Сорто-микробная симбиотическая система - штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti RCAM1774 и люцерны изменчивой сорта Таисия Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, а именно к новым штаммам клубеньковых бактерий, оказывающим стимулирующее воздействие на рост люцерны.

В последние десятилетия под влиянием экономического кризиса в сельском хозяйстве, а также под воздействием эколого-климатических изменений, носящих глобальный характер, доля деградированных почв увеличилась. Остановить деструктивные процессы, повысить плодородие почв и урожайность последующих культур позволяет возделывание многолетних трав, в частности, люцерны [Агроландшафтно-экологическое районирование и адаптивная интенсификация кормопроизводства Центрального экономического района Российской Федерации. - Под редакцией А.С. Шпакова, И.А. Трофимова, А.А. Кутузовой. - М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005. - 396 с.; Косолапов В.М. Кормопроизводство - основа сельского хозяйства России // Кормопроизводство. - 2010. - №8. - С. 3-6; Дегунова Н.Б., Данилова Ю.Б. Урожайность сортов люцерны изменчивой при инокуляции ризоторфином // Кормопроизводство. - 2013. - №7. - С. 26-28.].

Среди сельскохозяйственных культур люцерна занимает особое место, как повсеместно распространенная растение, облагораживающее почву, в частности, повышающее в ней содержание азотсодержащих соединений. В большинстве областей России люцерну культивируют дважды в год, однако, ее урожайность относительно невысока.

В этой связи значительный объем исследований посвящен разработке оптимальной технологии культивирования таких культур, как люцерна, в рамках которой одной из важных стадий является обработка семян люцерны препаратами, содержащими азотфиксирующие бактерии [RU 2025484, 2012; RU 2514217, 2014; CN 104025865, 2014; CN 102845204, 2013; CN 102755991, 2012; CN 104068293, 2014]. В настоящее время существует более 200 видов микроорганизмов способных к симбиотической фиксации азота. В частности, для повышения урожайности люцерны предлагается использовать штаммы Agrobacterium rhizogenes D32 [SU 1822883, 1993], Rhizobium meliloti 421a [RU 549454, 1977], Rhizobium meliloti425a [RU 549454, 1977], Rhizobium meliloti 441 [RU 629204, 1978], Rhizobium meliloti 443a [RU 745887, 1980], Rhizobium meliloti 450a [RU 881095,1981].

Эффективность обработки, как правило, зависит от сорта люцерны и свойств используемого штамма бактерий, что делает проблему создания новых штаммов клубеньковых бактерий для конкретных сортов люцерны достаточно актуальной.

Среди сортов люцерны для возделывания по Центральному и Северо-Западному регионам России одним из наиболее перспективных является сорт люцерны изменчивой Medicago varia Mart, сорт ТАИСИЯ [http://medi-cagosativa.narod.ru/index/0-5; http://greendeer.ru/products/green-deer-agro/taisi-ya.html/. Сорт предназначен для 6-8 летнего сенокосного использования, устойчив к возделыванию на кислых почвах (pH 4,5-5,0) нечерноземной зоны России. Благодаря высокой холодостойкости сорт Таисия обладает сравнительно высокой интенсивностью роста при среднесуточной температуре воздуха 10-12°C, хорошо развивается, растет и зимует при позднелетнем посеве (10-25 августа). Таисия превосходит сорта отечественной селекции по адаптивной способности к абиотическим стрессовым факторам (высокая холодостойкость, засухоустойчивость, устойчивость к переувлажнению почвы в весенний период), а начиная с четвертого-пятого лет жизни - по урожайности сена на 10-20%.

При культивировании люцерны для повышения ее урожайности в средней полосе России, как правило, используют бактериальные удобрения на основе бактерий семейства Rhizobiaceae. [RU 2508631, 2009; Ferguson и Mathesius, J. Plant Growth Regulation 22: 47-72, 2003], которые являются азот-фиксирующими внутриклеточными микросимбионтами, формирующими клубеньки на люцерне и бобовых, из одной с ней перекрестной группы инокуляции и могут существовать в почве, где они являются свободно живущими сапрофитами.

