СПОСОБ КАРТИРОВАНИЯ ПОЛОЖЕНИЙ РЯДА МЕТИЛИРОВАННЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Pu(5mC)GPy В ПРОТЯЖЕННОЙ ДНК ДЛЯ ПОСТРОЕНИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ И ВЫЯВЛЕНИЯ АНОМАЛЬНО МЕТИЛИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ ДНК Российский патент 2016 года по МПК C12N15/10 C12Q1/68 G06F19/18 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике и касается способа картирования положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК.

Основным эпигенетическим механизмом, обеспечивающим регуляцию генной активности, служит метилирование ДНК, широко распространенное в живых организмах. У высших эукариот модификация ДНК происходит преимущественно в CG-динуклеотидах путем добавления метальных групп к цитозиновым остаткам в положении С5 пиримидинового кольца, что приводит к образованию 5-метилцитозиновых остатков (5 mC) в составе ДНК. Метилирование ДНК играет важную роль в таких биологических процессах, как дифференцировка клеток и тканей, геномный импринтинг, инактивация мобильных элементов генома и других [Sontag LB, Lorincz МС, Georg Luebeck Ε. Dynamics, stability and inheritance of somatic DNA methylation imprints. J Theor Biol. 2006; 242(4): 890-899]. Аномальное de novo метилирование сайтов PuCGPy (с образованием последовательности Pu(5mC)GPy, где Pu=R-А или G, Py=Y-С или T) осуществляется ДНК-метилтрансферазами человека DNMT3a и DNMT3b в регуляторных участках генов и повторяющихся элементов генома, наблюдается в клетках пораженных тканей при ряде заболеваний, в частности при онкопатологиях. Определение степени модификации тех или иных участков генома в норме и патологии позволяет выявлять нарушения в регуляции экспрессии генов и имеет большой диагностический потенциал [de Caseres 1.1., Cairus P. Methylated DNA sequences for early cancer detection, molecular classification and chemotherapy response prediction // Clin. Transi. Oncol. - 2007. - Vol. 9. - P. 429-437]. Изучение метилирования ДНК также важно для понимания молекулярных механизмов онтогенеза, старения, приспосабливаемости организмов к изменениям среды обитания.

Следует разделять методы определения метилирования отдельных участков в протяженной ДНК и поиск максимально возможного числа метилированных участков (т.н. эпигенетическое профилирование или картирование) во всей геномной ДНК. Первая группа методов, таких как GLAD-ПЦР-анализ [Кузнецов В.В., Акишев А.Г., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. «Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК». Патент РФ №2525710, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.08.2014 г.], применяется, в основном, для диагностических целей. Эти методы позволяют достаточно просто определить состояние метилирования одного или нескольких участков геномной ДНК. При этом данные методы не предусматривают поиск этих участков, поскольку в процессе поиска необходимо проведение отдельного эксперимента для каждого кандидатного участка, что существенно увеличивает трудоемкость такого поиска. Вторая группа методов (эпигенетического картирования или профилирования) как раз нацелена на поиск и выявление аномально метилированных сайтов во всей протяженной ДНК и последующий анализ связи метилирования отдельных участков геномной ДНК с различными патологиями, изучение механизмов онтогенеза, старения, приспосабливаемости организмов к изменениям среды обитания.

Существующие способы эпигенетического профилирования геномов включают в себя методы, основанные на секвенировании бисульфитно-обработанной ДНК (например, WGBS и RRBS), и методы, использующие ферментативное расщепление ДНК эндонуклеазами, чувствительными к метилированию цитозиновых остатков ДНК (Grigg G.W. Sequencing 5-methylcytosine residues by the bisulphite method // DNA Seq. (1996) 6, 189-198). Метод WGBS (Whole Genome Bisulfite Sequencing, полногеномное бисульфитное секвенирование) позволяет определить статус метилирования цитозиновых остатков во всем геноме, но не нашел широкого применения в связи с высокой стоимостью проведения такого рода исследования и трудностью получения достаточного объема данных. Метод RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, бисульфитное секвенирование с пониженной представленностью) представляет собой упрощенный вариант метода WGBS и отличается тем, что для проведения секвенирования отбираются короткие MspI - фрагменты генома (40-220 п.н.), включающие в себя большую часть регуляторных CpG-островков.

