СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ПО НАТРИЮ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и фармации, а именно к биохимии клеточных мембран человека, и может быть использовано при изучении биофармацевтической доступности лекарственных средств путем определения влияния лекарственных препаратов на проницаемость клеточных мембран, что будет способствовать оптимизации подбора лекарственной терапии.

При изучении эффективности лекарственных средств местного действия необходимо проводить экспериментальные исследования по фармацевтической доступности лекарственных веществ. Для этого биофармацевтические исследования проводятся на моделях мембран: как на искусственных, так и на биологических. Известно, что в качестве искусственных мембран используются тефлоновые мембраны, мембраны из силиконов, полиуретана, 2-полигидроксиэтиленметакрилата, которые рекомендуют пропитывать липофильной фазой (н-додеканолом или изопропилмиристатом). Наиболее распространено использование мембран из производных целлюлозы, в частности из ацетата целлюлозы и целофана. Однако результаты, полученные с использованием всех искусственных мембран, по ряду причин дают весьма относительное представление о проникновении лекарственных веществ из лекарственных форм через кожу. В биофармацевтических исследованиях для приближения экспериментальных моделей к условиям in vivo широко используются в качестве диализных мембран биологические объекты: обезволошенная кожа мыши, тонкие лоскуты кожи человека, взятой в процессе хирургического вмешательства, кожа человека после пластической операции, кожа трупа человека, сброшенная кожа змеи, подскорлуповая оболочка куриного яйца. Однако при исследовании биологических объектов не выдерживается температурный режим. Резюмируя, можно заключить, что стандартные модели для оценки фармацевтической доступности лекарственной формы местного действия отсутствуют, и остается актуальной задача унификации биофармацевтических методов исследования.

В настоящее время для изучения проницаемости биомембран стали использоваться мембраны клеток крови. В качестве естественной модели для исследования общих характеристик, в том числе проницаемости всех биологических мембран, наиболее удобна мембрана эритроцита (МЭ), так как, с одной стороны, эритроцит - это безъядерная клетка, это, фактически, идеальная изолированная («чистая») мембрана, а с другой, - была доказана корреляция между изменениями свойств МЭ и мембран других клеток.

Существует два пути транспорта веществ через мембраны клеток (в том числе через мембрану эритроцита): активный и пассивный транспорт. Пассивный транспорт подразделяется на движение ионов по градиенту концентрации и посредством облегченной диффузии, когда для транспортировки ионов используются специфические белки-переносчики клеточной мембраны. Na⁺-Li⁺-противотранспорт (Na⁺-Li⁺-ПТ) является примером облегченной диффузии ионов. Na⁺-Li⁺-ПТ является лабораторным аналогом Na⁺-Na⁺-обмена и, хотя физиологическое и биофизическое значение Na⁺-Li⁺-ПТ остается неясным, тем не менее определение скорости Na⁺-Li⁺-ПТ является широко используемой методикой для оценки функционального состояния мембран клеток в целом.

Известен способ диагностики мембранной патологии определением скорости Na⁺-Li⁺-ПТ в МЭ, основанный на регистрации скорости выхода Li⁺ с внутренней поверхности мембраны во внешнюю среду после предварительной инкубации эритроцитов в среде, содержащей LiCl. Увеличение скорости Na⁺-Li⁺-ПТ показано при гипертонической болезни [см., Ослопов В.Н., Смирнов Ю.В., Хасанов З.Ш. и др. // Казмеджурнал., 1990, №5, с.329-331].

Однако исследования скорости Na⁺-Li⁺-ПТ не позволяют определять влияние лекарственных препаратов и веществ на проницаемость клеточных мембран по Na⁺.

Известен способ диагностики патологии клеточных мембран, которая характеризуется их повышенной проницаемостью для ионов H⁺ и снижением параметра X. Венозная кровь центрифугируется, полученные эритроциты отмываются физраствором, pH доводится до 6,8-6,9 при контроле на pH-метре, далее проводится регистрация трансляционной подвижности ионов Н⁺ посредством ЯМР [см., заявка на изобретение РФ №94015013 на «Способ диагностики патологии клеточных мембран методом ЯМР спектроскопии ионов H+», опубл. 10.09.1996 г.].

