СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛЫХ ФОРМ ПСОРИАЗА У ВЗРОСЛЫХ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и касается способа диагностики тяжелых форм псориаза у взрослых пациентов, в частности диагностики экссудативного псориаза, пустулезного псориаза, псориатического артрита, псориатической эритродермии.

Известно, что своевременное выявление и лечение всех заболеваний являются важным аспектом деятельности специалистов в области медицины. Ранняя постановка диагноза и раннее начало лечения заболевания определяют успех в излечении. Это особенно актуально для таких заболеваний, как тяжелая форма псориаза.

Известны лабораторные методы диагностики псориаза, которые включают микроскопические исследования биологической ткани пациента, например, исследования пробы сыворотки крови. К ним относится способ диагностики заболевания по виду высушенной капли сыворотки крови, нанесенной на предметное стекло. При выявлении на поверхности капли краевой аморфной зоны, промежуточной - с единичными рассеянными скобкообразными структурами, и центральной - с округлыми структурами неправильной формы с пустотами и выемками, размещенными на фоне аморфной поверхности центральной зоны, диагностируют псориаз (см. Патент РФ №2233122, «Способ диагностики псориаза», МПК А61В 10/00, G01N 33/48, опубликовано 27.07.2004). Его достоинством является простота диагностики без сложного гистологического и гистохимического исследования. Его недостаток заключается в субъективности оценки, что снижает достоверность диагностики.

Известен способ диагностики распространенного прогрессирующего псориаза, включающий разделение белков сыворотки крови, определение в них содержания фракций альфа-2 и гамма глобулинов с 3 по 5 неделю с момента обострения, при повышении содержания альфа-2 глобулинов на 60-80% от нормы, а гамма глобулинов на 30-40% от нормы к 3-4 неделе и снижении их содержания до нормы к 4-5 неделе диагностируют распространенный прогрессирующий псориаз с активным течением (Патент РФ №2243560, МПК G01N 33/48, опубликовано 27.12.04). Этот способ повышает достоверность диагностики за счет большей информативности, дифференциальной оценки и за счет проведения анализа в динамике. Однако результаты приведенных исследований недостаточно точны, т.к. указанные маркеры дают лишь общую картину белкового состава крови, что уменьшает чувствительность диагностики.

Кроме того, общим недостатком указанных способов является диагностирование псориаза, не учитывающее процессы, происходящие на клеточном уровне, при этом сами клетки крови не исследуются.

Известно, что структурно-функциональной единицей живого организма является клетка, основу функционирования и жизнедеятельности которой определяет клеточная мембрана. Клеточная мембрана обеспечивает избирательное проникновение в клетку и обратно молекул и ионов, необходимых для выполнения клеткой ее специфических функций, поддерживает трансмембранную разницу электрического потенциала, специфику межклеточных контактов. Перенос ионов через клеточную мембрану с помощью переносчиков белковой структуры, включающий активный транспорт и облегченную диффузию, является неотъемлемой частью жизнедеятельности всех клеток организма человека в норме и при патологии. Патология псориаза у взрослых связана с изменением ионного транспорта в их организме. Одной из ион-транспортных систем является натрий-литиевый противотранспорт (НЛПТ) через мембрану эритроцита.

Задачей и техническим результатом изобретения является достоверное и эффективное диагностирование тяжелых форм псориаза, в частности псориатической эритродермии. у взрослых с использованием исследований процессов на клеточном уровне путем анализа скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита.

