СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗРАСТА ЧЕЛОВЕКА ПО ДНК Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения возраста человека по метилированию его ДНК.

Предпосылки создания изобретения

Одним из этапов идентификации личности в криминалистике является определение возраста индивидуума. Старение человека можно представить как постепенный процесс накопления изменений в биомолекулах, как на уровне ДНК, так и на уровне белков. Применение анализа таких изменений в криминалистике позволяет определять возраст как живых людей, так и их останков. Оценка возраста может использоваться для получения информации, актуальной для уголовных дел, юридических и антропологических исследований. Оценка возраста индивидуума может использоваться для предсказания связанных с возрастом физических признаков, таких, как цвет волос или облысение у мужчин. Кроме того, это важный фактор для идентификации неопознанных останков (пропавших без вести, жертв массовых беспорядков или жертв стихийных бедствий) – распространенной и сложной задачи, особенно при отсутствии живых родственников.

Традиционно для оценки возраста в судебно-медицинской экспертизе применяются морфологические методы исследования останков (например, оценка морфологических особенностей зубов или частей скелета), а также биохимические методы (определение возраста радиоуглеродным методом, определение возраста с использованием рацемизации аспарагиновой кислоты в дентине). Ошибка при определении возраста морфологическими методами составляет около 10 лет, а при применении биохимических методов – около 3-х лет для рацемизации и около 1-2 лет при радиоуглеродном анализе.

Однако перечисленные методы являются неприменимыми при отсутствии достаточного количества материала (например, на месте преступления), высокой степени деградации материала, кроме того, для проведения анализа подходят не все типы образцов тканей. В таких случаях применяются молекулярно-генетические методы анализа, которые позволяют использовать для оценки возраста материалы человека, не содержащие морфологических признаков возраста, или образцы, содержащие очень малое количество биологического материала: кровь, сперму, слюну и другие биологические выделения, в том числе в форме высушенных мазков и пятен; мягкие ткани (фрагменты кожи, эпителиальные клетки слизистой оболочки, другие фрагменты мягких тканей); твердые ткани (кости, зубы); волосы с волосяными фолликулами; ДНК на сигаретных окурках и личных вещах, например, на зубной щетке. Основным материалом в молекулярно-генетических исследованиях является ДНК, поскольку она является чрезвычайно стабильной и долгоживущей молекулой, и сохраняется даже в переработанном биологическом материале (высушенные пятна биологических жидкостей, переработанные пищевые продукты, копролиты, мумифицированные ткани и т. д.). Кроме того, она присутствует во всех биологических жидкостях, что позволяет проводить анализ из почти всех видов биологических субстратов (слюна, фекалии, молоко и т. д.). Наконец, из-за вырожденности генетического кода и существования длинных некодирующих участков, анализ ДНК может быть более информативен, чем анализ белков.

Основными молекулярно-генетическими методами определения возраста индивидуума являются: 1) оценка накопления мутаций в митохондриальной ДНК, 2) оценка длины теломер, 3) оценка количества повторов в ДНК, 4) оценка экспрессии генов, 5) оценка уровней метилирования ДНК.

Метилирование ДНК является процессом модификации молекулы ДНК без изменения ее последовательности путем добавления метильной группы к 5'-углероду цитозина с образованием 5-метилцитозина. Эта реакция осуществляется семейством ферментов ДНК-метилтрансфераз (у человека это DNMT3А и DNMT3B, которые de novo добавляют метильные группы к неметилированным участкам, а также DNMT1, которая восстанавливает уровень метилирования во время деления клеток). Метилирование ДНК может возникать как в отдельных CpG-динуклеотидах, так и затрагивать целые области – CpG островки (области в геноме с повышенной представленностью CpG, которые обычно располагаются вблизи регуляторных областей генов и являются слабо метилированными). Повышение уровня метилирования регуляторной области гена, как правило, приводит к ингибированию его экспрессии через воздействие на сайт посадки транскрипционных факторов, изменение активности инсуляторных областей и компактизацию целого участка хромосомы. Среди факторов, которые приводят к изменениям уровней метилирования ДНК, можно отметить дифференцировку клеток, старение, генетическую вариабельность, воздействие окружающей среды – например, воздействие солнечного света и ультрафиолетового излучения, инфекции, физические упражнения, питание, употребление алкоголя, стрессы и т.д. Некоторые исследования показали, что ограничения калорийности рациона и физические упражнения позволяют изменить профили метилирования в скелетной мускулатуре и в тканях сердца таким образом, что они становятся сходны с более «молодыми» образцами. Кроме того, согласно некоторым исследованиям, они способны изменить профили метилирования в тканях мозга, и тем самым воздействовать на когнитивные функции.

Впервые изменения уровня метилирования ДНК в онтогенезе и при старении были идентифицированы при анализе различных органов и жизненных стадий лосося. Позже было показано, что возрастное глобальное ДНК-гипометилирование наблюдается у самых разных видов, включая крыс, мышей и человека. Однако это правило не является универсальным для всех генов – например, с возрастом увеличивается уровень метилирования промоторных областей генов-мишеней белков группы Polycomb, так же, как и уровень метилирования промоторов ключевых генов, связанных с развитием организма.

Появление микрочипов, развитие технологий масштабного параллельного секвенирования и расширение их применения в эпигенетике позволило выявить более специфические возрастные изменения профилей метилирования определенных генов или геномных областей. Были выявлены маркеры, уровни метилирования которых могут быть использованы для определения возраста индивидуума. В то же время в практической работе применимы далеко не все известные способы. Существует необходимость в создании простого и надежного способа определения возраста по уровню метилирования маркеров, дающий воспроизводимый результат даже при минимальном количестве анализируемого материала.

Предшествующий уровень техники

В последние годы количество публикаций, описывающих взаимосвязь профилей метилирования с возрастом, растет лавинообразно. Большинство исследователей используют анализ крови индивидуумов, однако, встречаются и публикации с результатами анализа других биологических жидкостей, а также различных типов клеток. Точность некоторых моделей для предсказания возраста индивидуумов по профилям метилирования уже достигла более высокого уровня, чем при применении вышеописанных методик (оценки длины теломер и др.) и достигает ошибки предсказания в ±4 года. В криминалистике могут быть использованы результаты следующих основных исследований профилей метилирования.

В исследовании Hannum с коллегами было показано, что уровень метилирования – это репрезентативный биомаркер скорости старения. Проведя полногеномный анализ метилирования двух когорт (N1 = 482, белая европеоидная популяция; N2 = 174, латиноамериканская популяция), в которых были представлены образцы возрастом от 19 лет до 101 года на микрочипе Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip, было выявлено 70387 точек, уровень метилирования которых был ассоциирован с возрастом проанализированных образцов. 76% из них были воспроизведены при анализе независимой выборки. Выявленные в исследовании закономерности позволили создать количественную модель старения, основанную на анализе метилома по 71 маркеру, которая демонстрирует высокую точность (корреляция реального возраста с предсказанным составила 96%, ошибка составила 3,9 лет) и способность различать такие важные характеристики, как пол и генетические варианты маркеров. Разработанная модель подходит для разных тканей, что увеличивает ее ценность для применения в нуждах криминалистики.

