ПРОМЫШЛЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПАКТИНА Российский патент 2016 года по МПК C12P17/06 C12P7/26 C12N1/14 C12R1/80 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенного компактина - промежуточного продукта для получения одного из ингибиторов биосинтеза холестерина в организме. Конкретно изобретение относится к способу получения компактина на основе штамма-продуцента компактина - Penicillium citrinum. Заявляемое изобретение обеспечивает высокорентабельное промышленное производство компактина с высокой степенью очистки.

Компактин является ингибитором фермента бета-гидрокси-метил-глутарил-КоА-редуктазы (HMG-CoA) и способен ингибировать ранние стадии биосинтеза холестерина. Поэтому производные компактина и родственные ему соединения (статины) широко применяются в качестве активного начала фармацевтических препаратов для снижения высокого уровня холестерина в крови.

Известно, что компактин является исходным ферментационным сырьем в технологии получения фармацевтической субстанции правастатина - одного из наиболее эффективных лекарственных препаратов, применяемых для лечения гиперлипопротеинемий IIa, IIb и III фенотипов.

Компактин подвергается конверсии в правастатин в результате биологической трансформации, при этом очень важно не вносить вместе с компактином дополнительное количество родственных примесей, особенно таких трудно отделяемых, как димер компактина, что позволяет снизить затраты по очистке конечного продукта - фармацевтической субстанции правастатина.

В настоящее время особое значение приобретают разработка новых технологичных и рентабельных способов получения компактина, которые стабильно обеспечивали бы высокий выход продукта при его промышленном получении.

Известны штаммы-продуценты компактина видов Penicillium citrinum и Penicillium adametzioides (US 3983140, 4049495, 5691173).

Однако продуктивность известных штаммов невысока, что не обеспечивает рентабельности процесса и высокого выхода продукта на конечной стадии.

Известны способы получения компактина путем культивирования штамма-продуцента компактина и многоступенчатого выделения целевого продукта, чаще всего в форме лактона, с заключительной стадией кристаллизации (RU 2114912, WO 98/50572). Основными недостатками описанных способов являются:

- недостаточная чистота целевого продукта, загрязнение его трудноотделяемыми примесями, такими как димер и кислотные формы компактина;

- низкие экономические показатели, недостаточный выход целевого продукта (50-60%);

- сложность и многостадийность технологии, использование дорогостоящего оборудования.

Наиболее близким аналогом промышленного способа получения компактина является способ получения компактина, в котором культуральную жидкость штамма-продуцента после ферментации подвергают щелочной обработке и очищают с помощью щелочи. После этого целевой продукт выделяют в кислых условиях экстракцией гидрофобным растворителем, после чего осуществляют кристаллизацию, экстрагент концентрируют и затем проводят экстракцию слабым основанием, целевой продукт выделяют кристаллизацией (WO/2001/062949).

Известный способ не обеспечивает получение целевого продукта достаточной степени чистоты и с высоким выходом, способ является многостадийным, трудоемким, требует использования больших объемов токсичных органических растворителей.

Техническим результатом заявленного изобретения - промышленного способа получения компактина на основе штамма-продуцента - Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 - является получение продукта высокого качества, с суммарным содержанием примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5% и выходом продукта не менее 65%.

Для достижения указанного технического результата и обеспечения высокопроизводительного получения компактина предлагается основанный на использовании штамма-продуцента Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 промышленный способ получения компактина, предусматривающий культивирование указанного штамма-продуцента в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы, источники азота и минеральные соли, выделение компактина путем экстракции его органическим растворителем, очистку целевого продукта кристаллизацией и перекристаллизацией, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099;

- полученную культуральную жидкость подкисляют минеральной кислотой до pH 2,5-3,5 и выдерживают в течение 1-2 ч;

- экстракцию компактина проводят из мицелия органическим растворителем - бутилацетатом в три ступени;

- экстракты очищают активированным углем;

- очищенный экстракт концентрируют отгонкой бутилацетата при пониженном давлении, затем добавляют минеральную кислоту и нагревают до 85-90°C при пониженном давлении до полной лактонизации компактина;

- после кристаллизации осуществляют перекристаллизацию компактин-лактона из водного раствора изопропанола при комнатной температуре и периодическом перемешивании в течение 1-2 часов, затем при 6-10°C в течение не менее 4 часов с выделением компактина.