Задача решается и технический результат достигается способом диагностики тяжелых форм псориаза у взрослых, который заключается в следующем:

- утром, натощак производят забор крови пациента в пробирки, смоченные гепарином с фосфатным буфером 20 ЕД на 1 мл крови;

- содержимое перемешивают и охлаждают до температуры тающего льда 0-2°С;

- после охлаждения проводят осаждение эритроцитов путем центрифугирования в режиме 3000 g в течение 5 минут;

- проводят выделение эритроцитов и плазмы (эритроцитарной массы) путем отсасывания;

- выделенные эритроциты промывают трехкратным объемом холодной среды А промывки при температуре тающего льда, при этом среду А промывки берут следующего состава (мМ): 75 - MgCl₂; 85 - сахароза; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН 7,4);

- далее упакованные (осажденные) эритроциты предынкубируют в среде Г следующего состава (мМ): 150 - LiCl; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН 7,4), при температуре 37°С в течение 3 часов с периодическим встряхиванием;

- далее полученную суспензию осаждают и для удаления наружного лития эритроциты промывают объемом среды А промывки;

- после промывки упакованные эритроциты переносят в среду Б, свободную от натрия и представляющую собой фактически среду А промывки, содержащую изоосмотическую смесь хлористого магния MgCl₂ и сахарозы с добавлением 0,1 мМ уабаина, и в среду В, богатую натрием, содержащую (мМ): 150 - NaCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис (рН 7,4), 0,1 - уабаин;

- в каждой из указанных сред проводят инкубацию в течение периода экспрессии - выхода лития в среды инкубации - 60 минут при температуре 37°С с периодическим встряхиванием;

- на шестидесятой минуте инкубации отбирают равное количество суспензии эритроцитов из обеих сред, проводят их раздельное осаждение центрифугированием в течение двух минут, затем осторожно набирают надосадочную жидкость из каждой пробы и разбавляют в 3 раза тридистиллированной водой;

- производят измерение содержания лития в обоих средах методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии, при этом калибровочные растворы готовят на средах инкубации с учетом разведения пробы.

- определяют скорость натрий-литиевого противотранспорта V в микромолях лития на 1 литр клеток в час как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, по формуле

V=(ANa-AMg)·K,

где · - знак умножения;

ANa - концентрация лития в среде, богатой натрием;

AMg - концентрация лития в среде, богатой магнием (свободной от натрия);

К - коэффициент, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах; коэффициент К, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах, выбирают равным 33 при следующих условиях:

проведение предынкубации эритроцитов в среде предынкубации в соотношении 1:5;

помещение эритроцитов в среду, богатую натрием, и свободную от натрия, в соотношении 1:10;

разбавление надосадочной жидкости в 3 раза.

При значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита не ниже 420 мкМLi/литр кл./час диагностируют тяжелую форму псориаза у взрослых.

Способ диагностики осуществляют следующим образом.

Кровь в количестве 3-х миллилитров забирают утром из вены пациента в пластиковые пробирки, смоченные гепарином с фосфатным буфером 20 ЕД на 1 мл крови. Содержимое перемешивают и пробирки немедленно помещают в контейнер с тающим льдом. После охлаждения до 0-2 градусов Цельсия пробирки помещают в рефрижираторную центрифугу с вертикальным ротором и эритроциты осаждают при достижении 3000 g в течение 5 минут. Далее плазму и эритроциты удаляют путем отсасывания. Выделенные эритроциты дважды промывают трехкратным объемом холодной среды А промывки при температуре тающего льда. Среда А промывки имеет следующий состав (мМ): 75 - MgCl2; 85 - сахароза; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН 7,4), при тех же условиях осаждения. Далее 0,25 мл упакованных (осажденных) эритроцитов помещают в 1,25 мл среды Г следующего состава (мМ): 150 - LiCl; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис (рН 7,4), при температуре 37°С и предынкубируют их при этой температуре в течение 3 часов с периодическим автоматическим встряхиванием каждые 15 минут по 15 секунд. Далее полученную суспензию осаждают и для удаления наружного лития эритроциты промывают 4 раза четырехкратным объемом среды А промывки.