В исследовании McClay с коллегами были проанализированы образцы цельной крови 718 индивидуумов возрастом 25-92 лет при помощи полнометиломного поиска ассоциаций (MWAS). Были выявлены 11 дифференциально метилированных областей, достоверно ассоциированных с возрастом, ими стали участки, ассоциированные с генами SNTG1, LSAMP, ZEB2, KCNJ8, MEIS1, PTPRT, C1orf201, FOXP1, FGF8/NPM3/MGEA5, и два участка на 5й и 2й хромосомах, не ассоциированные с генами. Были проанализированы выбранные маркерные области при помощи пиросеквенирования бисульфит-обработанной ДНК на дополнительной выборке из образцов 558 индивидуумов. Было показано, что гипо- или гипер- метилирование маркерных областей подтвердилось при анализе на независимой выборке.

В работе Steve Horvarth была сформулирована концепция «эпигенетических часов». Были проанализированные общедоступные данные, которые содержали результаты исследований метилирования, полученные на микрочипах Illumina 27K или Illumina 450K. В анализ были включены данные по образцам различных типов тканей, полученных от доноров, и различных типов клеток. Всего в анализ вошли 82 набора данных, содержавшие 7844 образцов, относящихся к 51 различному типу тканей и клеток, в основном соответствующие здоровым образцам. В частности, были исключены из анализа образцы раковых тканей, поскольку известно, что при раке наблюдаются изменения профилей метилирования. В анализ вошли 21369 CpGs, которые присутствовали на обоих микрочипах (27K и 450K). При помощи регрессионной модели было выделено 353 CpG локуса, которые и являются основой «эпигенетических часов», поскольку анализ уровней метилирования данных локусов позволяет определить возраст образца и является стабильным при анализе различных типов клеток и тканей. Кроме того, было сформулировано несколько характеристик, описывающих особенности взаимосвязи возраста и уровня метилирования ДНК: метилирование ДНК близко к нулю в эмбриональных тканях, в стволовых и в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках; уровень метилирования кореллирует с пассажем клеток; «эпигенетические часы» применимы для всех тканей приматов. На тренировочной выборке корреляция уровня метилирования маркерных локусов с возрастом составила 0,97, а ошибка – 2,9 лет, однако, на экспериментальной выборке показатели были немного хуже, коэффициент корреляции составил 0,96, а ошибка – 3,6 лет. Также описывается «урезанная» версия «эпигенетических часов», в которую вошли 110 маркерных локусов. Анализ по этим точкам позволяет оценить возраст индивидуума с корреляцией 0,95 и средней ошибкой в 4,2 года. Отличительной особенностью является высокая универсальность выявленных маркеров и небольшая ошибка определения возраста, что дает «эпигенетическим часам» большой потенциал для применения в криминалистике.

В исследовании Bocklandt с коллегами был проведен анализ метилирования ДНК в образцах слюны, полученных от 34 пар однояйцевых близнецов мужского пола в возрасте от 21 до 55 лет. В ходе анализа на микрочипе Illumina Human Methylation 27K было проанализировано метилирование 27578 локусов CpG в более чем 14000 генов. Были отобраны 88 сайтов, которые находились в или рядом с 80 генами, для которых уровень метилирования коррелировал с возрастом с коэффициентом корреляции выше 0,57. Из этих сайтов 19 коррелировали с возрастом негативно и 69 – позитивно. Три сайта с наиболее высоким коэффициентом корреляции проанализировали на дополнительной выборке, состоявшей из образцов, полученных от 31 мужчины и 29 женщин в возрасте от 18 до 70 лет. Метилирование трех сайтов - в промоторах EDARADD, TOM1L1 и NPTX2 генов - линейно коррелировало с возрастом на протяжении пяти десятилетий. С использованием только двух точек из этих локусов, была построена регрессионная модель, которая объясняла 73% дисперсии по возрасту и на основе которой можно оценить возраст человека со средней точностью 5,2 года.

В работе Koch и Wagner были проанализированы общедоступные данные, которые содержали результаты исследований метилирования, полученные на микрочипах Illumina Human Methylation 27K было проанализировано метилирование 27578 локусов CpG в более чем 14000 генов. Были проанализированы профили метилирования, полученные при анализе образцов дермы, эпидермиса, вагинальных мазков, Т-клеток и моноцитов. Исследователи идентифицировали 19 сайтов CpG, которые гиперметилируются с возрастом (R>0,6; p-value<10-13). 4 из них, ассоциированные с генами NPTX2, TRIM58, GRIA2 и KCNQ1DN, и дополнительный гипометилированный сайт CpG, ассоциированный с геном BIRC4BP, были использованы для регрессионного анализа и создания модели для предсказания возраста. Применение созданной модели позволило определять возраст образца с точностью ± 9,3 года. При этом если в модели использовали только 3 локуса с наиболее высокой корреляцией (NPTX2, GRIA2 и KCNQ1DN), точность определения возраста составляла ±10,3. Затем модель была верифицирована на 8 независимых наборах данных, на которых точность определения возраста составила ±12,7 лет, при этом при использовании только 3х локусов с наиболее высокой корреляцией точность предсказания составила ±11,4 года.

В своем исследовании Weidner с коллегами выявили три локуса, которые, по словам авторов, являются достаточно информативными, чтобы на основе оценки их уровней метилирования оценить возраст образцов крови. Авторы охарактеризовали 575 образцов клеток, полученных из крови доноров возрастом от 0 до 78 лет в четырех разных исследованиях при помощи Illumina Human Methylation 27K. Отбор по коэффициенту корреляции позволил выявить 102 локуса CpG, метилирование которых коррелировало с возрастом (58 гипометилированных и 44 гиперметилированных). Авторы разработали модель, которая смогла предсказать возраст образцов с точностью ±3,34 года, R2 = 0,98. Затем качество модели оценили на нескольких независимых выборках, находящихся в свободном доступе (GSE49904, ошибка составила ±5,79 лет; GSE41037, ошибка - ±5,52 лет; GSE37008, ошибка ±4,02 лет). Затем из 102 локусов были выбраны 3 наиболее информативных – ассоциированные с генами ITGA2B, ASPA и PDE4C. Они были проанализированы при помощи пиросеквенирования на дополнительной выборке бисульфит-конвертированной ДНК, полученной из 151 образцов крови. Точность предсказания на этой выборке составила около 5 лет. Авторы объясняют вариабельность предсказания возраста различиями в образе жизни и в клинических характеристиках. Так, образцы пациентов, больных апластической анемией или врожденным дискератозом (заболеваниями, связанными с прогрессирующими нарушениями функционирования костного мозга и сильным укорочением теломер), на основе профилей метилирования описывались как подверженные избыточному старению.

В исследовании Yi с коллегами описаны результаты анализа метилирования образцов периферической крови, полученных от 40 доноров. Для оценки метилирования применяли метод метилчувствительного репрезентативного дифференциального анализа (MS-RDA), который позволил выявить 8 дифференциально метилированных фрагментов, которые соответствовали генам TBOX3, GPR137, ZIC4, ZDHHC22, MEIS1, UBE2E1, PTDSS2 и UBQLN1. Была создана многомерная математическая модель линейной регрессии для оценки возраста, которая затем была протестирована при анализе независимой выборки 65 индивидуумов в возрасте от 11 до 72 лет. На проанализированной выборке модель характеризовалась высокой точностью (R2 = 0,918), корреляция с реальным значением возраста составила r=0,91.

В работе Alisch c коллегами были проанализированы 27578 CpG в образцах периферической крови 398 мальчиков в возрасте 3-17 лет. По 2078 локусом были обнаружены значительные различия по уровням метилирования, коррелировавшие с возрастом. Полученные результаты верифицировали на дополнительной выборке детей (N = 78). Мета-анализ, проведенный на двух взрослых популяциях (N = 1158), показал, что, несмотря на значительные перекрытия в списках локусов, метилирование которых ассоциировано с возрастом, основное количество выявленных локусов не характеризуется линейным изменением уровня метилирования с увеличением возраста, поэтому они не могут быть использованы для предсказания возраста индивидуума. Вероятно, такие результаты можно объяснить тем, что в детском возрасте происходит более быстрое накопление изменений метилирования ДНК, связанных с возрастом.

