СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С АЛЛЕРГЕНОМ ИЗ РОДОКОККОВ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к диагностике инфекционных болезней крупного рогатого скота.

В практике ветеринарной медицины для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота используют аллергический способ, при котором в качестве диагностикума выступает широко известный ППД-туберкулин для млекопитающих. Сущность способа заключается в том, что на аллерген, введенный внутрикожно, у больного туберкулезом и сенсибилизированного микобактериями животного, через 72 часа отмечают аллергическую реакцию, выражающуюся припухлостью (утолщение кожной складки), болезненностью при пальпации и повышением местной температуры. Реагирующими (больными) считаются животные, у которых обнаруживают разницу в толщине кожной складки в месте введения ППД-туберкулина на 3 и более мм в сравнении с таковой неизменной кожи (вблизи места введения).

Известно, что кроме М.бовис и туберкулезис, способностью сенсибилизировать макроорганизм к ППД-туберкулину обладают атипичные микобактерии и кислотоустойчивые сапрофиты (1), стрессовые факторы (2), нокардии (3). Нами было установлено, что аналогичными свойствами обладают близкородственные к микобактериям по генетическим, хемотаксономическим и иммунологическим свойствам микроорганизмы из рода родококкус (4). Перечисленные факторы могут быть причинами реакций на ППД-туберкулин, объединенных под общим названием - "неспецифические реакции". Проблема состоит в дифференциации специфических и неспецифических реакций на туберкулин, которая стала особенно актуальной за последние 30 лет.

В этих целях предложен способ (5), при котором одновременно с ППД-туберкулином для млекопитающих применяют аллерген из М.авиум (туберкулин для птиц). Пробу ставят на шее животного. ППД-туберкулин для млекопитающих вводят внутрикожно, в верхнюю среднюю треть шеи в дозе 10 тыс. МЕ в объеме 0,2 мл с правой стороны, а туберкулин для птиц - с левой стороны. Учет и оценку реакции дают через 72 часа после введения аллергенов. При обнаружении большего числа реагирующих на ППД-туберкулин животных, делают заключение о возможности (большей вероятности) сенсибилизации микобактериями бычьего вида, а в противном случае - М.авиум.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа является способ дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин в так называемой "симультанной пробе" с параллельным использованием очищенного комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), с последующим определением достоверности различия в интенсивности (степени проявления) реакций на эти аллергены. Под достоверностью различия понимают разницу в величине показателей интенсивности реакций на туберкулин и КАМ, которая дает возможность с уверенностью не менее, чем 95% сделать заключение о состоянии по туберкулезу исследуемой группы животных (6).

Принцип, на котором основаны способы дифференциации аллергических реакций в аналоге и прототипе заключается в том, что интенсивность реакций, а значит и количество реагирующих животных на гомологичный сенсибилизации аллерген обнаруживается больше чем на гетерологичный. Иначе говоря, если животные сенсибилизированы М. бовис, то интенсивность реакции и количество реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих достоверно выше, чем на другие аллергены и наоборот.

Недостатком этого способа является невозможность установления симультанной пробой с КАМ сенсибилизацию организма животных родококками, а значит дифференциацию неспецифических реакций ими вызванных. В таких случаях, результаты симультанной пробы с КАМ остаются неопределенными.

Целью изобретения является (разработка способа) повышение эффективности дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих у крупного рогатого скота.

Указанная цель достигается тем, что в симультанной пробе, комплексный аллерген из атипичных микобактерий заменяется аллергеном, изготовленным по следующей схеме: культуру Phodacoccus Bronchialis, высевали на среду Сотона с L-аспарагином, инкубировали при 37^oC в течение 60 дней. Колбы с выращенной культурой автоклавировали при 120^oC 30 мин и декантировали. Осаждение активного белка из культуральной среды производили в изоэлектрической точке NaCl в 20% концентрации при pH - 4,1-3,9. Осадок двукратно отмывали и растворяли в дистиллированной воде до концентрации белка (по Лоури) - 0,7 мг/мл (аналогично содержанию его в туберкулине).

Такая замена обосновывается тем, что сенсибилизированный родококками организм животного интенсивнее реагирует на аллерген из родококков, чем на КАМ или на ППД-туберкулин для млекопитающих.

Туберкулин и аллерген из родококков вводят соответственно с левой и правой стороны шеи, внутрикожно, в дозе 0,2 мл. Учет и оценку реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих и аллерген из родококков проводят через 72 часа после их введения. При учете реакции у каждого исследуемого животного пальпируют место введения туберкулина. В случае обнаружения припухлости в месте его инъекции, у этого животного прощупывают место введения родококкового аллергена. Затем сравнивают степень выраженности реакций кутиметром. Более выраженную реакцию на туберкулин при менее выраженной или полностью отсутствующей на родококковый аллерген обозначают знаком "+", менее выраженную реакцию на туберкулин знаком "-", при одинаковых реакциях знаком "=". Нереагирующих на туберкулин животных, независимо от наличия или отсутствия у них реакции на родококковый аллерген не учитывают. Результаты оценки реакций в знаках ("+", "-", "=") вносят в ведомость учета симультанной пробы. В дальнейшем поступают в соответствии с "Наставлением пор постановке симультанной пробы с КАМ".

