СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПАКТИНА Российский патент 2016 года по МПК C12P17/06 C12P7/26 C12N1/14 C12R1/80 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенного компактина - промежуточного продукта для получения одного из ингибиторов биосинтеза холестерина в организме. Конкретно изобретение относится к способу получения компактина на основе штамма Penicillium citrinum ВКПМ F-1099. Заявляемое изобретение обеспечивает высокорентабельное промышленное производство компактина с высокой степенью очистки.

Компактен является ингибитором фермента бета-гидрокси-метил-глутарил-КоА-редуктазы (HMG-CoA) и способен ингибировать ранние стадии биосинтеза холестерина. Поэтому производные компактина и родственные ему соединения (статины) широко применяются в качестве активного начала фармацевтических препаратов для снижения высокого уровня холестерина в крови.

Известно, что компактин является исходным ферментационным сырьем в технологии получения фармацевтической субстанции правастатина - одного из наиболее эффективных лекарственных препаратов, применяемых для лечения гиперлипопротеинемий IIa, IIIb и III фенотипов.

Компактин подвергается конверсии в правастатин в результате биологической трансформации, при этом очень важно не вносить вместе с компактином дополнительное количество родственных примесей, особенно таких трудно отделяемых, как димер компактина, что позволяет снизить затраты по очистке конечного продукта - фармацевтической субстанции правастатина.

В настоящее время особое значение приобретает разработка новых технологичных и рентабельных способов получения компактина, которые стабильно обеспечивали бы высокий выход продукта при его промышленном получении.

Известны штаммы-продуценты компактина видов Penicillium citrinum и Penicillium adametzioides (US 3983140; 4049495, 5691173).

Однако, продуктивность известных штаммов невысока, что не обеспечивает рентабельности процесса и высокого выхода продукта на конечной стадии.

Известны способы получения компактина путем культивирования штамма-продуцента компактина и многоступенчатого выделения целевого продукта, чаще всего в форме лактона, с заключительной стадией кристаллизации (RU 2114912, WO 98/50572). Основными недостатками описанных способов являются:

- недостаточная чистота целевого продукта, загрязнение его - трудноотделяемыми примесями, такими как димер и кислотные формы компактина;

- низкие экономические показатели, недостаточный выход целевого продукта (50-60%);

- сложность и многостадийность технологии, использование дорогостоящего оборудования.

Наиболее близким аналогом способа получения компактина из нативного раствора является способ получения компактина, в котором культуральную жидкость штамма-продуцента после ферментации подвергают щелочной обработке. После этого целевой продукт выделяют в кислых условиях экстракцией гидрофобным растворителем, экстракт концентрируют и затем проводят реэкстракцию слабым основанием, целевой продукт выделяют кристаллизацией (WO/2001/062949).

Известный способ не обеспечивает получение целевого продукта достаточной степени чистоты и с высоким выходом, способ является многостадийным, трудоемким, требует использования больших объемов токсичных органических растворителей.

Техническим результатом заявленного изобретения - промышленного способа получения компактина на основе штамма-продуцента Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 - является получение продукта с высоким выходом и высокой степенью чистоты.

Для достижения указанного технического результата и обеспечения высокопроизводительного получения компактина предлагается способ получения компактина, предусматривающий культивирование штамма-продуцента в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы, источники азота и минеральные соли, выделение компактина путем делактонизации компактина в щелочной среде, экстракции органическим растворителем, и очисткой целевого продукта кристаллизацией и перекристаллизацией, причем в качестве продуцента используют штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099; полученную культуральную жидкость обрабатывают щелочью при pH 12,0 и температуре 30-50°C в течение 2-3 часов, затем отделяют мицелий, проводят сорбцию компактина из нативного раствора на колонке с гидрофобным неионным сорбентом с элюцией его водным изопропанолом с последующим удалением растворителя отгонкой под вакуумом; из полученного раствора проводят экстракцию компактина бутилацетатом при подкислении до pH 3,0-5,0; полученный экстракт очищают активированным углем; концентрируют и лактонизируют компактин с частичной отгонкой растворителя при остаточном давлении 10-14 кПа и обогреве при 75-95°C в присутствии минеральной кислоты; кристаллизуют компактин-лактон из водного раствора изопропанола при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение 1-2 часов, затем при температуре 6-10°C в течение не менее 4 часов.