После промывки упакованные эритроциты по 0,1 мл переносят в среду Б 1 мл, свободную от натрия и представляющую собой фактически среду А промывки, содержащую изоосмотическую смесь хлористого магния MgCl₂ и сахарозы с добавлением 0,1 мМ уабаина, и в среду В, богатую натрием, содержащую (мМ): 150 - NaCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис (рН 7,4), 0,1 - уабаин. В указанных средах инкубацию продолжают 60 минут при температуре 37°С с периодическим встряхиванием. В этот период происходит выход лития в натриевую и безнатриевую (магниевую) среды за счет обмена лития на натрий и магний, осуществляемого благодаря работе белка-переносчика в условиях ингибирования натрий-калиевой АТФ-азы уабаином.

На шестидесятой минуте инкубации отбирают по 0,45 мл суспензии эритроцитов из обеих сред, производят их центрифугирование в течение двух минут, затем осторожно набирают 0,3 мл надосадочной жидкости и разбавляют в 3 раза тридистиллированной водой. Далее производят измерение содержания лития в магниевой и натриевой средах методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии на спектрофотометре СА-455. Калибровочные растворы готовят на средах инкубации с учетом разведения пробы. Используют следующие параметры аппаратуры: длина волны 670,6 нм, состав пламени ацетилен-воздух, стехиометрия пламени окисляющая, чувствительность 10-7 моль/литр. Программа измерения концентрации элемента в исследуемом растворе в эмиссионном режиме состоит в сравнении интенсивности светового потока эталонного раствора известной концентрации с интенсивностью потока исследуемого раствора. Информация со спектрофотометра поступает на специализированное вычислительное устройство «Электроника Д3-28», которое вычисляет концентрацию исследуемого элемента, а результаты выдает на цифровое табло. Скорость натрий-литиевого противотранспорта V в микромолях лития на 1 литр клеток в час определяют как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, через 60 минут инкубации по формуле

V=(ANa-AMg)·K,

где ANa - концентрация лития в среде, богатой натрием;

AMg - концентрация лития в среде, богатой магнием (свободной от натрия);

К - коэффициент, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах; К=33 при следующих условиях:

- проведение предынкубации эритроцитов в среде предынкубации в соотношении 1:5;

- помещение эритроцитов в среду, богатую натрием, и свободную от натрия, в соотношении 1:10;

- разбавление надосадочной жидкости в 3 раза.

При значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита не меньше 420 мкMLi/литр кл./час диагностируют тяжелую форму псориаза у взрослых.

Пороговое значение скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита, равное 420 мкМLi/литр кл./час, было определено на основе сопоставления значений скорости у контрольной группы заведомо здоровых пациентов и заведомо определенных как больных тяжелой формой псориаза: псориатической эритродермией. экссудативного псориаза, пустулезного псориаза, псориатического артрита. Для этого было отобрано две группы пациентов в возрасте от 22 до 63 лет: контрольная, скомплектованная из здоровых людей в количестве 9 человек, и испытуемая, скомплектованная из пациентов, заведомо больных псориатической эритродермией, экссудативным псориазом, пустулезным псориазом, псориатическим артритом, в количестве 9 человек. Для каждого члена групп были проведены указанные выше измерения скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембранах эритроцитов, и было установлено, что у членов контрольной группы указанная скорость была в пределах от 109 до 420 мкМLi/литр кл./час, а у членов заведомо больных тяжелой формой псориаза она была в пределах от 420 до 802 мкМLi/литр кл./час. Всего было продиагносцировано 97 больных различными формами псориаза, при этом диагноз «псориатическая эритродермия» и др., установленные по скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита, подтверждался проявлением внешних признаков заболевания и результатами других методов диагностики.

Ниже приводятся отдельные клинические примеры. За нормативы определяемых показателей взяты собственные данные исследований авторов изобретения, полученные при обследовании людей группы контроля и испытуемых групп.

Пример 1 (контрольная группа). Испытуемый Р., 22 года. Жалоб нет. Кожные покровы чистые. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита составила 240 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, составляющих смену популяции эритроцитов у взрослых, средняя скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 232,3 мкМ лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - здоров.

