СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННОГО РОДСТВА ГЕМАДСОРБИРУЮЩИХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/569 A61K39/12 A61K39/187 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии в частности к тестированию вирусных антигенов, и может быть использовано при разработке и применении средств специфической профилактики африканской чумы свиней.

Известна реакция задержки гемадсорбции (РЗГА), которая предназначена для определения типовой принадлежности гемадсорбирующих штаммов вируса африканской чумы свиней. Реакция основана на способности специфических сывороток задерживать образование гемадсорбции в культурах клеток костного мозга свиней и лейкоцитов свиней, зараженных гомологичным типом вируса африканской чумы свиней. РЗГА ставят со стандартными специфическими сыворотками 1, 2, 3, 4 серотипов, полученных на соответствующие эталонные штаммы вируса африканской чумы свиней ("Лиссабон-57" - 1 тип, "Конго-73" - 2 тип, "Мозамбик-78" - 2 тип, "Португалия-60" - 4 тип). Материал эталонных штаммов и типируемых изолятов вируса используется с активностью 10^4.0 - 10^6.0 50%-гемадсорбирующих единиц в мл (ГАЕ₅₀/мл), а типоспецифические сыворотки - с активностью не менее 1:50. Зараженные и контрольные 2-3 суточные культуры клеток в чашках Карреля объемом 10 мл инкубируют при 37^oC. Учет результатов реакции проводят ежедневно в течение 2 суток при отсутствии неспецифической дегенерации в контроле культур клеток и сывороток, наличии гемадсорбции в контроле эталонного вируса и задержке ее со стандартными гомологичными сыворотками (Вишняков И. Ф., Митин Н.И., Курносов А.Н., Колосов В.М., Карпов Г.М., Федорищев И.В., Бурлаков В.А. Диагностика вируса африканской чумы свиней. I. Реакция гемадсорбции и задержки гемадсорбции при АЧП. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологической и эпизоотологии. - Покров, 1992, ч.1, с.57-62).

Однако серотипирование в реакции задержки гемадсорбции проводят по качественному показателю, а именно задерживает ли данная антисыворотка гемадсорбцию, вызванную вирусом исследуемого изолята, или нет. О степени антигенного родства изолятов вируса, выраженной в количественных показателях, эта реакция информации не несет.

Целью настоящего изобретения является получение количественных параметров, характеризующих антигенное родство гемадсорбирующих изолятов вируса африканской чумы свиней.

Настоящий способ основан на определении радиоактивности сорбированных на твердой фазе (зерна протеин A-сефарозы CL-4B) иммунных комплексов, полученных при взаимодействии антигена, меченого ³H-глюкозамином, мажорного, изолятоспецифического, вирусоиндуцированного гликопротеина с молекулярной массой 110-140 килодальтон, а антителами из активных в РЗГА гипериммунных сывороток свиней.

Антигенсодержащий материал готовят из снятых через 14 - 18 ч после заражения с множественностью 10-50 ГАЕ₅₀/клетка адгезивных (А)-клеток костного мозга свиней. Именно указанные значения множественности обеспечивают синхронное заражение клеток и, соответственно, синхронный синтез вирусспецифических белков, что позволяет снимать еще нелизированные вирусом А-клетки с максимальным содержанием на их плазматической мембране изолятоспецифического гликопротеина.

Использование А-клеток является существенным отличительным признаком, поскольку, во-первых, из всех типов клеток, входящих в состав костного мозга свиней, только в них репродуцируется вирус африканской чумы свиней, во-вторых, основываясь на их способности к прочной адгезии на стекле, удается легко и быстро отделять непермиссивные для вируса клетки, составляющие 90-94% из числа клеток костного мозга свиней. Это позволяет при требуемом соотношении концентрации детергент/белок солюбилизировать белки в объеме в 10 раз меньшем, чем если бы в качестве исходного материала использовали пул клеток костного мозга свиней и, в конечном счете, добиться высокой удельной активности антигенсодержащего материала.

Существенным отличительным признаком предлагаемого способа является использование для маркирования изолятоспецифического гликопротеина ³H-гликозамина гидрохлорида. Это позволяет получать объективные количественные показатели реакции антиген-антитело по радиоактивности антигена. Кроме того, поскольку олигосахаридные цепи составляют около 50% массы изолятоспецифического гликопротеина, то он эффективнее других гликопротеинов маркируется указанным радионуклидом. ³H-глюкозамина гидрохлорид используют в концентрации 5-20 мкКю/мл, внося его в дефицитную по глюкозе среду культивирования.