Согласно указанному ниже, оптимальный режим концентрирования и лактонизации, обеспечивает степень лактонизации не менее 99% за 3-6 часов при минимальном содержании примесей, что приводит к повышению выхода продукта.

Кроме того, используемый штамм является высокопродуктивным по компактину и стабильным по своим культуральным и физиолого-биохимическим характеристикам, что позволяет эффективно применять его в процессе биосинтеза компактина и получать культуральную жидкость с высоким содержанием компактина (10-12 мг/г). Высокая продуктивность данного штамма обеспечивает высокий выход целевого продукта и рентабельность его производства. Таким образом, получают продукт с содержанием основного вещества не менее 98%, суммарным содержанием примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5% и выходом продукта не менее 65%.

Используемый для получения компактина штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 получен из штамма Penicillium citrinum SANK 18767 методом последовательного индуцированного мутагенеза. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУПГосНИИГенетика под номером F-1099. (Ukraintseva S.N., Voinova Т.М., Dzhavakhiya V.G. ((Obtaining the highly productive mutants Penicillium citrinum producing compactin and optimization of fermentation process in shaken flasks» Biotechnology in Biology and Medicine. Editor A.M. Egorov and G. Zaikov, New York 2006; Украинцева C.H., Воинова T.M., Джавахия В.Г. «Повышение активности гриба Penicillium citrinum - продуцента компактина, методом индуцированного мутагенеза и оптимизация условий культивирования высокопродуктивных штаммов» Материалы 3-й международной конференции из серии "Наука и бизнес", 19-21 июня 2006, Пущино, с 72-75, 2006 г.).

Предлагаемая технология получения компактина апробирована на пилотных ферментационных установках объемом 10 и 100 литров и пилотной установке химочистки.

В результате исследования была разработана технология процесса ферментации и химочистки, обеспечивающие заданные цели - получение высококачественного и рентабельного продукта.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Проводят выращивание посевного материала и аппаратную ферментацию с дозированным или постоянным внесением дополнительного источника углеводного питания, регулированием содержания растворенного кислорода, опосредованным регулированием кислотности культуральной жидкости. Это позволяет получить культуральную жидкость с концентрацией компактина 10-12 мг/г и низким содержанием родственных примесей.

Выращивание посевного материала проводят в инокуляторе на посевной питательной среде в течение 48-55 часов при 24°C, при постоянном перемешивании и аэрации. В качестве исходного посевного материала используется споровая культура, выращенная на агаризованной среде или ячмене. Споровая нагрузка при засеве посевного аппарата составляет 0,75×10⁵-1,25×10⁵ спор/мл.

Процесс биосинтеза проводят на ферментационной питательной среде в течение 192-264 часов. Посевной материал из инокулятора передают на ферментацию в объеме 8-10% от загруженной ферментационной среды. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 25-40% путем регулирования скорости перемешивания среды, аэрации и избыточного давления в пределах 0,2-0,5 атм.

В процессе ферментации в культуральную жидкость вносят добавку:

1. 50%-ный раствор сахарозы в объеме, равном 11-12% от объема первоначально загруженной питательной среды. Повторяют при снижении концентрации сахарозы в культуральной жидкости;

или

2. 50%-ный раствор сахарозы с переменной скоростью 0,0025-0,0045 м³/м³×ч (объем добавки/объем загруженной среды в час), для поддержания концентрации сахарозы в культуральной жидкости на постоянном уровне, что также позволяет поддерживать pH культуральной жидкости на постоянном уровне.

Полученную таким образом культуральную жидкость с содержанием компактина 10-12 мг/г передают на стадию выделения и химической очистки.

Как правило, основной формой использования компактина является лактон, так как он легко кристаллизуется, хорошо очищается от примесей, стабилен при хранении, однако используется и натриевая форма компактина.