Однако это способ диагностики патологии клеточных мембран, и он не предусматривает изучения влияния лекарственных веществ на проницаемость клеточных мембран по Na⁺.

Известен способ диагностики синдрома эндогенной интоксикации, включающий оценку проницаемости мембран эритроцитов, в котором определяют эритроциты, имеющие мембрану, блокированную иммунными комплексами, для чего оценивают проницаемость мембран эритроцитов в присутствии водного раствора NaCl в разведениях, из пробирки с наименьшим количеством негемолизированных эритроцитов отбирают жидкость для определения количества эритроцитов в камере Горяева, количество эритроцитов, превышающее 1,0 с соответствующей им концентрацией NaCl, принимают за контроль у данного больного, в контрольном разведении NaCl исследуют гемолиз в концентрации эритроцитов, в 10 раз превышающей стандартный уровень концентрации, производят повторное исследование в камере Горяева, определяют количество негемолизированных эритроцитов и при их количестве, более чем в 10 раз превышающем контрольное, диагностируют синдром эндогенной интоксикации [см., патент РФ №2234095, опубл. 10.08.2004].

Однако способ диагностики синдрома эндогенной интоксикации не позволяет определить влияние вещества на проницаемость клеточных мембран по Na⁺.

Известен способ определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов, который включает биофизическое исследование крови, взятой из пальца обработкой на предметном стекле, вычисляют количество дискоцитов и коэффициент чувствительности мембран эритроцитов по формуле [см., патент РФ №2332668, опубл. 10.05.2011].

Однако при этом не изучается проницаемость по Na⁺, а используется определение количества деформированных клеток и их морфологии. Наш метод предусматривает изучение изменения транспорта ионов через клеточную мембрану.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения скорости Na⁺-Li⁺-ПТ в мембране эритроцита [см. Canessa M., Adragna N., Solomon H. et al. // New Engl. G. Med. 1980, v.302, p.772-776], в котором измеряется обмен внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий и магний из среды инкубации.

Однако способ определения скорости Na⁺-Li⁺-ПТ в мембране эритроцита не позволяет изучать биодоступность лекарственных веществ в более высоких концентрациях.

Целью предлагаемого изобретения является возможность определения влияния лекарственных препаратов и веществ на проницаемость клеточных мембран по Na⁺.

Поставленная цель достигается способом оценки влияния лекарственных веществ на проницаемости мембран эритроцитов по Na⁺ с использованием метода M. Canessa et al., при котором измеряют скорость обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации, а биологическую доступность лекарственного вещества определяют путем 1-часовой инкубации лекарственного вещества при его внесении в среду, содержащую (в мМ): 150 - NaCl; 10 - глюкозы; 10 - Hepes-Tris; 0,1 - уабаина, и по изменению величин скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита от 0,001 до 0,025 µМ судят об индивидуальной терапевтической дозе исследуемого лекарственного вещества.

Более высокие концентрации лекарственных веществ порядка 1,0 µМ и более вызывают гемолиз. Гемолиз свидетельствует о том, что концентрации веществ выходят из области физиологических параметров (в случае вещества C₁₆ гемолиз наступает при концентрации даже 0,025 µМ).

Оценка влияния лекарственных веществ на проницаемость клеточных мембран по натрию проводится по следующей методике:

Кровь в количестве 3 мл забирают из вены самотеком в пластиковые пробирки, смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови), содержимое перемешивают и пробирки помещают в контейнер с тающим льдом.

Исследование состоит из следующих этапов:

Отделение эритроцитов проводят путем их осаждения на рефрижераторной центрифуге с вертикальным ротором (при 3000 g) при 0-2°C в течение 5 минут. Плазму и лейкоциты удаляют путем отсасывания.