Использование солюбилизирующего раствора, состоящего из низкомолекулярного (0,01 - 0,03 М ) буфера трис-HCl с pH 7.2-7.4, 1% неионного детергента тритона X-100 и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, обеспечивает за 40-60 минут при комнатной температуре перевод в растворимое состояние мембранных белков, к каковым относится изолятоспецифический гликопротеин вируса африканской чумы свиней. (10-15)•10⁶ А-клеток (содержимое одного клинского матраса с общим объемом 1,7 л) солюбилизируют в 2-4 мл раствора, что позволяет достигать достаточной для анализа концентрации изолятоспецифического гликопротеина. В совокупности с требуемым объемом сыворотки (70-80 мкл на 1 мл солюбилизированных белков) указанные количественные параметры реагентов обеспечивают достижение положительного результата.

Отличительным признаком предлагаемого способа является то, что в качестве антигена в реакции используют хроматографический очищенный изолятоспецифический гликопротеин с молекулярной массой 110-140 килодальтон. Ионообменную хроматографию проводят на уравновешенной солюбилизирующим раствором диэтиламиноэтилцеллюлозе (ДЭАЭ-целлюлозе) с использованием в качестве элюента 0.125 М хлористого натрия в солюбилизирующем растворе. Использование именно указанной концентрации NaCl позволяет получать элюат, содержащий изолятоспецифический гликопротеин, свободный от примеси вирусспецифических гликопротеинов с молекулярными массами 50-80 килодальтон, которые не обладают свойствами изолятоспецифичности.

Существенным отличием в постановке реакции является то, что реактивномеченный антиген взаимодействует с антителами, которые предварительно сорбируют из сывороток интактных или гипериммунизированных свиней на протеин А-сефарозе CL-4B в условиях избытка антител (70-80 мкл сыворотки в 100 мкл зерен протеин А-сефарозы CL-4B), что позволяет впоследствии избежать неспецифической сорбции не только белков вируса, но и гликозилированных клеточных компонентов.

Существенным отличием является то, что результат реакции учитывают по радиоактивности, измеряемой на бета-счетчике в импульсах за минуту. Находят средние значения радиоактивности параллельных проб, полученных в результате взаимодействия антигена с сорбентами, нагруженными антителами сывороток от интактных или гипериммунизированных свиней. Затем рассчитывают показатель специфичности связывания антигена в гетерологичных реакциях по следующей формуле:
(A-N)•100/(B-N)=P(%),
где
P - показатель специфичности связывания в гетерологичных реакциях,
A - средняя радиоактивность за минуту в пробе с гетерологичными вирусспецифическими антигеном и сывороткой, имп./мин.;
B - средняя радиоактивность за минуту в пробе с гомологичными вирусспецифическим антигеном и сывороткой, мин./мин.;
N - средняя радиоактивность за минуту в пробе в вирусспецифическим антигеном и сывороткой от интактной свиньи, имп./мин.

Пример. Антиген получали из лизата клеток костного мозга свиней, инфицированных относящимся по РЗГА к 3 серотипу изолятом Мозамбик-78 вируса африканской чумы свиней с множественностью заражения 10 ГАЕ₅₀/клетка. Для этого из 2 матрасов с 3-х суточной культурой костного мозга свиней половину культуральной среды (100 мл) заменяли вируссодержащей жидкостью с инфекционностью 10^6.0 ГАЕ₅₀/мл и инкубировали в течение 3-х часов при 37^oC для адсорбции вируса. Затем вирусосодердащую культуральную среду сливали, монослои промывали 50 мл стерильного забуференного (pH 7.2 - 7.4) физиологического раствора и заливали в каждый матрас по 200 мл дефицитной по глюкозе среды Игла на ГЛА, содержащей 5 мкКю/мл ³H-глюкозамина гидрохлорида и 10% свиной сыворотки. Для контроля результата заражения в одни матрас вносили неприкрепившиеся клетки костного мозга свиньи. Через 14-16 часов инкубировали, при появлении гемадсорбции в контрольном матрасе, радиомаркированные зараженные А-клетки снимали с монослоя метелкой, осаждали центрифугированием при 2-3 тыс. g в течение 15 минут и замораживали при минус 70^oC. После размораживания осадок из (10-15)•10⁶ клеток ресуспендировали в 4 мл солюбилизирующего раствора (0.02 М трис-HCl буфера, pH 7.2-7.4, 1% тритона X-100 и мМ фенилметилсульфонилфторида), и инкубировали 40 минут при 37^oC. Затем центрифугировали при 22000 g в течение 1 часа. Полученный надосадок очищали хроматографией на колонке с 10 мл ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешенной солюбилизирующим раствором без фенилметилсульфонилфторида. Элюирование производили 8-12 мл раствора, состоящего из 0.02 М трис-HCl буфера, pH 7.2-7.4, 1% тритона X-100 и 0.125 М хлористого натрия. Элюат использовали в реакции в качестве антигена.