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что в качестве второго, сравниваемого, берется аллерген, изготовленный из бактерий совершенно другого рода, не относящихся к роду микобактериум, что позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию "новизна". Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, а именно возможность дифференциации сенсибилизации микроорганизма родококками или микобактериями, не выявлены в других технических решениях при изучении литературы в данной области диагностики и, следовательно, обеспечивает заявляемому решению соответствие критерию "существенные отличия".

Ниже приводятся конкретные примеры осуществления заявляемого способа.

Пример 1. 20 кроликов, сгруппированные по 5 голов, были сенсибилизированы микобактериями: БЦЖ, авиум, флеи и скрофуляцеум. Исследования проводили через один, два и три месяца после заражения, симультанно (ППД-туберкулин для млекопитающих и родококковый аллерген), пробой на ушах (7). Аллергены вводили подкожно, соответственно, в правое и левое ухо. Оценку реакции давали через 48 ч. после введения препаратов. При этом, как интенсивность реакции, так и число реагирующих животных на ППД-туберкулин для млекопитающих превосходило при всех исследованиях (табл. 1). У контрольных животных реакции на аллерген не обнаружены.

Пример 2. 25 кроликов, сгруппированные по 5 голов, были сенсибилизированы родококками: бронхиалис, экви, лютеус и роднии. Исследования проводили через один, два и три месяца после заражения, симультанно (ППД-туберкулин для млекопитающих и родококковый аллерген), пробой на ушах. Аллергены вводили подкожно, соответственно, в правое и левое ухо. Оценку реакции давали через 48 ч после введения препаратов. При этом, интенсивность реакций и число реагирующих животных на родококковый аллерген превосходило при всех исследованиях у контрольных животных реакции на аллерген не обнаружены (табл. 1).

Пример 3. Исследовали 60 голов крупного рогатого скота внутрикожной пробой, в дозе 0,2 мл, симультанно ППД-туберкулином для млекопитающих и аллергеном родококков. Учет и оценку реакции давали через 72 часа после введения препаратов. При этом, у 3 животных реакция была выражена на туберкулин, у 16 голов на родококковый аллерген. Общее число реагирующих животных (16+3) равно 19 (показатель А). По таблице "определения достоверности различий" находят число соответствующее 19 (показатель Б), которое равно - 15, что указывает на достоверность различий в реакциях. Иначе говоря, животные данной группы с вероятностью 95% сенсибилизированы родококками. Результаты симультанной пробы в последующем были подтверждены бактериологическими исследованиями.

Использование заявляемого изобретения позволит дифференцировать аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, в случаях получения неопределенных результатов в симультанной пробе с КАМ. Это позволяет ускорить постановку диагноза и предотвратить неоправданный убой скота.

Источники информации
1. Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В. Ветеринарные препараты. - Москва, Колос, 1981 - 448 с.

2. Васин А.В. К вопросу о влиянии внешних факторов на аллергическое состояние при туберкулезе крупного рогатого скота //Ветеринария - 1951. - N 12. - С. 29-30.

3. Awad F.J. Studies on Bovine Nocardiosis with Particular Reference to its Interference in the Interpertation of the Results of Tuberculin Testing. //Kongresberichte Procceding Rapports Actas. Hannover - 1963. - P. 465-471.

4. Нуратинов Р.А., Ургуев К.Р. Экспериментальное обоснование неспецифической сенсибилизации к туберкулину кроликов, зараженных бактериями рода Rhodococcus. /Тезисы докладов международной конференции //"Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики в условиях реформирования сельскохозяйственного производства Прикаспийского региона". Махачкала - 1997. - С. 49-50.

5. Plum N. Geflugeltuberculose bei Saenqetieren // Druck von Kandripa Wunsch Kopengagen - 1925.

6. Шаров А. Н. Изучение эффективности применения симультанной пробы с комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза /Сб. науч. трудов ВГНКИ. - 1985. - С. 3-9.

7. Иванова Н.А., Соколова А.С. Туберкулинизация кроликов. //Ветеринария, 1988. - N 4. - С. 64-65.1

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к диагностике инфекционных болезней крупного рогатого скота. Способ дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих включает введение ППД-туберкулина для млекопитающих и диагностикума неспецифической сенсибилизации микроорганизма в симультанной пробе с последующим определением достоверности различий в интенсивности реакций. В качестве диагностикума неспецифической сенсибилизации микроорганизма вводят аллерген из Rhodocоccus bronchialis. Данное изобретение позволяет повысить эффективность дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих у крупного рогатого скота.

Способ дифференциации аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, включающий введение ППД-туберкулина для млекопитающих и диагностикума неспецифической сенсибилизации макроорганизма в симультанной пробе с последующим определением достоверности различий в интенсивности реакций, отличающийся тем, что в качестве диагностикума неспецифической сенсибилизации макроорганизма вводят аллерген из Rhodococcus bronchialis.