МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, С КОТОРЫМИ СВЯЗАН МОТИВ, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ОСТАТОК ЦИСТЕИНА, КОНЪЮГАТЫ ЭТИХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ С ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C07K16/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к модифицированным антителам, содержащим мотив, включающий остаток цистеина (Cys), связанный с исходным антителом, предпочтительно на конце его молекулы, более предпочтительно на конце тяжелой или легкой цепи исходного антитела, наиболее предпочтительно - на С-конце тяжелой или легкой цепи исходного антитела; к конъюгатам этих модифицированных антител с лекарственными веществами (mADC), включающим лекарственное вещество, предназначенное для диагностики или лечения и связанное с модифицированным антителом; и к способу получения этих модифицированных антител или их конъюгатов с лекарственными веществами.

Конъюгат модифицированного антитела с лекарственным веществом по данному изобретению может точно доставить это вещество к клетке-мишени благодаря высокой антигенной специфичности исходного антитела, включенного в конъюгат, и таким образом усиливается терапевтический эффект данного лекарственного вещества. Также это может увеличить полезность лекарства, что в особенности касается противораковых препаратов с высокой активностью, применение которых ограничено их токсичностью.

Также данное изобретение относится к композициям, включающим конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, для лечения заболеваний, в частности раковых заболеваний, и к способу лечения заболеваний с использованием конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами.

Конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению могут содержать некоторое число остатков цистеина, которые служат для образования конъюгата антитела с лекарственным веществом, поскольку мотив, содержащий один или более остатков цистеина, связан с исходным антителом. Таким образом, конъюгат по данному изобретению может содержать большое количество молекул связанного лекарственного вещества, и это количество лекарства может быть эффективно доставлено клетке-мишени или ткани, подлежащей лекарственному воздействию. Кроме того, число остатков цистеина, связывающихся с исходным антителом, легко контролировать, и, соответственно, легко контролировать количество лекарственного вещества, содержащегося в конъюгате с модифицированным антителом, доводя его до желаемого уровня.

Также, поскольку в силу своей высокой антигенной специфичности конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению способны точно доставлять лекарство к клетке-мишени, они могут усилить терапевтический эффект данного лекарства и увеличить полезность лекарственных препаратов, в частности противораковых, применение которых ограничено из-за их токсичности несмотря на противораковую эффективность.

Уровень техники

Среди биологических лекарственных (биофармацевтических) препаратов наиболее активно изучаются терапевтические агенты, в которых используются антитела, специфично связывающиеся со своими мишенями (то есть антигенами), экспрессирующимися при определенных заболеваниях. В частности, интенсивно идет идентификация антигенов, ассоциированных с опухолями и экспрессирующихся на поверхности раковых клеток, и широко применяются способы диагностирования и лечения опухолей с использованием антител (то есть противораковых антител), связывающихся с такими антигенами, для подавления клеточного роста или индукции гибели клеток; область разработки этих методов имеет очень хорошие перспективы.

Такие противораковые антитела обладают очень высокой специфичностью к мишени, но их цитотоксическое воздействие на раковые клетки обычно слабее, чем у существующих цитотоксических лекарств (то есть противораковых лекарственных препаратов или агентов). Поэтому во многих случаях эти противораковые антитела служат в комбинированной терапии с цитотоксическими агентами или иными лекарственными веществами, подавляющими пролиферацию клеток.

Что касается упомянутой выше комбинированной терапии, то весьма активно изучаются конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами (mADC), обеспечивающих усиление терапевтического эффекта связанного цитотоксического агента при снижении его токсичности. Считается, что при использовании конъюгата модифицированного антитела с лекарственным веществом системная токсичность этого вещества снижается, а его цитотоксичность в отношении определенных клеток (в частности, раковых клеток), в которых усилена экспрессия мишени, может увеличиться, и таким образом усиливается терапевтический эффект данного лекарственного вещества.

Так, для лечения неходжкинской лимфомы или острого миелоидного лейкоза успешно разработаны конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, включающие цитотоксический агент или радиоактивный изотоп, связанный с антителом, например ZEVALIN™ [Witzig et al., J. Clin. Oncol, 2002, 20(15): 3262-3269]) или MYLOTARG™ [Drags of the Future, 2000, 25(7): 686]). Предпринимались также попытки получить конъюгаты антител с высокотоксичным мертанзином (например, кантузумаб-мертанзин (Immunogen, Inc. [Xie et al., J. of Pharm. and Exp. Ther. 2004, 308 (3): 1073-1082]) или трастузумаб-мертанзин (Roche [Isakoff et al., J. Clin. Oncol. 2011, 9(4): 351-4])) или с другими цитотоксическими лекарственными веществами, например производными доластатина (например, пептиды ауристатин, ауристатин Ε (АЕ), монометилауристатин (метил-валин-валин-долаизолейцин-долапроин-норэфедрин, обозначаемый ММАЕ, или метал-валин-валин-долаизолейцин-долапроин-фенилаланин, обозначаемый MMAF); при этом брали такие антитела, как cBR96 (специфичные к карциномному антигену Lewis Y); cAClO, специфичные к белку CD30, свойственному злокачественным заболеваниям крови; антитела, специфичные к опухолевому маркеру CD20, для лечения раковых заболеваний, при которых наблюдается экспрессия этого белка; моноклональные антитела Rituxan для лечения иммунных расстройств; антитела против рецептора эфрина EphB2R для лечения колоректального рака; антитела 2Н9, антитела против интерлейкина-8; антитела против селектина Ε ([Klussman, et al., Bioconjugate Chemistry, 2004, 15(4): 765-773]; [Doronina et al., Nature Biotechnology, 2003, 21(7): 778-784]; [Francisco et al., Blood, 2003, 102(4): 1458-1465]) US 2004/0018194 A1) WO 04/032828 A3; [Mao et al., Cancer Research, 2004, 64(3): 781-788]; [Bhaskar et al., Cancer Res, 2003, 63: 6387-6394]).

Предпринимались также попытки разработать конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, используя дауномицин, доксорубицин, метотрексат или виндезин. Известно, что в таких конъюгатах можно использовать бактериальные токсины (например, дифтерийный), растительные токсины (например, рицин) или некоторые низкомолекулярные соединения (например гелданамицин) ([Mandler et al., J. of the Nat. Cancer Inst, 2000, 92 (19): 1573-1581]; [Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, 2000, 10: 1025-1028]; [Mandler et al., Bioconjugate Chem, 2002, 13: 786-791]), майтанзиноид ([ЕР 1391213 A1]; [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 8618-8623]) или калихеамицин ([Lode et al., Cancer Res, 1998, 58: 2928]; [Hinman et al., Cancer Res, 1993, 53: 3336-3342]). Эти цитотоксические агенты обладают способностью убивать клетки и подавлять их пролиферацию посредством таких механизмов, как связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.

Когда для получения описанных выше конъюгатов антител с лекарственными веществами применяют обычные методы создания ковалентных связей между компонентами конъюгата, молекулы лекарственного вещества оказываются связанными с несколькими сайтами молекулы антитела, так что получается гетерогенная смесь. Например, цитотоксический агент может связываться с антителом через остатки лизина в его полипептидной цепи, в результате чего образуется гетерогенная смесь конъюгатов этого агента с молекулами антитела. В такой гетерогенной смеси могут быть конъюгаты, содержащие различное число связанных молекул лекарственного агента - от 0 до 8 в зависимости от условий реакции - и распределение их тоже может быть разным, то есть число молекул связанного лекарственного вещества на единицу антитела варьирует.

Для конъюгатов с определенным числом связанных молекул лекарственного вещества существует иной источник гетерогеннности - различные сайты конъюгирования. Для производства лекарств в больших масштабах гомогенизирующая очистка гетерогенной смеси не подходит ([Hamblett et al., Clin. Cancer Res, 2003, 10, 7063-7070], [Wang et al., Protein Sci. 2005, 14, 2436-2446]).

Другой метод конъюгирования лекарственных веществ с антителами состоит в восстановлении дисульфидных связей между остатками цистеина в молекуле антитела при помощи восстанавливающих агентов с последующим присоединением лекарственного агента к образовавшимся тиоловым группам восстановленных остатков цистеина. Этот метод тоже имеет свои недостатки, а именно: во-первых, из-за реакции восстановления антитело может утратить какие-либо присущие ему свойства, а во-вторых, образуется весьма гетерогенная смесь. Конкретные примеры: иммуноглобулин M - пентамер за счет дисульфидных связей, а в иммуноглобулине G - внутренние дисульфидные связи. В таких белках восстановление дисульфидных связей при помощи реагентов типа дитиотреитола (DTT) или селенола создает реакционноспособные тиоловые группы ([Singh et al., Anal. Biochem. 2002, 304: 147-156]). Это может привести к изменению исходной третичной структуры и потере связанной с ней специфичности связывания антигена ([Jagath et al., Nature Biotechnology, 2008, 26(8): 925-32]).

Типичным недостатком обычных методов конъюгирования антител с лекарственными веществами, описанных выше, является то, что трудно точно контролировать сайты конъюгирования с лекарственным веществом в молекуле антитела и число связанных молекул лекарственного вещества. В попытке преодолеть эти недостатки для создания свободных тиоловых групп определенные аминокислотные остатки заменяли на остатки цистеина там, где такая замена не нарушала функционирование антитела. С этой целью для молекулы антитела была предсказана вероятная реакционноспособность тиоловых групп в каждом сайте возможных мутаций, после чего был разработан способ скрининга для выявления оптимальных мутантов. (Korean Patent Laid-Open Publication No. 2007-0054682, ′ThioFab technology′). Полученный таким путем конъюгат антитела (трастузумаба) с лекарственным веществом (мертанзином) проходит в настоящее время испытания применительно к лечению метастазирующего рака молочной железы. ([Bums III et al., J. Clin. Oncol, 2011, 29(4): 398-405]). Описанный выше метод, обозначенный ThioFab, обладает тем преимуществом, что нарушение дисульфидных связей в молекул исходного антитела можно свести к минимуму путем введения в молекулу антитела новых остатков цистеина, однако опасение относительно изменения структуры и функционирования исходных антител из-за замены некоторых аминокислотных остатков в молекуле исходного антитела на цистеин остается.

Следовательно, настоятельно необходимо разработать новые конъюгаты антител с лекарственными веществами и способ их получения, которые бы позволяли точно контролировать число и положение связанных молекул лекарственного вещества, конъюгированного с исходным антителом так, чтобы структурные и функциональные свойства исходного антитела не изменялись.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения - решить существовавшие в данной области техники проблемы, описанные выше, и предложить новые антитела (далее называемые модифицированными антителами), которые содержат мотив, включающий один или более остатков цистеина, связанных с молекулой исходного антитела, для создания множества сайтиов связывания лекарственного вещества. Также цель данного изобретения состоит в том, чтобы предложить конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, содержащие лекарственный агент, связанный с модифицированным антителом.

Модифицированные антитела по данному изобретению способны эффективно связываться с различными лекарственными агентами, причем свойства исходного антитела сохраняются, и таким образом достигается высокая специфичность в отношении мишени и увеличивается терапевтический эффект содержащегося в конъюгате лекарственного вещества.

Преимущество модифицированных антител по данному изобретению состоит в том, что они содержат мотив, включающий один или более остатков цистеина, и таким образом лекарственное вещество, связавшись с этими остатками цистеина, в составе конъюгата будет прицельно доставлено к ткани-мишени. Кроме того, можно точно контролировать число остатков цистеина, с которыми может связаться лекарственное вещество, и тем самым контролировать число или количество молекул лекарственного агента в конъюгате с модифицированным антителом. Соответственно, конъюгаты модифицированных антител с лекарственным веществом по данному изобретению можно использовать как отличную систему прицельной доставки лекарств в организме, в которой преодолеваются недостатки обычных конъюгатов антител с лекарственными веществами и которую можно эффективно применять для лечения заболеваний, например рака.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 изображает схему экспрессионного вектора для модифицированного антитела, представляющего собой трастузумаб, содержащий цистеин

Фиг. 2 представляет результаты вестерн-блоттинга после очистки трастузумаба (две правых дорожки) и варианта трастузумаба, содержащего цистеин (HR-Cys, две левых дорожки).

Фиг. 3 представляет результаты абсорбционной спектрофотометрии в видимом и ультрафиолетовом диапазоне (UV-VIS) (3А) и электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) (3В), подтверждающие образование конъюгата доксорубицина с HR-Cys.

Фиг. 4 представляет результаты электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) (4А) и определения относительной интенсивности флуоресценции (4В) красителя Alexa488, связавшегося с тяжелыми и легкими цепями, для Her-M2(Cys)-Alexa488, являющегося конъюгатом варианта антитела Her-M2(Cys) и AlexaFluor® 488.

Фиг. 5 представляет результаты определения при помощи реагента MTS [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия] подавляющего действия на клеточный рост конъюгата HR-Cys-DOX, герцептина, смеси (1:2) герцептина с доксорубицином и доксорубицина в клетках ВТ-474, в которых экспрессируется антиген HER2.