Используемый для получения компактина штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 получен из штамма Penicillium citrinum SANK 18767 методом последовательного индуцированного мутагенеза. (Ukraintseva S.N., Voinova Т.М., Dzhavakhiya V.G. «Obtaining the highly productive mutants Penicillium citrinum producing compactin and optimization of fermentation process in shaken flasks» Biotechnology in Biology and Medicine. Editor A.M. Egorov and G. Zaikov, New York, 2006; Украинцева C.H., Воинова T.M., Джавахия В.Г. «Повышение активности гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования высокопродуктивных штаммов». Материалы 3-й международной конференции из серии "Наука и бизнес", 19-21 июня 2006, Пущино, с. 72-75, 2006 г.)

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика под номером F-1099.

Техническим результатом приведенной совокупности существенных признаков является получение продукта с содержанием основного вещества не менее 97%, суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью димера не более 0,5%. Выход продукта составляет не менее 65%.

Кроме того, штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 является высокопродуктивным по компактину и стабильным по своим культуральным и физиолого-биохимическим характеристикам, что позволяет эффективно применять его в процессе биосинтеза компактина и получать культуральную жидкость с высоким содержанием компактина (10-12 мг/г). Высокая продуктивность данного штамма обеспечивает высокий выход целевого продукта и рентабельность его производства.

Таким образом, преимуществом заявленного способа является практически полный переход компактина в лактонную форму и минимальное содержание в продукте примеси в виде димера, что подтверждено представленными в описании примерами.

Предлагаемая технология получения компактина апробирована на пилотных ферментационных установках объемом 10 и 100 литров и пилотной установке химочистки.

В результате исследования была разработана технология процесса ферментации и химической очистки, обеспечивающая заданные цели - получение высококачественного и рентабельного продукта.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Проводят выращивание посевного материала и аппаратную ферментацию с дозированным или постоянным внесением дополнительного источника углеводного питания, регулированием содержания растворенного кислорода, опосредованным регулированием кислотности культуральной жидкости. Это позволяет получить культуральную жидкость с концентрацией компактина 10-12 мг/г и низким содержанием родственных примесей.

Выращивание посевного материала проводят в инокуляторе на посевной питательной среде в течение 48-55 часов при 24°C, при постоянном перемешивании и аэрации. В качестве исходного посевного материала используют споровую культуру, выращенную на агаризованной среде или ячмене. Споровая нагрузка при засеве посевного аппарата составляет 0,75·10⁵-1,25·10⁵ спор/мл.

Процесс биосинтеза проводят на ферментационной питательной среде в течение 192-264 часов. Посевной материал из инокулятора передается на ферментацию в объеме 8-10% от загруженной ферментационной среды. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 25-40% путем регулирования скорости перемешивания среды, аэрации и избыточного давления в пределах 0,2-0,5 ати.

В процессе ферментации в культуральную жидкость вносят добавку:

1) 50%-ный раствор сахарозы в объеме, равном 11-12% от объема первоначально загруженной питательной среды. Повторяют при снижении концентрации сахарозы в культуральной жидкости;

или

2) 50%-ный раствор сахарозы с переменной скоростью 0,0025-0,0045 м³/м³·ч (объем добавки/объем загруженной среды в час) для поддержания концентрации сахарозы в культуральной жидкости на постоянном уровне, что также позволяет поддерживать pH культуральной жидкости на постоянном уровне.

Полученная таким образом культуральная жидкость с содержанием компактина 10-12 мг/г передается на стадию выделения и химической очистки.

Как правило, основной формой использования компактина является лактон, так как он легко кристаллизуется, хорошо очищается от примесей, стабилен при хранении, однако используется и натриевая форма компактина. Поэтому получение целевого продукта в форме лактона или натриевой соли имеет свои особенности.

Получение компактин-лактона методом экстракции

В предложенном способе выделения компактин-лактона экстракция компактина осуществляется органическим растворителем не из ферментационного бульона, что требует оборудования типа декантеров, а из мицелия, на котором осаждается присутствующий в культуральной жидкости компактин в лактонной и кислой форме при подкислении культуральной жидкости минеральными кислотами до pH 2.5-3,5 и выдержке в течение 1-2 часов.

Для достижения практически 100% выхода по стадии, в данном изобретении экстракция органическим растворителем осуществляется в 3 ступени, с соблюдением оптимальных условий на каждой ступени.

Так как компактин получают в виде лактона, основной стадией процесса является стадия лактонизации.

Предлагаемая очистка экстракта перед стадией концентрирования и лактонизации активированным углем, а также использование минеральной кислоты в качестве катализатора процесса лактонизации, оптимальный режим концентрирования и лактонизации обеспечивают степень лактонизации не менее 99% за 3-6 часов при минимальном содержании примесей. Дополнительно кристаллы лактона промываются для полного избавления от примесей водным щелочным раствором.