Для проведения анализа с помощью методов геномного бисульфитного секвенирования требуется сложная пробоподготовка образцов ДНК, включающая в себя: а) случайную фрагментацию ДНК ультразвуком или неспецифической нуклеазой; б) восстановление концов фрагментов ДНК-полимеразой и добавление адениновых нуклеотидов к их концам для сшивки с адаптерами; в) сшивку фрагментов с олигонуклеотидными адаптерами, содержащими метилированные цитозиновые основания; г) очистку и отделение фракции фрагментов нужной длины; д) проведение бисульфитной конверсии; е) ПЦР-амплификацию продуктов конверсии; ж) очистку амплифицированных фрагментов. Недостатками этого подхода являются трудоемкость, значительная степень деградации ДНК при обработке бисульфитом (до 90% от всей обрабатываемой ДНК) и трудность получения полностью конвертированной ДНК [Smith ZD, Gu H, Bock C, Gnirke A, Meissner A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 2009; 48: 226-232].

Ферментативный подход требует использования пары сайт-специфических эндонуклеаз, отличающихся по чувствительности к метилированию одного и того же сайта узнавания, например HpaII/MspI [Xia Ζ, Zou M, Zhang S, Feng B, Wang W. AFSM sequencing approach: a simple and rapid method for genome-wide SNP and methylation site discovery and genetic mapping. Sci Rep. 2014; 4: 7300] или Smal/Xmal [международная заявка WO 2010085774, МПК C12Q 1/68, опубл. 29.07.2010 г. «Digital restriction enzyme analysis of methylation»]. Однако известно лишь несколько таких пар ферментов, что резко сужает возможности этого метода. Кроме того, необходимость использования двух гидролизатов ДНК для проведения геномного секвенирования также усложняет и повышает стоимость исследований [Booth MJ, Raiber ЕА, Balasubramanian S. Chemical methods for decoding cytosine modifications in DNA. Chem Rev. 2015; 115(6): 2240-2254]. Процедура пробоподготовки в этом случае включает в себя: а) расщепление геномной ДНК редкощепящей эндонуклеазой рестрикции, например EcoRI; б) раздельную обработку полученного гидролизата метил-чувствительной и метил-нечувствительной эндонуклеазами; в) сшивку полученных фрагментов с олигонуклеотидными адаптерами, подобранными в соответствии с образуемыми при ферментативном расщеплении концами фрагментов.

Открытие нового класса ферментов - 5mC-зависимых сайт-специфических эндонуклеаз - позволяет расширить инструментарий геномного эпигенетического анализа. Эти ферменты проявляют специфичность лишь к определенным нуклеотидным последовательностям, содержащим 5mC [Землянская Е.В., Дегтярев С.X. Субстратная специфичность и свойства метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз // Молекулярная биология, том 47, №6, с. 900-913 (2013)].

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявленному способу является способ фрагментации геномной ДНК метилзависимой эндонуклеазой MspJI [заявка США № US 2014/0364321, МПК C12Q 1/68, опубл. 11.12.2014 г. «Method for analyzing DNA methylation based on MspJI cleavage»]. Данный фермент узнает последовательность 5′-(5mC)NNPu-3′ и гидролизует ДНК преимущественно в позициях 9/13 (верхняя/нижняя цепи ДНК) в 3′-направлении от сайта узнавания. При расщеплении геномной ДНК ферментом MspJI образуются короткие фрагменты длиной 32 п.н., содержащие модифицированные CG-динуклеотиды в составе последовательности 5′-PyN(5mC)GNPu-3′. Определение нуклеотидного состава коротких MspJI-фрагментов методами NGS-секвенирования и установление их позиций в референсном геноме позволяет выявить значительную часть модифицированных CG-динуклеотидов.

Недостатками данного способа фрагментации являются:

1) вариабельность позиций расщепления эндонуклеазы MspJI;

2) неполнота гидролиза по сайтам 5′-(5mC)NNA-3′ по сравнению с сайтами 5′-(5mC)NNG-3′;

3) необходимость использования олигонуклеотидного активатора фермента;

4) длительное время обработки ДНК эндонуклеазой MspJI (16 часов);

5) необходимость достройки выступающих концов фрагментов, образуемых при расщеплении двуцепочечной ДНК ферментом MspJI;

6) сниженная степень достоверности картирования коротких фрагментов ДНК на референсный геном [Cohen-Karni D, Xu D, Apone L, Fomenkov A, Sun Z, Davis PJ, Kinney SR, Yamada-Mabuchi M, Xu SY, Davis Τ, Pradhan S, Roberts RJ, Zheng Y. The MspJI family of modification-dependent restriction endonucleases for epigenetic studies. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108(27): 11040-11045].