Промывание эритроцитов проводят дважды трехкратным объемом холодной (температура тающего льда) среды А, при тех же условиях осаждения.

Прединкубацию - нагрузку эритроцитов литием - осуществляют в среде Г, содержащей изоосмотическую концентрацию LiCl, где при блокированной уабаином Na⁺-K⁺-АТФазе натрий в эритроцитах замещался на литий.

Прединкубация продолжалась 3 часа при 37°C с периодическим автоматическим встряхиванием (шейкированием) - каждые 15 минут по 15 секунд.

Промывание эритроцитов для удаления наружного лития производят четырехкратным объемом среды А при 0-2°C 4 раза.

Инкубацию (ключевую часть исследования) проводят путем переноса упакованных эритроцитов (по 0,1 мл) в 1 мл среды В (среда с Na) и в 1 мл среды Б (среда с Mg). Инкубация продолжается 60 минут при 37°C с периодическим шейкированием.

Содержание Li⁺ в конечном супернатанте в натриевой и магниевой средах регистрируют методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме. Спектрофотометрию осуществляют на атомном абсорбционном спектрофотометре СА-455 (ПО «КОМЗ», г.Казань) в лаборатории спектроскопии кафедры медицинской и биологической физики Казанского государственного медицинского университета. Программа измерения концентрации лития в исследуемом растворе в эмиссионном режиме состояла в сравнении интенсивности светового потока эталонного раствора известной концентрации с интенсивностью светового потока исследуемого раствора.

Конечный результат - максимальная скорость Na⁺-Li⁺-ПТ в мембране эритроцита в микромолях Li на литр клеток в час (в дальнейшем для краткости обозначается как «мкМ Li») определялась как разность между концентрациями лития в среде, богатой натрием (А Na⁺), и в среде, свободной от натрия, - в магниевой среде (A Mg²⁺) через 60 минут инкубации по формуле: скорость Na⁺-Li⁺-ПТ=(A Na⁺ - A Mg²⁺)×K, где K (коэффициент) = 33.

Сущность заключается в том, что, используя методику M. Canessa определения скорости Na⁺-Li⁺-ПТ в мембране эритроцита, при внесении в среду В при 1 часовой инкубации, мы, определяя изменения скорости Na⁺-Li⁺-ПТ, судим о том, что исследуемое вещество изменяет (или не изменяет) проницаемость клеточной мембраны по Na⁺.

Мы проводили пилотные исследования по изучению изменения величины скорости Na⁺-Li⁺-ПТ путем внесения исследуемого вещества изолированно в каждую из 3-х сред инкубации (в средах Б, В, Г). Нами было обнаружено, что скорость Na⁺-Li⁺-ПТ изменяется при внесении исследуемого вещества только в среду В (среду, содержащую Na⁺).

Выявлено, что при внесении в среду В различных концентраций исследуемых веществ происходит увеличение проницаемости по Na⁺ на малых дозах (концентрациях) исследуемых веществ - для диметилсульфоксида (в %) - 0,01% и для синтезированных веществ C₁₀, C¹², C₁₃, C₁₄, С₁₆, С₁₈ [см. пат. РФ 2423372, опубл. 10.07.2011] (в µM) - 0,01 µM и 0,05 µM, что оценивается по достоверному увеличению скорости Na⁺-Li⁺-ПТ.

Таким образом, по скорости Na⁺-Li⁺-ПТ (при добавлении испытуемого вещества в среду В в период 1 часовой инкубации) можно судить о возможности использования определенных концентраций исследуемых веществ в отношении их влияния на проницаемость клеточной мембраны по натрию.

Приводим примеры исследования различных веществ по их влиянию на проницаемость клеточной мембраны по натрию с помощью определения скорости Na⁺-Li⁺-ПТ в МЭ.

Фиг №1. «Исследование влияния диметилсульфокида на величину скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в МЭ (in vitro) при внесении в среду В».

Результаты исследования влияния «Диметилсульфоксида» приведены на фиг.1.