В исследовании Zbieć-Piekarska с коллегами проводилась оценка уровней метилирования 7 CpG, расположенных в гене ELOVL2. Были проанализированы 303 образца крови, полученных от индивидуумов в возрасте от 2 до 75 лет. Анализ проводился путем обработки ДНК бисульфитом с последующим пиросеквенированием, и позволил выявить наиболее информативный сайте, обуславливающий 83% вариабельности по возрасту. Финальная модель линейной регрессии включала в себя 2 CpG сайта в гене ELOVL2 и позволяла предсказывать возраст индивидуумов с R2 = 0.859 между предсказанным и хронологическим возрастом и ошибкой ±5.03 года. Верификация модели на независимой выборке из 124 образцов крови показала ошибку определения возраста ±7 лет. Кроме того, исследователи показали, что статус метилирования изучаемого гена в пятнах крови, хранившихся при комнатной температуре, достоверно не изменился через 4 недели хранения. Анализ 45 пятен крови, которые хранились на бумажных салфетках при комнатной температуре в течение 5, 10 и 15 лет показал, что, несмотря на постепенную деградацию ДНК с возрастом пятна, общая предсказательная сила модели сохранялась, и уровень успешного определения возраста составлял 60-78%.

В другом исследовании к проанализированной выборке были добавлены дополнительные образцы, и суммарное их количество составило 420 (возраст от 2 до 75 лет). Было проанализировано 41 CpG, расположенных в 8 локусах, выявленных в исследовании. Пять из них наиболее полно коррелировали с возрастом исследуемых образцов (CpG в гене ELOVL2 в локусе 6p24.2, C1orf132 в локусе 1q32.2, TRIM59 в локусе 3q25.33, KLF14 в локусе 7q32.3, FHL2 в локусе 2q12.2). Их использовали для того, чтобы построить модель для предсказания возраста образцов. Исходную выборку разделили на 2, и на основе анализа 300 образцов коэффициент корреляции составил R(2)=0,94, а стандартная ошибка – 4,5 года. При верификации на второй части выборки, состоявшей из 120 образцов, средняя ошибка определения возраста составила 3,9 лет. При этом точность предсказания зависела от возраста исследуемого образца: для образцов возрастом 2-19 лет количество корректно оцененных образцов составляло 86,7%, и постепенно с увеличением возраста до 60-75 лет точность оценки возраста 50%.

Bekaert c коллегами на основе опубликованных работ по предсказанию возраста образца по оценке профилей метилирования ДНК выдвинули гипотезу, что результаты прогнозирования хронологического возраста могут быть улучшены за счет снижения количества маркеров в анализе и использования более точных математических моделей. Из опубликованных данных они выбрали 4 гена, метилирование которых было ассоциировано с возрастом (ASPA, PDE4C, ELOVL2 и EDARADD), и определили уровни метилирования CpG на 206 образцах крови (возраст доноров составил от 0 до 91 лет, анализировались образцы и от живых, и от мертвых людей). Впоследствии эти данные были использованы для оценки точности прогнозирования линейных и нелинейных регрессионных моделей. Наилучшие показатели были получены с применением модели квадратичной регрессии, для которой среднее абсолютное отклонение между хронологическим возрастом и прогнозируемым возрастом составило 3,75 лет, а скорректированный R2 - 0,95. Не было обнаружено различий в точности определения возраста для образцов, полученных от живых или умерших людей, или различий между полами. Следующим этапом работы стала оценка характеристик проанализированных маркеров на выборке из 29 образцов зубов от разных индивидуумов (возрастной диапазон: 19-70 лет). Для этого анализа среднее абсолютное отклонение составило 4,86 лет, а скорректированный R2 - 0,74. Кросс-валидация результатов продемонстрировала робастность и воспроизводимость анализа. Авторы сделали заключение о том, проанализированный набор из 4 CpG может быть использован как точный маркер предсказания возраста на образцах крови как живых, так и умерших людей.

В следующем исследовании те же авторы проанализировали эффективность применения того же набора из 4 CpG в генах APSA, PDE4C, EDARADD и ELOVL2 на образцах ДНК буккального эпителия. Были проанализированы 50 образцов ДНК, полученных от доноров возрастом 0-73 лет. Разработанная авторами ранее модель на основе квадратичной регрессии позволила определять возраст образцов со средним абсолютным отклонением в 3,32 года, что несколько выше, чем при анализе образцов крови (MAD = 3,75 лет) и значительно точнее, чем при анализе образцов дентина (MAD = 4,86 лет).

В работе An c коллегами оценивались ассоциированные с возрастом изменения профилей метилирования в сперме. Авторы проанализировали образцы крови, слюны и спермы, полученные от 40 мужчин двух возрастных групп – моложе 30 лет и старше 50 лет, кроме того, для сравнения использовались образцы крови, слюны, менструальной крови и вагинального секрета женщин из исследования. Для анализа применялись метил-специфичные ферменты рестрикции и мультиплексный анализ метилирования SNaPshot. Оценивались статусы метилирования CpG в локусах USP49, DACT1, PRMT2, и PFN3. Выбранные маркеры позволили отличить образцы спермы от образцов менструальной крови, вагинального секрета, цельной крови и слюны и эти маркеры могут применяться в криминалистических исследованиях для идентификации типа образцов.

В аналогичном исследовании Lee c коллегами разрабатывали маркеры, которые могут быть использованы для анализа различных биологических жидкостей (крови, слюны, спермы, влагалищного секрета и менструальной крови) на основе профилей метилирования, полученных на чипе Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. 64 CpG были выбраны в качестве маркеров, которые разделяли типы анализируемой жидкости. Затем для каждого из типов жидкости было выбрано от 1 до 3 CpG, и был проведен мультиплексный анализ SNaPshot, по результатам которого авторы смогли разделить все образцы.

Park с коллегами проанализировали результаты работ по оценке профилей метилирования, находящиеся в свободном доступе в GEO database (GSE32148, GSE36064, GSE40005, GSE40279, GSE41169, GSE51032, GSE53128, GSE53740). Всего было проанализировано 1415 общедоступных наборов данных, полученных с использованием Human Methylation 450 BeadChip. Были выбраны три наиболее информативных сайта CpG (cg16867657 (ген ELOVL2), cg04208403 (ген ZNF423), и cg19283806 (ген CCDC102B), их статус проанализировали на собственной выборке образцов крови (765 образцов ДНК корейцев, 380 мужчин и 358 женщин, распределение по возрасту 11-90 лет) с использованием пиросеквенирования. Выборку разделили на 2 части, 535 образцов использовали в качестве обучающей выборки, а 230 – для тестирования модели. При анализе обучающей выборки разработанная модель множественной линейной регрессии характеризовалась 91,44% корреляцией между возрастом и уровнем метилирования. Стандартная ошибка регрессии составила 6,32 лет, а среднее абсолютное отклонение – 3,156 лет. При тестировании модели на выборке из 230 образцов модель объясняла 91,08% вариабельности метилирования и предсказывала возраст образцов (±6 лет) с точностью 77,30% в возрастной группе <60 лет и с точностью 57,30% в группе ≥60 лет. Учитывая ограниченное количество ДНК, которое обычно доступно на месте преступления, необходимо проводить поиск и разработку панелей, содержащих небольшое количество маркеров, даже если их использование позволяет получить менее точные результаты предсказания возраста, чем более широкие панели. По результатам работы сделано заключение о том, что применение трех выбранных маркеров для оценки возраста образцов применимо в криминалистической практике при анализе азиатской популяции.

