СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2016 года по МПК A61K39/155 A61P31/14 

Для профилактики и лечения целого ряда вирусных болезней с успехом применяются различные сывороточные препараты, получаемые посредством гипериммунизации животных или от реконвалесцентов.

Однако практическим ветеринарным врачам не всегда представляется возможность иметь в своем распоряжении достаточное количество иммунных сывороток с высоким титром определенного набора специфических противовирусных антител. Выпускаемые биологической промышленностью гипериммунные сыворотки недостаточно эффективны при вирусных респираторных инфекциях и дороги.

Изобретение относится к области биотехнологии (вирусологии) и касается изготовления и применения высокоактивной гипериммунной сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) для пассивной иммунизации, преимущественно телят, против парагриппа-3 (ПГ-3).

Известны способы получения гипериммунных сывороток, предусматривающие приготовление антигена, иммунизацию продуцентов и приготовление сыворотки [1, 2, 5, 6].

Известно получение и применение гипериммунной цитратно-фенолизированной крови быков для лечения и профилактики ПГ-3 телят [4]. Антигеном для гипериммунизации быков служила вируссодержащая культуральная жидкость с титром вируса 10^5-5,5 ТЦД ₅₀/мл. Иммунизировали здоровых 1,5-летних быков путем внутривенного введения антигена через каждые 5 дней в дозах, соответственно, 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 40 мл. Спустя 6 дней после 7-й инъекции от быков была получена кровь. При титровании сывороток крови быков, полученной после 5, 6 и 7-й инъекций антигена, установлена вируснейтрализующая активность в разведениях 1:256-1:1024 в отношении 100 ТЦД ₅₀/мл вируса ПГ-3. Кровь цитрировали и консервировали фенолом, который вносят до конечной концентрации 0,5%.

Недостаток получения цитратно-фенолизированной крови заключается в том, что срок годности такой крови ограничен и используют в течение 2-х дней с момента взятия.

Наиболее близким в техническом отношении к предъявляемому изобретению является способ получения гипериммунной сыворотки против вируса ПГ-3 КРС путем пятикратной иммунизации ослов эмульсионной инактивированной вакциной против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС с адъювантом аэросил или монтанид [3].

Недостаток способа заключается в том, что из-за отсутствия специализированных хозяйств для содержания и выращивания этих животных, затруднено их использование в качестве доноров для получения гипериммунной сыворотки в достаточном количестве. Поэтому считают целесообразным использовать для этих целей крупный рогатый скот, поскольку сырье для сыворотки доступно в любом месте и количестве.

Целью предлагаемого изобретения является разработка оптимальной схемы для приготовления высокоактивных гипериммунных моновалентных сывороток против парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Поставленная цель изобретения достигается иммунизацией быков-доноров путем шестикратного комбинированного интраназального, подкожного и внутривенного введения живой авирулентной вакцины «Паравак» против ПГ-3 КРС с титром вируса 10⁵ ТЦД ₅₀/мл в нарастающих дозах с интервалом в 7 дней.

Анализ источников патентной и научно-технической информации не выявил способа получения гипериммунной сыворотки против ПГ-3 КРС путем шестикратного комбинированного введения вакцины «Паравак» в нарастающих дозах с предварительной активацией иммунной системы левамизолом, что соответствует критерию «новизна».

Технический результат изобретения заключается в повышении активности иммунной сыворотки и сокращении сроков лечения телят от парагриппа-3.

Для получения иммунных сывороток использовали быков красно-степной породы в возрасте 1,6-2 лет, живой массой 350-400 кг, серонегативных к бруцеллезу, лейкозу, лептоспирозу и отрицательно реагирующих на введение туберкулина. Антигеном для гипериммунизации служила живая лиофилизированная вакцина «Паравак» против ПГ-3 КРС с титром вируса 10⁵ ТЦД ₅₀/мл.

С целью определения дозы антигена и кратности его введения сформировали 3 опытные группы животных, по 5 голов в каждой. Быков-доноров иммунизировали вакциной «Паравак» интраназально, 1 раз по 1 мл в каждую ноздрю, затем подкожно 3 раза - 4; 6; 8 мл и внутривенно 2 раза - 10; 12 мл с интервалом в 3 дня (1-я группа), - 2; 3; 6; 9; 12; 15 мл с интервалом в 5 дней (2-я группа) и 4; 5; 6; 7; 10; 15 мл через 7 дней (3-я группа), соответственно.

Перед каждым введением антигена и через 14 дней после последнего исследовали сыворотку крови у быков в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Шестикратное комбинированное (интраназально, подкожно и внутривенно) введение антигена в дозах 4; 5; 6; 7; 10; 15 мл с интервалом в 7 дней позволило получить более высокие тиры антител, по сравнению с другими схемами (1:512). Результаты опыта представлены в таблице 1.

Судя по данным таблицы 1, схема вакцинации быков 3-й группы оказалась наиболее результативной, при этом достигался наивысший титр антител 1:512 (P<0,05). Эту схему выбрали как оптимальную, согласно которой гипериммунизацию животных проводят путем комбинированного (интраназально, подкожно и внутривенно) 6-кратного введения антигена в нарастающих дозах с интервалом 7 суток (табл. 2).

Для активации иммунного ответа используют различные препараты (иммуностимуляторы), способные влиять на процессы иммуногенеза при вакцинации животных. Поскольку в результате иммунизации были получены относительно невысокие титры антител к вирусу ПГ-3, мы в отдельном опыте на быках в сравнительном аспекте изучали иммуностимуляторы - левамизол, нуклеинат натрия и пирогенал.