Одновременно к равным объемам (по 100 мкл) уравновешенной элюирующим раствором протеин А-сефарозы CL-4B добавляли по 70 мкл сыворотки (по 4 параллельные пробы с сыворотками от интактных и гипериммунизированных рефлекс-штаммами 1, 2, 3, 4 типов вируса африканской чумы свиней) и оставляли на 2 часа при комнатной температуре, периодически перемешивая. Сорбент отмывали от несвязавшихся белков 5-6 раз тем же раствором, осаждая зерна сорбента центрифугированием при 3000 g 2 - 3 минуты. Затем ко всем пробам сорбентов добавляли по 0.5 мл препарата антигена и оставляли на ночь при постоянном перемешивании при 4^oC. После отмывки проб 6 раз, как описано выше, вносили в каждую пробу по 150 мкл 0.01 М трис-HCl буфера pH 6.8, содержащего 2,3% додецилсульфата натрия, 5% 2-бета-меркаптоэтанола, 10% глицерина. Затем пробы прогревали в течение 5 минут на водяной бане при 100^oC. Для анализа на бета-счетчике отбирали по 100 мкл раствора без зерен сорбента. Затем рассчитывали показатели специфичности связывания по формуле.

Данные сведены в таблицу.

Как следует из данных, радиоактивность проб антигена из относящегося к 3 серотипу по РЗГА изоляту Мозамбик-78 с сывороткой, полученной на этот изолят была максимальной. Показатели специфичности связывания с антителами сывороток, полученных на изоляты других серотипов находятся в пределах от 17,4 до 29,2;.

Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с существующими методами следующие преимущества:
- повышение точности измерения степени антигенного родства за счет перехода от качественных к количественным параметрам;
- сокращение расхода гипериммунных сывороток.

Ожидаемый эффект состоит в возможности получить данные об антигенном родстве имеющихся аттенуированных штаммов с вирулентными изолятами вируса АЧС с целью использования первых для временной защиты свиней от гибели.

Изобретение может быть использовано в ветеринарной вирусологии при разработке средств специфической профилактики при африканской чуме свиней. Для этого проводят иммунологическую реакцию радиоактивномеченного очищенного изолятоспецифического антигена (ГП) с м.м. 110-140 кД с сорбированными на твердой фазе (протеин А-сефароза CL-4В) антителами из вирусспецифических сывороток свиней. На бета-счетчике определяют удельную радиоактивность элюированных с сорбента продуктов реакции. Рассчитывают антигенное родство по формуле. При этом в качестве метаболического маркера ГП используют ³Н-глюкозамина гидрохлорид. Вносят его в зараженную вирусом культуру клеток костного мозга свиней в дозе 5-20 мкКю/мл. ГП получают солюбилизацией 1 %-ным тритоном Х-100 в 0.02 М трис-НС1 буфере, рН 7,2 - 7,4 инфицированных клеток. Далее очищают ультрацентрифугированием при 22000 g в течение 1 ч и ионнообменной хроматографией на ДЕАE - целлюлозе с элюированием сорбированных белков 0,125 М NаСl на солюбилизирующем буфере. Изобретение позволяет определить количественные параметры, характеризующие антигенное родство гемадсорбирующих изолятов вируса африканской чумы свиней. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ определения антигенного родства гемадсорбирующих изолятов вируса африканской чумы свиней, включающий заражение исследуемым вирусом культуры клеток костного мозга свиней и использование для проведения тест-реакции специфичных к референс-штаммам гипериммунных сывороток крови свиней, отличающийся тем, что зараженные клетки метаболически маркируют ³H-глюкозамином, выделяют из адгезивных клеток изолятоспецифический гликопротеин и проводят тест-реакцию между ним и сорбированными на протеин-А сефарозе 4В антителами из используемых сывороток, на бета-счетчике определяют удельную радиоактивность элюированных с сорбентов продуктов реакции и рассчитывают антигенное родство по формуле, принимая значение радиоактивности гомологичной реакции за 100% специфичности связывания. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуру клеток костного мозга свиней заражают исследуемым изолятом вируса с множественностью 10-100 ГА гемадсорбирующих единиц/клетка и инкубируют с ³H-глюкозамином в концентрации 5 - 20 мкКю/мл в течение 14 - 18 ч при 37^oС, выделяют изолятоспецифический гликопротеин из солюбилизированных 1% тритоном Х-100 в 0,002 М трис-НС1 буфере с pH 7,2 - 7,4 белков инфицированных клеток путем центрифугирования при 22 000 g в течение 1 часа и ионообменной хроматографии содержимого надосадка на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюированием сорбированных белков 0,125 М NaCl на солюбилизирующем буфере.