СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ТЕРРИЛИТИНА Российский патент 2016 года по МПК C12N9/62 C07K1/34 C12R1/66 

Способ выделения протеолитического фермента террилитина (далее - Изобретение) относится к медицинской промышленности, поскольку протеолитический фермент террилитин применяется в медицине в качестве лекарственного средства, в хирургии, офтальмологии, гинекологии и других сферах медицины (А.С. СССР №860523, кл. С12N 9/62, 02.04.80. Способ получения протеолитического ферментного препарата Террилитина).

Кроме террилитина, в медицине применяются и другие протеолитические ферменты: трипсин и химотрипсин животного происхождения, коллагеназа из морских крабов, другие протеолитические ферменты, продуцируемые микроорганизмами [Введение в прикладную энзимологию. / Под ред. И.В. Березина. К. Мартинека. М.: МГУ, 1982. - 383 с.]. В настоящее время известны и были ранее описаны следующие методы очистки протеолитических ферментов.

В авторском свидетельстве (А.С. СССР №767121) подробно рассматривается процесс выделения очищенных трипсина и химотрипсина, которые могут быть использованы в медицине, биохимии, молекулярной биологии. В качестве исходного вещества используется панкреатин, выделяемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота и содержащий, кроме протеиназ, другие балластные белки. Выделение целевых ферментов присходит на вновь синтезированном сорбенте - бензил-хитине. Чистота фермента соответствует 90%.

В патенте RU 2003688 C1 дается описание процесса получения высокоочищенной протеиназы, предназначенной для применения в офтальмологии для лечения внутриглазных кровоизлияний. Сущность предлагаемого изобретения заключается в дополнительной очистке технического продукта протеиназы «Протосубтилина». Для очистки протеиназы применяется экстракция фермента из технического продукта, обессоливание, ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе и осаждение протеиназы ацетоном с последующей лиофилизацией. Для экстракции фермента используют воду или разбавленные растворы с 0,1-0,5 CaCl₂, pH 6,2-7,5. Обессоливание ведут на сефадексе G-25, в такой же среде ведут ионообменную хроматографию. Выход составляет 40-50%.

В патенте RU 2112035 C1 дается описание процесса получения протеиназы из бактерий рода Bacillus. Культуральную среду отделяют от биомассы микрофильтрацией и проводят последующую стерилизующую фильтрацию целевого ферментного раствора.

Ранозаживляющее средство на основе протеиназы «Коллагеназа КК» предлагается в патенте RU 2093166 C1. Сырьем для этого препарата является панцири крабов. Выделенные из крабов ферменты подвергаются очистке флокуляцией, микро- и ультрафильтрацией, причем продукт обладает несколькими видами ферментативной активности: коллагеназной и трипсиноподобной активностью. Поскольку гидролазы - весьма специфические ферменты, то такую смешанную активность следует интерпретировать как очистку низкого качества.

В патенте RU 2285038 C2 приводится описание способа получения протеиназы, продуцируемой Bacillus subtilis P1 при культивировании в питательной среде, содержащей минеральные соли, микроэлементы, мочевину, дрожжевой экстракт. Супернатант, отделенный сепарацией, осветляется микрофильтрацией и далее стерилизуется. Фермент обладает широким гидролизующим действием на различные белки: казеин, желатин, коллаген, альбумин, что также свидетельствует о низкой степени очистки продукта, состоящего из нескольких отдельных протеолитических компонентов.

Выделение лизоцима описано в патенте RU 2342431 C1, где указано, что основной этап очистки осуществляется сорбцией на силохроме С-80 и последующей гелевой хроматографией на сефадексе G-75.

Способ получения коллагенолитических ферментов, продуцируемых Clostridium histolyticum, описан в патенте WO 2007/089851 A2. Очистка коллагеназ осуществляется фильтрацией культуральной жидкости через колонну с сорбентом Mustang Q, высаливанием белка сульфатом аммония, гидрофобной хроматографией, очисткой на Q-сефарозе HP. Конечная лекарственная форма состоит из очищенного белка в трис-буфере с сахарозой, pH 8,0.