Фиг. 6 представляет результаты определения подавляющего действия на клеточный рост конъюгата модифицированного герцептина с монометилауристатином (HER-M(Cys)-ММАЕ) в клетках SK-BR3, в которых экспрессируется антиген HER2, по сравнению с герцептином.

Фиг. 7 представляет результаты определения каспазной активности, отражающей апоптоз, в клетках SK-BR3, в которых экспрессируется антиген HER2, под действием различных концентраций HR-Cys2-MMAE в сравнении с герцептином.

Фиг. 8 представляет результаты определения каспазной активности, отражающей вызываемый монометилауристатином (ММАЕ) апоптоз, в клетках SK-BR3, в которых экспрессируется антиген HER2, под действием различных концентраций конъюгата варианта герцептина с монометилауристатином в сравнении с герцептином.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение описывается подробнее.

Настоящим изобретением предлагаются новые модифицированные антитела, которые содержат мотив, включающий один или более остатков цистеина, связанный с молекулой исходного антитела, для создания множества сайтов связывания антитела с лекарственным агентом, причем иммуноконъюгат лекарственного агента содержит такое модифицированное антитело. Модифицированные антитела по данному изобретению могут образовывать конъюгаты с различными лекарственными веществами, сохраняя свойства исходных антител, и, таким образом, их можно эффективно использовать в иммуноконъюгатах.

В настоящем документе термин «исходное антитело» означает обычное антитело - без мотива, содержащего цистеин. По данному изобретению можно без ограничения использовать любые исходные антитела, обладающие сродством связывания и специфичностью в отношении определенного антигена. Примеры исходных антител, которые можно использовать по данному изобретению, включают моноклональные или поликлональные антитела, например происходящие из животных (например, мышей), гибридные антитела, гуманизированные антитела и человеческие антитела, полученные с использованием трансгенных мышей или методом фагового дисплея. Для специалиста в данной области техники должно быть ясно, что по настоящему изобретению в качестве модифицированных антител можно использовать также биспецифичные антитела или фрагменты антител.

В настоящем документе термин «фрагмент антитела» относится к фрагментам, сохраняющим по меньшей мере сродство связывания в отношении антигена. Примеры фрагментов антител включают одноцепочечные антитела (scAb), диантитела, триантитела, тетраантитела, фрагменты Fab, F(ab′)₂, Fd, scFv, доменные антитела, миниантитела, производные константных областей антител и искусственные антител на основе белковых каркасов.

Кроме того, примеры исходных антител, которые можно использовать по данному изобретению, включают все типы иммуноглобулинов (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) и их подтипы (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Также исходные антитела могут происходить из любого вида живых организмов.

Исходные антитела по данному изобретению обладают сродством связывания и специфичностью к антигенам, характерным для раковых заболеваний, например к антигенам, ассоциированным с опухолями (ТАА), рецепторным белкам клеточной поверхности, нерецепторным белкам и другим молекулам клеточной поверхности, трансмембранным белкам, сигнальным белкам, регуляторам выживания клеток, регуляторам пролиферации клеток, веществам, ассоциированным с (то есть установлено или предполагается функциональное участие) развитием или дифференцировкой тканей, лимфокинам, цитокинам, веществам, участвующим в регуляции клеточного цикла, веществам, участвующим в васкулогенезе, и веществам, ассоциированным (то есть установлено или предполагается функциональное участие) с ангиогенезом.

Конкретные антигены, с которыми могут связываться исходные антитела, по данному изобретению следующие (не ограничиваясь перечисленным здесь):

(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенетического белка типа IB; Genbank регистрационный номер NM_001203);

(2) Е16 (LATI, SLC7A5; Genbank регистрационный номер NM_003486);

(3) STEAP1 (шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы; Genbank регистрационный номер NM_012449);

(4) 0772Р (СА125, MUC16; Genbank регистрационный номер AF361486);

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, мегакариоцитарный потенцирующий фактор, мезотелин; Genbank регистрационный номер NM_005823);

(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, член 2 семейства 34 переносчиков растворенных веществ (фосфата натрия), натрий-зависимый переносчик фосфата 3b типа II; Genbank регистрационный номер NM_006424);

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Семафорин 5b Hlog, sema-домен, семь тромбоспондиновых повторов (тип 1 и подобные типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5В; Genbank регистрационный номер АВ040878);

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN кДНК 2700050C12; Genbank регистрационный номер AY358628);

(9) ETBR (рецептор эндотелина типа В; Genbank регистрационный номер AY275463);

(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315; Genbank регистрационный номер NM_017763);

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ген, ассоциированный с раком предстательной железы, 1, белок, ассоциированный с раком предстательной железы, 1, шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы 2, шестой трансмембранный белок предстательной железы; Genbank регистрационный номер AF455138);

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, рецептор катионного канала с транзиторным потенциалом, подсемейство М, член 4; Genbank регистрационный номер NM_017636);

(13) CRIPTO (GR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, тератокарциномный фактор роста; Genbank регистрационный номер NP 003203 или NM_003212);

(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (рецептор компонента комплемента C3d и вируса Эпштейна-Барр) или Hs.73792 Genbank регистрационный номер М26004);

(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (ассоциированный с Ig-бета), В29; Genbank регистрационный номер NM_000626);

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (фосфатазный жорный белок, содержащий домен SH2, 1a), SPAP1B, SPAP1C; Genbank регистрационный номер NM_030764);

(17) HER2 (Genbank регистрационный номер M11730);

(18) NCA (Genbank регистрационный номер M18728);

(19) MDP (Genbank регистрационный номер ВСО17023);

(20) IL20Rα (Genbank регистрационный номер AF184971);

(21) Бревикан (Genbank регистрационный номер AF229053);

(22) EphB2R (Genbank регистрационный номер NM 004442);

(23) ASLG659 (Genbank регистрационный номер АХ092328);

(24) PSCA (Genbank регистрационный номер AJ297436);

(25) GEDA (Genbank регистрационный номер AY260763);

(26) BAFF-R (рецептор фактора активации В-клеток, BLyS-рецептор, BR3, NP_443177.1);

(27) CD22 (В-клеточный рецептор CD22-B изоформа; NP_001762.1);

(28) CD79a (CD79A, CD79α, ассоциированный с Ig-альфа специфичный для В-клеток белок, который ковалентно взаимодействует с Ig-бета (CD79B) и образует комплекс на поверхности с молекулами IgM, передает сигнал, участвующий в дифференцировке В-клеток; Genbank регистрационный номер NP_001774.1);

(29) CXCR5 (рецептор 1 лимфомы Беркитта, рецептор, сопряженный с G белком, то есть активируемый хемокином CXCL13, действует при миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет роль в инфекции HTV-2 и, возможно, в развитии СПИДа, лимфомы, миеломы и лейкоза); Genbank регистрационный номер NP_001707.1);

(30) HLA-DOB (бета-субъединица молекулы МНС класса II (антиген 1а), который связывается с пептидами и представляет их (CD4⁺)Т-лимфоцитам; Genbank регистрационный номер NP_002111.1);

(31) Р2Х5 (пуринергический рецептор Р2Х лиганд-зависимого ионного канала 5; ионный канал, управляемый внеклеточным АТФ, может участвовать в синаптической передаче и нейрогенезе, недостаточность может вносить вклад в патофизиологическую картину идиопатической гиперактивности (нестабильности) детрузора; Genbank регистрационный номер NP_002552.2);

(32) CD72 (антиген CD72, ассоциированный с дифференцировкой В-клеток; Lyb-2; Genbank регистрационный номер NP_001773.1);

(33) LY64 (лимфоцитарным антиген 64 (RP105), мембранный белок семейства белков, богатых лейциновыми повторами (LRR) типа I, регулирует активацию В-клеток и апоптоз, утрата функции связана с агрессивностью заболевания у больных системной красной волчанкой; Genbank регистрационный номер NP 005573.1);

(34) FcRHl (белок 1, подобный Fc-рецептору, предполагаемый рецептор для Fc-домена иммуноглобулинов, который содержит С2-тип Ig-подобных и ITAM-доменов, может играть роль в дифференцировке В-лимфоцитов); Genbank регистрационный номер NP_443170.1);

(35) IRTA2 (ассоциированный с транслокацией рецептор суперсемейства 2 иммуноглобулинов, предполагаемый иммунорецептор, возможно, играющий роль в развитии В-клеток и лимфомагенезе; нарушение регуляции его гена в результате транслокации встречается при некоторых В-клеточных злокачественных новообразованиях; Genbank регистрационный номер NP_112571.1); и

(36) TENB2 (предполагаемый трансмембранный протеогликан, родственный семейству факторов роста EGF/герегулин и фоллистатину; Genbank регистрационный номер AF179274). Кроме того, примеры антигенов включают все антигены, которые можно использовать для лечения или диагностики.

В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения исходное антитело обладает сродством связывания и специфичностью к рецепторам семейства эпидермального фактора роста EGFR/ErbB, выбираемому из EGFR, HER2, НЕЮ, HER4 и других раковых антигенов.

В частности, исходные антитела, которые используются по данному изобретению, включают одно или более антител, выбираемых из (не ограничиваясь перечисленным здесь) трастузумаба (торговое название Herceptin/герцептин), ритуксимаба (торговое название Rituxan/ритуксан), бевацизумаба (торговое название Avastin/авастин), цетуксимаба (торговое название Erbitux/эрбитукс), cBR96, cAClO, антител против CD20, антител против EphB2, антител против интерлейкина-8, антител против селектина Е, антител против MUC16 и антител против CD30.

Обозначение HER2 (ErB-В2) относится к одному из членов семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR/ErbB), являющемуся ключевым элементом сигнального каскада, участвующего в пролиферации и выживании раковых клеток молочной железы Известно, что тирозинкиназные рецепторы семейства EGFR/ErbB, включающие erb1, erb2/HER2, erb3 и erb4, участвуют в регуляции не только пролиферации, но и адгезии, миграции и дифференцировки клеток.

Такого лиганда, который из четырех членов erb этого семейства связывался бы только с erb2/HER2 не существует, но erb2/HER2 известен как наиболее мощный онкоген при раке молочной железы. При нормальном уровне HER2 этот белок участвует в росте и развитии нормальной ткани молочной железы, но при аномально усиленной экспрессии или амплификации HER2 нормальная регуляция клеток нарушается таким образом, что в ткани молочной железы возникают агрессивные раковые клетки. Иными словами, если HER2 активирован в результате олигомеризации с другими членами семейства EGFR, он фосфорилирует ряд последующих молекулярных мишеней, что ведет к активации различных сигнальных каскадов. Примерами механизмов, связанных с пролиферацией раковых клеток, являются путь SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK, участвующий в пролиферации клеток, и путь PI-3K/Akt, обеспечивающий подавление смерти клеток.

Результаты предклинических и клинических испытаний показывают, что чрезмерная экспрессия HER2 является важным биологическим маркером, появляющимся на начальных этапах развития рака и играющим существенную роль в росте опухолей и прогрессировании рака. Известно, что чрезмерная экспрессия HER2 имеет место в 20-30% случаев инвазивного рака молочной железы, а также ассоциирована с плохим прогнозом развития этого заболевания, его высокой агрессивностью и злокачественностью.

Согласно данному изобретению мотив, содержащий один или более остатков цистеина, связан с исходным антителом, обладающим специфичностью к рецептору фактора роста, выбираемому из группы, состоящей из рецепторов HER2 или EGF. Обычное противораковое лекарственное вещество конъюгируют с указанным мотивом, так что получается модифицированный иммуноконъюгат (конъюгат антитела с лекарственным веществом) по данному изобретению. Когда такой конъюгат модифицированного антитела с лекарственным веществом вводят больному в количестве, эффективном для подавления роста опухолевых клеток, он может дать превосходный вклад в лечение рака благодаря подавлению роста опухолевых клеток, в которых чрезмерно экспрессируется рецептор фактора роста, и в то же время вызывая смерть таких клеток.

Исходным антителом по данному изобретению предпочтительно служит трастузумаб. Хотя этот препарат изготовляют таким образом, что он практически не содержит остатков лизина на С-концах полипептидных цепей, для конъюгатов модифицированных антител с лекарственным веществом по данному изобретению можно использовать трастузумаб как содержащий остатки лизина в С-концевой области, так и не содержащий их там, где может быть связан мотив, включающий цистеин (Cys).

В настоящем документе аминокислоты обозначаются общепринятыми трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами. Нуклеотиды в различных фрагментах нуклеиновых кислот обозначаются стандартными однобуквенными аббревиатурами, принятыми в данной области техники.

Мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению состоит из 1-100 аминокислотных остатков, предпочтительно из 1-50 аминокислотных остатков, более предпочтительно из 1-30, наиболее предпочтительно из 1-10 аминокислотных остатков, и включает один или более остатков цистеина. В частности, мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению включает предпочтительно 1-20 остатков цистеина, более предпочтительно 1-10 остатков цистеина, еще более предпочтительно 1-5 остатков цистеина.

Мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению, может представлять собой простой пептид без какой-либо специфической функции или вторичной либо третичной структуры, но предпочтительно, чтобы он обладал некой специфической функцией или вторичной либо третичной структурой. Под специфической функцией здесь имеется в виду предпочтительно свойство, состоящее в том, чтобы поддерживать/защищать способность остатков цистеина к химическому конъюгированию (но этим функции указанного мотива не ограничиваются). В частности, мотив, содержащий цистеин, может более эффективно поддерживать функциональность остатков цистеина путем предотвращения или задержки их окисления из-за связывания со специфичными лигандами или с вторичной/третичной структурой самого мотива (пептида).

Мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению, имеет структуру, представленную формулой (1):

где (M_Cys)_n представляет просто остаток цистеина или же пептид, содержащий остаток цистеина и обладающий специфической функцией или вторичной\третичной структурой; Ха и Xb_n независимо друг от друга представляют пептид, включающий 0-20 аминокислотных остатков, отличных от цистеина, а n - целое число от 1 до 20.

В формуле (1) (M_Cys)_n, то есть (M_Cys)₁, (M_Cys)₂……(M_Cys)_n могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга. Также Xb_n, то сеть Xb₁, Xb₂…Xb_n могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга.

Кроме того, если (M_Cys)_n в формуле (1) является просто остатком цистеина, то мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению имеет структуру, представленную формулой (2):

где Ха, Xb_n и n определяются так же, как в формуле (1).

Если (M_Cys)_n в формуле (1) является пептидом, включающим остаток цистеина и обладающим специфической функцией или вторичной/третичной структурой, то (M_Cys)_n может быть предпочтительно ионом металла, связывающим мотив, включающий остаток цистеина. Известно, что мотивы, включающие остаток цистеина и связывающиеся с ионами металлов, могут связывать ион металла для того, чтобы подавить окисление этого остатка цистеина, тем самым эффективно сдерживая способность цистеинового остатка к алкилированию (Van Horn et al. (2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8: 601-610).

Примеры применяемых по данному изобретению мотивов, содержащих остаток цистеина, которые связывают ионы металлов, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) хелатирующие агенты (Zhang et al. (2012) Biochem. Genet. 50(7-8): 585-599), которые используются для регуляции концентрации ионов металлов in vivo; шапероны (Ansbacher and Shurki, J. Phys. Chem. В (2012) 116(15): 4425-4432; Allen et al. (2012) Biochemistry 51(7): 1439-48; Click et al. (2012) H. Comput. Chem. 33(11): 1142-51), функция которых состоит в том, чтобы доставлять ионы металлов в определенные положения снаружи или внутри клетки; регуляторы транскрипции (Gunther et al. (2012) Biochim. Biophys. Acta. 1823(2): 476-483; Sitthisak et al. (2012) FEMS Microbiol. Lett. 327(2): 126-133), функционирование которых (регуляция транскрипции) зависит от концентрации ионов металлов; мотивы цинковых пальцев (MacPherson et al. (2006) Microbiol. Mol. Bio. Rev. 70(3): 583-604; Schaeffer et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40(18): 9298-9307), которые имеются во многих белках, участвуя в белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействиях; и мотивы (Zielazinski et al. (2012) Biochemistry 51(40): 7891-7900; Zhou et al. (2012) FEBS J. 279(2): 285-298; Cochran et al. (2011) Nat. Struct. Mol. Biol. 19(1): 122-127), происходящие из различных ферментов. Мотивы, связывающие ионы металлов, содержат остаток цистеина, служащий ключевой связывающей группой; такие мотивы, связывающие ионы металлов, можно использовать для получения конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению.

Предпочтительные в данном изобретении примеры мотивов, связывающих ионы металлов, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) группу С₂Н₂ (класс Cys₂His₂: Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-X_3-5-His), группу С₄ (класс С4: Cys-X₂-Cys-X_n-Cys-X₂-Cys-X_m-Cys-X₂-Cys-X_n-Cys-X₂-Cys) или группу С₆ (класс С6: Cys-X₂-Cys-X₆-Cys-X_5-12-Cys-X₂-Cys-X_6-8-Cys) цинковых пальцев; мотив вида Cys-X_m-Cys, например Cys-X-X-Cys или Cys-X-Cys; мотив Met-X-Cys-X-X-Cys или мотив C-Q-C-Q-C-A-C, часто встречающийся в белках - регуляторах транскрипции, белках металлошаперонах, белках - переносчиках металлов, супероксиддисмутазе или подобных ей белках; мотив Ser-Pro-Cys мембранной аденозинтрифосфатазы и проч. В описанных выше пептидных мотивах, связывающих ионы металлов, X представляет аминокислотные остатки, отличные от цистеина (Cys); m - целое число от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5; X_m или X_m-q представляют аминокислотные остатки, отличные от цистеина (Cys), количество которых указывается числом m или числом от m до q.

Конкретнее, примеры используемых по данному изобретению мотивов, связывающих ионы металлов, из белков с цинковыми пальцами включают (но не ограничиваются перечисленным здесь):

Мотив, связывающий ионы металла, белка с цинковыми пальцами может быть любым выбираемым из мотивов, связывающих ионы металлов, белков с цинковыми пальцами, описанными в следующих работах: http://www.zincfingers.org, http://www.genenames.org/genefamilies/ZF,

http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php,

https://zifdb.msi.umn.edu:8444/ZiFDB/ или Macpherson et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70(3), 583-604, которая по техническим признакам согласуется с данным изобретением.

Примеры мотивов, связывающих ионы металлов, из белков - регуляторов транскрипции, белков - металлошаперонов или им подобных, которые используются по данному изобретению, включают (но не ограничиваются пересиленным здесь):

У белков, связывающих цинк (Zn), которые обнаружены среди мембранных белков, участвующих в передаче сигналов у бактерий, имеется присущий им мотив, связывающий ионы металла, который состоит из одного остатка цистеина и трех остатков гистидина (Draper et al., J. Bacteriol. 2011, 193 (17), 4338-4345). В настоящем документе идет речь о связывающих ионы металлов мотивах, имеющих структуру HXXWFYLX_21-28CXLFMVIGXWFLVIX_18-27HXXH, где X представляет любую аминокислоту, a X_m-q представляет аминокислотные остатки, отличные от цистеина (Cys), количество которых указано числом от m до q. Кроме того, по данному изобретению в качестве мотива, связывающего ионы металла, можно использовать 150 или более известных на сегодняшний день белков, связывающих цинк.

Известные переносчики ионов металлов включают белки, участвующие в механизме облегченной диффузии катионов; белки Zrt; Irk-подобные белки; белки, осуществляющие обмен катионов; переносчики меди; АТФ-азы, транспортирующие тяжелые металлы, типа Р; АТФ-связывающие кассетные переносчики и проч. (Hanikenne et al. Plant Physiology 2005, 137, 428-446; Hall and Williams, J. Experimental Botany, 2003, 54(393) 2601-2613), и по данному изобретению предпочтительно используются следующие мотивы М-Х-С-Х-Х-С (не ограничиваясь перечисленным здесь):

Кроме того, в конъюгатах модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению могут быть использованы различные связывающие ионы металлов мотивы, сконструированные искусственно на основе соответствующих мотивов дикого типа, обнаруженных in vivo. Приметы таких мотивов, связывающих ионы металлов, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) мотив CGH (Van Horn et al. (2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8: 601-610) составленный на основе мотива GGH из белка с цинковыми пальцами, не содержащего остатков цистеина, и мотивы (Jancso et al. (2011) Metallomics 3(12): 1331-1339), полученные путем замены одного или более остатков цистеина в пептидном мотиве на остатки других аминокислот, например треонина, серина или гистидина. Мотив CGH имеет структуру, представленную приведенной ниже химической формулой 1, и предпочтительно имеет структуру ACGHA с остатками аланина на С- и N-концах.

Химическая формула 1

[где Μ представляет ион металла, a R - остаток аминокислоты, отличной от цистеина, предпочтительно аланин].

Мотив CGH по данному изобретению обладает свойством связывать ион металла даже когда положения С-конца и N-конца обратные. Специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что мотив HGC с обратными положениями С- и N-концов входит в объем мотива CGH по данному изобретению.

По данному изобретению можно использовать связывающие ионы металлов мотивы, искусственно сконструированные на основе мотивов цинковых пальцев, включающие приведенные ниже связывающие ионы металлов мотивы (см. Roehm and Berg, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120. 13083-13087), полученные путем замены остатка цистеина (который играет весьма существенную роль) в PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTH на метилцистеин (Me-Cys) или путем замены остатка гистидина в этой последовательности на цистеин:

[В описанных выше мотивах, связывающих ионы металлов, Ме-С представляет остаток метилированного цистеина.]

Также по данному изобретению можно использовать опубликованные на сегодняшний день пептиды, искусственно сконструированные на основе ряда мотивов белков, связывающих ионы металлов.

Связывающие ионы металлов мотивы с характерной вторичной или третичной структурой полипептидной цепи включают бета-слои, смешанные альфа/бета мотивы и альфа-спиральные структуры, которые встречаются наиболее часто. Эти альфа-спиральные структуры включают пептиды с одноцепочечной, двухцепочечной, трехцепочечной или четырехцепочечной альфа-спиральной структурой.

Что касается таких многоцепочечных альфа-спиральных структур, то, например, семейство пептидов TRI характеризуется структурой G(LKALEEK)4G с четырьмя повторами пептида, имеющего последовательность LKALEEK. Сообщалось о связывающих ионы металлов пептидных мотивах, искусственно сконструированных путем замены определенной аминокислоты в пептидах семейства TRI на цистеин (Peakcock et al. 2009. Dalton Trans. 7(13). 2271-2280), и по данному изобретению могут быть использованы искусственно сконструированные пептидные мотивы с приведенными ниже структурами (не ограничиваясь перечисленным здесь):

Также по данному изобретению можно использовать ряд связывающих ионы металлов пептидных мотивов с кольцевой структурой, например Cyclo[K 1,12] (QCGVCGKCIACK) (Nivorozhkin et al. 2000. Inorg. Chem. 39(11) 2306-2313).

Связывающие ионы металлов мотивы, содержащие цистеин, которые можно использовать в модифицированных антителах по данному изобретению, представлены в таблице 1.

Такие мотивы, содержащие цистеин, могут быть связаны с N- или С-концом легкой либо тяжелой цепи исходного антитела без ограничений, коль скоро с ним может образовать конъюгат нужное лекарственное вещество, а специфичность исходного антитела сохранится. Мотив по данному изобретению предпочтительно связан с С-концом тяжелой либо легкой цепи антитела. В частности, он связан с С-концом тяжелой цепи, то есть с концом константной области исходного антитела. Если используется фрагмент антитела, то указанный мотив предпочтительно связан с С-концом тяжелой цепи этого фрагмента.

Однако при сохранении специфичности исходного антитела цистеин-содержащий мотив по данному изобретению, а конкретно - цистеин-содержащий мотив, имеющий функцию связывания иона металла или иную специфическую функцию, или специфическую вторичную или третичную структуру, может быть связан в любом положении помимо легкой и тяжелой цепей исходного антитела и может быть включен в состав исходного антитела посредством длинноцепочечного связующего пептида (линкера). Известно, что при получении конъюгата антитела с лекарственным веществом путем присоединения к остатку цистеина или лизина, появившемуся в результате сайт-специфического мутагенеза, в легкой либо тяжелой цепи (кроме области CDR) антитела посредством длинноцепочечного углеводородного линкера структурные особенности и специфичность исходного антитела могут сохраняться. Таким образом, цистеин-содержащий связывающий ионы металла мотив, присоединенный в некотором положении исходного антитела посредством длинноцепочечного пептидного линкера, может обеспечить образование высоко гомогенного конъюгата антитела с лекарственным веществом, сохраняющего специфичность исходного антитела.

В модифицированных антителах по данному изобретению цистеин-содержащий мотив может быть присоединен к исходному антителу непосредственно амидной связью. Или же концевая функциональная группа мотива, содержащего цистеин, образует химическую связь с концевой функциональной группой исходного антитела. Или же указанный мотив может быть присоединен к исходному антителу посредством линкерной структуры (первый линкер).

Лекарственное вещество может быть присоединено непосредственно к остатку цистеина и тиоловой группе (-SH) цистеина в мотиве, содержащем цистеин, связанном с исходным антителом, а также лекарственное вещество может быть присоединено к остатку цистеина посредством линкерной структуры (второй линкер).

Связывание второго линкера, присоединяющего лекарственное вещество к остатку цистеина в мотиве, содержащем цистеин, может осуществляться путем алкилирования, дисульфидного обмена или переэтерификации (тиоловой группы). Второй линкер может быть одним или более выбираемых из (не ограничиваясь перечисленным здесь) производных алкилгалидов, содержащих галоацетильную функциональную группу; производных, содержащих малеимидную группу; азиридиновых производных; акрилоиловых производных и производных арилгалидов, содержащих фторбензол или подобные группировки. Эти производные могут быть присоединены к тиоловой группе остатка цистеина в указанном мотиве с помощью реакционноспособной алкилирующей группы, реакционноспособной арилирующей группы, малеимидной группы, азиридиновой группы, акрилоиловой группы или группы, способной к дисульфидному обмену и содержащей пиридилдисульфид и тионитробензойную кислоту (см. Bioconjugate techniques, 2nd edition, рр 182~192, Gerg T. Hermanson, ELSVIER).