Поэтому получение целевого продукта в форме лактона или натриевой соли имеет свои особенности. Таким образом, в данном изобретении заявляется технология выделения и химической очистки компактина в виде лактона с помощью синтетического сорбента, и получение из него высокоочищенной натриевой соли компактина.

После завершения биосинтеза компактин в культуральной жидкости находится в виде кислоты и лактона. Для проведения процесса сорбции препарата на гидрофобном полимерном сорбенте типа Amberlite® XAD-16 или его аналоге Diaion НР-20 требуется перевести полупродукт в водный раствор в виде натриевой соли, что достигается путем гидролиза лактона компактина (делактонизации) в щелочной среде при pH 10-12, и температуре 30-50°C в течение 2-3 часов.

Затем делактонизированную культуральную жидкость фильтруют под вакуумом и проводят сорбцию компактина из полученного нативного раствора на гидрофобном полимерном сорбенте типа Amberlite® XAD-16 или его аналоге Diaion НР-20 с последующей элюцией его водным изопропанолом.

Так как компактин получают в виде лактона, основной стадией процесса является стадия лактонизации.

Предлагаемая в описываемом способе очистка экстракта перед стадией концентрирования и лактонизации активированным углем, а также использование минеральной кислоты в качестве катализатора процесса лактонизации, оптимальный режим концентрирования и лактонизации, обеспечивает степень лактонизации не менее 99% за 3-6 часов при минимальном содержании примесей. Дополнительно кристаллы лактона промываются для полного избавления от примесей водным щелочным раствором.

Преимуществами заявленного способа лактонизации являются:

- практически полный переход компактина в лактонную форму;

- минимальное содержание в продукте примеси в виде димера.

Кристаллизацию целевого продукта ведут из водного раствора изопропанола при комнатной температуре (25°C) с периодическим перемешиванием в течение 1-2 часов, затем при Т=6-10°C в течение не менее 4 часов. Получают продукт с чистотой не менее 90%, выходом 75%, суммарным содержанием примесей не более 1,5%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5%.

С целью получения высокоочищенного целевого продукта дополнительно включена стадия перекристаллизации из водного раствора изопропанола, либо перевод лактона в натриевую соль компактина с дополнительной очисткой целевого продукта активным углем. Получают продукт с содержанием основного вещества не менее 95%, суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5% и выходом продукта не менее 65%.

Получение натриевой соли компактина.

Натриевую соль компактина с содержанием основного вещества не менее 98% (ВЭЖХ), суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,5% и выходом от теории 88% можно получить из компактин-лактона. Для этого компактин-лактон растворяют в смеси изопропилового спирта и воды, затем проводят делактонизацию при добавлении NaOH (pH 11-12) и температуре 40°C. Затем водно-изопропанольную смесь нейтрализуют до pH 9,0-9,5 и отгоняют изопропиловый спирт при пониженном давлении и температуре 45°C на роторном испарителе. Компактин экстрагируют бутилацетатом из водного раствора при кислом pH, водную фазу отделяют, экстракт очищают активированным углем, фильтруют и промывают. Для получения натриевой формы компактина к экстракту добавляют NaOH до pH 9,0-9,5, органическую фазу удаляют. С целью концентрирования водного раствора и кристаллизации отгоняют воду в виде азеотропа с изопропиловым спиртом при пониженном давлении и температуре 45°C. Выпавшие кристаллы натриевой соли компактина фильтруют, промывают и сушат.

Получение компактин-лактона с использованием синтетического сорбента.

1. Делактонизация компактина в культуральной жидкости с получением натриевой соли.

После завершения биосинтеза компактин в культуральной жикости находится в виде кислоты и лактона. Для проведения процесса сорбции препарата на гидрофобном полимерном сорбенте типа Amberlite® XAD-16 или его аналоге Diaion НР-20 требуется перевести полупродукт в водный раствор в виде натриевой соли, что достигается путем гидролиза лактона компактина при pH 12 в течение 3 ч.

2. Фильтрация культуральной жидкости под вакуумом.