Huang c коллегами использовали метод пиросеквенирования для скрининга ассоциированных с возрастом сайтов CpG на 89 образцах крови, полученных от доноров 9-75 лет. В ходе анализа были выявлены 5 локусов, которые могут выступать в качестве маркеров возраста, три из которых, ITGA2B_1, NPTX2_3 и NPTX2_4, были впервые идентифицированы в данном исследовании. Затем была построена модель линейной регрессии, которая включала в себя четыре ассоциированных с возрастом CpG в трех фрагментах генов ASPA, ITGA2B и NPTX2 и позволяла прогнозировать возраст с R(2) = 0,819. Среднее абсолютное отклонение от хронологического возраста образцов составляло ±7,87 лет. Модель линейной регрессии протестировали на независимой выборке, полученной из 40 образцов крови доноров в возрасте 11-70 лет, где MAD составило ± 7,99. При этом не наблюдалось статистически значимой разницы в оценке возраста при анализе 20 пар образцов крови и пятен крови. Затем модель протестировали путем анализа еще одной независимой выборки, которая состояла из 6 пар пятен крови индивидуумов в возрасте 12, 29, 40, 45, 62, 65 лет. Одно пятно из пары анализировали непосредственно после отбора, а второе – через 4 месяца хранения при комнатной температуре. Результаты анализа не показали достоверных различий по эффективности определения возраста в обоих типах пятен, что подтверждает стабильность модели.

Cheng Xu c коллегами проанализировали кровь, полученную от 8 пар монозиготных близнецов женского пола из Китая. На первом этапе была использована платформа Illumina HumanMethylation450 BeadChip, на которой проанализировали полногеномные профили метилирования ДНК образцов крови. Проведенный анализ выявил 2965 локусов в 1783 генах, ассоциированных с возрастом. Применение более жестких критериев отбора позволило ограничить выборку 9ю локусами. Затем на дополнительной выборке образцов крови 50 китаянок возрастом 20-80 лет исследователи проанализировали выбранные локусы при помощи платформы Sequenom MassARRAY, добавив в анализ 3 ассоциированных с возрастом локуса (cg02228185, cg25809905, и cg17861230) из исследования. Таким образом, был получен список из 11 локусов, на которых затем были протестированы различные модели анализа – основанные на многопараметрической линейной регрессии, многопараметрической нелинейной регрессии, нейронных сетях с обучением по методу обратного распространения ошибки и на методе регрессии опорных векторов. Модель, основанная на методе регрессии опорных векторов, была признана наиболее робастной, она характеризовалась наименьшим средним абсолютным отклонением от хронологического возраста, которое составило 2,8 лет, и средней точностью определения возраста в 4,7 лет при использовании всего лишь 6 из 11 маркерных локусов. Остается открытым вопрос воспроизводимости полученных показателей качества определения возраста на альтернативных выборках образцов людей других национальностей, смешанных по полу.

Freire-Aradas c коллегами для оценки возраста исследуемых образцов использовали технологию EpiTYPER (Agena Bioscience, ранее Sequenom). Они проанализировали данные о профилях метилирования, находящиеся в свободном доступе и полученные на Illumina HumanMethylation 450 BeadChip. В общей сложности были проанализированы 177 локусов, из которых были выбраны 7 наиболее ассоциированных с возрастом (ELOVL2, ASPA, PDE4C, FHL2, CCDC102B, C1orf132 и chr16:85395429), которые были использованы исследователями при разработке новой модели анализа на основе многопараметрической квантильной регрессии. Разработанная модель позволяла определять возраст со средней абсолютной ошибкой предсказания в ±3,07 года и процентом ошибки прогнозирования возраста, равным 6,3%. Модель была верифицирована на двух выборках: обучающей, подобранной по возрасту, в которую вошло 725 образцов неродственных индивидуумов европейского происхождения возрастом 18-104 лет, а также на тестовой выборке из образцов, полученных от 52 однояйцевых близнецов женского пола в возрасте от 42 до 69 лет. На 46 парах образцов (для остальных 8 не хватило ДНК для повторного анализа) точность определения возраста составила 83,70%, а средняя абсолютная ошибка предсказания - ±4,3. Величину ошибки исследователи объясняют небольшими размерами тестовой выборки и выпадающими образцами, предсказанный возраст которых значительно отличался от хронологического.

Для решения научной проблемы поиска воспроизводимых и точных биомаркеров старения человека в Евросоюзе был создан консорциум MARK-AGE, в который вошли 26 партнеров: 21 некоммерческая организация (университеты и государственные научно-исследовательские институты), 3 малых и средних предприятия и 2 крупных компании. Консорциум являлся междисциплинарным проектом: в его состав входили исследователи, которые являются экспертами в различных областях, от гериатрии, эпидемиологии и генетики человека до клинической химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии, молекулярной генетики, биоинформатики и математического моделирования. Участниками консорциума были проанализированы 3200 образцов ДНК, полученных от доноров в возрасте 35-74 лет, собранных в разных географических регионах Европы. Для поиска биомаркеров возраста были проанализированы различные маркерные локусы, в том числе (1) хорошо изученные, для которых имеются опубликованные данные с результатами нескольких исследований; (2) «новые», основанные на предварительных данных, полученных в ограниченных по размеру исследованиях, а также (3) «выявленные в ходе выполнения работ», основанные на недавних исследованиях, проводимых в рамках консорциума. Была проведена оценка профилей метилирования в клетках крови, и проведен анализ функциональных взаимосвязей между уровнями метилирования и экспрессией генов, ассоциированных со старением или долголетием. Кроме того, оценивали и другие показатели возраста образцов - длину теломер и накопление мутаций в митохондриальной ДНК. Для того, чтобы создать надежный набор биомаркеров для определения возраста и разработать модель здорового старения, применялись такие методы обработки результатов, как корреляционный анализ, регрессионный анализ, искусственные нейронные сети, регрессионные деревья, анализ главных компонент и другие методы снижения размерности, машинное обучение, а также разнообразные методы визуализации данных. В результате выполнения проекта были выявлены 2 типа биомаркеров: «нейтральные» биомаркеры, они же «маркеры хронологического старения», анализ которых не дает предикторной информации о риске заболевания, и маркеры глобального риска возникновения заболеваний, связанных с возрастом. В своей работе авторы непосредственно не приводят списков выявленных маркеров, но отмечают, что маркеры первой группы могут использоваться при оценке возраста, скорости старения организма и общих изменений в организме, возникших в результате старения.

Brian Chen с коллегами предложили использовать эпигенетические маркеры возраста, оцененные на основе анализа профилей метилирования ДНК клеток крови, в качестве предикторов примерного времени смерти индивидуума. Авторы провели мета-анализ 13 когорт, общий объем проанализированной выборки составил 13089 индивидуумов, которые относились к трем различным этническим группам. В качестве маркеров были проанализированы 353 CpGs, выявленные в одном исследовании, а также 71 CpGs, выявленный в другом исследовании. Коэффициенты корреляции биологического возраста, предсказанного на основе профилей метилирования, и хронологического возраста варьировали в обоих случаях от 0,65 до 0,89. Они хорошо коррелировали друг с другом (r=0,76), несмотря на то, что перекрытие в маркерах между исследованиями составило всего 6 CpG. Кроме того, авторы рассмотрели вопрос о том, влияет ли включение в анализ информации о клеточном составе образцов крови на способность маркеров прогнозировать ориентировочное время смерти. Для получения более точных результатов предсказаний авторы воспользовались одномерными и многомерными моделями регрессии Кокса. Включение в анализ информации о составе клеточных популяций в образцах увеличило точность предсказания времени смерти (p = 7,5×10-43).