Пример 2. Больной Ч., 32 года, обратился с жалобами на высыпания на коже. Диагноз при поступлении в стационар - экссудативный псориаз. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритоцита на второй день госпитализации составила 441 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого протвотранспорта составила 439 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - экссудативный псориаз.

Пример 3 (группа пациентов с диагнозом «хроническая экзема»). Больная М., 35 лет. Жалобы на очаговые раздражения на коже. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита составила 250 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, составляющих смену популяции эритроцитов у взрослых, средняя скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 251,7 мкМ лития на литр клеток в час. Клинический диагноз не изменился.

Пример 4. Больной X., 47 лет, обратился с жалобами на высыпания на коже. Диагноз при поступлении в стационар - псевдоаллергическая (неспецифическая) форма аллергии в стадии обострения. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита на второй день госпитализации составила 238 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, составляющих смену популяции эритроцитов у взрослых, средняя скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 257,2 мкМ лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - атопический дерматит.

Пример 5. Больной Н., 52 года. Диагноз при поступлении в стационар - неинфекционно-аллергическая форма дерматита, стадия обострения. Скорость натрий-литиевого протвотранспорта в мембране эритоцита на второй день госпитализации составила 337 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, средняя скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 363 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - атопический дерматит и ладонно-подошвенный псориаз.

Пример 6. Больной Ш., 63 года. Диагноз при поступлении в стационар - хронический дерматит. Скорость натрий-литиевого протвотранспорта в мембране эритоцита на второй день госпитализации составила 312,9 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, средняя скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 295,2 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - атопический дерматит и себорейный псориаз.

Пример 7. Больной Е., 44 года. Диагноз при поступлении в стационар - пустулезный псориаз. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита на второй день госпитализации составила 484 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 487 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - пустулезный псориаз.

Пример 8. Больной М., 35 лет. Диагноз при поступлении в стационар - псориатический артрит. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита на второй день госпитализации составила 457 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 461 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - псориатический артрит.

Пример 9. Больной А., 51 год. Диагноз при поступлении в стационар - псориатическая эритродермия. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита на второй день госпитализации составила 420 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 422 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - псориатическая эритродермия.

Пример 10. Больной М., 45 лет. Диагноз при поступлении в стационар - ладонно-подошвенный псориаз. Скорость натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита на второй день госпитализации составила 419 мкМ лития на литр клеток в час. Через 120 дней, т.е. в условиях полной смены популяции эритроцитов, скорость натрий-литиевого противотранспорта составила 417 микромоль лития на литр клеток в час. Клинический диагноз - ладонно-подошвенный псориаз.

Таким образом, тяжелые формы псориаза, в частности псориатическую эритродермию, экссудативный псориаз, пустулезный псориаз, псориатический артрит у взрослых, диагностировали путем анализа функционального состояния клеточных мембран, которое оценивали по максимальной скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита по методу M. Canessa (см. Canessa M.L., Adragna N.C., Solomon H.S. et al. // N. Engl. J. Med. - 1980. - Vol. 302. - P.772-776), заключающемуся в измерении обмена внутриклеточного лития, в загруженных этим ионом клетках, на внеклеточный натрий из среды инкубации. Конечный результат представляли в микромолях Li на литр клеток (эритроцитов) в час (мкМLi/л/час).

Приведенные клинические данные свидетельствуют о достоверности предлагаемого способа диагностики тяжелых форм псориаза у взрослых, о ее эффективности для последующего лечения и послелечебного анализа состояния пациента.