При этом установлено, что активация иммунной системы перед иммунизацией левамизолом, внутримышечно, в дозе 3 мг/кг массы тела, трехкратно с интервалом двое суток, способствовала выработке парагриппозных антител у животных в более высоких титрах (1:1024), чем у животных, привитых в сочетании с нуклеинатом натрия и пирогеналом.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Изучение эффективности предлагаемой сыворотки при ПГ-3 КРС осуществляли на сформированных опытных группах больных и клинически здоровых животных. Контролем служила группа животных, которых подвергали лечению и профилактике по общепринятым в хозяйстве методам.

С профилактической целью сыворотку вводили телятам подкожно, через 2 дня после отъема, в дозе 1 мл на 1 кг массы тела и 5 мл интраназально, трехкратно, с интервалом 10-12 дней. С терапевтической целью сыворотку вводили подкожно в удвоенной дозе (2 мл на 1 кг массы тела), с интервалом 24-48 ч до полного выздоровления. Оценку эффективности сыворотки проводили по сохранности телят в опытных и контрольных группах. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что в группе телят, обработанных гипериммунной сывороткой с профилактической целью, отход составил 3,1%, что в 6,9 раза меньше, по сравнению с животными, которых не подвергали профилактической обработке.

Лечение больных телят сывороткой привело к выздоровлению 92,2% животных, в то время, как в контрольной группе при общепринятых методах лечения этот показатель был ниже и составил 78,6%.

Следует отметить, что у телят опытных групп отсутствовали рецидивы, тогда как у 5-8% животных контрольных групп болезнь имела рецидивирующий характер. Большинство животных, подвергавшихся лечению гипериммунной сывороткой, выздоровело через 8-10 дней. У животных контрольной группы болезнь продолжалась 14-18 и более суток.

Таким образом, было установлено, что подкожное введение гипериммунной сыворотки с интраназально-капельной аппликацией слизистой носовой полости с профилактической целью предотвращает заболеваемость их в критический возрастной период (от 1 до 3-х месяцев) после рождения, обуславливая тем самым снижение гибели животных почти в 7 раз. Эффективность гипериммунной сыворотки при лечении больных телят в условиях молочных комплексов также была высокой.

В производственных условиях данной сывороткой обработано более 5000 телят.

Источники информации

1. Грязин В.Н. Этиология респираторных заболеваний телят и меры специфической профилактики в условиях спецхоза. Научно-технический бюллетень ИЭВСиДВ. Новосибирск. 1982. Вып. 11. С. 19-22.

2. Жидков С.А., Крюков Н.Н., Зудилина З.Ф. и др. Эффективность сывороточных препаратов при вирусных респираторных заболеваниях телят. Бюл. ВИЭВ. 1976. Вып. 22. С. 38-41.

3. Мусиев Д.Г., Джамбулатов З.М., Гунашев Ш.А. Способ получения гипериммунной сыворотки против вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота. Патент РФ №2456021 от 20.07.2012. Бюл. №20.

4. Свиридов А.А., Грязин В.Н., Галахарь Н.Л., Шмаков С.И. Получение гипериммунной цитратно-фенолизированной крови и испытание ее при парагриппе-3 телят. Научно-технический бюллетень ИЭВСиДВ. Новосибирск. 1978. Вып. 10. С. 6-9.

5. Сергеев В.А., Сергеев О.В. Гипериммунная поливалентная сыворотка против массовых вирусных болезней крупного рогатого скота. Патент РФ №2396979 от 20.08.2010.

6. Цветков П., Хараламбиев X. Получение и испытание тривалентной гипериммунной сыворотки против парагриппа-3, аденовируса-1 и инфекционного ринотрахеита телят. Вет.-мед. науки. 1974. Т. II, №6, С. 66.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для получения гипериммунной сыворотки против парагриппа-3 крупного рогатого скота. Быков иммунизируют вакциной «Паравак» через каждые 7 дней. Вакцину вводят интраназально, 1 раз по 2 мл в каждую ноздрю, затем подкожно - 3 раза - 5; 6; 7 мл и внутривенно - 2 раза - 10; 15 мл. Через 2 недели после последнего введения вакцины из крови получают сыворотку, консервируют ее фенолом, который вносят до конечной концентрации 0,5%. Выдерживают при температуре 4±2°C в течение 30-40 дней и подвергают стерилизующей фильтрации. Заявленное изобретение обеспечивает получение препарата с высоким содержанием специфических антител против данной болезни, обладающего высоким лечебно-профилактическим действием при его применении в практических условиях. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

1. Способ получения гипериммунной сыворотки против парагриппа-3 крупного рогатого скота, отличающийся тем, что быков иммунизируют вакциной «Паравак» через каждые 7 дней, причем, вакцину вводят интраназально, 1 раз по 2 мл в каждую ноздрю, затем подкожно - 3 раза - 5; 6; 7 мл и внутривенно - 2 раза - 10; 15 мл, через 2 недели после последнего введения вакцины из крови получают сыворотку, консервируют ее фенолом, который вносят до конечной концентрации 0,5%, выдерживают при температуре 4±2°C в течение 30-40 дней и подвергают стерилизующей фильтрации.

2. Способ получения гипериммунной сыворотки против парагриппа-3 крупного рогатого скота по п. 1, характеризующийся тем, что для активации иммунной системы перед иммунизацией в качестве адъюванта используют левамизол, внутримышечно, в дозе 3 мг/кг массы тела, трехкратно, с интервалом двое суток.