3. Сорбция компактина на гидрофобном неионном адсорбенте типа Amberlite® XAD-16 с элюцией его водным изопропанолом.

4. Отгонка изопропилового спирта из элюата под вакуумом при температуре 40°C.

5. Экстракция компактина-кислоты бутилацетатом и очистка экстракта активированным углем.

6. Концентрирование на роторном вакуум-испарителе и лактонизация с частичной отгонкой растворителя при остаточном давлении 10-14 кПа и обогреве Т=75-95°C, в течение 3 часов в присутствии органической или минеральной кислоты.

7. Промывка лактонизированной массы водным щелочным раствором.

8. Кристаллизация из водного изопропанола.

С целью получения высокоочищенного целевого продукта дополнительно включена стадия перекристаллизации из водного изопропанола. Получают продукт с содержанием основного вещества до 98% (метод ВЭЖХ), суммой примесей не более 0,6%, единичной максимальной примесью (димер) не более 0,4% и выходом продукта не менее 65%.

Преимуществами данной технологии являются:

- экономичность метода;

- отсутствие побочных продуктов;

- выход конечного продукта - 88% от теории;

- высокое качество получаемой натриевой соли компактина - содержание основного вещества не менее 98% (ВЫЖХ); сумма примесей не более 1,0%, единичная максимальная примесь (димер) не более 0,5%;

- использование типичного для химического производства оборудования.

ПРИМЕР 1. Биосинтез компактина.

Выращивание посевного материала штамма Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 проводят в аппарате вместимостью 10-л на посевной питательной среде следующего состава (на 1 л среды):

- соевая мука - 20 г;

- пептон (триптон) - 10 г;

- сахароза - 100 г;

- натрия нитрат - 2 г;

- магния сульфат семиводный - 1 г;

- вода дистиллированная - до 1 л;

- щелочь (КОН или NaOH) или кислота (HCl) до pH 6,0-6,2 Посевную среду стерилизуют в аппарате при 120°C 30 минут.

Посев посевного аппарата проводят споровым посевным материалом, выращенным на агаризованной среде, споровая нагрузка составила 1,0×10⁵ спор/мл. Выращивание посевного материала в посевном аппарате проводят в течение 44 часов при 24°C, перемешивании и аэрации. В момент передачи посевного материала в ферментационный аппарат объемная биомасса продуцента составила 15,2%. Посевной материал передают на ферментацию в объеме 8% от загруженной ферментационной среды.

Культуру штамма Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 выращивают в аппарате вместимостью 10 л в течение 211 часов на ферментационной питательной среде следующего состава (на 1 л среды):

- соевая мука - 30 г;

- пептон (триптон) - 10 г;

- дрожжевой экстракт - 3 г;

- сахароза - 100 г;

- натрия нитрат - 5 г;

- магния сульфат семиводный - 1 г;

- вода дистиллированная - до 1 л;

- щелочь (КОН или NaOH) или кислота (HCl) до pH 5,8-6,0 Ферментационную среду стерилизуют в аппарате при 120°C 30 минут.

В процессе ферментации регулируют подачу воздуха, скорость перемешивания среды, избыточное давление, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 30-40%. На 73, 101 и 129 часы роста вводят 50% раствор сахарозы в объеме 9,2% к начальному объему среды (по 600 мл при начальном объеме 6,5 л). Массовая доля компактина в культуральной жидкости на момент слива составила 10,61 мг/г при массовой доле углеводов 0,28%, объемной биомассе 42,5% и pH 5,75. Слито из аппарата 6,2 кг культуральной жидкости, фактический съем компактина в культуральной жидкости составил 70,2 г.

Культуральную жидкость подщелачивают 40% раствором NaOH до pH 11,8; выдерживают при постоянном перемешивании 3 часа, нативный раствор отделяют фильтрацией под вакуумом и отработанный мицелий промывают водой с pH 12,0.