Например, малеимидная группа, которую обычно используют для связывания с тиоловой группой, и линкер используются для присоединения лекарственного вещества к цистеину, поскольку нуклеофильная реакционноспособность тиоловой группы остатка цистеина в отношении малеимидной группы примерно в 1000 раз выше, чем таковая аминогруппы или N-концевой аминогруппы другого аминокислотного остатка, например остатка лизина. Таким образом, в случае конъюгатов модифицированных антител с лекарственным веществом, содержащих малеимид или иодацетамид в качестве второго линкера, цистеин связывается с лекарственным веществом тиоэфирной связью. Вобщем, во втором линкере есть реакционноспособный сайт, несущий электрофильную группу, которая взаимодействует с нуклеофильным цистеином, присутствующим в молекуле антитела.

Лекарственное вещество, связывающееся с модифицированным антителом по данному изобретению, может быть любым веществом, обладающим терапевтическим эффектом в отношении того или иного заболевания. В частности, оно является предпочтительно противораковым средством, эффект которого состоит в подавлении пролиферации опухолевых клеток. А именно, лекарственное вещество, используемое в конъюгатах с модифицированными антителами по данному изобретению, включает любое соединение, группировку или группу, обладающие цитотоксическим действием или подавляющие пролиферацию клеток; примеры таких веществ включают:

(i) химиотерапевтические агенты, способные действовать как ингибиторы микротубулина, ингибиторы митоза, ингибиторы топоизомеразы или ДНК-интеркаляторы;

(ii) белковые токсины, способные действовать как ферменты;

(iii) микро-RNA (микроРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК) или короткие РНК, содержащие шпильки (кшРНК), которые могут подавлять экспрессию определенных онкогенов; и

(iv) радиоактивные изотопы.

Примеры таких веществ включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) майтансиноид, ауристатин, доластатин, трихотецен, цитотоксическое соединение CCI065, калихеамицин и другие энедииновые антибиотики, таксан, антрациклин, метотрексат, адриамицин, виндезин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин, дауномицин и их стереоизомеры, изостеры, аналоги или производные, другие интеркалирующие агенты, ферменты и их фрагменты, например нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, например низкомолекулярные токсины или токсины с ферментативной активностью бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, и различные противоопухолевые или противораковые агенты, например цисплатин, СРТ-11, доксорубицин, паклитаксел и доцетаксел.

Кроме того, нуклеофильные группы лекарственных агентов по данному изобретению включают одну или более выбираемых из (не ограничиваясь перечисленным здесь) аминогруппы, тиоловой группы, гидроксильной группы, гидразидной группы, оксимной группы, гидразиновой группы, тиосемикарбазоновой группы, гидразинкарбоксилата и арилгидразидной группы, которые могут взаимодействовать со второй линкерной группировкой и электрофильной группой второго линкерного агента с образованием ковалентной связи.

Как говорилось выше, число молекул лекарственного вещества в конъюгате, присоединившихся к антителу посредством второго линкерного агента, может увеличиваться, когда увеличивается число остатков цистеина в мотиве, связанном с исходным антителом.

Как говорилось выше, модифицированные антитела по данному изобретению могут содержать некоторое число остатков цистеина, поскольку мотив, включающий один или более остатков цистеина, связан с исходным антителом, предпочтительно с С-концом полипептидной цепи исходного антитела. Таким образом, в конъюгате с модифицированными антителами по данному изобретению может быть много молекул лекарственного вещества, и это большое количество лекарственного вещества в составе конъюгата может быть успешно доставлено к клетке-мишени или ткани-мишени.

Также, поскольку число остатков цистеина, связанных с исходным антителом, легко контролировать, можно держать на нужном уровне количество лекарственного вещества, содержащееся в конъюгате с модифицированным антителом. Этот отличительный признак позволяет преодолеть ограничения применения обычных конъюгатов лекарственных веществ с антителами, и новые конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению можно использовать как превосходную систему доставки лекарственного вещества к его мишени и эффективно применять для лечения заболеваний, например рака.

Данным изобретением также предлагается способ получения модифицированных антител, который включает связывание мотива, содержащего один или более остатков цистеина с исходным антителом.

Исходное антитело можно получить путем конструирования подходящего экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую константный домен тяжелой либо легкой цепи исходного антитела; трансформирования этим вектором прокариотических или эукариотических клеток, чтобы в них экспрессировался соответствующий белок (антитела); выделения этого белка (антител) и его очистка до фармацевтически приемлемой чистоты.

Подходящие для данного изобретения экспрессионные векторы могут включать регуляторные элементы, влияющие на экспрессию, например промоторы, инициирующие кодоны, стоп-кодоны, сигналы полиаденилирования и энхансеры, а также сигнальные последовательности для нацеливания на мембрану или секреции. Примеры доступных промоторов прокариотических клеток включают промоторы lac, tac, Т3 и Т7. Примеры доступных промоторов эукариотических клеток включают промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), промотор мышиной опухоли молочной железы (MMTV), промотор человеческого вируса иммунодефицита (HIV), например промотор длинных концевых повторов (LTR) HIV, промотор мышиного вируса лимфолейкоза Молони, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор гена бета-актина, промоторы ряда человеческих генов, например гемоглобина и металлотионеина.

Экспрессионный вектор может включать селективный маркер, позволяющий отбирать трансформированные клетки, несущие вектор. Используются маркеры, обеспечивающие фенотип, по которому можно вести отбор, например устойчивость к тому или иному лекарственному веществу, потребность в том или ином питательном веществе, устойчивость к цитотоксическом агентам или экспрессию белков клеточной поверхности. Отбор трансформированных клеток возможен в силу того, что только клетки, в которых экспрессируется селективный маркер, выживают в среде, содержащей фактор отбора (селективный агент). Также реплицирующиеся экспрессионные векторы могут содержать ориджин репликации со специфической нуклеотидной последовательностью, с которого начинается репликация.

В качестве рекомбинантных экспрессионных векторов для экспрессии экзогенных генов можно использовать векторы различных типов, в том числе плазмиды, вирусы или космиды. Тип рекомбинантного вектора ничем определенным не ограничивается, коль скоро он способен обеспечить экспрессию желаемого гена в различных клетках-хозяевах, например прокариотических и эукариотических клетках, и продуцирование желаемого белка. Однако предпочтительно использовать векторы, которые включают промоторы с высокой активностью и способны обеспечить продуцирование с высоким выходом экзогенного белка, сохраняющего сходство с природным белком.

Для экспрессии исходного антитела или модифицированного антитела, содержащего мотив с одним или более остатками цистеина, можно использовать различные сочетания экспрессионных векторов и организмов-хозяев. В случае эукариотических клеток-хозяев используются (не ограничиваясь перечисленным здесь) экспрессионные векторы, содержащие последовательности, регулирующие экспрессию, из SV40, папилломавирусов крупного рогатого скота, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, цитомегаловируса и ретровирусов. В случае бактериальных клеток-хозяев используются экспрессионные векторы, включающие плазмиды бактерий, например плазмиды из Е.coli, в том числе рЕТ, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 и их производные; плазмиды более широкого круга организмов-хозяев, например RP4; фаговые ДНК, например многочисленные производные фага «лямбда», например λgt10, λgt11, NM989, и другие фаговые ДНК, например М13 и одноцепочечная ДНК филаментных фагов. В случае дрожжевых клеток используются экспрессионные векторы, включающие 2-микронную плазмиду и ее производные. В случае клеток-хозяев насекомых используются векторы, включая pVL 941.

В другом аспекте данного изобретения предлагаются клетки-хозяева, трансформированные описанными выше рекомбинантными векторами. Рекомбинантный вектор внедряется в клетки-хозяева, так что получаются трансформанты. Подходящая для трансформации клетка может быть прокариотической, например клеткой бактерий Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis или Staphylococcus sp. Также клетки-хозяева могут быть грибными, например клетками Aspergillus sp., дрожжей (Pichiapastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp.) и Neurospora crassa; клетками низших эукариот; клетками высших эукариот, например насекомых. Также клетки-хозяева могут происходить из млекопитающих и/или растений. Предпочтительные примеры клеток-хозяев по данному изобретению включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) клетки PER.C6, обезьяньи почечные клетки (в частности COS7), клетки NSO, SP2/0, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки W138, почечные клетки новорожденного сирийского хомячка (ВПК), собачьи почечные клетки линии Мадин-Дарби (MDCK), миеломные клетки, клетки HuT 78, НЕK293 и другие клетки млекопитающих, способные продуцировать белки-антитела по данному изобретению.

В частности, для достижения возможно большей эффективности экспрессии клетки-хозяева по данному изобретению предпочтительно выбирают из клеток Е.coli, а также клеток млекопитающих (COS, СНО и др.), которые способны продуцировать белки-антитела по данному изобретению. Более предпочтительными клетками-хозяевами по данному изобретению являются хомячьи клетки яичника СНО-K1.

По данному изобретению трансформация клеток-хозяев включает любые методы внедрения нуклеиновых кислот в организмы, клетки, ткани или органы и осуществляется с применением известных в данной области техники стандартных методик, выбираемых в зависимости от типа клеток-хозяев. Примеры таких методов включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) электропорацию, слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция (СаРО₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), перемешивание с использованием карбидкремниевых волокон, трансформацию с помощью Agrobacterium, трансформацию, опосредованную полиэтиленгликолем, декстрансульфатом, липофектамином, или трансформацию с применением высушивания/ингибирования.

Экспрессирующиеся белки-антитела можно выделить из клеток-хозяев, культурального супернатанта или лизата клеток и очистить обычно применяемыми для очистки белков методами; таким образом получают модифицированные антитела, содержащие мотив с одним или более остатками цистеина.

Антитела выделяют из культуральной среды путем обычной процедуры очистки иммуноглобулинов, например с помощью белка А, иммобилизованного на сефарозе, путем хроматографии на гидроксилапатите, гель-электрофореза, диализа или аффинной хроматографии.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую мотив с цистеином, можно объединить («слить») с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен тяжелой цепи или легкой цепи исходного антитела. Такой «слитый» рекомбинантный вектор обеспечит продуцирование модифицированного антитела точно так же, как исходного антитела, то есть после трансформации прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, приводящей к экспрессии нужного полинуклеотида.

Также модифицированные антитела по данному изобретению можно получить путем раздельной экспрессии исходного антитела и мотива, содержащего один или более остатков цистеина, и последующего химического связывания концевой функциональной группы исходного антитела с концевой функциональной группой мотива, содержащего цистеин, или связывания исходного антитела с этим мотивом посредством первого линкера. К полученному модифицированному антителу с мотивом, содержащим цистеин, может быть присоединено лекарственное вещество - тем самым образуется конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества (mADC).

Говоря конкретно, конъюгаты лекарственных веществ с модифицированными антителами, содержащими мотив, включающий остатки цистеина, можно получить следующим образом:

(a) путем ковалентного связывания исходного антитела, содержащего мотив, включающий цистеин, с линкерным агентом с образованием промежуточного соединения антитело-второй линкер и затем прибавления к этому промежуточному соединению активированного лекарственного агента; или

(b) путем ковалентного связывания нуклеофильной группы лекарственного агента со вторым линкерным агентом с образованием промежуточного соединения лекарственный агент-второй линкер и затем прибавления модифицированного антитела, содержащего мотив с цистеином.

В другом аспекте данного изобретения предлагается терапевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента конъюгат модифицированного антитела с лекарственным веществом.

В указанной композиции лекарственное вещество в составе конъюгата с модифицированным антителом может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) цитотоксическим агентом, ингибитором пролиферации клеток, химиотерапевтическим агентом, иммуносупрессором, противовоспалительным или иным агентом. При лечении рака использование конъюгатов антител с лекарственными веществами для локальной доставки лекарственного вещества, убивающего или подавляющего опухолевые клетки, делает возможной прицельную доставку лекарственного агента в опухолевые клетки благодаря взаимодействию антитела с соответствующим антигеном и накоплению лекарственного вещества внутри этих клеток. Введение композиции, содержащей лекарственное вещество само по себе, может приводить к неприемлемому уровню токсичности не только в опухолевых, но и в нормальных клетках. А конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению благодаря высокой антигенной специфичности антител могут точно доставить лекарственное вещество, тем самым усиливая его терапевтический эффект. Кроме того, такой подход расширяет применимость лекарственных веществ, в частности противораковых агентов, применение которых, несмотря на высокую эффективность, ограничено из-за их токсичности. Данным изобретением предлагаются конъюгаты антител с лекарственными веществами, позволяющие достичь наибольшей возможной эффективности, в то же время сводя к минимуму токсичность лекарственного вещества.

Данным изобретением предлагается также способ подавления пролиферации клеток-мишеней при раке, аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваниях с помощью конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами в качестве активного ингредиента.