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение, повышение надежности и достоверности способа определения позиций (картирования) большого числа метилированных сайтов PuCGPy в геноме.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе картирования положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК, согласно изобретению выделяют высокоочищенную геномную ДНК, которую гидролизуют в реакционном буфере метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой GlaI в течение времени и при температуре, достаточных для полного гидролиза продукта с получением смеси фрагментов геномной ДНК. В качестве реакционного буфера A используют 20 мМ Tris-SO₄, pH 8.0, 4 мМ MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 нг/мкл BSA, а для гидролиза ДНК используют эндонуклеазу GlaI активностью не менее 2-3 е.а. на 1 мкг геномной ДНК в течение 1 часа при 30°C с последующей инактивацией при 65°C в течение 20 минут. Указанную смесь фрагментов ДНК выделяют из раствора осаждением, а для дальнейшего анализа отбирают GlaI-фрагменты ДНК размером 150-500 п.н., наиболее оптимально подходящие для NGS-секвенирования. Для этого короткие фрагменты геномной ДНК выделяют электрофорезом в 2%-ной агарозе вырезанием фрагмента геля, содержащего GlaI-фрагменты геномной ДНК размером 150-500 п.н., и отделяют полученный продукт от гелевой массы центрифугированием. Далее определяют нуклеотидный состав концов образовавшихся коротких GlaI-фрагментов геномной ДНК методами NGS-секвенирования путем парноконцевого чтения при длине чтения 75 п.н. с каждого конца фрагмента ДНК, программно фильтруют полученные данные для исключения фрагментов с низким качеством чтения, с концами, неспецифичными для GlaI-фрагментов, и по признаку присутствия динуклеотида GPy на 5′-концах последовательностей и определяют положения в референсном геноме нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy отфильтрованных GlaI-фрагментов с использованием любого программного обеспечения класса «геномный ассемблер».

Описание заявляемого способа картирования положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК

Способ включает следующие шаги:

1) получение образцов высокоочищенной геномной ДНК, пригодной для секвенирования следующего поколения;

2) обработка ДНК метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой GlaI и получение GlaI-фрагментов;

3) определение нуклеотидного состава концов образовавшихся GlaI-фрагментов методами NGS-секвенирования;

4) фильтрация полученных данных для исключения фрагментов с низким качеством чтения и с концами, неспецифичными для GlaI-фрагментов;

5) установление положения секвенированных последовательностей ДНК в референсном геноме для определения положения метилированных участков.

Высокоочищенную геномную ДНК выделяют, как описано ранее в [Sambrook J., Russel D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. - 2222 p.].

GlaI-фрагменты получают при расщеплении ДНК путем добавления метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI (2-3 е.а. на 1 мкг ДНК) в реакционном буфере А (20 мМ Tris-S04, pH 8.0, 4 мМ MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 нг/мкл BSA) в течение 1 часа при 30°C с последующей инактивацией при 65°C в течение 20 минут.

Подготовку и проверку библиотеки ДНК-фрагментов для секвенирования проводят в соответствии с рекомендациями производителя секвенирующей машины NGS. Определяют нуклеотидный состав фрагментов из полученной библиотеки с использованием секвенирующей машины NGS. При выборе размера рида исходят из того, что задачей, в отличие от традиционного секвенирования, не является прочтение всей последовательности фрагментов, а лишь определение положения их концов. Поэтому размер рида выбирают достаточным для надежного определения положения прочитанного фрагмента на известном референсном геноме.