550 мл нативного раствора, содержащего 4,57 г компактина, пропускают через колонку со 100 мл сорбента Amberlite XAD - 16 со скоростью 1 мл/мин. Элюцию компактина осуществляют водным раствором ИПС. Получают 293 мл элюата, содержащего 4,48 г компактина. Отгоняют ИПС из элюата под вакуумом, к водному раствору Na - соли компактина приливают 150 мл бутилацетата и при постоянном перемешивании подкисляют раствором H₂SO₄ до pH 3,0-5,0. По истечении 30 мин БАЭ обрабатывают 2,17 г активированного угля при Т=40°C в течение 1 часа. Уголь промывают бутилацетатом, промывку присоединяют к основному экстракту. Осветленный экстракт концентрируют под вакуумом при Т=60°C до содержания компактина 100-150 мг/мл, после чего добавляют 1,2 мл минеральной кислоты и проводят лактонизацию под вакуумом в течение 4-х часов. Лактонизированную массу промывают водным щелочным раствором.

Полученный сырец компактина-лактона растворяют в 18 мл водного ИПС и кристаллизуют. Кристаллы отделяют путем фильтрации под вакуумом; получают 3,46 г пасты с содержанием компактина 93,04%, суммой примесей 1,07%, содержанием единичной примеси - 0,38%. После перекристаллизации - содержание компактина - 98,2%, сумма примесей - 0,26%, единичная примесь - 0,15%. Суммарный выход 63%.

ПРИМЕР 2.

Выращивание посевного материала штамма Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 проводят в аппарате вместимостью 10 л на посевной питательной среде, в течение 36 часов при 24°C, перемешивании и аэрации. Аппарат засевают споровым посевным материалом, выращенным на ячмене, споровая нагрузка составила 1,5×10⁵ спор/мл. В момент передачи посевного материала в ферментационный аппарат объемная биомасса продуцента составила 17,9%. Посевной материал передают на ферментацию в объеме 8% от загруженной ферментационной среды.

Культуру штамма Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 выращивают в аппарате вместимостью 10 л в течение 192 часов на ферментационной питательной среде. Регулируют подачу воздуха, скорость перемешивания среды, избыточное давление, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 25-40%. На 73, 103 и 132 часы роста вводят 50% раствор сахарозы в объеме 10% к начальному объему среды (по 650 мл при начальном объеме 6,5 л). Массовая доля компактина в культуральной жидкости на момент слива составила 9,77 мг/г при следовом количестве углеводов, объемной биомассе 52,0% и pH 5,94. Слито из аппарата 6,83 кг культуральной жидкости, фактический съем компактина в культуральной жидкости составил 66,7 г.

500 мл культуральной жидкости с содержанием компактина 4,85 г подщелачивают 40% раствором NaOH до pH 12,0; выдерживают при постоянном перемешивании в течение 3-х часов, отработанный мицелий отделяют фильтрацией под вакуумом и промывают подщелоченной до pH 12,0 водой. Получают 518 мл нативного раствора, который пропускают через колонку со 100 мл сорбента Amberlite XAD - 16. Элюцию компактина осуществляют водным раствором изопропилового спирта (ИПС). Получают 300 мл элюата, содержащего 4,38 г компактина. Отгоняют ИПС из элюата под вакуумом, к водному раствору Na - соли компактина в количестве 60 мл приливают 180 мл бутилацетата и при постоянном перемешивании по каплям приливают 20%-ный раствор H2SO4 до pH 3,0-5, 0. По истечении 30 мин бутилацетатный экстракт (БАЭ) обрабатывают 2,4 г активированного угля при Т=40°C в течение 1 часа. Уголь промывают 5 мл бутилацетата, промывку присоединяют к основному экстракту. Осветленный экстракт концентрируют под вакуумом при Т=60°C до содержания компактина 100-150 мг/мл, после чего добавляют 3-5 мл минеральной кислоты и проводят лактонизацию под вакуумом в течение 4-х часов.

Полученный сырец компактина - лактона растворяют в 20,7 мл 90% ИПС с последующей кристаллизацией. Кристаллы отделяют путем фильтрации под вакуумом; получают 3,63 г пасты с содержанием компактина не менее 90%. Пасту растворяют в 18,4 мл ИПС, обрабатывают 4 г активированного угля в течение 1 часа, уголь промывают и тщательно отжимают; компактин - лактон кристаллизуют из полученного раствора.