В целом, результаты этого исследования показали, что а) предсказание примерного времени смерти, основанное на оценке эпигенетических маркеров возраста, дает более точные результаты, чем основанное на традиционной оценке хронологического возраста и факторов риска, и б) демонстрирует, что включение информации о составе клеток крови при предсказании примерного времени смерти на основе эпигенетических маркеров значительно увеличивает точность предсказаний.

В исследовании Florath с коллегами были проанализированы образцы крови от 965 доноров в возрасте от 50 до 75 лет при помощи Infinium Human Methylation450 Bead Chip. В поисковом анализе, проведенном на 400 образцах, были идентифицированы 200 CpG-сайтов с самыми высокими коэффициентами корреляции Спирмена по ассоциациям между метилированием и возрастом. Из этих 200 CpGs 162 были достоверно связаны с возрастом, что было подтверждено на независимой когорте из 498 индивидуумов с использованием моделей смешанной линейной регрессии, скорректированных с учетом пола, курения, возрастных заболеваний, случайного batch эффекта и поправки Бонферрони на множественные сравнения. При анализе другой независимой когорты из 67 человек, не имевших истории ассоциированных с возрастом заболеваний, наблюдения за которой велись на протяжении 8 лет, авторы детектировали увеличение метилирования в 96% положительно ассоциированных с возрастом CpG, и потерю метилирования во всех отрицательно ассоциированных с возрастом CpGs. Такая динамика была идентифицирована у всех проанализированных индивидуумов в течение 8 лет наблюдений. Модель регрессии для прогнозирования возраста на основе 17 CpGs маркеров объясняла 71% дисперсии по возрасту со средней точностью 2,6 года. При сравнении показателей метилирования с образцами пуповинной крови, для 86 CpG авторы наблюдали более чем 2-кратное изменение средних уровней метилирования от рождения до достижения старшего возраста. Кроме того, в ходе исследования были выявлены 65 новых сайтов CpG, метилирование которых было достоверно ассоциациировано с возрастом.

Исследование Forat с коллегами было посвящено идентификации биологических жидкостей, обнаруживаемых на месте преступления. Проблема, которую решали исследователи, заключается в том, что биологический материал очень часто подвергается пагубным экзогенным воздействиям, что приводит к его деградации. Эта проблема в первую очередь является актуальной при анализе РНК и белков, поэтому в данном исследовании авторы решили найти дифференциально метилированные локусы ДНК, по которым можно было бы проводить дифференцировку между типами биологических жидкостей. В результате двух широкомасштабных скринингов генома с применением Illumina Human Methylation BeadChips 27 и 450k были идентифицированы 150 локусов-кандидатов, по которым можно проводить дифференциальный анализ метилирования биологических жидкостей организма: венозной крови, менструальной крови, влагалищного секрета, слюны и спермы. Из 150 локусов были выбраны 9 наиболее перспективных маркеров. Для окончательной оценки степени метилирования был применен метод Ms-SNuPE (Methylation Sensitive Single Nucleotide Primer Extension Assay). Поскольку степень метилирования может изменяться под воздействием эндогенных и экзогенных факторов, каждый маркер тестировали приблизительно на 100 образцах каждой целевой жидкости для валидации. Была продемонстрирована стабильность и воспроизводимость результатов в условиях симуляции различных воздействий, которым могут подвергаться образцы на месте преступления. Кроме того, были изучены профили метилирования 9 маркеров в 12 относительно распространенных типах опухолей на образцах биологических жидкостей 34 пациентов. Анализ показал, что только карцинома шейки матки может оказывать значительное влияние, поскольку наличие заболевания изменяет профили метилирования по обоим вагинальным маркерам. Затем на образцах 54 доноров при помощи Illumina MiSeq авторы оценили потенциальное влияние цис-действующих полиморфизмов на степень метилирования 9 маркеров ДНК в анализируемых биологических жидкостях. Для 4 маркерных локусов такое влияние наблюдалось либо за счет самих SNP, либо за счет гаплотипов. Чувствительность идентификации отдельных типов жидкостей организма при использовании маркеров метилирования ДНК находится в том же диапазоне, что и при криминалистическом STR-анализе.

В исследовании Hamano с коллегами авторы применяли метил-чувствительный анализ плавления высокого разрешения (MS-HRM, High Resolution Melting Analysis) для оценки профилей метилирования промоторов генов ELOVL2 и FHL2 в образцах крови. Анализ нелинейного распределения профилей метилирования и хронологического возраста проводили при помощи логистической кривой. Примечательно, что распределения были одинаковыми как для 22 образцов крови, взятых у живых доноров, так и на 52 образцах крови мертвых людей. Таким образом авторы показали, что метод MS-HRM не только является экономичным по затратам времени и средств, но и воспроизводимым на образцах, полученных от мертвых и живых индивидуумов. Кроме того, авторы интегрировали информацию о профилях метилирования ELOVL2 и FHL2 в модель аппроксимации к логистической кривой для разработки конечной прогностической модели с применением множественной логистической регрессии уровня метилирования ДНК и физического возраста, и на полученной модели R2 составил 0,83.

Среднее абсолютное отклонение для обучающей выборки из 74 образцов составило 7,44 года, а для независимой тестовой выборки из 31 образца составило 7,71 года. Авторы сделали вывод, что разработанная ими модель имеет большой потенциал для прогнозирования фактического возраста образцов благодаря своей точности, экономичности и производительности.

Те же авторы в своей следующей работе применяли разработанный подход к оценке профилей метилирования ДНК, выделенной из образцов слюны. Профили метилирования ELOVL2 и EDARADD показали высокую степень корреляции с возрастом и были использованы для создания модели прогнозирования возраста на основе опорных векторов. В данной работе профиль метилирования ELOVL2 впервые был предложен как предикторный маркер для определения возраста индивидуумов по образцам слюны. Разработанная прогностическая модель показала высокую точность со средним абсолютным отклонением от хронологического возраста в 5,96 лет на обучающей выборке из 197 образцов. Модель была верифицирована на дополнительной тестовой выборке из 50 образцов, на которой она показала MAD в 6,25 лет. Кроме того, авторы проанализировали применимость разработанного подхода к анализу образцов слюны, выделенных из 7 окурков сигарет, обнаруженных на месте преступления. При анализе этих образцов MAD была несколько выше, и составила 7,65 лет, однако, авторы показали принципиальную применимость данного подхода для анализа такого типа образцов. В целом разработанный подход зарекомендовал себя как быстрый (2 часа) и экономически эффективный (стоимость примерно на 95% меньше, чем у ДНК-чипов), хотя и менее точный метод оценки возраста индивидуумов. Метод является перспективным для применения в практической криминалистике.