Раковые заболевания, подлежащие лечению по данному изобретению, могут быть одним или более выбираемых из рака печени, рака желудка, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака костной ткани, рака поджелудочной железы, раковых опухолей головы и шеи, рака матки, рака яичника, рака прямой кишки, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака анального канала, рака фаллопиевой трубы, рака эндометрия, рака шейки матки, рака влагалища, рака вульвы, болезни Ходжкина, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почки, рака мочеточника, почечно-клеточной карциномы, рака почечной лоханки и раковых поражений центральной нервной системы. В одном из конкретных примеров пролиферация клеток ВТ-474 раковой опухоли молочной железы с амплифицированным геном рецептора HER2 in vitro может быть подавлена в результате контактирования этих клеток с конъюгатом модифицированного антитела и лекарственного вещества. Таким образом, ясно, что применение предлагаемого данным изобретением способа подавления пролиферации клеток-мишеней с использованием в качестве активного ингредиента конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами приводит к гибели клеток, с которыми связаны перечисленные выше заболевания, или к снижению скорости пролиферации этих клеток.

Далее изобретение описывается подробнее на примерах. Рядовому специалисту в данной области должно быть очевидно, что эти примеры не следует считать ограничивающими объем данного изобретения и что возможны различные модификации и изменения, не выходящие за пределы технического замысла и объема настоящего изобретения.

В настоящем документе технические или научные термины употребляются (если не оговорено иного) в тех значениях, в которых они понятны в рамках рядового объема знаний в области техники, к которой относится данное изобретение. В настоящем документе не приводится подробное описание тех явлений и интерпретаций, которые известны в данной области техники.

1. Аналитические методы

1.1. Спектрофотометрия в видимом и ультрафиолетовом диапазоне

По данному изобретению для получения конъюгатов антител с лекарственным веществом использовали противораковый агент доксорубицин с присоединенным к нему линкером (6-малеимидкапроил)гидразоном (гидразидом ε-малеимидкапроновой кислоты) (DOX-EMCH). Будучи введен путем инъекции в организм человека DOX-EMCH связывается с тиоловой группой цистеина, имеющегося в полипептидной цепи альбумина, содержащегося в крови, с образованием конъюгата альбумин-лекарственное вещество [Willner et al., Bioconjugate Chem. 1993 (4): 521-7]; в таком виде его легко использовать по данному изобретению.

Чтобы проверять, остается ли лекарственное вещество связанным с белком после стадий образования конъюгата и очистки, применяли метод абсорбционной спектрофотометрии в видимом и ультрафиолетовом диапазоне (UV-VIS). Максимум поглощения белка достигается при длине волны 280 нм (ультрафиолетовый диапазон), а доксорубицин, использовавшийся по данному изобретению, характеризовался максимумом поглощения при длине волны 495 нм (видимый диапазон). Как белку, так и доксорубицину свойственны определенные коэффициенты поглощения при определенных длинах волн. Таким образом при измерении поглощения на 280 нм и 495 нм определяется количество связанного лекарственного вещества на одну молекулу белка (патент США №7,528,234 В2).

1.2. Определение подавления пролиферации клеток in vitro.

Для определения цитотоксичности или степени подавления пролиферации клеток конъюгатами модифицированных антител с лекарственным веществом (mADC) клетки млекопитающих, несущие рецепторный белок, например клетки SK-BR-3 или ВТ-474, подвергали воздействию конъюгатов антител с лекарственным веществом (mADC) в культуральной среде. После этого клетки культивировали в течение периода от 6 часов до 5 суток и определяли их жизнеспособность.

1.3: Определение активности каспазы 3/7 in vitro.

Герцептин вызывает гибель раковых клеток не впрямую: на клетки, несущие рецептор Her2, он влияет через механизм опосредованной антителами цитотоксичности. Однако при медикаментозной терапии рака лекарственные вещества непосредственно вызывают апоптоз раковых клеток, поэтому, определяя каспазную активность, можно установить, вызывают конъюгаты модифицированных антител с лекарственным веществом (mADC) опосредованный каспазой апоптоз или нет (Bayascas, et al. (2002), Cell Death and Differentiation. 9: 1078-1089; Preaudat, et al. (2002), Journal of Biomolecular Screening. 7: 267-274; Phillips, et al. (2008), Cancer Research 68(22): 9280-9290).

По данному изобретению для исследования механизма апоптоза под действием конъюгатов модифицированных антител с лекарственным веществом (mADC), определяли активность каспаз 3/7. Как правило, апоптоз под влиянием конъюгатов модифицированных антител с лекарственным веществом (mADC) определяют, подвергая клетки млекопитающих, несущие рецепторный белок, например клетки SK-BR-3 или ВТ-474, воздействию конъюгатов модифицированных антител с лекарственным веществом (mADC). Обработанные mADC клетки инкубировали в культуральной среде в течение примерно 2 суток, после чего измеряли каспазную активность.

2. Примеры

Пример 1. Получение экспрессионного вектора pAV4

Клонирование экспрессионного вектора, требовавшегося по данному изобретению, осуществляли, используя вектор pAV4, сконструированный из исходного вектора pSGHV0 (GenBank, регистрационный номер AF285183) и модифицированный таким образом, чтобы его можно было использовать для промышленного получения антител. Хотя возможно добиться усиленной экспрессии человеческого белка в бактериальных клетках, например в клетках Е.coli, трудно получить его как активное вещество. Поэтому был изготовлен исходный вектор для экспрессии физиологически активного белка в высокой концентрации в животных клетках in vitro, и разработаны достаточно простые стадии очистки. Несмотря на большое преимущество высокого уровня экспрессии желаемого белка, обеспечиваемого этим исходным вектором, для его применения в промышленности имеются ограничения. Поэтому исходный вектор модифицировали так, чтобы его можно было использовать для промышленного применения. Кроме того, вектор pAV4 модифицировали соответственно задаче экспрессии доменов как легкой цепи, так и тяжелой цепи антитела.

Пример 2. Конструирование векторов для получения трастузумаба и модифицированного цистеином трастузумаба

Для создания вектора для трастузумаба (HHL002), синтезировали кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности кДНК, соответствующие тяжелой и легкой цепям трастузумаба, чтобы усилить экспрессию в клетках СНО. Эти гены клонировали в векторе pAV4c по сайтам рестрикции XhoI/NotI и ApaI/SmaI соответственно; таким образом получался вектор для трастузумаба pHHL002.

2.1. Конструирование векторов для модифицированных антител (трастузумаба) HR-Cys и HR-Cys-Glv-Cys

Чтобы создать векторы для модифицированных антител (трастузумаба), а именно для антитела HR-Cys (HHL002C) с единичной заменой С-концевого лизина на цистеин и для антитела HR-Cys-Gly-Cys (HHL002C2) с С-концевым пептидом Cys-Gly-Cys (CGC), проводили полимеразную цепную реакцию с использованием в качестве матрицы сконструированного вектора для трастузумаба (pHHL002). Для амплификации брали нуклеотидную последовательность, кодирующую трастузумаб, в качестве матрицы, прямой праймер XhoHH (5′-GGG GGG СТС GAG АСС ATG GGT TGG AGC TGT -3′) и обратный праймер HHNot (5′-GCG GCC GGC CGC TCA АСА АСС CGG AGA С AG -3′) для HHL002C или обратный праймер HHNot (5′-GCG GCC GGC CGC TCA ACA GCC АСА АСС CGG AGA CAG-3′) для HHL002C2. Амплифицированную нуклеотидную последовательность расщепляли ферментами рестрикции XhoI и NotI и лигировали с экспрессионным векторам pHHL002, содержащим сайты рестрикции XhoI/NotI; таким образом получались векторы для модифицированных цистеином антител - pHHL002C и pHHL002C2. На фиг. 1 представлена схема такого вектора. Содержащие цистеин антитела, получаемые в данном примере, представляют собой содержащий цистеин трастузумаб, в котором отсутствует С-концевой лизин и добавлен один остаток цистеина или короткий пептид цистеин-глицин-цистеин.

2.2. Конструирование вектора для модифицированных антител (трастузумаба) HR-M2(Cys)

Чтобы создать вектор, кодирующий модифицированное антитело (трастузумаб) HR-M2(Cys) (HR-ACHGAACGHA; HHL002M2), в котором имеются два мотива, связывающих ионы металла (CGH), провели амплификацию путем полимеразной цепной реакции, используя в качестве матрицы вектор для трастузумаба (pHHL002), прямой праймер XhoHH (5′-GGG GGG CTC GAG ACC ATG GGT TGG AGC TGT -3′) и обратный праймер M2 (5′ CCCCGC GGC CGC СТА GGC ATG GCC АСА AGC AGC ATG GCC АСА GGC GCC GGG AGA CAG AGA 3′). Амплифицированную нуклекотидную последовательность расщепляли рестриктазами XhoI и NotI и лигировали с экспрессионным вектором pHHL002, содержащим сайты расщепления XhoI/NotI; таким образом получался вектор для модифицированного цистеином антитела (трастузумаба) pHHL002M2.

2.3. Получение модифицированных антител (трастузумаба) HR-M(Cys)

Чтобы создать вектор, кодирующий модифицированное антитело (трастузумаб) HR-M(Cys) (HR-GGGACGHA; HHL002M), в котором имеется один мотив, связывающий ионы металла (CGH), провели амплификацию путем полимеразной цепной реакции, используя набор EzChange для сайт-направленного мутагенеза (Enzynomics, Ez004S). В качестве матрицы брали полученную, как описано выше, нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированное антитело (трастузумаб) HR-M2(Cys), прямой праймер (5′-GGT GGA GGT GCT TGT GGC CAT TAA GC) и обратный праймер (3′-GCC GGG AGA CAG AGA CAG TG). Из имеющихся в HR-M2(Cys) двух мотивов, связывающих ионы металла, один на С-конце удаляли и между оставшимся мотивом, связывающим ионы металла, и исходным антителом добавляли глициновый линкер (GGG). После амплификации, проведенной, как указано выше, первоначальную матрицу HR-M2(Cys) расщепляли рестриктазой DpnI и полученную последовательность 5-M(Cys) лигировали в двухцепочечный ДНК-вектор; таким образом получался вектор для модифицированного антитела (трастузумаба) pHHL002M.

2.4. Конструирование вектора для модифицированных антител (трастузумаба) HR-M2UCVS)

Чтобы создать вектор, кодирующий модифицированное антитело (трастузумаб) HR-M2L(Cys) (HR-ACGHAGGGACGHA, HHL002M2L), в котором имеется линкерная структура из трех аминокислотных остатков (GGG) между двумя мотивами, связывающими ионы металла (CGH), провели амплификацию путем полимеразной цепной реакции. В качестве матрицы брали полученный, как описано выше, вектор для модифицированного антитела (трастузумаба) HR-M2(Cys), прямой праймер (5′-GGT GGA GGTGCT TGT GGC CAT GCC TAA GCG) и обратный праймер (3′-AGC ATG GCC АСА GGC GCC). Первоначальную матрицу HR-M2(Cys) расщепляли рестриктазой DpnI и полученную нуклеотидную последовательность, кодирующую 5-M2L(Cys), лигировали в двухцепочечный ДНК-вектор; таким образом получался вектор для модифицированного антитела (трастузумаба) pHHL002M2L.

2.5. Конструирование вектора для модифицированных антител (трастузумаба) HR-Z(Cys)

Чтобы создать вектор, кодирующий HR-Z(Cys) (HR-CDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQK, HHL002Z), в котором имеется мотив, связывающий ионы металла, из белка с цинковыми пальцами класса I, провели амплификацию путем полимеразной цепной реакции, используя в качестве матрицы вектор для трастузумаба (pHHL002), прямой праймер XhoHH (5′-GGG GGG СТС GAG АСС ATG GGT TGG AGC TGT -3′, SEQ IN NO: 1) и обратный праймер Ζ (5′-GCA TGC GGC CGC CTT ACT TCT GCC GCA GGT GGA TCT TGG TAT GCC TTT TTC GCT CGT CGG АТС TAG CAA ATT TGC GTC CAC AAA TAT CGC ATT TGC CGG GAG АСА GAG A-3′). Амплифицированную нуклеотидную последовательность расщепляли рестриктазами XhoI и NotI и дотировали с экспрессионным вектором pHHL002, содержащим сайты расщепления XhoI/NotI; таким образом получался вектор для модифицированного цистеином антитела (трастузумаба) pHHL002Z.

Пример 3. Экспрессия и очистка трастузумаба и модифицированных цистеином антител (трастузумаба)

Экспрессию трастузумаба (HHL002) и его модифицированных цистеином вариантов (антител HHL002C, HHL002C2, HHL002M, HHL002M2, HHL002M2L, HHL002Z) определяли на клетках яичника китайского хомячка СНО-K1. А именно, клетки СНО-K1 культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной коровьей сыворотки (FBS) и антибиотик. Клетки СНО-K1 высевали в чашки Петри диаметром 100 мм в концентрации 5×10⁶ клеток/мл и затем культивировали 24 часа. Среду DMEM без FBS и антибиотика в количестве 800 мкл смешивали с 10 мкг вектора и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты, после чего добавляли, перемешивая, 20 мкг неразветвленного полиэтиленимина (PEI, Polysciences Inc., номер по каталогу 23966, мол. масса -25,000) и оставляли при комнатной температуре на около 10-15 минут. Тем временем клетки промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатом (PBS) и прибавляли к ним 6 мл свежей среды DMEM. Вектор для трастузумаба или модифицированного цистеином трастузумаба держали при комнатной температуре 10-15 минут и вносили в чашки Петри. На следующий день клетки промывали PBS и прибавляли к ним среду Дульбекко, модифицированную по Пскову, без FBS (IMDM, Gibco, номер по каталогу 12200-028), чтобы убедиться в экспрессии антител.