Так, в симбиозе с люцерной изменчивой использовали штамм Rhizobium meliloti 415^b, разработанный ВНИИСХМБ, и штамм Sinorhizobium meliloti Якутский №1 ГНУ ВНИИСХМ 1775 [RU 2299188, 2006; http://www.rusnau-ka.com/13 NPT 2008/Biologia/31476.doc.htm]. Однако эффективность штамма недостаточно высока, особенно при выращивании люцерны на кислых почвах.

Наиболее близким по достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является штамм Sinorhizobium meliloti RCAM03363, разработанный ВНИИСХМБ и показавший лучшие результаты при культивировании люцерны изменчивой [RU 2593714, 2016]. Однако эффективность штамма все еще недостаточно высока, особенно при выращивании люцерны сорта Таисия.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось повышение урожайности люцерны изменчивой сорта Таисия при выращивании на кислых почвах путем получения симбиотического штамма с повышенной эффективностью симбиоза, обеспечивающего более высокий урожай люцерны.

Наиболее перспективным способом повышения продуктивности симбиоза является создание высококомплементарных растительно-микробных систем. В результате многолетних экспериментов выявлена высокопродуктивная система: сочетание люцерны сорта Таисия и штамма Sinorhizobium meliloti шт. AK 23/A2, депонированного 07.10.2008 в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ № RCAM1774. Коэффициенты корреляции (г) между урожайностью люцерны в контроле и в варианте с использованием штамма RCAM1774 достигала 0,99, в то время как у других штаммов клубеньковых бактерий люцерны составляла 0,55-0,78.

Штамм характеризуется следующими свойствами:

1. Родовое, видовое название, номер. Sinorhizobium meliloti AK 23/A2

2. Где выделена:

Штамм выделен из клубеньков Melilotus , собранного в Челкарской обл. (Мугоджары), Казахстан

3. По какому определителю, руководству идентифицирована (автор, год, место издания).

Определитель бактерий Берджи. Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. Девятое издание. В двух томах. Москва «Мир», 1997.

4. Культурально-морфологические, физико-биохимические особенности культуры:

- Форма колоний - на среде TY образуют округлые слизистые колонии беловатого цвета.

- Форма клеток и подвижность - подвижные, палочки, 0,5-0,9×1,2-3,0 мкм.

- Окраска по Грамму - грамотрицательные

- Жгутикование - полярное

- Спорообразование - спор не образует

- Наличие пигмента - нет

- Дыхание, форма усвоения углеводов - аэроб, рост на среде с углеводами сопровождается обильным образованием внеклеточной слизи полисахаридной природы

- Отношение к источникам азота - источниками азота могут служить соли аммония, нитрат, нитрит и большинство аминокислот

- Образование индола, сероводорода -

- Кислотоустойчивость - некислотоустойчивый

- Анаэробный тест - строгий аэроб

- Наличие уреазы, каталазы -

- Восстановление нитратов - восстанавливает

- Разжижение желатины - не разжижает

- Молоко с лакмусом - подщелачивает

5. Способы, условия хранения:

- Выращивание на средах: TY, 79, бобовый агар.

- Выращивание в течение 2-3 суток.

- Суспензию замораживают при температуре при температуре 25-26°C, высушивают при температуре 45-50°C и закрывают в пенициллиновые флаконы

- Флаконы с лиофильно-высушенными клетками сохраняют при температуре 4-6°С

6. диссоциация культуры: не диссоциирует

Геномные характеристики.

Геном содержит одну хромосому, две мегаплазмиды и одну криптическую плазмиду размером 160 т.п.н.

Структурная организация таксономически важной межгенной последовательности рибосомального оперона (ITS rrn-оперон) сходна со структурной организацией этого локуса у типового штаммам Rm1021.

Структура хромосомы № RCAM1774 (AK 23/А2) не содержит геномных островов, но имеет ген SMc02155 выявленный в геномном острове Sme21T штамма Sinorhizobium meliloti Rm1021 (SMc02155 - не охарактеризованный гипотетический белок (942 а.о.).