В исследовании Vidal-Bralo с коллегами разработан новый подход к предсказанию возраста индивидуума. Они проанализировали находящиеся в свободном доступе данные, а результаты верифицировали на собственных образцах. На первом этапе для создания регрессионной модели авторы использовали данные о профилях метилирования 390 образцов крови индивидуумов возрастом старше 20 лет, полученные на платформе Illumina Methylation Beadchip 27K (GSE19711), GSE20242, GSE20236, GSE23638). Была проанализирована выборка из 8 маркерных CpG (cg16386080, cg24768561, cg19761273, cg25809905, cg09809672, cg02228185, cg17471102, cg10917602). Затем различные аспекты созданной модели протестировали на дополнительных выборках, которые состояли из 335 образцов и 92 образцов. Первая из дополнительных выборок использовалась для оценки точности выявленных биомаркеров возраста, а вторая – для того, чтобы оценить влияние гетерогенности крови по клеточному составу на точность определения возраста. После этого авторы верифицировали разработанную модель на собственной выборке, в которую вошли данные о профилях метилирования, полученные при помощи метода MS-SNuPE на 557 образцах ДНК индивидуумов европейского происхождения. На результаты не оказывали существенного влияния пол доноров, курение или различия в составе клеток крови. Преимуществами предложенного метода анализа является возможность мультиплексного анализа и более низкая стоимость, чем при анализе путем пиросеквенирования или с применением ДНК-чипов. На тестовой выборке авторов разработанный метод определения возраста показал уровень определения >97%, низкий CV (<3,3%) и довольно высокую точность (среднее абсолютное отклонение составило 6,07 года).

В одном из последних исследований представлено применение модели случайного леса (random forest machine learning algoritm) для анализа результатов массивного параллельного секвенирования (MPS). На основе анализа данных метилирования, полученных на чипах Illumina 450K, находящихся в свободном доступе, были выбраны 13 маркерных локусов, ассоциированных с возрастом (DDO, ELOVL2, F5, GRM2, HOXC4, KLF14, LDB2, MEIS1-AS3, NKIRAS2 , RPA2, SAMD10, TRIM59, ZYG11A), в анализ вошли как сайты с чипов, так и находящиеся рядом сайты CpG. Для обучения алгоритма использовались образцы цельной крови 208 индивидуумов (в возрасте 18-69 лет), а для верификации модели использовали дополнительную выборку из 104 образцов той же возрастной группы. В случае KLF14, LDB2, SAMD10 и GRM2 для включения в конечную модель были выбраны соседние сайты CpG, а не исходные сайты с чипов. Кросс-валидация на обучающей выборке показала MAD=3,21 года и среднеквадратическую ошибку (RMSE) в 3,97 года. Оценка качества модели с использованием тестовой выборки показала сопоставимый результат (MAD=3,16 года, RMSE=3,93 года). Сокращенная модель, основанная только на 4 маркерах (ELOVL2, F5, KLF14 и TRIM59), показала RMSE=4,19 лет и MAD=3,24 года на тестовой выборке и RMSE=4,63 года, MAD=3,64 года на валидационной выборке.

Недавно в работе Евгения Путина с коллегами был предложен новый подход для предсказания возраста, основанный на исследовании результатов общего клинического и биохимического анализа крови. Авторы создали систему из 21 глубокой нейронной сети (DNN) различной глубины, структуры и степени оптимизации для предсказания хронологического возраста человека на основе результатов анализа крови. Для обучения DNN авторы использовали более 60 000 результатов общих клинических и биохимических анализов крови. Наилучшая DNN в системе при предсказании хронологического возраста образцов продемонстрировала такие показатели точности

предсказания, как эпсилон=81,5% в диапазоне 10 лет, r = 0,90, R2 = 0,80 и среднюю абсолютную ошибку в 6,07 года, а вся система продемонстрировала эпсилон=83,5%, r = 0,91 с R2 = 0,82 и среднюю абсолютную ошибку в 5,55 лет. Анализ позволил выявить 5 наиболее важных маркеров для предсказания хронологического возраста человека: ими стали уровни альбумина, глюкозы, щелочной фосфатазы, мочевины и эритроцитов. Учитывая его низкую стоимость, можно сказать, что этот подход является довольно перспективным, несмотря на не очень высокую на сегодняшний день точность предсказания возраста.

Практически во всех вышеперечисленных работах при определении возраста осуществляется анализ уровня метилирования маркеров, изменяющийся с возрастом. Поэтому одним из ключевых факторов становится точность используемого метода детекции. К сожалению, универсальные массовые методы, применяемые сегодня, базируются на анализе ДНК после химической обработки, так называемой бисульфитной конверсии. Суть ее заключается в превращении неметилированного цитозина в урацил при обработке сульфатами. Получившиеся продукты в последующем детектируются различными методами. Основными недостатками метода является то, что он чрезвычайно чувствителен к сроку экспозиции образца ДНК в реактиве: при недостаточной экспозиции происходит недоконверсия цитозина в урацил и, как следствие, завышение уровня метилирования образца. При избыточной же экспозиции происходит деградация ДНК, что ведет к неверному выводу о пониженном уровне метилирования. Как следствие, результаты, полученные с использованием методов, основанных на бисульфитной конверсии ДНК, становятся трудновоспроизводимыми. Также существенным ограничением метода является требование к количеству ДНК. Для анализа метилирования ДНК при её обработке бисульфитом натрия необходимо использовать от 50 нг исходной ДНК, что часто бывает недостижимо в криминалистической практике.

Другие методы детекции, основанные на метилчувствительных ферментах, таких как MspI/HpaII лишены данного недостатка, однако применимы не во всех случаях, так как сайт узнавания данных рестриктаз совпадает только с одним из четырех вариантов сайта RCGY (здесь R – аденин или гуанин, Y – цитозин или тимин), являющегося продуктом de novo метилирования метилтрансферазами DNMT3, а именно CCGG. Сам по себе метод изящен и прост и базируется на блокировании гидролиза ДНК при метилировании в сайте узнавания второго цитозина. Таким образом, количество анализируемой ДНК в образце снижается пропорционально количеству гидролизованных копий.

Использование вместо MspI/HpaII ранее открытого метилзависимого фермента GlaI позволяет обойти ограничение метода. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза GlaI имеет сайт узнавания R(5mC)GY то есть режет именно тот сайт, который образуется в ходе de novo метилирования. Новый метод с ее использованием получил название GlaI-ПЦР анализа. Также на базе данного фермента ранее были разработаны метод GLAD-ПЦР анализа, позволяющий определять единичные метилированные молекулы в образце и метод эпигенетического секвенирования без бисульфитной обработки.

Краткое описание сущности изобретения

Определение возможного возраста неизвестного индивида проводят путем анализа уровня метилирования эпигенетических маркеров возраста - сайтов RCGY, расположенных в областях генов, метилирование которых ассоциировано с возрастом, в 2 шага:

1. Определение доли метилированных сайтов эпигенетических маркеров возраста методом GLAD-ПЦР анализа. 2. Определение возможного возраста индивида путем подставления полученных на предыдущем шаге значений в математическую модель.

Подробное описание изобретения

Задачей настоящего изобретения является упрощение процедуры и сокращение времени анализа, а также использование малого количества ДНК для анализа, повышение воспроизводимости результата и, как следствие, достоверности определения возраста. Указанная задача решается созданием способа определения возможного возраста неизвестного индивида путем анализа уровня метилирования эпигенетических маркеров возраста - сайтов RCGY, расположенных в областях генов, метилирование которых ассоциировано с возрастом, и вычисления значения возраста на основе полученных значений.