Способ апробирован в стационарном отделении клиники Казанского Государственного Медицинского Университета, может найти широкое клиническое применение в медицинской практике и эффективно использоваться в дерматологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики тяжелых форм псориаза у взрослых. Сущность способа состоит в том, что проводят определение функционального состояния клеточных мембран, которое оценивают по максимальной скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита, заключающегося в измерении обмена внутриклеточного лития, в загруженных этим ионом клетках, на внеклеточный натрий из среды инкубации. Скорость натрий-литиевого противотранспорта V определяют как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, по формуле. При значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита не ниже 420 мкМ лития/литр клеток/час диагностируют тяжелую форму псориаза. Способ обеспечивает достоверное и эффективное диагностирование тяжелых форм псориаза у взрослых. 10 з.п. ф-лы, 10 пр.

1. Способ диагностики тяжелых форм псориаза у взрослых, включающий перемешивание и охлаждение пробы крови пациента до температуры тающего льда, осаждение и выделение эритроцитов, промывку средой промывки следующего состава, мМ: 75 - MgCl₂; 85 - сахароза; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис при рН, равном 7,4, при температуре тающего льда, предынкубацию упакованных эритроцитов в среде предынкубирования состава, мМ: 150 - LiCl; 10 - глюкоза; 10 - HEPES-трис при рН, равном 7,4, при температуре 37°С в течение 3 часов, осаждение полученной суспензии, удаление наружного лития, перенесение упакованных эритроцитов в среду, свободную от натрия, содержащую изоосмотическую смесь хлористого магния MgCl₂ и сахарозы с добавлением 0,1 мМ уабаина, и в среду, богатую натрием следующего состава, мМ: 150 - NaCl, 10 - глюкоза, 10 - HEPES-трис с рН 7,4, 0,1 - уабаин, в каждой из указанных сред проводят инкубацию в течение периода экспрессии - выхода лития в среды инкубации, его обмена на натрий и магний при температуре 37°С с периодическим встряхиванием, затем проводят отбор равного количества суспензии эритроцитов из обеих сред, их раздельное осаждение, затем набирают надосадочную жидкость из каждой пробы, разбавляют водой, производят измерение содержания лития в обеих средах, по полученной концентрации лития определяют скорость натрий-литиевого противотранспорта V как разность между концентрацией лития в среде, богатой натрием, и в среде, свободной от натрия, по формуле
V=(ANa-AMg)·K, мкМ лития/1 литр клеток/час, где
ANa - концентрация лития в среде, богатой натрием;
AMg - концентрация лития в среде, свободной от натрия;
K - коэффициент, связанный с разбавлением сред и с соотношением количества надосадочной жидкости с эритроцитами к количеству сред предынкубации и инкубации на предыдущих этапах, при этом указанный коэффициент, связанный с разбавлением сред на предыдущих этапах, выбирают равным K=33 при следующих условиях: проведение предынкубации эритроцитов в среде предынкубации в соотношении 1:5; помещение эритроцитов в среду, богатую натрием, и среду, свободную от натрия, в соотношении 1:10; разбавление надосадочной жидкости в 3 раза,
при значении скорости натрий-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита не меньше 420 мкМ лития/литр клеток/час диагностируют тяжелую форму псориаза у взрослых.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение эритроцитов проводят путем центрифугирования в режиме 3000 g в течение 5 минут.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение эритроцитов и плазмы проводят путем отсасывания.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделенные эритроциты дважды промывают трехкратным объемом холодной среды промывки.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предынкубирование проводят при температуре 37°С в течение 3 часов с периодическим встряхиванием каждые 15 минут по 15 секунд.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что удаление наружного лития проводят промывкой эритроцитов.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что промывку эритроцитов проводят 4 раза четырехкратным объемом среды промывки.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение содержания лития проводят методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в режиме эмиссии.

9. Способ по п. 1 или 8, отличающийся тем, что калибровочные растворы для измерения содержания лития готовят на средах инкубации с учетом разведения пробы.

10. Способ по п. 1 или 8, отличающийся тем, что измерение содержания лития проводят при следующих параметрах: длина волны 670,6 нм, состав пламени ацетилен-воздух, стехиометрия пламени окисляющая, чувствительность 10-7 моль/литр.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что период экспрессии определяют в течение 60 минут.