Имеются различия в структурной организации хромосомных функционально-важных генов. Ген betC (SMc00127) - детерминирующий синтез холин сульфатазы имеет иную структурную организацию (тип ab), чем аналогичный ген у Rm1021 (аа). Структурная организация гена SMc04407 (MFS-тип транспортного протеина) отличается (тип Ь) от структурной организации этого гена у Rm1021 (а).

Имеются различия в структурной организации генов, расположенных на мегаплазмиде I (SMa) и детерминирующих синтез фактора вирулентности, ответственного за клубенькообразование. Гены nodD1 (bb) (SMa0870 - nod-box зависимый транскрипционный активатор), nodA (ас) (SMa0869 - N-ацилтранефераза) и nodH (ab) (SMa0851 - сульфотрансфераза) имеют принципиально иные RFLP-типы, чем штамм Rm1021 (везде тип «а»).

Выполнен анализ метаболической активности AK23/A2 с использованием фенотипических биочипов (РМ) фирмы BioLOG посредством выращивания штамма на различных субстратах, при этом считается, что питательная среда не оказывает влияния, либо ее влияние нивелируется математической обработкой. Установлено, что штамм не способен расти на среде с pH 9,5. Штамм может использовать в качестве дополнительных органических источников фосфора производные аминокислот, например, O-фосфо-L-тирозин или D-глюкоза-6-фосфат и D-глюкозо-1-фосфат или 2-дезокси-D-глюкозо-6-фосфат. Штамм AK 23/А2 способен использовать 3 неорганических источника N, а также 4 источника неорганической серы.

Установлено, что штамм устойчив к 7 бета-лактамным и к 11 лактамам антибиотикам, чувствителен к полимиксину В, полипептидному антибиотику из Bacillus polymyxa, действующему преимущественно на грамотрицательные микроорганизмы.

Изучение симбиотической эффективности этого штамма в стерильных микровегетационных и вегетационных опытах показало, что штамм CIAM 1774 формирует высокоэффективный симбиоз с такими хозяйственно-ценными сортами люцерны, как: изменчивая, например, сорта Вега, Таисия, Пастбищная 88 и другие и хмелевидная (сорт Мира).

Сорто-микробные системы, сформированные с сортом Таисия (Medicago varia Mart.) и штаммом RCAM1774 {Sinorhizobium meliloti), а также производственным штаммом 415^б испытывали в 2012-2016 гг. во ВНИИ кормов им. В.Р.Вильямса на участках с разным уровнем почвенной кислотности (pH 4,4-6,4) и разной степенью заселенности местными расами клубеньковых бактерий. Последний показатель определялся продолжительностью возделывания люцерны в севообороте, в котором находился опытный участок. Содержание гумуса по Тюрину 1,35-1,65%, общего азота 0,159-0,176%, фосфора 166,0-194,0, калия 76,9-111,9 мг на 1 кг почвы. Посев сплошной, рядовой, площадь делянок 10 м², повторность 4-х кратная. Норма высева семян люцерны в опытах на корм - 10 кг/га, на семена - 4 кг/га. Контроль - вариант без предпосевной инокуляции.

На участках с разным уровнем почвенной кислотности, где люцерна прежде не выращивалась, эффективность симбиоза люцерны сорта Таисия со штаммом 415б составила 15-151%, а со штаммом RSAM 1774 достигала 41-397%.

В селекционном севообороте люцерны, где люцерна возделывается более 50 лет и почва насыщена местными расами ризобий, средняя эффективность симбиоза сорта Таисия со штаммом 4156 составила 6%, а со штаммом RSAM1774 - 19% (табл.).

Самый высокий сбор сухого вещества люцерны и семян был получен при возделывании на почве, близкой к нейтральной (pH 6,00-6,45). Средняя урожайность сорта Таисия в варианте без инокуляции достигала 12,5 т/га сухого вещества и 600 кг/га семян. Инокуляция производственным штаммом 412^б повысила сбор сухого вещества на 15% до 14,4 т/га, семян - на 12% до 670 кг/га, а инокуляция комплементарным штаммом RSAM1774 увеличила урожайность на 41 и 47%, то есть до 17,6 т/га сухого вещества и 880 кг/га семян соответственно. Густота травостоя люцерны сорта Таисия в контрольном варианте и в варианте с инокуляцией штаммом RSAM1774 на третий год пользования травостоем составила 93 и 94%, инокуляция производственным штаммом 4156 обеспечила сохранность травостоя люцерны на уровне 99% (табл.).