Определение возможного возраста неизвестного индивида проводят в несколько шагов:

1. Определение доли метилированных сайтов эпигенетических маркеров возраста (таблица 1) методом GLAD-ПЦР анализа (фигура 1). 2. Определение возможного возраста индивида путем подставления полученных на предыдущем шаге значений в математическую модель. Анализ уровня метилирования каждого сайта осуществляется с использованием метода GLAD-ПЦР анализа, например, с применением набора для GLAD-ПЦР анализа (ООО «СибЭнзайм», Россия, кат. номер K009S). Точные положения сайтов приведены в Таблице 1. Было установлено, что уровень метилирования даных сайтов на проанализированных выборках имеет корреляцию с возрастом индивида.

Таблица 1. Отобранные в качестве эпигенетических маркеров возраста сайты RCGY в области генов.

Хромосома Позиция Ассоциированный ген или условное обозначение позиции Увеличение (+) или уменьшение (-) степени метилирования с возрастом 20 56004845 CBLN4 + 2 105399411 FHL2 + 5 141430540 PCDHA12 + 3 171235103 TNIK + 1 206512065 RASSF5 -

Для реализации способа определения возраста человека по ДНК разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флюоресцентных зондов. Структура разработанных праймеров приведена в Перечне последовательностей SEQ ID 1-15.

Метод GLAD-ПЦР анализа включает в себя три стадии, проводимые в одной пробирке:

1) Гидролиз геномной ДНК из исследуемого образца метилзависимой эндонуклеазой GlaI;

2) Лигазная пришивка к образуемым фрагментам геномной ДНК универсального олигонуклеотидного дуплекса (адаптера);

3) Проведение ПЦР в реальном времени с использованием геномного праймера, гибридного праймера (комплементарного последовательности адаптера и прилегающим к позиции расщепления четырем нуклеотидам генома) и флюоресцентно-меченного зонда.

Первые две стадии подготовки фрагментированной матричной ДНК проводят в одной совмещенной реакции. В качестве исходного материала используют ДНК. Реакционная смесь (30 мкл) для совместного гидролиза и лигирования ДНК включает в себя 3 нг геномной ДНК в 1х GlaI буфере (10 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ß-меркаптоэтанол), 100 нг/мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 6 мМ ß-меркаптоэтанола (дополнительно к содержащемуся в буфере), 0,5 мМ АТФ, 0,04 е.а./мкл метилзависимой эндонуклеазы рестрикции GlaI, 33 е.а./мкл T4 ДНК-лигазы и по 0,5 мкМ олигонуклеотидов 5’-CCTGCTCTTTCATCG-3’ и 3’-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5’ (составляющих 15-звенный адаптерный дуплекс, содержащий 3’- и 5’-фосфаты в одной из цепей). Реакцию проводят в течение 60 мин при 25°С с последующей инактивацией ферментов при 65°С в течение 20 мин.

Для проведения ПЦР в реальном времени к полученной лигазной смеси добавляют следующие компоненты до достижения итоговых концентраций в конечном объеме, равном 60 мкл: 1x GLAD-ПЦР буфер (50 мМ Трис-SO4, pH 9,0, 10 мМ [NH4]2SO4, 30 мМ KCl, 0,01% Твин 20, 3 мМ MgCl2), 1x стабилизатор (0,54 М бетаин, 1,34 мМ ДТТ, 1,34% ДМСО), по 0,2 мМ каждого дНТФ, по 0,4 мкМ геномного праймера, гибридного праймера и флюоресцентно-меченного зонда, и 0,05 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы. Полученную смесь разделяют на три аликвоты по 20 мкл и проводят ПЦР в детектирующем амплификаторе.

Работы проводят с использованием амплификатора в реальном времени (например, Lightcycler 96 Roche, CFX Bio-Rad). Измерения значений Cq проводят троекратно для каждой выбранной позиции.

Построение калибровочной прямой и определение концентрации препаратов ДНК.

Определение концентрации препаратов ДНК человека проводят путем определения количества копий того или иного гена/уникального фрагмента гена в 1 мкл полученного препарата ДНК. В качестве уникального фрагмента геномной ДНК использут фрагмент гена URBI, присутствующий в геноме человека в единственной копии. Ранее было показано, что сайт ACGT в позиции хр21:32334291 (в соответствии с геномной сборкой GRCh38/hg38) в области гена URB1 является метилированным, что позволяет использовать GLAD ПЦР анализ этого сайта для определения количества копий ДНК.

В работе использовались ранее разработанные праймеры и флуоресцентно меченый зонд, структура которых приведена в Перечне последовательностей SEQ ID 16-18, а также подобранные условия проведения ПЦР. Позиция сайта - 32334291-32334294 в 21 хромосоме.

Определение количества сайта А(5mC)GT в области гена URB1 в 1 мкл препарата ДНК проводят в стандартной планшетке на 96 лунок. Исследование каждого образца проводят в трех повторах – триплетах. Смесь праймеров (2,5 мкл на 1 триплет) включала геномный и гибридный праймеры, а также флюоресцентный зонд в концентрациях 10 мкМ каждого.

Все реакции проводят с использованием реактивов производства компании «СибЭнзайм». Концентрации используемых растворов MgCl2, БСА, АТФ, адапторов и смеси трифосфатов соответствуют протоколу производителя. GLAD-ПЦР анализ стандартов ДНК клеточной линии и 24-х образцов ДНК, связанной с клетками крови, проводят как описано ниже.

Подготовка ДНК и гидролиз:

1) Подготавливают пробирки для ПЦР (200 мкл) по числу анализируемых образцов, и в каждой пробирке смешивают 14 мкл H₂O и 1 мкл ДНК образца.

2) Подготавливают 5 пробирок с «точками калибровки» и одну контрольную.

В пробирку № К1 вносят 28 мкл H₂O, в пробирки № 2, № 3, № 4, № 5 – по 15 мкл H₂O, в пробирку № 6 – 14 мкл H₂O.

В пробирку № К1 добавляют 2 мкл раствора ДНК Raji в концентрации 18 нг/мкл и аккуратно перемешивают.

В пробирку № К2 переносят 15 мкл раствора ДНК из пробирки № 1, аккуратно перемешивают.

В пробирку № К3 переносят 15 мкл раствора ДНК из пробирки № 2, аккуратно перемешивают.

В пробирку № К4 переносят 15 мкл раствора ДНК из пробирки № 3, аккуратно перемешивают.

В пробирку № К5 переносят 15 мкл раствора ДНК из пробирки № 4, аккуратно перемешивают.

Из пробирки № К5 удаляют 15 мкл смеси.

В пробирку № К6 добавляют 1 мкл раствора ДНК фага лямбда в концентрации 18 нг/мкл. Аккуратно перемешивают, сбрасывают капли центрифугированием.

3) Готовят общую реакционную смесь для гидролиза ДНК из расчета на один триплет: 3,6 мкл H₂O + 2,2 мкл 10X SE TMN-буфера + 0,5 мкл ДМСО + 0,2 мкл БСА + 0,03 мкл GlaI. После добавления каждого следующего реагента содержимое пробирки аккуратно перемешивают.

4) Добавляют 6,5 мкл полученной реакционной смеси в каждую из пробирок с ДНК образцов, содержимое пробирки аккуратно перемешивают.

5) Инкубируют 30 минут при 30°C.

Лигирование с универсальным адаптером:

6) Подготавливают общую реакционную смесь для лигирования ДНК из расчета на один триплет: 4,6 мкл H₂O + 1,6 мкл универсального адаптера + 1,6 мкл АТФ + 1,2 мкл Т4-ДНК-лигазы. После добавления каждого следующего реагента смесь аккуратно перемешивают.

7) Добавляют по 8,5 мкл смеси для лигирования ДНК в каждую пробирку после инкубирования (стадия 5), содержимое пробирки аккуратно перемешивают, капли сбрасывают центрифугированием.