В патенте US 2011/0070622 A1 очистка протеиназы описывается на примере коллагеназы Clostridium histolyticum. Основные этапы очистки заключаются в различных видах хроматографии на сефарозах.

В патенте RU 2451076 C1 рассматривается способ получения генно-инженерной протеиназы, основным методом которого является хроматография, а именно металл-хелатная хроматография.

Технология получения клостридиальных коллагеназ описана в патенте WO 2012/125948 A1, где подробно анализируются вопросы культивирования, подбор питательных сред и затем методы очистки коллагенолитических ферментов. Технология очистки основывается на высаливании из культуральной жидкости суммы белков, в том числе коллагеназ, последующего диализа, хроматографии на гидроксиапатите, концентрации элюата ультрафильтрацией и окончательной хроматографии на анионите.

Как следует из материалов обзора, посвященного методам очистки протеолитических ферментов, большинство из них основано на применении хроматографических приемов с использованием различных видов хроматографии, начиная с гельпроникающей, вплоть до хелатообразующей.

В качестве наиболее близкого аналога может быть выбран способ, описанный в АС №860523, который основан на применении фильтрационных процессов. Это изобретение опирается на применение крупнопористых материалов с размером пор 600-800 Å (60-80 нм или ~ 800 кДа) на первом этапе и повторной фильтрации с целью концентрирования раствора на материалах с размером пор 150-180 Å (15-18 нм или ~ 200 кДа). Как утверждают авторы, выход при получении террилитина по описанному способу достигает 30-50%.

Такой выход, с нашей точки зрения, обусловлен непропорционально высокой пористостью фильтрующих мембран по сравнению с размерами белковой молекулы террилитина.

Действительно, если на первом этапе фильтрации используют мембрану с порами 600-800 Å, то это соответствует проницаемости макромолекул размером 800 кДа. Размер белковой макромолекулы террилитина порядка 30 кДа, поэтому можно сделать вывод, что террилитин на первом этапе фильтрации проходит в фильтрат с большим количеством высокомолекулярной примеси. На втором этапе фильтрации применение мембраны с размерами пор 150-180 Å (~ 200 кДа) обуславливает большие потери фермента, который в основном уходит в фильтрат, не задерживаясь в концентрате.

Задачей настоящего изобретения является разработка новой технологии получения высокоочищенного террилитина.

Сущность изобретения заключается в получении высокоочищенного фермента террилитина с использованием мембранных технологий с целью удаления высокомолекулярных балластных компонентов, а затем концентрирования и деминерализации раствора террилитина.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке промышленного способа получения высокоочищенного террилитина.

Нами последовательно применялись фильтрационные материалы с порогом отсечения по молекулярной массе 100-300 кДа на мембранах Pellicon® на первом этапе с целью удаления высокомолекулярных балластных компонентов, а затем на мембранах с порогом отсечения по молекулярной массе 2-5 кДа на мембранах Pellicon® на втором этапе с целью концентрирования и деминерализации раствора террилитина.

Пример 1

Культивирование гриба Aspergillus terricola Н-20 проводят на среде, содержащей KCl, MgSO₄, KH₂РО₄, FeSO₄, крахмал, казеин и CaCO₃. По завершении культивирования мицелий отделяли на картонном фильтре, причем в нативном растворе, собранном в количестве 370 л, протеолитическая активность составляла 6,5 ПЕ/мл. Общая протеолитическая активность в нативном растворе 2,405*10⁶ ПЕ. Примем эту величину за 100%. Первую ультрафильтрацию для удаления балластных белков с большей молекулярной массой, чем террилитин, провели на мембране (Pellicon®) с порами на 300 кДа. Вторая тангенциальная ультрафильтрация с целью концентрирования террилитина проходила на мембране с порогом отсечения по молекулярной массе 5 кДа (Pellicon®) с уменьшением объема раствора в 8,25 раз.

