличивать выживаемость мышей по сравнению с пептидами L2 и L551. Эти результаты доказывают, что модификации, введенные в L552, увеличивали противоопухолевую эффективность in vivo. Статистические анализы осуществляли посредством логарифмического рангового способа, чтобы определить значимые различия между группами. Результаты демонстрируют, что пептид L552 значительно увеличивает (*p<0,05) выживаемость животных в сравнении с другими протестированными пептидами. Эти результаты демонстрируют, что D-аминокислотные замены в конкретных положениях и блокирование N-конца посредством ацетилирования значительно увеличивают противоопухолевые способности пептида.

Пример 6. Иллюстрирует, что экспрессия белка COMMD1, несущего последовательности ядерной локализации, достаточна для того, чтобы индуцировать гибель клеток

Чтобы подтвердить роль ядерной локализации COMMD1 в ингибировании клеточной пролиферации, создавали рекомбинантные плазмиды pGFP-COMMD1, экспрессирующие COMMD1, слитый с GFP, и pGFP-N-COMMD1, которая также содержит последовательность пептида ядерной локализации PKKKRKV. Для клонирования pGFP-COMMD1 осуществляли полимеразную цепную реакцию с использованием олигонуклеотидов:

CF: TTCTGCAGTCGACCTTGAGGGTGGCAAA

CR:CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT

Для амплификации гена, кодирующего COMMD1, с введением NLS, использовали следующие олигонуклеотиды:

NF:TGCAGTCGACCCGAAAAAGAAAGGGAAACTTGAGGGTGGCAAACCC

CR:CGCTCGAGACATCTTCAGTTAGGCTGGCTGATCAGTGT.

Рекомбинантные клоны анализировали посредством рестрикции и последовательности ДНК. Обе конструкции и контроль pEGFP временно трансфицировали в клеточные линии HT-29 и HEK293 с использованием полиэтиленимина (Sigma, USA) (Boussif, О et al., 1995, Proc Natl Acad Sci, 92: 7297-7301) в 24-луночных планшетах в двух повторениях. После 72 часов одну из лунок использовали для того, чтобы оценивать экспрессию рекомбинантных белков с использованием флуоресцентного микроскопа Axiovert 40 (Zeiss, Germany) и объектива APIan 10×.

Среду для культивирования удаляли из оставшейся лунки и окрашивание осуществляли смесью акридина оранжевого/бромистого этидия (AO/EB) в концентрации 5 мг/мл в PBS, для идентификации апоптоза (Riblah D, et al., 2005, BMC Biotechnology, 5:12-15), и их наблюдали под микроскопом Axiovert 40 и объективом APIan 40×. При этом типе окрашивания АО проходит через мембрану живых клеток и окрашивает ядро и цитоплазму клеток в зеленый и оранжевый, соответственно, тогда как BE только проникает в клетки с потерей целостности мембран и окрашивает ДНК в красный цвет. Флуоресценция BE преобладает над флуоресценцией АО.

Окрашивание AO/EB показывает жизнеспособные клетки, окрашенные с использованием АО, в трансфекциях с использованием GFP и GFP-COMMD1. Только в случае клеток, трансфицированных с использованием GFP-N-COMMD1, наблюдали клетки с ядром, с окрашенным EB, что показывает, что они находятся в поздней фазе апоптоза. На фиг.6 представлен график с процентной долей окрашенных клеток с красным ядром, трех независимых полей на экспериментальное условие. Она представляет значения и стандартные отклонения. Эти результаты демонстрируют, что введение NLS в белке COMMD1 является достаточным для того, чтобы индуцировать апоптоз в клетке. Эти результаты также демонстрируют полезность COMMD1 в качестве новой терапевтической мишени.

