СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОРИНЕБАКТЕРИОЗА И АССОЦИАТИВНЫХ С КОРИНЕБАКТЕРИЯМИ ИНФЕКЦИЙ У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к ветеринарной медицине и может быть использовано в диагностике инфекционных болезней животных. Диагностику коринебактериоза и ассоциативных с коринебактериями инфекций проводят патологоанатомическим и бактериологическим методами. Исследуют молоко, мокроту, навоз, мочу, при отрицательных результатах проводят диагностический убой и при обнаружении патологоанатомических изменений, свойственных коринебактериозным инфекциям, уточняют диагноз. В сомнительных случаях для подтверждения диагноза берут кусочки паренхиматозных органов для бактериологического исследования. В практической ветеринарии для диагностики некоторых хронически протекающих заболеваний (туберкулеза, бруцеллеза, туляремии и др.) применяют аллергическую пробу, основанную на феномене повышенной чувствительности замедленного типа. На введение аллергена гомологично сенсибилизированный макроорганизм реагирует увеличением кожной складки, что является показателем инфицированности организма (1. 2.). Для диагностики инфекций коринебактериозной этиологии, которые имеют группоспецифическую общность с микобактериями, подобный метод не предусмотрен по причине отсутствия аллергена.

Наиболее близким техническим решением является аллергический способ диагностики туберкулеза с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих. На внутрикожное введение туберкулина сенсибилизированный коринебактериями макроорганизм отвечает нечетко выраженной неспецифической реакцией.

Недостатком данного метода является низкая чувствительность и непродолжительность реакции на туберкулин у зараженных коринебактериями животных. При этом причина неспецифических реакций остается невыясненной, что заметно сказывается на эффективности принимаемых мер при ликвидации данной патологии. Бактериологические и патологоанатомические исследования коринебактериозных инфекций не только трудоемки, но и требуют немалых материальных вложений.

Целью изобретения является повышение эффективности и упрощения прижизненной диагностики коринебактериозных инфекции.

Указанная цель достигается тем, что в способе диагностики коринебактериозных инфекций в качестве диагностикума используется коринебактериозный аллерген, который вводится внутрикожно в верхней средней трети шеи крупного рогатого скота в дозе 0,2 мл с учетом и оценкой реакции через 72 часа. Используемый в качестве диагностикума аллерген более специфичен и чувствителен. Реагирующими считают животных с увеличением кожной складки на месте введения аллергена с разницей в 3 и более мм по сравнению с толщиной неизмененной кожи.

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что в качестве диагностикума используется аллерген, изготовленный из коринебактерий. Для экспериментальной проверки заявляемого аллергена предварительно изготовили аллерген из коринебактерий. Для этого культуру коринебактерий (Corynebacterium xerosis N1911) выращивали на синтетической среде Сотона с добавлением смеси индивидуальных н-алканов, содержанием в цепи от 10 до 17 атомов углерода, в течение 2-х месяцев. Следует отметить, что среда Сотона нами была модифицирована и сравнительно испытана ранее. Результаты этих испытаний показали большую эффективность модифицированного варианта для выращивания коринебактерий, биомасса которых превышала контрольные серии более 2-х раз. Это позволило получить в 2-раза больше активного белка к единице объема. Колбы с культурой, где толщина слоя бакмассы достигала около 1 см, автоклавировали при 1,5 атм в течение 30 мин. Отделяли бактериальную массу фильтрацией и центрифугированием, после чего проводили осаждение белка. Из объема супернатанта в количестве 1,5 л осаждением в изоэлектрической точке NaCl (18% - концентраций при 4,1 РН) получили 3,2 г белка. Осажденный белок отделили, двукратно отмыли, чистый белковый осадок растворили в дистиллированной воде до концентрации остаточного азота 0,7 мг/мл и стерилизовали, пропустив через фильтр Зейтца.

Данное отличие позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого аллергена критерию «новизна». В диагностике коринебактериозных инфекций решения, имеющие похожие признаки, не выявлены ни в зарубежной, ни в отечественной литературе, следовательно заявляемое решение соответствует критерию «существенные отличия».