Трастузумаб и модифицированные цистеином антитела, экспрессировавшиеся, как описано выше, очищали следующим образом. Чтобы очистить выделившиеся в среду, в которой культивировались клетки, трастузумаб и модифицированные цистеином антитела, культуральную среду отделяли от клеток путем центрифугирования, супернатант наносили на колонку HiTrap Protein A HP (GE Healthcare, США), уравновешенную буферным раствором для уравновешивания. Колонку затем промывали достаточным количеством того же буферного раствора и элюировали белок, изменяя рН глициновым буферным раствором (глицин 100 мМ; рН 2,8). Полученный в результате раствор подвергали диализу против фосфатного буферного раствора, затем концентрировали с помощью Vivaspin20 (Sartorius, США).

Пример 4. Получение конъюгатов вариантов антител с лекарственным веществом.

4.1. Получение конъюгата варианта трастузумаба в качестве антитела и доксорубицина в качестве лекарственного вещества

Как правило, если в молекуле белка остатки цистеина не участвуют в образовании внутримолекулярных дисульфидных связей, то такой белок обычно образует димеры за счет межмолекулярных дисульфидных связей. Однако, как показано на фиг. 2, антитело HR-Cys, полученное по данному изобретению, существует в виде мономера, что демонстрируется результатами электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга. Кроме того, имеющийся в белке остаток цистеина со свободной тиоловой группой может образовывать дисульфидную связь с присутствующим внутри клетки глутатионом или цистеином. Поэтому после связывания с лекарственным веществом через второй линкер требуется обработка восстанавливающим агентом, например дитиотреитолом (DTT) или трис(2-карбоксиэтилфосфином (ТСЕР), чтобы разорвать эти дисульфидные связи, но достаточное связывание может быть достигнуто даже путем перемешивания при комнатной температуре.

Лекарственным веществом, связанным со вторым линкером, в данном эксперименте служило (6-малеимидокапроил)гидразоновое производное доксорубицина, обозначаемое DOXO-EMCH. Способ присоединения такого соединения, как DOXO-ЕМСН, которое имеет малеимидную группу, к тиоловой группе белка хорошо известен [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773, page 766; Emmanuel et al. (2010) Chemistry & Biology 2010(17): 213-227].

HR-Cys, очищенный по данному изобретению, смешивали с DOXO-EMCH в молярном соотношении 1:10 и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем удаляли не связавшийся DOXO-EMCH на обессоливающей колонке и оставшийся материал три раза промывали путем ультрафильтрации, в результате чего получали конъюгат доксорубицина и HR-Cys (HR-Cys-DOX). Полученный продукт проверяли путем абсорбционной спектрофотометрии в видимом и ультрафиолетовом диапазоне (UV-VIS), что показано на фиг. 3. Расчеты на основании коэффициентов поглощения белка и лекарственного вещества показывают, что на одну молекулу HR-Cys связывается две молекулы DOXO-EMCH.

4.2. Получение конъюгата лекарственного вещества (ММАЕ) с модифицированным антителом на основе трастузумаба

В данном изобретении монометилауристатин Ε (ММАЕ; см. химическую формулу 2 ниже), который, как известно, обладает гораздо более высокой цитотоксичностью, чем доксорубицин, объединяли с HR-Cys-GLy-Cys с образованием конъюгата герцептин-монометилауристатин Ε (HR-Cys2-MMAE). Монометилауристатин Ε, представляющий собой производное ауристатина, способное образовывать конъюгаты, связывается с тиол-специфичной малеимидной группой через валин-цитруллин (VC), который в клетках может быть расщеплен протеазой, и саморазрушающийся спейсер - пара-анилинбензойную кислоту (РАВА). Эта структура обозначается MC-VC-PAB-MMAE (МС - от малеимидокапроат), и метод ее синтеза хорошо известен (патент США №6214345; патент США №7745394). Обладающий высокой цитотоксичностью ауристатин подавляет пролиферацию клеток с IC₅₀=200-300 пМ.

Химическая формула 2. MC-VC-PAB-метилауристатин Ε

По данному изобретению к модифицированным антителам (трастузумабу) прибавляли 2-10 эквивалентов восстанавливающего агента ТСЕР и давали реакции восстановления тиоловых групп протекать в течение 30 минут при температуре 4°С, после чего в реакционную смесь прибавляли 2-10 эквивалентов MC-VC-PAB-MMAE и давали реакции протекать в течение 2-4 часов при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением избытка цистеина и не прореагировавшие MC-VC-PAB-MMAE и ТСЕР удаляли путем центрифугирования-фильтрации и диализа в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (PBS); в результате получали очищенный вариант трастузумаба-MC-VC-PAB-MMAE.

Чтобы убедиться в специфичности связывания полученного варианта трастузумаба-MC-VC-PAB-MMAE, проводили пептидное картирование полученного HR-M2(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE (ProteinWorks Co., Ltd., Дэчон, Корея). Результаты пептидного картирования показывают, что MC-VC-PAB-MMAE включен по остатку цистеина в пептиде, являющимся участком связывания лекарственного вещества на С-конце тяжелой цепи. Связывания лекарственного вещества с цистеином, происходящим из внутрицепочечных или межцепочечных дисульфидных связей легких или тяжелых цепей, не наблюдалось. Это позволяет полагать, что удалось успешно синтезировать вариант антитела по данному изобретению, с которым значительно повышается гомогенность конъюгата антитела и лекарственного вещества, специфично связываемого на С-конце тяжелой цепи.

4.3. Исследование избирательного конъюгирования модифицированных антител (трастузумаба) с помощью флуоресцентного красителя, содержащего малеимид. Alexa Flour® 488.

Чтобы проверить, избирательно ли связывается лекарственное вещество с остатком цистеина, введенным в С-конец тяжелой цепи трастузумаба, проводили реакцию каждого из модифицированных антител с флуоресцентным красителем Alexa Fluor® 488 замещенным тиол-специфичной малеимидной группой. Когда в молекуле белка остатки цистеина не участвуют в образовании внутримолекулярных дисульфидных связей, то такой белок обычно образует димеры за счет межмолекулярных дисульфидных связей. Однако, как показано на фиг. 2, антитело HR-Cys, полученное по данному изобретению, существует в виде мономера, что демонстрируется результатами электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга. Кроме того, имеющийся в белке остаток цистеина со свободной тиоловой группой может образовывать дисульфидную связь с присутствующим внутри клетки глутатионом или цистеином. Поэтому после связывания с лекарственным веществом через второй линкер требуется обработка восстанавливающим агентом, например дитиотреитолом (DTT) или трис(2-карбоксиэтилфосфином (ТСЕР), чтобы разорвать эти дисульфидные связи, но достаточное связывание может быть достигнуто даже путем перемешивания при комнатной температуре. Восстанавливающий агент в количестве 2-4 эквивалента может восстановить не только остаток цистеина, введенный в С-конец тяжелой цепи, но и внутрицепочечные дисульфидные связи в каждой из легких и тяжелых цепей, а также межцепочечные дисульфидные связи между легкой и тяжелой цепями. Таким образом, взятый флуоресцентный краситель может связаться с любым остатком цистеина, восстановленным восстанавливающим агентом. Если лекарственное вещество связывается по межцепочечным или внутрицепочечным дисульфидным группам, то снижается гомогенность конъюгата антитела с лекарственным веществом, и связанное лекарственное вещество, обладая относительно большими размерами, скорее всего ухудшит структурную стабильность и антигенную специфичность собственно антительного белка; по этой причине эффективность производства таких медико-биологических препаратов существенно снижается.

К модифицированным антителам (трастузумабу) прибавляли 2-4 эквивалента ТСЕР и оставляли на 30 минут при температуре 4°С для восстановления тиоловых групп. При этом образуется восстановленная форма, способная связываться с малеимидной группой, либо того варианта антитела, который присутствует в виде димера с дисульфидными связями, либо функциональной тиоловой группы цистеина, в ходе экспрессии связанной с окислителем. После реакции восстановления такой восстанавливающий агент, как DTT, который может взаимодействовать с малеимидной группой, должен быть удален, например, путем центрифугирования-фильтрации, но ТСЕР, не участвующий в реакции конъюгирования между малеимидной и тиоловой группами, удалять нет необходимости. К модифицированным антителам (трастузумабу) прибавляют 2-4 эквивалента Alexa Fluor® 488 и перемешивают в течение 2-4 часов при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением избытка цистеина, а не прореагировавший краситель и восстанавливающий агент удаляют путем центрифугирования-фильтрации. Полученный материал подвергают диализу против физиологического раствора, забуференного фосфатом (PBS), и в результате получают конъюгат красителя Alexa488 с модифицированным антителом (трастузумабом).

Полученный, как описано выше, конъюгат красителя Alexa488 с модифицированным антителом (трастузумабом) разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и определяют количество красителя, связанного с легкими и с тяжелыми цепями, при помощи сканирующей системы для анализа флуоресцентного свечения Typoon9410 (Amersharm Bioscience Ltd.). Результаты этого анализа показывают, что в случае вариантов антитела HR-Cys и HR-Cys-Gly-Cys с тяжелой цепью связывается больше красителя, чем с легкой. В случае HR-M(Cys), HR-M2(Cys), HR-M2L(Cys) и HR-Z(Cys) тоже с тяжелой цепью связывалось больше красителя, чем с легкой. Как видно на фиг. 4, в случае варианта антитела HR-M2(Cys) интенсивность флуоресценции красителя, связанного с тяжелой цепью, в 6 раз выше, чем красителя, связанного с легкой цепью. Эта разница в интенсивности флуоресценции свидетельствует, что с тяжелой цепью связывается гораздо больше красителя, чем с легкой, а значит можно полагать, что избирательность малеимидной группы в отношении тяжелой цепи значительно выше.

Пример 5. Определение сродства связывания ионов металла мотивом, связывающим ионы металлов.

Как говорилось выше, ионы металла связываются с пептидом, содержащим связывающий ионы металлов мотив CGH, и подавляют или задерживают окисление остатка цистеина, тем самым предотвращая реакцию сульфонирования, вызываемую переокислением цистеина. Окисление остатков цистеина может происходить двумя путями. В одном из них за счет тиол-тиолового взаимодействия создается дисульфидная связь, а в другом цистеин может также окисляться за счет взаимодействия с избытком кислорода воздуха с образованием промежуточного продукта - сульфеновой кислоты (R-S-OH). Образование дисульфидной связи является обратимой реакцией, в которой дисульфидная связь может быть восстановлена, так что образуется тиол, но образование сульфеновой кислоты в реакции с кислородом необратимо. Когда дисульфидная связь и сульфеновая кислота продолжительное время контактируют с кислородом, они окисляются до сульфоновой кислоты (R-SO3H) - эта реакция необратимая. Поскольку сульфеновая или сульфоновая кислоты не взаимодействуют с малеимиидом, окисление до сульфоновой или сульфеновой кислоты снижает реакционную способность антитела в отношении малеимида и таким образом может существенно повлиять на выход конъюгирования и гомогенность конъюгата антитело-лекарственное вещество.

Как говорилось выше, сообщалось о том, что пептид, который содержит синтетический мотив CGH, происходящий от связывающего ионы металлов мотива GGH который часто встречается in vivo, связывает ионы металлов и подавляет сульфонирование цистеина (Van Horn et al. (2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8: 601-610). Будучи выделены из клетки в процессе экспрессии, белки-антитела, в которых есть пептидный мотив, связывающий ионы металлов, могут связываться с присутствующими (в очень малых количествах) в культуральной среде ионами металлов и эффективно подавлять сульфонирование цистеина. Чтобы определить связывающую способность вариантов антител, содержащих этот пептидный мотив, связывающий ионы металлов, измеряли сродство связывания с помощью хорошо известного агента Fura-2 (Invitrogen, F-1200), образующего хелатные комплексы с ионами металлов. По результатам таких измерений HR-M2(Cys) характеризуется константой диссоциации (К4) около 20 нМ, что означает образование очень прочных связей с ионами металлов. Также для того, чтобы исследовать, связываются ли с ионами металлов варианты антител, содержащие связывающий ионы металлов мотив, и защищают ли они остатки цистеина, определяли скорость алкилирования. Оказалось, что эти варианты антител образовывали очень прочные связи с ионами цинка и таким образом подавляли алкилирование цистеина на срок до 24 часов по сравнению с тем, что наблюдалось в отсутствие ионов металлов. Ионы никеля связывались с мотивом CGH не столь прочно, как ионы цинка, что позволяет предполагать меньший ингибирующий эффект в отношении алкилирования цистеина в сравнении с ионами цинка. Однако по сравнению с буферным раствором без ионов металлов ионы никеля снижали скорость алкилирования цистеина. Когда для удаления ионов цинка из HR-M2(Cys) использовали сильный хелатирующий агент этилендиаминтетраацетат (EDTA), алкилирование цистеина происходило быстро, как в случае отсутствия добавленных извне ионов металлов.