Пример 7. Иллюстрирует эффект ядерной локализации белка COMMD1 в чувствительности к 5-FU, а также к воспалительным стимулам в клеточной линии HT-29

(A) Клеточную линию HT-29, временно трансфицированную конструкциями, описанными выше, высевали в 96-луночные планшеты (Costar) при плотности 1×10⁴ клеток/мл в RPMI 1640 (Gibco) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco). После 24 часов цитостатик 5-FU добавляли в среду для культивирования в диапазоне доз между 0,025 мкМ и 2500 мкМ, в серийных разведениях 1:10. Инкубацию осуществляли в течение 48 часов в присутствие 5% CO₂ и в конце выявляли с использованием MTT. В конце осуществляли считывание планшетов при поглощении 492 нм. Каждую точку выполняли дважды, а эксперименты осуществляли по меньшей мере два раза независимо. Значения IC₅₀ получали из соответствующих кривых клеточной пролиферации. Результаты, представленные на фиг.7A, показывают, что экспрессия COMMD1 с NLS (GFP-N-COMMD1) служит причиной повышенной чувствительности клеток злокачественной опухоли к 5-FU. В этом примере показано снижение IC₅₀ в клетках, экспрессирующих GFP-NCOMMD1 по сравнению с клетками, экспрессирующими GFP или GFP-COMMD1. Эти результаты также демонстрируют полезность COMMD1 в качестве новой терапевтической мишени. Это также показывает, что ядерная локализация COMMD1 индуцирует хемочувствительность к стандартным цитостатикам.

(B) Клеточную линию HT-29, временно трансфицированную с использованием GFP-NCOMMD1, подвергали другому воспалительному стимулу, например, ЛПС (40 мкг/мл) и TNF-α (20 нг/мл), в течение 30 мин. Впоследствии IC₅₀ оценивали, как описано в примере 6. Результаты показаны на фиг.7B.

Пример 8. Иллюстрирует эффект пептида L552, оказываемый на клеточную пролиферацию клеток злокачественной опухоли, которые подвергли воспалительному стимулу

Для этого анализа клетки острого миелоцитарного лейкоза человеческого происхождения (THP-1) и клетки карциномы ободочной кишки мыши (CT-26) высевали в 96-луночные планшеты (Costar) при плотности 1×10⁴ клеток/мл в RPMI 1640 (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Клетки поддерживали в течение 24 часов при 37°C и 5% CO₂. После этого времени ЛПС (40 мкг/мл) или TNF-α (20 нг/мл) добавляли в течение 30 мин. На фиг.8 представлены значения IC₅₀ для клеточных линий THP-1 и CT-26 в присутствии или отсутствие указанного выше стимула. Результаты показывают, что пептид L552 ингибирует клеточную пролиферацию в клеточных линиях злокачественных опухолей THP-1 и CT-26, в присутствии другого воспалительного стимула. Этот результат показывает, что пептид L552 эффективен при блокировании пролиферации клеток злокачественной опухоли, которые подвергали различным воспалительным агентам.

Пример 9. Иллюстрирует противоопухолевый эффект пептида L552 в модели злокачественной опухоли ободочной кишки на мышах BALB/c, которых подвергали воспалительному стимулу посредством инъекции ЛПС

В этих анализах использовали самок мышей BALB/c в возрасте между 8 и 10 неделями (n=10 животных на экспериментальную группу). Для имплантации опухоли в этой модели использовали клетки CT-26, выделенные из карциномы ободочной кишки у BALB/с. Клетки числом 7×10⁴, суспендированные в 200 мкл PBS 1×, инокулировали мышам подкожно внутриподмышечно. После 11 суток животные получали инъекцию 10 мкг ЛПС/мышь (серотип 055: B5, Sigma) в PBS, интраперитонеально введенную. Как только опухоли достигали объема 100 мм³, одна группа получала 5 доз пептида L552 (0,2 мг/кг массы) каждые вторые сутки, одна группа получала 5-FU дозами 20 мг/кг. Интересующими параметрами, которые оценивали в этом эксперименте, были выживаемость животных и увеличенный объем опухолевой массы.

Результаты, представленные на фиг.9, показывают эффективность пептида L552 в модели злокачественной опухоли ободочной кишки, в которую добавляли воспалительную стадию посредством инъекции ЛПС. (A) Результаты демонстрируют, что пептид L552 более эффективен в увеличении выживаемости (*p<0,05) животных по сравнению с группой, которую лечили 5-FU, когда добавляют ЛПС. Статистический анализ осуществляли посредством логарифмического рангового способа, чтобы определить значимые различия между группами. (B) Пептид L552 более эффективен с точки зрения способности ингибировать развитие опухоли. Результаты, представленные в этом примере, показывают, что пептид L552 эффективен в лечении злокачественной опухоли, ассоциированной с воспалением.