Общая протеолитическая активность составила 2,617*10⁶ ПЕ, что соответствует выходу по активности 108,8±10%.

На фиг. 1 показаны результаты гель-электрофоретического изучения образцов очищенного террилитина с различной концентрацией: столбец 2 - 519 мкг/мл, столбец 3 - 2424 мкг/мл. Столбец 1 отражает электрофоретическую подвижность стандартных белков сравнения, их молекулярная масса указана слева от столбца 1.

Пример 2

Культивирование проводили обычным образом, причем культуральной жидкости после отделения мицелия на картонном фильтре было собрано 276 л. Культуральную жидкость для предварительной очистки профильтровали через мембрану Pellicon® с порогом отсечения по молекулярной массе 300 кДа. В культуральной жидкости удельная активность составила 7,1 ПЕ/мл, а общая активность составила 1,960*10⁶ ПЕ. При первой фильтрации на мембране 300 кДа было собрано 272,5 л. Далее раствор был направлен для концентрирования на мембране Pellicon® с пористостью, соответствующей 5 кДа, причем было собрано 12 л с удельной активностью 139 ПЕ/мл. Выход по ферментативной активности составил 95±10%.

Пример 3

Общий объем осветленной культуральной жидкости составил 276 мл, которую профильтровали через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 300 кДа (Pellicon®) и затем сконцентрировали на мембране 10 кДа (Pellicon®). Выход по белку составил 44%, по активности 70,2±10%.

Пример 4

Собрали осветленную культуральную жидкость в количестве 800 мл, профильтрованную через мембрану Pellicon® с порогом отсечения по молекулярной массе порами 100 кДа. Далее сконцентрировали в 10,4 раза с помощью тангенциальной ультрафильтрации на мембране с порогом отсечения 2 кДа. Выход по белку составил 100,5%, по активности 107,2±10%. Скорость фильтрации на мембране 100 кДа составляла 1100 л/ч*м², на мембране 2 кДа - 2 мл/мин при давлении 2 бар или 120 л/ч*м².

Подводя итог экспериментальным результатам, следует отметить, что качество выделенного методами ультрафильтрации террилитина полностью соответствует требованию получения высокоочищенного индивидуального белка - фермента. При этом первая стадия фильтрации может осуществляться на мембранах 100-300 кДа, а последующая тангенциальная ультрафильтрация с целью получения концентрата фермента должна быть проведена на мембранах с порогом отсечения 2-5 кДа, лучше, для уменьшения потерь, - 2 кДа. Увеличение пористости мембраны на втором этапе до 10 кДа снижает выход по активности при получении фермента до 70±10%, но скорость процесса при этом возрастает. Применение на 2-м этапе мембран с пористостью 2-5 кДа обеспечивает выход не ниже 85±10%.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской промышленности. Предложен способ получения террилитина. Осуществляют культивирование Aspergillus terricola Н-20. Осветляют полученную культуральную жидкость и выделяют фермент. При этом на первой стадии осуществляют тангенциальную ультрафильтрацию культуральной жидкости на мембранах с порогом отсечения по молекулярной массе 100-300 кДа. На второй стадии проводят тангенциальную ультрафильтрацию с порогом отсечения по молекулярной массе 2-5 кДа. Способ позволяет получать высокоочищенный террилитин с выходом не ниже 85%. 1 ил., 4 пр.

Способ получения протеолитического фермента террилитина путем культивирования культуры Aspergillus terricola Н-20, осветления культуральной жидкости и выделения фермента, отличающийся тем, что фермент получают в две стадии:
1) первая стадия состоит из тангенциальной ультрафильтрации культуральной жидкости на мембранах с порогом отсечения по молекулярной массе 100-300 кДа;
2) вторая стадия - тангенциальная ультрафильтрация на мембранах с порогом отсечения по молекулярной массе 2-5 кДа.