СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛОВАСТАТИНА Российский патент 1998 года по МПК C12P17/06 C12P7/26 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии и к способу выделения гиполипемического активного вещества ловастатина из бродильного бульона. Ловастатин вырабатывается как вторичный метаболит гриба Aspergillus terreus (US 4231938), хранящегося в Американской Коллекции Типированных Культур под номерами АТСС 20541, АТСС 20542, и Monascus ruber хранящегося в Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Министерства международной торговли и промышленности, Япония (DE 3006216 А1) под номером Ferm 4822.

Известны также другие виды микроорганизмов, вырабатывающих ловастатин, например мутант микроорганизма Aspergillas terreus и Aspergillus oryzae обозначенный АТСС 74135.

Ловастатин химически представляет собой 5-лактон 1',2',6',7',8а',-гексагидро-3,5-дигидрокси-2, '6'диметил-8'-2''-метил- 1''-оксобутокси)-1-нафталин гептановой кислоты (Stubbs и др., 1986) формулы [1].

Активная форма ловастатина также является кислотой, которая химически представляет собой 1,2,6,8,8а-гексагидро- β,δ -дигидрокси-1-нафталин гептановую кислоту (Alberts и др., 1980) формулы [2].

Лактонная форма ловастатина применяется в качестве агента, снижающего уровень холестерина в крови (Scott M.G. и Vega G.L., 1985). Она ингибирует биосинтез мевалоновой кислоты посредством ингибирования З-гидрокси-З-метилглутарилкофермент А-редуктазы (HMG-СоА-редуктаза, E.C.1.1.1.34) (Zubay и др., 1964).

После завершения ферментации ловастатин присутствует в бульоне в форме лактона (соединение I) и в форме кислоты (соединение II). Наиболее близким по технической сущности к заявленному является способ выделения [3], в котором ловастатин экстрагируют из бульона этилацетатом. Этот экстракт концентрируют перегонкой в вакууме. Поскольку ловастатин присутствует как в лактонной, так и в кислотной форме, и только лактон представляет коммерческий интерес, кислотную форму необходимо превратить в лактон. Лактонизацию выполняют посредством нагревания с вертикальным холодильником этого концентрата в толуоле при 106^oC течение 2 ч. После завершения лактонизации раствор концентрируют до малого объема. Чистое вещество получают посредством очистки концентрата на колонках с силикагелем в присутствии растворителей, таких как этилацетат или н-гексан. Собранные фракции снова концентрируют в вакууме, и затем чистый ловастатин кристаллизуется в лактонной форме.

Благодаря сложной многоэтапной процедуре и жестким условиям выделения, выходы ловастатина обычно низкие. Используются различные растворители, частью проявляющие токсичность, такие как бензол, толуол, ацетонитрил или этилацетат. Следовательно, работа с этими растворителями угрожает здоровью людей, занятых в этом процессе, и представляет проблему для окружающей среды.

Задачей изобретения является создание эффективного и экономичного способа выделения ловастатина. Помимо этого, необходимо уделить внимание вопросам здоровья рабочих, занятых выделением ловастатина, и окружающей среде.

Поставленная задача достигается способом, включающим экстракцию ловастатина из сырья, полученного на основе гриба-продуцента ловастатина, концентрирование экстракта при пониженном давлении и кристаллизацию целевого продукта, при этом экстракцию ловастатина проводят бутилацетатом из культуральной жидкости, ее фильтрата или мицелия гриба-продуцента, а концентрирование экстракта ведут при температуре выше 40^oC. В способе изобретения используют гриб-продуцент, предпочтительно относящийся к роду Aspergillus, в особенности к виду Aspergillus terreus или Aspergilius oryzae. Наиболее предпочтительно, когда в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

В соответствии со способом изобретения ловастатин может быть получен исключительно в лактонной форме. Неожиданно было обнаружено, что применяемый растворитель, т. е. бутилацетат, обладает свойствами, облегчающими достижение этой цели. А именно, в процессе лактонизации выделяется вода и ее необходимо удалять из реакционной среды. Поскольку бутилацетат обладает более высокой температурой кипения и не образует в значительной степени азеотропных смесей с водой при данных условиях, практически вся вода, которая образуется в процессе лактонизации, может быть удалена.