Преимуществом заявленного способа лактонизации является:

- практически полный переход компактина в лактонную форму;

- минимальное содержание в продукте примеси в виде димера,

В отличие от ближайшего аналога, кристаллизацию целевого продукта ведут из водного раствора изопропанола при комнатной температуре (25°C) с периодическим перемешиванием в течение 1-2 часов, затем при Т=6-10°C в течение не менее 4 часов. Получают продукт с чистотой не менее 90%, выходом 75%, суммарным содержанием примесей не более 1,5%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5%.

С целью получения высокоочищенного целевого продукта дополнительно включена стадия перекристаллизации в органическом растворителе, либо перевод лактона в натриевую соль компактина с дополнительной очисткой целевого продукта активным углем. Получают продукт с содержанием основного вещества не менее 95%, суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5% и выходом продукта не менее 65%.

Получение натриевой соли компактина

Натриевую соль компактина с содержанием основного вещества не менее 98% (ВЭЖХ), суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5% и выходом от теории 88% получают из компактин-лактона. Компактин-лактон растворяют в смеси изопропилового спирта и воды, затем проводят делактонизацию путем добавления NaOH (pH 11-12) и при температуре 40°C. Затем водно-изопропанольную смесь нейтрализуют до pH 9.0-9.5 и отгоняют изопропиловый спирт на роторном испарителе при пониженном давлении и температуре 45°C. Компактин экстрагируют бутилацетатом из водного раствора при кислом pH, водную фазу отделяют, экстракт очищают активным углем, фильтруют и промывают. Для получения натриевой формы компактина к экстракту добавляют NaOH до pH 9.0-9.5, органическую фазу удаляют. С целью концентрирования водного раствора и кристаллизации отгоняют воду в виде азеотропа с изопропиловым спиртом при пониженном давлении и температуре 45°C. Выпавшие кристаллы натриевой соли компактина фильтруют, промывают и сушат.

Преимуществами данной технологии являются:

- экономичность метода;

- отсутствие побочных продуктов;

- выход конечного продукта - 88% от теории;

- высокое качество получаемой натриевой соли компактина - содержание основного вещества не менее 98% (ВЭЖХ); сумма примесей не более 1.0%, единичная максимальная примесь димер не более 0.5%;

- использование типичного для химического производства оборудования.

ПРИМЕР 1

Выращивание посевного материала штамма Penicillium citrinum F-1099 ВКПМ проводят в аппарате вместимостью 10 л на посевной питательной среде следующего состава (на 1 л среды):

- соевая мука - 20 г;

- пептон (триптон) - 10 г;

- сахароза - 100 г;

- натрия нитрат - 2 г;

- магния сульфат семиводный - 1 г;

- вода дистиллированная - до 1 л;

- щелочь (KOH или NaOH) или кислота (HCl) до pH 6,0-6,2.

Посевную среду стерилизуют в аппарате при 120°C 30 минут.

Посев посевного аппарата проводят споровым посевным материалом, выращенным на агаризованной среде, споровая нагрузка составила 1,0·10⁵ спор/мл. Выращивание посевного материала в посевном аппарате проводят в течение 44 часов при 24°C, перемешивании и аэрации. В момент передачи посевного материала в ферментационный аппарат объемная биомасса продуцента составляет 15,2%. Посевной материал передают на ферментацию в объеме 8% от загруженной ферментационной среды.

Культуру штамма Penicillium citrinum F-1099 ВКПМ выращивают в аппарате вместимостью 10 л в течение 211 часов на ферментационной питательной среде следующего состава (на 1 л среды):

- соевая мука - 30 г;

- пептон (триптон) - 10 г;

- дрожжевой экстракт - 3 г;

- сахароза - 100 г;

- натрия нитрат - 5 г;

- магния сульфат семиводный - 1 г;

- вода дистиллированная - до 1 л;

- щелочь (KOH или NaOH) или кислота (HCl) до pH 5,8-6,0.

Ферментационную среду стерилизуют в аппарате при 120°C 30 минут.

В процессе ферментации регулируют подачу воздуха, скорость перемешивания среды, избыточное давление, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 30-40%. На 73, 101 и 129 часы роста вводят 50%-ный раствор сахарозы в объеме 9,2% к начальному объему среды (по 600 мл при начальном объеме 6,5 л). Массовая доля компактина в культуральной жидкости на момент слива составляет 10,61 мг/г при массовой доле углеводов 0,28%, объемной биомассе 42,5% и pH 5,75. Слито из аппарата 6,2 кг культуральной жидкости, фактический съем компактина в культуральной жидкости составляет 70,2 г.