Пример 6. Исследование подавления пролиферации клеток in vitro

6.1. Подавление пролиферации клеток конъюгатами доксорубицина с вариантами антител

Клетки ВТ-474 разводили средой DMEM/F12, содержащей 10% FBS, и по 100 мкл разбавленной суспензии клеток вносили в каждую лунку 96-луночного планшета (плотность посева 1×10⁴ клеток на лунку). Затем планшеты помещали на 24 часа в инкубатор с атмосферой 5% СО₂ при температуре 37°С. Брали: 1) герцептин; 2) смесь герцептина и доксорубицина 1:2; 3) полученный, как описано в примере выше, HR-Cys-DOX и 4) доксорубицин; каждый из них разводили культуральной средой и по 100 мкл каждого разведения вносили в лунки планшета (концентрации 1000 нМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 M и 0,1 нМ). Для отрицательного контроля в другие лунки вносили среду без лекарства. Инкубировали в течение 5 суток, после чего в каждую лунку прибавляли по 20 мкл реагента CellTiter 96-AQueous One Solution (количество живых клеток пропорционально поглощению цветного растворимого продукта - формазана, образующегося из реагента MTS под действием клеточных дегидрогеназ) и помещали на 2 часа в инкубатор при температуре 37°С. Для прекращения реакции в каждую лунку добавляли 20 мкл 10%-ного раствора SDS, после чего тщательно перемешивали, чтобы произошел лизис клеток. В каждой лунке измеряли поглощение с помощью спектрофотометра, определяли на основании этих данных долю (%) жизнеспособных клеток и строили графики, показанные на фиг. 5. В итоге было установлено, что эффект подавления клеточного роста HR-Cys-DOX в низких концентрациях сходен с таковым герцептина и смеси герцептина с доксорубицином (1:2), а в высоких концентрациях HR-Cys-DOX проявлял цитотоксичность, сходную с таковой доксорубицина. Эти результаты свидетельствуют, что HR-Cys-DOX сохраняет характерную функцию герцептина и в достаточной степени обладает цитотоксичностью, свойственной доксорубицину, несмотря на то, что доксорубицин связан с герцептином через второй линкер.

6.2. Подавление пролиферации клеток конъюгатами ММАЕ с вариантами антител

Клетки SK-BR3 разводили средой DMEM/F12, содержащей 10% FBS, и по 100 мкл разбавленной суспензии клеток вносили в каждую лунку 96-луночного планшета (плотность посева 1×10⁴ клеток на лунку). Затем планшеты помещали на 24 часа в инкубатор с атмосферой 5% СО₂ при температуре 37°С. Брали герцептин и полученные, как описано в примере выше, конъюгаты варианта антитела (герцептина)-МС-VC-РАВ-ММАЕ, разводили культуральной средой и вносили в лунки планшета в различных концентрациях (66,7 нМ; 33,3 нМ; 6,7 нМ; 3,3 нМ; 0,67 нМ; 0,33 нМ; 0,067 нМ и 0,0067 нМ). Для отрицательного контроля в контрольные лунки вносили среду без лекарства. Инкубировали в течение 5 суток, после чего в каждую лунку прибавляли по 20 мкл реагента CellTiter 96-AQueous One Solution (количество живых клеток пропорционально поглощению цветного растворимого продукта - формазана, образующегося из реагента MTS [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия] под действием клеточных дегидрогеназ) и помещали на 2 часа в инкубатор при температуре 37°С. В каждой лунке измеряли (с помощью спектрофотометра) поглощение при 490 нм и определяли на основании этих данных долю (%) жизнеспособных клеток. Все варианты конъюгатов (HR-Cys-MC-VC-PAB-MMAE, HR-Cys-Gly-Cys-MC-VC-PAB-MMAE, HR-M2(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE, HR-M(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE, HR-M2L(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE и HR-Z(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE) проявляли превосходную по сравнению с исходным антителом (герцептином) способность подавлять пролиферацию клеток. Как показано на фиг. 6, значение IC₅₀ для HR-M2(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE по меньшей мере в 5 раз меньше, чем для исходного антитела - герцептина (в качестве IC₅₀ для герцептина брали среднее между наибольшим и наименьшим значениями, поскольку в случае герцептина жизнеспособность клеток не снижалась до 50% или менее). Также жизнеспособность клеток при высоких концентрациях снижалась на около 85% в случаях конъюгатов антител с лекарственным веществом, но только на 40% в случае исходного антитела (герцептина). Эти результаты свидетельствуют, что конъюгаты антител с лекарственным веществом по данному изобретению обладают очень высокой цитотоксичностью и характеризуются очень низким IC₅₀ по сравнению с исходным антителом.

Пример 7. Исследование активации каспаз 3/7 in vitro

Клетки SK-BR3 разводили средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS, и по 100 мкл разбавленной суспензии клеток вносили в каждую лунку 96-луночного планшета (плотность посева 1×10⁴ клеток на лунку). Затем планшеты помещали на 24 часа в инкубатор с атмосферой 5% СО₂ при температуре 37°С. Герцептин и полученные, как описано в примере выше, конъюгаты модифицированных антител и лекарственного вещества разводили культуральной средой и вносили в лунки планшета в различных концентрациях (66,7 нМ; 33,3 нМ; 6,7 нМ; 3,3 нМ; 0,67 нМ; 0,33 нМ; 0,067 нМ и 0,0067 нМ). Для отрицательного контроля в контрольные лунки вносили среду без лекарства. Инкубировали 48 часов, после чего в каждую лунку прибавляли по 100 мкл реагента Caspase-Glo 3/7 (метод с использованием реагента Caspase-Glo 3/7 состоит в определении активности каспаз 3/7 по люминесценции продукта каспазного расщепления соответствующего субстрата, происходящего в клетках, в которых индуцирован апоптоз с участием каспазного каскада), инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре и измеряли люминесценцию при помощи люминометра.

Как показано на фиг. 7, в клетках, обработанных исходным антителом (герцептином), не наблюдалось каспазной активности или она была очень мала, а в клетках, обработанных HR-Cys2-MMAE, каспазная активность возрастала с увеличением концентрации HR-Cys2-MMAE. Эти результаты свидетельствуют, что лекарственное вещество ММАЕ, высвобождающееся из HR-Cys2-MMAE в клетках, куда этот конъюгат его доставил, вызывает апоптоз с участием каспаз; герцептин же этого эффекта не имеет.

Также, как показано на фиг. 8, в клетках, обработанных герцептином, не наблюдалось каспазной активности или она была очень мала, а в клетках, обработанных HR-M2(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE, каспазная активность возрастала с увеличением концентрации HR-M2(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE. Эти результаты свидетельствуют, что лекарственное вещество ММАЕ, высвобождающееся из HR-M2(Cys)-MC-VC-PAB-MMAE в клетках, куда этот конъюгат его доставил, вызывает апоптоз с участием каспаз; герцептин же этого эффекта не имеет.

Промышленное применение

Описанные выше модифицированные антитела и содержащие их конъюгаты с лекарственными веществами по данному изобретению благодаря своей высокой антигенной специфичности могут точно доставлять лекарственное вещество в клетки-мишени и тем самым усиливать его терапевтический эффект. Также расширяется применимость лекарственных веществ, в частности противораковых агентов, использование которых несмотря на высокую эффективность ограничено из-за их токсичности.

Изобретение относится к биохимии. Представлено модифицированное антитело, используемое для конъюгации с лекарственными веществами, которое на С-конце молекулы содержит цистеин-содержащий мотив, имеющий структуру, представленную формулой 1, приведенную в материалах заявки. Также представлен конъюгат указанного антитела и лекарственного средства и способы его получения. Изобретение расширяет арсенал терапевтических средств. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Модифицированное антитело, используемое для конъюгации с лекарственными веществами, которое на С-конце молекулы содержит цистеин-содержащий мотив, имеющий структуру, представленную формулой 1, приведенной ниже:

где (M_Cys)_n представляет собой связывающий ионы металлов мотив, содержащий 1-100 остатов цистеина; Ха представляет пептид, содержащий от 0 до 20 остатков аминокислот, отличных от цистеина; Xb_n представляет пептид, содержащий от 0 до 20 остатков аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A, G и S;
и n является целым числом от 1 до 20;
(M_Cys)₁ до (M_Cys)_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга, и Хb₁ до Xb_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга; и
связывающий ионы металлов мотив содержит цистеиновые остатки мотива цинковых пальцев, который содержит С₂Н₂ группу (класс Cys₂His₂: Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-X_3-5-His, X является аминокислотным остатком(ами), отличным от Cys) белка с цинковыми пальцами, Ser-Pro-Cys мотив мембранной АТФазы или мотив, содержащий CGH или HGC.

2. Модифицированное антитело по п. 1, в котором связывающий ионы металлов мотив, содержащий цистеин и имеющий структуру, представленную приведенной выше формулой 1, связан с концом тяжелой цепи исходного антитела.

3. Модифицированное антитело по п. 2, в котором связывающий ионы металлов мотив, содержащий цистеин и имеющий структуру, представленную приведенной выше формулой 1, связан с С-концом тяжелой цепи исходного антитела.

4. Модифицированное антитело по п. 1, в котором группа С₂Н₂ белка с цинковыми пальцами является любой выбираемой из группы, состоящей из:
(SEQ ID NO: 5),
(SEQ ID NO: 7),
(SEQ ID NO: 9),
(SEQ ID NO: 12),
(SEQ ID NO: 13),
(SEQ ID NO: 14),
(SEQ ID NO: 16),
(SEQ ID NO: 19),
(SEQ ID NO: 21),
(SEQ ID NO: 22),
(SEQ ID NO: 23),
(SEQ ID NO: 24),
(SEQ ID NO: 25),
(SEQ ID NO: 26),
(SEQ ID NO: 27),
(SEQ ID NO: 28),
(SEQ ID NO: 29),
(SEQ ID NO: 30),
(SEQ ID NO: 31),
(SEQ ID NO: 32),
(SEQ ID NO: 33),
(SEQ ID NO: 34),
(SEQ ID NO: 35),
(SEQ ID NO: 36),
(SEQ ID NO: 37),
(SEQ ID NO: 39),
(SEQ ID NO: 40),
(SEQ ID NO: 41),
(SEQ ID NO: 42),
(SEQ ID NO: 43),
(SEQ ID NO: 44),
(SEQ ID NO: 45),
(SEQ ID NO: 46),
(SEQ ID NO: 47),
(SEQ ID NO: 49),
(SEQ ID NO: 50),
(SEQ ID NO: 51),
(SEQ ID NO: 52),
(SEQ ID NO: 53),
(SEQ ID NO: 54),
(SEQ ID NO: 55),
(SEQ ID NO: 56),
(SEQ ID NO: 57),
(SEQ ID NO: 58),
(SEQ ID NO: 59),
(SEQ ID NO: 60),
(SEQ ID NO: 61), и
(SEQ ID NO: 62)
и
мотив CGH имеет структуру, представленную приведенной ниже химической формулой 1:
Химическая формула 1

где М представляет ион металла, R представляет остаток аминокислоты, отличной от цистеина.

5. Модифицированное антитело по п. 1, в котором исходное антитело является одним или более выбираемым из группы, состоящей из моноклонального антитела, биспецифичного антитела, гибридного антитела, человеческого антитела и гуманизированного антитела.

6. Модифицированное антитело по п. 1, в котором исходное антитело является одним или более выбираемым из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG и IgM.

7. Модифицированное антитело по п. 1, в котором исходное антитело обладает сродством связывания и специфичностью в отношении специфичных для рака антигенов; рецепторных белков клеточной поверхности; белков клеточной поверхности; трансмембранных белков; сигнальных белков; регуляторов выживания клетки; регуляторов клеточной пролиферации; молекул, ассоциированных с развитием или дифференцировкой тканей; лимфокинов; цитокинов; молекул, участвующих в регуляции клеточного цикла; молекул, участвующих в васкулогенезе, или молекул, ассоциированных с ангиогенезом.