Получают 3,21 г компактина - лактона с содержанием основного вещества не менее 98%; сумма примесей - не более 1%; единичная примесь - не более 0,5%.

Выход от содержания в культуральной жидкости - 66,2%.

ПРИМЕР 3.

10 г компактина-лактона с содержанием основного вещества 93,6% растворяют в смеси изопропилового спирта и воды, и проводят делактонизацию при перемешивании, температуре 40°C и pH=11-12 (добавление NaOH). Затем реакционная смесь нейтрализуют кислотой pH до 9,0-9,5 и на роторном испарителе отгоняют изопропиловый спирт при пониженном давлении и температуре 45°C. Из водного раствора компактин экстрагируют бутилацетатом при pH=3,0, водную фазу отделяют, а бутилацетатный экстракт очищают активным углем, фильтруют и промывают. Для получения натриевой формы компактина к экстракту при перемешивании добавляют NaOH до pH=9,0-9,6, выдерживают 30 мин, органическую фазу удаляют. С целью концентрирования водного раствора и кристаллизации натриевой соли компактина на роторном испарителе отгоняют воду в виде азеотропа с изопропиловым спиртом при пониженном давлении и температуре 45°C. Выпавшие кристаллы натриевой соли компактина фильтруют, промывают и сушат. Получают 10,2 г компактина в форме натриевой соли с содержанием основного вещества 97,5% (ВЭЖХ), сумма примесей 0,19%. Выход от теории составляет 87,7%.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения компактина, в котором осуществляют культивирование штамма Penicillium citrinum ВКПМ F-1099 на питательной среде. Полученную культуральную жидкость подщелачивают до pH 12,0 при 30-50°C в течение 2-3 часов. Затем отделяют мицелий. Проводят сорбцию компактина из нативного раствора на колонке с гидрофобным неионным сорбентом с элюцией его водным раствором изопропанола. Из полученного раствора проводят экстракцию компактина бутилацетатом при подкислении до pH 3,0-5,0. Экстракт очищают активированным углем. Концентрируют и лактонизируют компактин с частичной отгонкой растворителя при остаточном давлении 10-14 кПа и обогреве 75-95°C в присутствии минеральной кислоты. Кристаллизуют компактин-лактон из водного раствора изопропанола при комнатной температуре и периодическом перемешивании в течение 1-2 часов, затем при температуре 6-10°C в течение не менее 4 часов. Затем продукт перекристаллизовывают. Изобретение обеспечивает степень лактонизации компактина не менее 99% и получение продукта с содержанием компактина не менее 98%, суммой примесей не более 1,0%, единичной максимальной примесью димера не более 0,5% и выходом продукта не менее 65%. 3 пр.

Способ получения компактина, предусматривающий культивирование штамма-продуцента в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы, источники азота и минеральные соли, выделение компактина путем делактонизации компактина в щелочной среде, экстракции органическим растворителем и очисткой целевого продукта кристаллизацией и перекристаллизацией, отличающийся тем, что
- в качестве продуцента используют штамм Penicillium citrinum ВКПМ F-1099;
- полученную культуральную жидкость обрабатывают щелочью при pH 12,0 и температуре 30-50°C в течение 2-3 часов, затем отделяют мицелий,
- проводят сорбцию компактина из нативного раствора на колонке с гидрофобным неионным сорбентом с элюцией его водным изопропанолом с последующим удалением растворителя отгонкой под вакуумом;
- из полученного раствора проводят экстракцию компактина бутилацетатом при подкислении до pH 3,0-5,0;
- полученный экстракт очищают активированным углем;
- концентрируют и лактонизируют компактин с частичной отгонкой растворителя при остаточном давлении 10-14 кПа и обогреве 75-95°C в присутствии минеральной кислоты;
- кристаллизуют компактин-лактон из водного раствора изопропанола при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение 1-2 часов, затем при температуре 6-10°C в течение не менее 4 часов.