961,5 см³ (1000 г) культуральной жидкости, полученной культивированием Penicillium citrinum штамм F-1099 ВКПМ, содержащей 11 г компактина, подкисляют минеральной кислотой до pH 2,5-3.5, выдерживают в течение 30 мин. Биомассу фильтруют, промывают подкисленной водой, тщательно отжимают. Проводят экстракцию компактина из мицелия бутилацетатом в три ступени. Экстракты объединяют, очищают активным углем (9,4 г). Очищенный экстракт концентрируют отгонкой бутилацетата при пониженном давлении, в концентрат добавляют 3 см³ минеральной кислоты и продолжают нагрев при пониженном давлении и температуре 85-90°C в течение 3 часов до полной лактонизации компактина. Для очистки от примесей реакционную массу промывают щелочным раствором и водой. Промытые кристаллы лактона компактина растворяют в изопропиловом спирте, кристаллизуют и высушивают. Получают 8,3 г компактина с содержанием не менее 90%. Далее проводят перекристаллизацию из изопропилового спирта. Выход компактина составляет 65,6%, содержание основного вещества 99% (ВЭЖХ).

ПРИМЕР 2

10 г компактина-лактона с содержанием основного вещества 93,6% растворяют в смеси изопропилового спирта и воды и проводят делактонизацию при перемешивании, температуре 40°C и pH 11-12 (добавление NaOH). Затем кислотой доводят pH до 9,0-9,5 и на роторном испарителе из смеси отгоняют изопропиловый спирт при пониженном давлении и температуре 45°C. Из водного раствора компактин экстрагируют бутилацетатом при pH 3.0, водную фазу отделяют. Бутилацетатный экстракт очищают активированным углем, фильтруют и промывают. Для получения натриевой формы компактина к экстракту при перемешивании добавляют NaOH до pH 9.0-9.5, выдерживают 30 мин, органическую фазу удаляют. С целью концентрирования раствора и кристаллизации натриевой соли компактина на роторном испарителе отгоняют воду в виде азеотропа с изопропиловым спиртом при пониженном давлении и температуре 45°C. Выпавшие кристаллы натриевой соли компактина фильтруют, промывают и сушат. Получают 10,2 г компактина в форме натриевой соли с содержанием основного вещества 97,5% (ВЭЖХ), суммой примесей 0,19%. Выход от теории составляет 87,7%.

ПРИМЕР 3

Выращивание посевного материала штамма Penicillium citrinum F-1099 ВКПМ проводят в аппарате вместимостью 10 л на посевной питательной среде в течение 43 часов при 24°C, перемешивании и аэрации. Аппарат засевают споровым посевным материалом, выращенным на агаризованной питательной среде, споровая нагрузка составляет 0,8·10⁵ спор/мл. В момент передачи посевного материала в ферментационный аппарат объемная биомасса продуцента составляет 18,1%. Посевной материал передают на ферментацию в объеме 8% от загруженной ферментационной среды.

Культуру штамма Penicillium citrinum F-1099 ВКПМ выращивают в аппарате вместимостью 10 л в течение 192 часов на ферментационной питательной среде. Регулируют подачу воздуха, скорость перемешивания среды, избыточное давление, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 25-40%. С 73 часа роста и до конца ферментации непрерывно вводят 50%-ный раствор сахарозы с удельной скоростью 0,0025-0,0035 м³/м³·ч (объем добавки/объем загруженной среды в час). Массовая доля компактина в культуральной жидкости на момент слива составляет 9,74 мг/г при следовом количестве углеводов, объемной биомассе 43,1% и pH 5,92. Слито из аппарата 6,3 кг культуральной жидкости, фактический съем компактина в культуральной жидкости составляет 61,4 г.

1021 г культуральной жидкости, содержащей 9,9 г компактина, подкисляют серной кислотой до pH 2,75, выдерживают в течение 1 ч. Биомассу фильтруют, промывают подкисленной водой, тщательно отжимают. Проводят экстракцию компактина из мицелия бутилацетатом в три ступени. Экстракты объединяют, очищают активным углем (9,7 г). Очищенный экстракт концентрируют отгонкой бутилацетата при пониженном давлении с 3,4 мл серной кислоты и температуре 85°C до полной лактонизации компактина. Для очистки от примесей реакционную массу дважды промывают раствором соды и водой. Промытые кристаллы лактона компактина растворяют в изопропиловом спирте, кристаллизуют и сушат. Получают 8,2 г компактина с содержанием 94,7%. Далее проводят перекристаллизацию из изопропилового спирта. Получают 7,12 г с содержанием основного вещества 98,3% (ВЭЖХ), суммой примесей 0,6%. Выход компактина составляет 71,9%.