Как следует из представленных данных (фиг.1), при инкубации эритроцитов в среде В (среда с NaCl) при 1 часовой инкубации препарат «Диметилсульфоксид» повлиял на скорость Na⁺-Li⁺-ПТ в мембране эритроцита на проницаемость по Na⁺ в концентрации 0,01% (увеличил проницаемость по Na⁺).

Вещества С₁₀, С₁₂, С₁₄, C₁₆, C₁₈ - это поверхностно-активные вещества с высоким катионным зарядом на атоме фосфора, обладающие противомикробной, фунгицидной активностью. Результаты исследования представлены на фиг.2-6. «Исследование влияния C₁₀, C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈ на величину скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в МЭ (in vitro) при внесении в среду В».

При этом различные концентрации исследуемых веществ C₁₀, C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈ вносились в среду В, содержащую NaCl (1 часовая инкубация).

Данные опытов сведены в таблицу №1.

Таблица 1 Влияние фармакологически активных веществ C₁₀, C₁₂, C₁₄, C₁₆, C₁₈ на скорость Na⁺-Li⁺-ПТ в МЭ (в исследованиях in vitro) (скорость Na⁺-Li⁺-ПТ в мкМ Li/л кл./ч, M±m) Вещество Исходное значение скорости Na⁺-Li⁺-ПТ Концентрация веществ C₁₀-C₁₈ в µM 0,001 0,005 0,010 0,025 0,05 1,0 C₁₀ 337±5 403±13* 370±4* 322±7 362±5 376±1 гемолиз C₁₂ 337±5 398±15* 350±24* 303±12 322±15 323±15 гемолиз C₁₄ 337±5 430±27* 381±5* 359±7 355±8 343±7 гемолиз C₁₆ 337±5 443±39* 441±42* 369±20 гемолиз гемолиз гемолиз C₁₈ 337±5 416±10* 368±4* 327±5 365±14 381±6 гемолиз * достоверные различия с исходным значением скорости Na⁺-Li⁺-ПТ (p<0,05)

Из таблицы 1 видно, что для веществ C₁₀, C₁₂, C₁₄ и C₁₈ гемолиз наступает при концентрации 1,0 µM, а у вещества C₁₆ гемолиз наблюдается при меньшей концентрации порядка 0,025 µM.

Увеличение скорости Na⁺-Li⁺-ПТ в мембране эритроцита происходит под влиянием минимальной концентрации вещества. Под влиянием других концентраций скорость Na⁺-Li⁺-ПТ не изменяется. Таким образом, увеличение проницаемости клеточных мембран по Na⁺ происходит под влиянием минимальной концентрации вещества, дальнейшее увеличение концентрации не влияет на скорость Na⁺-Li⁺-ПТ.

Настоящее изобретение относится к области медицины и фармации, а именно к биохимии клеточных мембран человека, и описывает способ оценки влияния лекарственных веществ на проницаемость мембран эритроцитов по натрию с использованием определения скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита, при котором измеряют скорость обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации, причем исследуемое вещество вносят в среду 1-часовой инкубации, содержащую в мМ: 150 - NaCl; 10 - глюкозы; 10 - Hepes-Tris; 0,1 - уабаина, и по изменению величины скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита судят о влиянии вещества на проницаемость клеточной мембраны по натрию. Изобретение обеспечивает оптимизацию подбора лекарственной терапии. 6 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ оценки влияния лекарственных веществ на проницаемость мембран эритроцитов по натрию с использованием определения скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита, при котором измеряют скорость обмена внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации, отличающийся тем, что исследуемое вещество вносят в среду 1-часовой инкубации, содержащую в мМ: 150 - NaCl; 10 - глюкозы; 10 - Hepes-Tris; 0,1 - уабаина, и по изменению величины скорости Na⁺-Li⁺-противотранспорта в мембране эритроцита судят о влиянии вещества на проницаемость клеточной мембраны по натрию.