При возделывании на участках с кислой почвой (pH 4,64), где люцерну прежде не выращивали, урожайность сорта Таисия в контроле составила 1,85 т/га сухого вещества и 42 кг/га семян. Инокуляция производственным штаммом ризобий 412^б позволила получить 4,65 т/га сухого вещества и 114 кг/га семян. Эффективность симбиоза составила 151 и 171% соответственно. Инокуляция новым штаммом ризобий RSAM1774 повысила сбор сухого вещества в 4 раза (до 9,2 т/га), семян - в 8,9 раза (до 372 кг/га).

Эффективность симбиоза люцерны изменчивой сорта Таисия, на почвах с раличной реакции среды (среднее 2011-2016 гг).

Средняя урожайность и средние прибавки урожайности в вариантах с инокуляцией активными штаммами клубеньковых бактерий люцерны были получены при возделывании люцерны сорта Таисия на участках со слабокислой почвой (pH 5,5-6,0). В варианте без инокуляции средняя урожайность составила 7,8 т/га сухого вещества и 215 кг/га семян. Инокуляция штаммом 4156 повысила эти показатели на 32 и 40%, а штаммом RSAM1774 - на 69 и 67% соответственно. На третий год пользования густота травостоя в варианте без инокуляции составляла 84%, а с инокуляцией активными штаммами была на 10% выше.

В селекционном севообороте люцерны на участках со слабокислой почвой (pH 5,8-6,0) урожайность сорта Таисия в варианте без инокуляции (10,5 т/га сухого вещества и 372 кг/га семян) была выше, чем при возделывании на участке с близким уровнем почвенного плодородия, где люцерна прежде не выращивалась (7,8 т/га и 215 кг/га). По-видимому, это объясняется прибавкой урожайности за счет симбиоза с местными расами ризобий. Инокуляция производственным штаммом 4156 повысила сбор сухого вещества на 6%, а семян - 7%. Эффективность симбиоза штамма RSAM1774 выше, чем у 4156, и прибавки урожайности составили 19% сухого вещества и 23% семян (табл.).

Эффективность заявляемого штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В 2015-2016 годах в ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса», г. Лобня проводили изучение эффективности различных штаммов клубеньковых бактерий с люцерны изменчивой сорта Таисия для получения семян. Предпосевная инокуляция семян проводилась методом их опудривания штамм-содержащим препаратом.

Полученные результаты показали, что использование штамма Sinorhizobium meliloti RCAM1774 на 30-200% повышает урожайность люцерны изменчивой сорта Таисия.

Пример 4. В 2013-2014 годах оценка влияния штаммов клубеньковых бактерий на семенную продуктивность люцерны изменчивой проводилась в Калининградской обл.

(Почва - дерново-подзолистая среднесуглинистая, pH участков 5,3 Содержание гумуса 1,55-1,75%, общего азота 0,165-0,185%, фосфора 188-194, калия 309 мг на 1 кг почвы. Посев сплошной, рядовой, площадь делянок 1,6 м², повторность 4-х кратная.

Полученные результаты приведены в таблице 4.

Полученные результаты показали, что штамм Sinorhizobium meliloti RCAM

1774, образуя с клубеньками Люцерны изменчивой сорта Таисия сорто-микробную симбиотическую систему, способствует повышению урожайности люцерны в 1,5 и более раз по сравнению с контролем и традиционно используемыми штаммами микроорганизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Сорто-микробную симбиотическую систему - штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti RCAM1774 и люцерны изменчивой сорта Таисия, обладающую повышенной продуктивностью в различных агроклиматических условиях. Изобретение позволяет повысить урожайность люцерны изменчивой сорта Таисия. 4 табл.

Сорто-микробная симбиотическая система - штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti RCAM1774 и люцерны изменчивой сорта Таисия, обладающая повышенной продуктивностью в различных агроклиматических условиях.