8. Модифицированное антитело по п. 7, в котором исходное антитело обладает сродством связывания к одному или более белкам, выбираемым из группы, состоящей из:
(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенетического белка, тип IB, Genbank регистрационный номер NM_001203);
(2) Е16 (LAT1, SLC7A5, Genbank регистрационный номер NM_003486);
(3) STEAP1 (шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы, Genbank регистрационный номер NM_012449);
(4) 0772Р (СА125, MUC16, Genbank регистрационный номер AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, мегакариоцитарный потенцирующий фактор, мезотелин, Genbank регистрационный номер NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, член 2 семейства 34 переносчиков растворенных веществ (фосфата натрия), натрий-зависимый переносчик фосфата 3b типа II, Genbank регистрационный номер NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Семафорин 5b Hlog, sema домен, семь тромбоспондиновых повторов (тип 1 и подобные типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5В, Genbank регистрационный номер АВ040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN кДНК 2700050C12, Genbank регистрационный номер AY358628);
(9) ETBR (рецептор эндотелина типа В, Genbank регистрационный номер AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315, Genbank регистрационный номер NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ген, ассоциированный с раком предстательной железы, 1; белок, ассоциированный с раком предстательной железы, 1; шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы 2; шестой трансмембранный белок предстательной железы; Genbank регистрационный номер AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, рецептор катионного канала с транзиторным потенциалом, подсемейство М, член 4, Genbank регистрационный номер NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, тератокарциномный фактор роста, Genbank регистрационный номер NP_003203 или NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (рецептор C3d/вируса Эпштейна-Барр) или Hs.73792 Genbank регистрационный номер М26004);
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (ассоциированный с Ig-бета), B29, Genbank регистрационный номер NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (фосфатазный якорный белок, содержащий SH2-домен, 1a), SPAP1B, SPAP1C, Genbank регистрационный номер NM_030764);
(17) HER2 (Genbank регистрационный номер M11730);
(18) рецептор ErbB, выбираемый из EGFR, HER3 и HER4;
(19) NCA (Genbank регистрационный номер М18728);
(20) MDP (Genbank регистрационный номер ВС017023);
(21) IL20Rα (Genbank регистрационный номер AF184971);
(22) Бревикан (Genbank регистрационный номер AF229053);
(23) EphB2R (Genbank регистрационный номер NM_004442);
(24) ASLG659 (Genbank регистрационный номер АХ092328);
(25) PSCA (Genbank регистрационный номер AJ297436);
(26) GEDA (Genbank регистрационный номер AY260763);
(27) BAFF-R (рецептор фактора активации В-клеток, BLyS-рецептор, BR3, NP_443177.1);
(28) CD22 (изоформа В-клеточного рецептора CD22-B; NP_001762.1);
(29) CD79a (CD79A, CD79α, ассоциированный с Ig-альфа специфичный для В-клеток белок, который ковалентно взаимодействует с Ig-бета (CD79B) и образует комплекс на поверхности с молекулами IgM, передает сигнал, участвующий в дифференцировке В-клеток; Genbank регистрационный номер NP_001774.1);
(30) CXCR5 (рецептор 1 лимфомы Беркитта; рецептор, сопряженный с G белком, то есть активируемый хемокином CXCL13, действует при миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет роль в инфекции HIV-2 и, возможно, в развитии СПИДа, лимфомы, миеломы и лейкоза; Genbank регистрационный номер NP_001707.1);
(31) HLA-DOB (бета-субъединица молекулы МНС класса II (антиген 1а), который связывается с пептидами и представляет их (CD4⁺) Т-лимфоцитам; Genbank регистрационный номер NP_002111.1);
(32) Р2Х5 (пуринергический рецептор Р2Х лиганд-зависимый ионный канал 5, ионный канал, управляемый внеклеточным АТФ, может участвовать в синаптической передаче и нейрогенезе, недостаточность может вносить вклад в патофизиологическую картину идиопатической гиперактивности (нестабильности) детрузора; Genbank регистрационный номер NP_002552.2);
(33) CD72 (антиген CD72, ассоциированный с дифференцировкой В-клеток, Lyb-2; Genbank регистрационный номер NP_001773.1);
(34) LY64 (лимфоцитарный антиген 64 (RP105), мембранный белок семейства белков, богатых лейциновыми повторами (LRR) типа I, регулирует активацию В-клеток и апоптоз, утрата функции связана с агрессивностью заболевания у больных системной красной волчанкой); Genbank регистрационный номер NP_005573.1);
(35) FcRH1 (белок 1, подобный Fc-рецептору, предполагаемый рецептор для Fc-домена иммуноглобулинов, который содержит С2-тип Ig-подобных и ITAM-доменов, может играть роль в дифференцировке В-лимфоцитов; Genbank регистрационный номер NP_443170.1);
(36) IRTA2 (рецептор, ассоциированный с транслокацией, суперсемейства иммуноглобулинов 2, предполагаемый иммунорецептор, возможно, играющий роль в развитии В-клеток и лимфомагенезе; нарушение регуляции его гена в результате транслокации встречается при некоторых В-клеточных злокачественных новообразованиях; Genbank регистрационный номер NP_112571.1);
(37) TENB2 (предполагаемый трансмембранный протеогликан, родственный семейству факторов роста EGF/герегулин и фоллистатину; Genbank регистрационный номер AF179274);
(38) MAGE-C1/CT7 (белок, чрезмерно экспрессирующийся при раке яичка);
(39) рецептор андрогенов, PTEN, человеческая пептидаза, родственная калликреину, 3 (белок, чрезмерно экспрессирующийся при раке предстательной железы);
(40) CD20;
(41) CD30;
(42) CD33;
(43) CD52;
(44) EpCam;
(45) СЕА;
(46) gpA33;
(47) муцины;
(48) TAG-72;
(49) карбоангидраза IX;
(50) PSMA;
(51) белок, связывающий фолаты;
(52) ганглиозиды (GD2, GD3, GM2);
(53) гидрат/сахарид Lewis-Y;
(54) VEGF;
(55) VEGFR;
(56) aVb3;
(57) a5b1;
(58) ERB3;
(59) c-MET;
(60) EphA3;
(61) TRAIL-R1, TRAIL-R2;
(62) RANKL;
(63) FAP; и
(64) тенасцин.

9. Модифицированное антитело по п. 7, в котором исходное антитело представляет собой один или более выбираемых из группы, состоящей из трастузумаба, ритуксимаба, бевацизумаба, цетуксимаба, панитумумаба, ипилимумаба, алемтузумаба, офатумумаба, гемтузумаба, брентуксимаба, ⁹⁰Y-ибритумомаба, ¹³¹I-тозитумомаба, cBR96, cAClO, антитела к CD20, антитела к EphB2, антитела к IL-8, антитела к Е-селектину, антитела к MUC16, антитела к CD30, антитела к CD33 и антитела к CD52.

10. Конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества, для доставки лекарственного вещества к цели с высокой специфичностью, включающий лекарственное вещество, связанное с модифицированным антителом по любому из п. 1-9, в котором лекарственное вещество присоединено к тиоловой группе остатка цистеина в связывающем ионы металлов мотиве, связанном с исходным антителом и имеющим структуру, представленную приведенной выше формулой 1.

11. Конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества по п. 10, в котором лекарственное вещество присоединено к остатку цистеина в указанном мотиве через линкер, причем указанный мотив имеет структуру, представленную приведенной выше формулой 1, и связан с исходным антителом.

12. Конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества по п. 11, в котором линкер является одним или более выбираемым из группы, состоящей из производных алкилгалидов, содержащих галоацетильную группу; производных, содержащих малеимидную группу; производных азиридина; производных акрилоила и производных арилгалидов, содержащих фторбензол, или т.п.

13. Конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества по п. 12, в котором указанные производные содержат алкилирующую реакционноспособную группу, арилирующую реакционноспособную группу, малеимидную группу, азиридиновую группу, акрилоильную группу или дисульфидную группу, способную к обмену, включая пиридилдисульфид, или тионитробензойную кислоту, которая взаимодействует с тиоловой группой остатка цистеина в указанном мотиве и образует с ним ковалентную связь.

14. Конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества по п. 10, в котором лекарственное вещество является одним или более выбираемым из группы, состоящей из ингибиторов микротубулина, ингибиторов митоза, ингибиторов топоизомеразы или химиотерапевтических агентов, способных интеркалировать в ДНК, противораковых агентов, белковых токсинов, способных действовать как ферменты, микро-РНК (микроРНК), малых интерферирующих РНК (миРНК) или коротких РНК, содержащих шпильки кшРНК), которые могут подавлять экспрессию определенных онкогенов, и радиоактивных изотопов.

15. Конъюгат модифицированного антитела и лекарственного вещества по п. 10, в котором лекарственное вещество является одним или более выбираемым из группы, состоящей из майтансиноида, ауристатина, аминоптерина, актиномицина, блеомицина, тализомицина, камптотецина, N⁸-ацетилспермидина, 1-(2-хлорэтил)-1,2-диметилсульфонилгидразида, таксола, эсперамицина, этопозида, 6-меркаптопурина, доластатина, трихотецена, цитотоксического соединения СС1065, калихеамицина и других энедииновых антибиотиков, таксана, антрациклина, метотрексата, адриамицина, виндезина, алкалоидов барвинка, винкристина, винбластина, этопозида, доксорубицина, мелфалана, митомицина А, митомицина С, хлорамбуцила, даунорубицина, дауномицина и его стереоизомеров, изостеров, аналогов или производных, дуокамицина и его стереоизомеров, изостеров, аналогов или производных, нуклеолитических ферментов, антибиотиков, токсинов растительного, бактериального или животного происхождения, цисплатина, СРТ-11, доксорубицина, паклитаксела и доцетаксела.

16. Способ получения конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами, включающий:
(a) взаимодействие модифицированного антитела, в котором имеется структурный мотив, представленный приведенной ниже формулой 1, с линкерным агентом с образованием промежуточного соединения, в котором указанное антитело связано с линкером; и
(b) взаимодействие указанного интермедиата с активной молекулой/группировкой лекарственного вещества с образованием конъюгата модифицированного антитела и лекарственного вещества:

где (M_Cys)_n представляет связывающий ионы металлов мотив, который содержит 1-100 остатков цистеина; Ха представляют пептид из 0-20 остатков аминокислот, отличных от цистеина; Xb_n представляет пептид, содержащий от 0 до 20 остатков аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A, G и S; n - целое число от 1 до 20;
(M_Cys)₁ до (M_Cys)_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга, и Хb₁ до Xb_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга; и
связывающий ионы металлов мотив содержит цистеиновые остатки мотива цинковых пальцев, который содержит С₂Н₂ группу (класс Cys₂His₂: Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-Х_3-5-His, X является аминокислотным остатком(ами), отличным от Cys) белка с цинковыми пальцами, Ser-Pro-Cys мотив мембранной АТФазы или мотив, содержащий CGH или HGC.

17. Способ получения конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами, включающий:
(a) взаимодействие нуклеофильной группы лекарственного вещества с линкерным агентом с образованием интермедиата, в котором лекарственное вещество связано с линкером; и
(b) взаимодействие указанного интермедиата с антителом, содержащим мотив, имеющий структуру, представленную приведенной ниже формулой 1:

где (M_Cys)_n представляет связывающий ионы металлов мотив, который содержит 1-100 остатков цистеина; Ха представляют пептид из 0-20 остатков аминокислот, отличных от цистеина; Xb_n представляет пептид, содержащий от 0 до 20 остатков аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A, G и S; n - целое число от 1 до 20;
(M_Cys)₁ до (M_Cys)_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга, и Хb1 до Xb_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга; и
связывающий ионы металлов мотив содержит цистеиновые остатки мотива цинковых пальцев, который содержит С₂Н₂ группу (класс Cys₂His₂: Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-Х_3-5-His, X является аминокислотным остатком(ами), отличным от Cys) белка с цинковыми пальцами, Ser-Pro-Cys мотив мембранной АТФазы или мотив, содержащий CGH или HGC.

18. Способ получения модифицированных антител, в которых к исходному антителу присоединен мотив, причем этот способ включает следующие этапы:
(а) конструирование экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотидную последовательность, в которой путем рекомбинации соединены нуклеотидная последовательность, кодирующая указанный мотив, и нуклеотидная последовательность, кодирующая исходное антитело;
(b) экспрессия созданного экспрессионного вектора в культуре клеток-хозяев; и
(c) выделение модифицированных антител из культуры клеток и их очистка, причем указанный мотив имеет структуру, представленную нижеследующей формулой 1:

где (M_Cys)_n представляет связывающий ионы металлов мотив, который содержит 1-100 остатков цистеина; Ха представляют пептид из 0-20 остатков аминокислот, отличных от цистеина; Xb_n представляет пептид, содержащий от 0 до 20 остатков аминокислот, выбранных из группы, состоящей из A, G и S; n - целое число от 1 до 20;
(M_Cys)₁ до (M_Cys)_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга, и Xb₁ до Xb_n независимо друг от друга могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга; и
связывающий ионы металлов мотив содержит цистеиновые остатки мотива цинковых пальцев, который содержит С₂Н₂ группу (класс Cys₂His₂: Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-Х_3-5-His, X является аминокислотным остатком(ами), отличным от Cys) белка с цинковыми пальцами, Ser-Pro-Cys мотив мембранной АТФазы или мотив, содержащий CGH или HGC.

19. Способ по п. 18, в котором клетки-хозяева выбирают из группы, состоящей из обезьяньих почечных клеток 7 (COS7), клеток NSO, клеток SP2/0, клеток яичника китайского хомячка (СНО), клеток W138, почечных клеток новорожденного сирийского хомячка (BHK), собачьих почечных клеток линии Мадин-Дарби (MDCK), линий клеток миеломы, клеток HuT 78 и клеток HEK293.