Пример 10. Иллюстрирует синергический эффект комбинации пептида L552 и стандартной химиотерапии

Для этого анализа опухолевые клетки HT-29 и H-125 высевали в 96-луночные планшеты (Costar) при плотности 1×10⁴ клеток мл в RPMI 1640 (Gibco) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco). После 24 часов пептид добавляли в среду для культивирования в диапазоне доз между 9 мкМ и 300 мкМ и цитостатическое лекарственное средство добавляли в диапазоне серийного разведения доз 1:10 выше и ниже сообщавшейся IC₅₀ для каждой клеточной линии. Инкубацию осуществляли в течение 48 часов в присутствии 5% CO₂ и выявляли с использованием MTT. Эффект сопутствующего лечения цитостатик-пептид анализировали с помощью компьютерного программного обеспечения CalcuSyn, чтобы изучать комбинации лекарственных средств (Ting-Chao Chou, 2006, Pharmacologic Reviews, 58: 621-681). Данные, представленные в таблице 2, показывают, что комбинация пептид-цитостатик может снижать количество цитостатика, задаваемое значениями, данными в показателе коэффициента снижения лекарственного средства (RI). Эти результаты показывают, что пептид можно вводить в сочетании со стандартной химиотерапией для того, чтобы предоставить эффективное лечение (фракция пораженных клеток 89-94%) при использовании меньшего количества стандартного лекарственного средства. Комбинация 5-FU+пептид L552 позволяет в 20 раз снизить (RI) цитостатик в клеточной линии HT-29. Для комбинации цисплатин+пептид L552 снижение цитостатика составляет 5 раз в клеточной линии H-125. Эти результаты показывают, что пептид можно вводить в комбинации со стандартным лечением злокачественной опухоли легких и злокачественной опухоли ободочной кишки, облегчая снижение дозы цитостатика. Это может снизать неблагоприятные эффекты, связанные с химиотерапией.

Таблица 2
Синергизм комбинированного лечения пептидом L552 и цитостатиками 5-FU и цисплатин для двух линий
опухолевых клеток человека Клеточная линия Af (пораженная фракция) CI Лекарст-
венное средство
5-FU (мкМ) Лекарст-
венное
средство
L552(мкМ) RI
(5-FU) RI
(L552) HT-29 89% 0,3 5000 700 20 5   Af (пораженная фракция) CI Лекарст-венное средство цисплатин (мкМ) Лекарст-
венное
средство
L552(мкМ) RI
(циспла-
тин) RI
(L552) H-125 94% 0,5 273 308 5 3

CI<1 обозначает синергизм, CI=1 обозначает аддитивность, CI>1 обозначает антагонизм. Это также показывает коэффициент снижения (RI) лекарственного средства в комбинации.

Представленные изобретения относятся к области биомедицины и касаются пептида со способностью связывать домен СОММ, его применения для получения композиций. Охарактеризованный пептид состоит из аминокислотной последовательности HARIKpTFRRIKWKYKGKFW, где N-конец защищен ацетилированием, и D-аминокислоты присутствуют в положениях пролин-6 и лейцин-11. Представленная группа изобретений позволяет лечить злокачественные опухоли посредством увеличения ядерной локализации белка COMMD1, которое ассоциировано со снижением или блокированием пролиферации клеток злокачественной опухоли. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 10 пр.

1. Пептид со способностью связывать домен СОММ, характеризующийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID №3, где N-конец защищен ацетилированием, и D-аминокислоты присутствуют в положениях пролин-6 и лейцин-11.

2. Применение пептида по п. 1 для увеличения ядерной локализации белка COMMD1 в клетке злокачественной опухоли.

3. Применение по п. 2, характеризующееся тем, что опухоль ассоциирована с воспалением и метастазом.

4. Применение по п. 3, где опухоль, ассоциированная с воспалением и метастазом, расположена в ободочной кишке, прямой кишке, пищеводе, легких, предстательной железе, груди, поджелудочной железе или печени.

5. Фармацевтическая композиция для терапии злокачественной опухоли, которая содержит эффективное количество пептида по п. 1.

6. Композиция по п. 5, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты или носители.

7. Фармацевтическая комбинация для лечения злокачественной опухоли, содержащая SEQ ID №3 в сочетании по меньшей мере с одним лекарственным средством, выбранным из цисплатина и 5-FU.