Благодаря способу изобретения возможно значительное сокращение времени выделения ловастатина. Поскольку бутилацетат можно применять для экстрагирования ловастатина из образца, и в то же время для выполнения лактонизации могут быть устранены токсические эффекты других растворителей. Этот процесс можно воспроизвести в промышленных масштабах с конечными выходами около 60%, независимо от того, производится ловастатин микроорганизмами интрацеллюлярно или экстрацеллюлярно, в лактонной или в кислотной форме.

Выделенное вещество является тем же веществом, которое выделяют в соответствии с ранее известными способами. Структура подтверждена ИК-спектроскопией (фиг. 1), масс-спектроскопией (фиг. 2), ЯМР (фиг. 3) и УФ-спектроскопией (фиг. 4).

Пример 1. Бродильный бульон (1000 мл), полученный ферментацией в течение 120 ч Aspergillus terreus (АТСС 20452) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135), имеющий pH 4,8 и содержание ловастатина 300 мкг/мл (лактон+кислота), подкисляют HCl (36%) до pH 3-5. Бродильный бульон затем охлаждают до температуры ниже 20^oC, добавляют бутилацетат и экстрагируют при этой температуре в течение 4 ч. После завершения экстракции его центрифугируют и разделяют водную и органическую фазы. Мицелий и водную фазу удаляют, а органическую фазу подвергают дальнейшей обработке. Ее концентрирование осуществляют перегонкой при пониженном давлении 85-88 м бар при температуре 58-60^oC до объема 50 мл. Одновременно с концентрированием проводят лактонизацию. Концентрат затем охлаждают до температуры ниже 20^oC и оставляют на несколько часов для кристаллизации ловастатина. Полученный сырой продукт подвергают перекристаллизации. Получают ловастатин (170 мг) в лактонной форме, очищенный более чем на 90%.

Пример 2. Ферментационный бульон (1000 мл), полученный ферментацией в течение 120 ч Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135), имеющий pH 4,73 и содержание ловастатина 190 мкг/мл (лактон+кислота) в фильтрате и 15 мкг/мл в мицелии, подкисляют HCl (36%) до pH 3-5. Бульон фильтруют через фильтр Оливера. Мицелий удаляют, фильтрат охлаждают до температуры ниже 20^oC и добавляют половину объема бутилацетата. Экстракцию осуществляют в течение 1 ч, дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Получают ловастатин (79 мг) в лактонной форме, очищенный более чем на 90%.

Пример 3. Ферментационный бульон (1000 мл), полученный ферментацией в течение 120 ч Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135), имеющий pH 4.78 и содержание ловастатина 5 мкг/мл (лактон+кислота) в фильтрате и 300 мкг/мл в мицелии, подкисляют HCl (36%) до pH 3-5 и центрифугируют. Фильтрат удаляют, к мицелию добавляют 4-кратный объем бутилацетата и охлаждают его до температуры ниже 20^oC. Экстракцию осуществляют в течение 4 ч с последующим центрифугированием. Мицелий отделяют, а фильтрат обрабатывают, как в примере 1. Получают ловастатин (90 мг) в лактонной форме, очищенный более чем на 90%.

Изобретение предназначено для выделения антибиотика ловастатина. Способ основан на выделении его из образца бродильного бульона, мицелия или фильтрата Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135) путем экстракции бутил-ацетатом. Затем проводят концентрацию экстракта при температуре выше 40^oC. За нею следует прямая кристаллизация ловастатина в лактонной форме из бутилацетата. Способ является технологически более безопасным. Достигаемый выход около 60% при чистоте 90%. 3 з.п.ф-лы, 4 ил.

1. Способ выделения ловастатина, включающий экстракцию его из сырья, полученного на основе гриба - продуцента ловастатина, концентрирование экстракта при пониженном давлении и кристаллизацию целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию ловастатина проводят бутилацетатом из культуральной жидкости, ее фильтрата или мицелия гриба-продуцента, а концентрирование экстракта ведут при температуре выше 40^oC. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют гриб-продуцент, относящийся к роду Aspergillus. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют гриб-продуцент, относящийся к виду Aspergillus terreus или Aspergillus oryzae. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве гриба-продуцента используют Aspergillus terreus ATCC 20542 или Aspergillus oryzae ATCC 74135.