По итогам секвенирования проводят фильтрацию суммарного массива данных для исключения из него фрагментов с низким качеством чтения, определяемым аппаратно при проведении секвенирования. Проводят дополнительную фильтрацию массива данных, исключая из него фрагменты, не несущие на 5′-конце динуклеотид GPy и, следовательно, образовавшиеся при неспецифической деструкции ДНК при ее выделении или в процессе случайной сшивки во время пробоподготовки. Картирование (определение положения) отфильтрованных GlaI-фрагментов на референсный геном проводят с помощью любого программного обеспечения класса «геномный ассемблер», предназначенного для этой цели, например с помощью программ CLC Genomics Workbench, Bowtie, GMAP и т.д. Начальные координаты положения картированных фрагментов в геноме соответствуют координатам нуклеотида G в метилированном CG-динуклеотиде. Значительное количество фрагментов, имеющих одинаковую начальную координату, свидетельствует о высокой частоте метилирования сайта 5′-Pu(5mC)GPy-3′ в данной позиции генома.

Результатом картирования являются данные о расположении (координаты нуклеотида G в метилированном CG-динуклеотиде) и количестве метилированных фрагментов PuCGPy в исследуемом геноме (так называемый эпигенетический профиль).

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

На фиг. 1-3 приведены результаты проведенного картирования секвенированных GlaI-фрагментов ДНК на референсный геном.

Ниже приведен пример конкретного выполнения заявляемого способа.

Пример. Определение позиций метилированных сайтов 5′-Pu(5mC)GPy-3′ в геномной ДНК опухолевой клеточной линии Raji человека

56 мкг ДНК, выделенной из клеточной культуры Raji, гидролизовали в 400 мкл буфера A, содержащего 160 е.а. фермента GlaI в течение 1 часа при 30°C. Инактивацию эндонуклеазы GlaI проводили, нагревая реакционную смесь при 65°C в течение 20 минут. Полученные фрагменты ДНК осаждались из раствора путем добавления 40 мкл 3M ацетата калия и 1 мл 96%-ного этилового спирта, перемешивания и центрифугирования при 12000 об/мин в течение 10 мин. Осадок двукратно промывали 300 мкл 96%-ного этилового спирта, подсушивали в течение 30 мин при комнатной температуре и растворяли в 80 мкл буфера ТЕ (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 тМ ЭДТА).

Для дальнейшего анализа отбирались фрагменты ДНК размером 150-500 п.н., наиболее оптимально подходящие для секвенирования на NGS-приборе. Для этого проводили электрофоретическое разделение полученной смеси GlaI-фрагментов в 2%-ном агарозе А-4018 («Sigma», США) в IX трис-ацетатном буфере. После проведения электрофореза ДНК окрашивалась бромистым этидием и из геля вырезалась область, соответствующая длине гидролизатов 150-500 п.н.

Вырезанный кусок геля помещался в микроцентрифужную пробирку (спин-колонку с сорбентом для ДНК) из набора для очистки ДНК из геля и реакционных смесей Cyt 202 («Цитокин», Россия). Добавлялся равный объем связывающего буфера (800 мкл) из этого набора. ДНК элюировалась с помощью 40 мкл буфера для элюции согласно протоколу производителя. В результате было получено 40 мкл GlaI-фрагментов ДНК Raji с концентрацией 0,35 мг/мл.

Секвенирование фрагментов проводили на приборе MiSeq (Illumina, США). Подготовку библиотеки фрагментов для проведения секвенирования проводили согласно протоколу производителя секвенирующего прибора (Illumina Paired-End Sample Preparation protocol) и с использованием набора реагентов от этого производителя. Для повышения надежности картирования была выбрана стратегия парноконцевого чтения при длине чтения 75 п.н. с каждого конца фрагмента ДНК.

В результате проведения секвенирования было получено 23511713 млн пар чтений концов фрагментов. После фильтрации по качеству с помощью программы CLC Genomics Workbench ("CLC bio", США) размер массива данных составил 19470289 пар чтений. Дополнительная фильтрация по признаку присутствия динуклеотида GPy на 5′-концах последовательностей, проведенная с помощью разработанного программного обеспечения ResultPrep сократила объем массива данных до 19004979 пар чтений.

Картирование и визуализация положения полученных последовательностей на референсный геном человека (сборка hgl9) проводилось с помощью программы CLC Genomics Workbench.