8) Инкубируют 15 минут при 25°C.

ПЦР в реальном времени:

9) Подготавливают пробирку на 1,5 мл и подписывают ее «ПЦР-смесь URB» .

10) ПЦР-смесь URB готовят из расчета на один триплет: 19,0 мкл H₂O + 6,3 мкл 10X SE GLAD-Mg буфер + 1,6 мкл MgCl2 + 1,3 мкл смеси нуклеотидтрифосфатов + 0,6 23

мкл БСА + 2,5 мкл смеси праймеров и зонда URB1 + 0,2 мкл SP-Taq-ДНК-полимеразы. После добавления каждого последующего реагента содержимое пробирки аккуратно перемешивали и сбрасывали капли центрифугированием.

11) В пробирки с ДНК после инкубации (стадия 8) добавляют по 30 мкл смеси для ПЦР, и аккуратно перемешивают содержимое пробирки.

12) Переносят по 20 мкл реакционной смеси из каждой пробирки в три лунки на ПЦР-планшете, заклеивают оптически прозрачной плёнкой для запечатывания планшетов, центрифугируют и помещают в термоциклер.

13) Проводят ПЦР в реальном времени по следующей схеме:

3 мин при 95°C; 5 «слепых» циклов: 95°C — 10 сек, 63°C — 20 сек, 72°C — 5 сек;

40 циклов: 95°C — 10 сек, 63°C — 20 сек (с детекцией флуоресцентного сигнала в канале FAM), 72°C — 5 сек.

По завершении ПЦР, при помощи программного обеспечения амплификатора “Bio-Rad CFX Manager v.2.1”, определяют значения Cq для всех образцов и строят калибровочную прямую для разведений референсной ДНК, по которой определяют копийность каждого из препаратов ДНК. Таким образом устанавливают копийность препаратов ДНК.

Степень метилирования того или иного выбранного сайта определяют в процентах расчетного числа копий полученных ампликонов для этого сайта относительно расчетного числа копий ампликонов для сайта А(5mC)GT в гене URB1 для того же образца геномной ДНК.

Модель на шаге 2 получена путем регрессионного анализа экпериментальных данных и имеет вид:

Возраст(лет) ≈ 16,8076 + 0,3875×Met(CBLN4) + 0,4037×Met(FHL2) + 0,3849×Met(PCDHA12) + 0,2637×Met(TNIK) – 0,2368×Met(RASSF5)

где "Met" – доля метилирования сайта в данном гене (CBLN4, FHL2, PCDHA12, TNIK, или RASSF5) относительно сайта в гене URB1, выраженная в процентах.

Заявленный способ иллюстрируется примером 1, реализующим определение возраста индивида путем анализа эпигенетических маркеров возраста в ДНК человека. 24

Примеры

Пример 1

Определение возраста неизвестного индивида заявленным способом

Для неизвестного образца с помощью GLAD-ПЦР анализа по описанной методике были определены уровни метилирования сайтов FHL2 – 28%, PCDHA12 – 16%, CBLN4 – 18%, RASSF5 – 59%, TNIK – 38%.

Используя формулу расчета вероятного возраста:

Возраст (лет) ≈ 16,8076 + 0,3875×Met(CBLN4) + 0,4037×Met(FHL2) + 0,3849×Met(PCDHA12) + 0,2637×Met(TNIK) – 0,2368×Met(RASSF5),

был определен возраст неизвестного индивида, равный 37,3 года, в то время как истинный возраст донора образца ДНК был равен 35,2 года.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова Российской

академии наук» (ИОГен РАН)

<120> СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗРАСТА ЧЕЛОВЕКА ПО ДНК

<160> 15

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Флюоресцентный зонд CBLN4_p

<400> FAM-CCGCTGCCTCCCTCCCTACCTCTGG-BHQ1

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер CBLN4_g

<400> CAAAAAAATCCCCCAAACCTGGTG

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Гибридный праймер HP16 для маркера CBLN4

<400> CCTGCTCTTTCATCGGCTT

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Флюоресцентный зонд FHL2_p

<400> FAM- CACATGCCTCCTGAGAAGTGACCCCC-BHQ1

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер FHL2_g

<400> GTCCACCTTGCAAATATATCCCAGG

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Гибридный праймер HP26 для маркера FHL2

<400> CCTGCTCTTTCATCGGTGC

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Флюоресцентный зонд PCDHA12_p

<400> FAM- CCGCTTTTCTCTCCCCGATTGGTGA-BHQ1

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер PCDHA12_g

<400> GTGCAAGGCGAGCAGGATCT

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Гибридный праймер HP7 для маркера PCDHA12

<400> CCTGCTCTTTCATCGGCCG

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Флюоресцентный зонд TNIK _p

<400> FAM- ACGGAGTCTCACTCTGTTGCCCAGGC-BHQ1

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер TNIK _g

<400> CCCAGTAACCTCCTCTCAACCCAA

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Гибридный праймер HP5 для маркера TNIK

<400> CCTGCTCTTTCATCGGCCA

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Флюоресцентный зонд RASSF5_p

<400> FAM- AATCCCCCACTCCCAAGCCCTCTCC-BHQ1

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер RASSF5_g

<400> CTTGCCCAAGAAGAAGATCCCAGTT

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Гибридный праймер HP28 для маркера RASSF5

<400> CCTGCTCTTTCATCGGTGT

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Флюоресцентный зонд URB1_p

<400> FAM-CTGCTGCCACAGTGACCTGCCCA-BHQ1

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер URB1_g

<400> GCGAAGGATGTCCCCGACAC

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Гибридный праймер для URB1

<400> CGCCTGCTCTTTCATCGGTGC

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа определения вероятного возраста неизвестного индивида. Сущностью способа является проведение анализа уровня метилирования эпигенетических маркеров возраста - сайтов RCGY, расположенных в областях генов, метилирование которых ассоциировано с возрастом, с помощью GLAD-ПЦР анализа и вычисления значения возраста на основе полученных значений. Техническим результатом является разработка способа упрощения процедуры и сокращения времени анализа, а также использование малого количества ДНК для анализа, повышения воспроизводимости результата и, как следствие, достоверности определения возраста. 1 табл., 1 пр.

Способ определения возможного возраста неизвестного индивида путем анализа уровня метилирования эпигенетических маркеров возраста, включающий 1) определение методом GLAD-ПЦР анализа количества метилированных сайтов в образце ДНК в позициях эпигенетических маркеров возраста CBLN4, FHL2, PCDHA12, TNIK, RASSF5 с использованием праймеров и флюоресцентных зондов, структура которых приведена в последовательностях SEQ ID 1-15; 2) определение копийности образца ДНК методом GLAD-ПЦР анализа сайта ACGT в области гена URB1 с использованием праймеров и флюоресцентных зондов, структура которых приведена в последовательностях SEQ ID 16-18; 3) определение доли метелирования сайтов эпигенетических маркеров CBLN4, FHL2, PCDHA12, TNIK, RASSF5 путем деления значений, полученных на шаге 1, на значение, полученное на шаге 2 и выраженное в процентах; 4) определение по формуле возможного возраста неизвестного индивида: Возраст(лет)≈16,8076+0,3875×MetCBLN4+0,4037×MetFHL2+0,3849×MetPCDHA12+0,2637×MetTNIK–0,2368×MetRASSF5, где "Met" – доля метилирования сайта в данном гене (CBLN4, FHL2, PCDHA12, TNIK или RASSF5) относительно сайта в гене URB1, полученная на шаге 3.