Испытание разных доз аллергена (0,1-0,4 мл) проводили на сенсибилизированных коринебактериями (С.xerosis N1911), через 27 дней после подкожного заражения в дозе 10 мг влажной культуры в 1 мл физиологического раствора. В опыт были взяты 25 морских свинок по 5 голов на испытываемую дозу и 5 находились на контроле. Опытным морским свинкам на депилированный участок реберной поверхности вводили испытуемые дозы аллергена. Учет и оценку реакции проводили через 48 и 72 часа после введения аллергена. Реагирующими считали животных, у которых обнаруживали разницу в толщине кожной складки в месте введения аллергена в сравнении с таковой неизмененной кожи не менее 3 мм.

По результатам проведенных исследований на дозу 0,1 мл реагировали все опытные морские свинки со средней интенсивностью реакции через 48 часов на 4,18±0,40, через 72 часа на 4,78±0,46. На дозу 0,2 мл интенсивность реакций составляла 5,39±0,33 и 6,11±0,37 соответственно. С увеличением доз аллергена не установили разницы в сторону увеличения интенсивности реакции, поэтому оптимальной дозой аллергена для использования в целях диагностики коринебактериозных инфекций была принята доза в объеме 0,2 мл. Следует сказать, подведение концентрации белка в аллергенах к количественному содержанию его в туберкулине (0,7 мг/мл) имело решающее значение в определении оптимальной дозы в объемном выражении. Табл. 1

Испытание аллергена на специфичность проводили на зараженных коринебактериями и атипичными микобактериями морских свинках и на больных туберкулезом животных.

Исследования показали высокую специфичность аллергена. Сенсибилизированные животные реагировали с большей интенсивностью на гомологичный аллерген. Так интенсивность реакции у зараженных коринебактериями морских свинок составляла 6,92±0,28, тогда как у зараженных атипичными микобактериями и больных туберкулезом животных было 4,76±0,33 и 4,95±38 соответственно (см. Табл 2).

Следует сказать, что микобактерии имеют родственные антигенные детерминанты с коринебактериями, поэтому данная группа животных реагировала на коринебактериозный аллерген, но в значительно меньшем количестве и с меньшей реакцией.

Источники информации

1. Курская биофабрика 100 лет. - Курск 1996. - С. 374-403.

2. Лазовская А. Л., Блохина И.Н. Патогенные и условно-патогенные микобактерии - Горький, 1976.

3. Нуратинов Р.А., Ургуев К.Р., Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. Способ диагностики родококковой инфекции у животных. Патент на изобретение №2146534. - Москва от 20 марта 2000 г.

4. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены. - Москва, « Медицина», 1990 г. -226 с.

5. Шевырев Н.С. Совершенствование промышленных технологий сухого очищеного туберкулина для млекопитающих. // Тр. ВГНКИ ветпрепаратов. М., 1972.-Т. XVIII.- с. 59.

6. Janicki B.W., Chaparas S.D., Daniel Т.М. et. al.// Amer. Rev. Dis. - 1971 - Vol. 104-№4-P. 602-604.

Результаты испытания разных доз аллергена на сенсибилизированных коринебактериями морских свинках

Результаты испытания аллергена на специфичность

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики коринебактериоза и ассоциативных с коринебактериями инфекций. Способ включает внутрикожное введение коринебактериозного аллергена, который вводят внутрикожно в дозе 0,2 мл. Учет и оценку реакции проводят через 72 часа. Заявленный способ более специфичен и чувствителен, что позволяет предотвратить неоправданный убой животных, а также расходы на проведение дальнейших исследований для уточнения диагноза. 2 табл., 1 пр.

Способ диагностики коринебактериоза и ассоциативных с коринебактериями инфекций у животных, неспецифически реагирующих на внутрикожное введения ППД-туберкулина для млекопитающих, отличающийся тем, что в качестве диагностикума используется коринебактериозный аллерген, который вводится внутрикожно в дозе 0,2 мл.