На фиг. 1-3 показаны некоторые результаты проведенного картирования секвенированных GlaI-фрагментов ДНК на референсный геном. В качестве примеров приведено положение GlaI- фрагментов в регуляторных участках трех генов-онкосупрессоров, которые, как было показано ранее методом GlaI-ПЦР-анализа, гиперметилированы (DAPK1 и IGFBP3) или незначительно метилированы (MGMT) в геноме клеток Raji (А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев. Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова, Т. 7, №3, с. 5-16 (2011)).

На фиг. 1 и 2 продемонстрирована высокая частота картирования GlaI-фрагментов в областях начала генов DAPK1 и IGFBP3, что говорит о значительной степени метилирования сайтов PuCGPy в регуляторных участках данных генов. Фиг.3 свидетельствует о незначительном метилировании регуляторного участка гена MGMT, так как содержит лишь несколько картированных фрагментов.

Полученные данные для клеточной линии Raji могут быть использованы для статистической обработки с целью выявления гиперметилированных сайтов во всем геноме путем сравнения с опубликованными данными, полученными для клеток тканей здоровых индивидов.

Использование заявляемого способа позволяет значительно сократить время, необходимое для подготовки проб геномной ДНК для секвенирования на приборах NGS-типа, проводить более надежное картирование полученных последовательностей на нуклеотидную последовательность референсного генома, удешевить процедуру выявления метилированных сайтов в геномах.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике. Способ предусматривает картирование положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК. Способ включает выделение высокоочищенной геномной ДНК, которую гидролизуют в реакционном буфере метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой GlaI в течение времени и при температуре, достаточных для полного гидролиза продукта с получением смеси фрагментов геномной ДНК. Выделяют указанную смесь фрагментов ДНК из раствора осаждением, а для дальнейшего анализа отбирают GlaI-фрагменты ДНК размером 150-500 п.н., наиболее оптимально подходящие для NGS-секвенирования. Определяют нуклеотидный состав концов образовавшихся коротких GlaI фрагментов геномной ДНК методами NGS-секвенирования, программно фильтруют полученные данные для исключения фрагментов с низким качеством чтения, с концами, неспецифичными для GlaI-фрагментов, и по признаку присутствия динуклеотида GPy на 5′-концах последовательностей и определяют положения в референсном геноме нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy отфильтрованных GlaI-фрагментов с использованием любого программного обеспечения класса «геномный ассемблер». Применение данного способа позволяет упростить, повысить надежность и достоверность способа определения позиций (картирования) большого числа метилированных сайтов PuCGPy в геноме. 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ картирования положений ряда метилированных нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy в протяженной ДНК для построения эпигенетического профиля и выявления аномально метилированных участков ДНК, характеризующийся тем, что выделяют высокоочищенную геномную ДНК, которую гидролизуют в реакционном буфере метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой GlaI в течение времени и при температуре, достаточных для полного гидролиза продукта с получением смеси фрагментов геномной ДНК, выделяют указанную смесь фрагментов ДНК из раствора осаждением, а для дальнейшего анализа отбирают GlaI-фрагменты ДНК размером 150-500 п.н., наиболее оптимально подходящие для NGS-секвенирования, определяют нуклеотидный состав концов образовавшихся коротких GlaI фрагментов геномной ДНК методами NGS-секвенирования, программно фильтруют полученные данные для исключения фрагментов с низким качеством чтения, с концами, неспецифичными для GlaI-фрагментов, и по признаку присутствия динуклеотида GPy на 5′-концах последовательностей и определяют положения в референсном геноме нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy отфильтрованных GlaI-фрагментов с использованием любого программного обеспечения класса «геномный ассемблер».

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для гидролиза ДНК используют эндонуклеазу GlaI активностью не менее 2-3 е.а. на 1 мкг геномной ДНК в течение 1 часа при 30°C с последующей инактивацией при 65°C в течение 20 минут.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве реакционного буфера A используют 20 мМ Tris-SO₄, pH 8.0, 4 мМ MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 нг/мкл BSA.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что короткие фрагменты геномной ДНК выделяют электрофорезом в 2%-ной агарозе вырезанием фрагмента геля, содержащего GlaI-фрагменты геномной ДНК размером 150-500 п.н., и отделяют полученный продукт от гелевой массы центрифугированием.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение положений (картирования) нуклеотидных последовательностей Pu(5mC)GPy осуществляют путем парноконцевого чтения при длине чтения 75 п.н. с каждого конца фрагмента ДНК.