ПРИМЕР 4

Выращивание посевного материала штамма Penicillium citrinum F-1099 ВКПМ проводят в аппарате вместимостью 10 л на посевной питательной среде в течение 42 часов при 24°C, перемешивании и аэрации. Аппарат засевают споровым посевным материалом, выращенным на ячмене, споровая нагрузка составляет 1,0·10⁵ спор/мл. В момент передачи посевного материала в ферментационный аппарат объемная биомасса продуцента составляет 15,6%. Посевной материал передают на ферментацию в объеме 8% от загруженной ферментационной среды.

Культуру штамма Penicillium citrinum F-1099 ВКПМ выращивают в аппарате вместимостью 100 л в течение 193 часов на питательной среде КЗ. Регулируют подачу воздуха, скорость перемешивания среды, избыточное давление, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 35-40%. С 74 часа роста и до конца ферментации непрерывно вводят 50%-ный раствор сахарозы со скоростью 0,0025-0,0040 м³/м³·ч (объем добавки/объем загруженной среды в час). Введением добавки удерживают pH культуральной жидкости на уровне 6,0-6,4. Массовая доля компактина в культуральной жидкости на момент слива составляет 9,4 мг/г при массовой доле углеводов 0,4%, объемной биомассе 47,8% и pH 5,93. Слито из аппарата 68 л культуральной жидкости, фактический съем компактина в культуральной жидкости составляет 639 г.

Культуральную жидкость подкисляют серной кислотой до pH 2,67, выдерживают в течение 1 ч. Биомассу фильтруют, промывают подкисленной водой, тщательно отжимают. Проводят экстракцию компактина из мицелия 15,3 кг бутилацетатом 86 л в три ступени. Экстракты объединяют, очищают активированным углем. Очищенный экстракт концентрируют отгонкой бутилацетата на установке Laborota-20 при пониженном давлении, в концентрат добавляют 194,3 см³ концентрированной минеральной кислоты и продолжают нагрев при пониженном давлении и температуре 85°C в течение 5 часов до полной лактонизации компактина. Для очистки от примесей лактонизированную массу дважды промывают щелочным водным раствором. Промытые кристаллы лактона компактина растворяют в изопропиловом спирте, кристаллизуют при температуре 6-8°C и сушат. Получают 484,7 г компактина с содержанием 92,1%. Далее проводят перекристаллизацию из органического растворителя. Получают 421,7 г компактин лактона с содержанием основного вещества 97.8%(ВЭЖХ), суммой примесей 0,9%, единичной 0.3% Выход компактина от культуральной жидкости составляет 66%.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен промышленный способ получения компактина. Осуществляют культивирование штамма-продуцента Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы, источники азота и минеральные соли. Полученную культуральную жидкость подкисляют минеральной кислотой до pH 2,5-3,5 и выдерживают в течение 1-2 ч. Экстрагируют компактин из мицелия бутилацетатом в три ступени. Экстракты очищают активированным углем. Очищенный экстракт концентрируют отгонкой бутилацетата при пониженном давлении. Затем добавляют минеральную кислоту и нагревают до 85-90°C при пониженном давлении до полной лактонизации компактина. Осуществляют кристаллизацию компактин-лактона. Затем осуществляют перекристаллизацию компактин-лактона из водного раствора изопропанола при комнатной температуре и периодическом перемешивании в течение 1-2 часов, затем при 6-10°C в течение не менее 4 часов с выделением компактина. Получают продукт с содержанием компактина не менее 97%, суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью димера не более 0,5%. Выход продукта составляет не менее 65%. 4 пр.

Промышленный способ получения компактина, предусматривающий культивирование штамма-продуцента в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы, источники азота и минеральные соли, выделение компактина путем экстракции его органическим растворителем, очистку целевого продукта кристаллизацией и перекристаллизацией, отличающийся тем, что
- в качестве продуцента используют штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099;
- полученную культуральную жидкость подкисляют минеральной кислотой до pH 2,5-3,5 и выдерживают в течение 1-2 ч;
- экстракцию компактина проводят из мицелия органическим растворителем - бутилацетатом в три ступени;
- экстракты очищают активированным углем;
- очищенный экстракт концентрируют отгонкой бутилацетата при пониженном давлении, затем добавляют минеральную кислоту и нагревают до 85-90°C при пониженном давлении до полной лактонизации компактина;
- после кристаллизации осуществляют перекристаллизацию компактин-лактона из водного раствора изопропанола при комнатной температуре и периодическом перемешивании в течение 1-2 часов, затем при 6-10°C в течение не менее 4 часов с выделением компактина.