Штамм бактерий RнIZовIUм меLILотI для производства удобрения под пажитник Советский патент 1993 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

Цель изобретения - получение нового штамма Rhizobium meiiloti с высокой эффективностью азотфиксации в симбиозе с пажитником, что позволяет получить более высокий по сравнению с известными штаммами урожай зерна и зеленой массы пажитника и увеличить содержание в нем белка, а также удовлетворяющего технологическим

требованиям промышленного производства.

В качестве такого штамма предлагается штамм Rhizobium meiiloti 2502.

Бактерия штамма R.meliloti 2502 выделены из клубеньков пажитника сенного сор- тообразца из ВИР, произраставшего в Курской области на выщелоченном черноземе. Идентифицированы по определителю Берги.

Штамм R.meHioti 2502 депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под № 2502,

Морфолого-культуральные признаки штамма R.mellfoti 2502.

Вегетативные клетки на косом бобовом агаре при 28°С и рН 6,8-7,0 в 2-суточной культуре имеют форму коротких палочек с зернистой протоплазмой и закругленными концами, 1,2-1,8x0,6-0,7 мкм, грзмотрица- тельные, до 24 часов.подвижные, затем по мере старения - к 48 часам - утрачивают подвижность, перитрихи. Быстрорастущая культура.

Образование специализированных клеток. При старении культуры на бобовом агаре с рН 6,8-7,0 и при t 28°C в возрасте 3-х суток и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика колоний на плотной среде,

1. Гороховый агар, г/л: горох - 100,0; сахароза - 20,0; агар - 20,0; рН среды 6,8. При 28°С штрих 3-суточной культуры обильный, беловатый, слизистый; слабо-выпуклый, стекающий, блестящий. Колонии появляются на 3 сутки; на 5 сутки имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, слабо-выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, беловатые. t

2. Люпиновый агар, г/л: КаНРОз - 0,5; КН2Р04 - 0,5; MgS04x7H20 - 6,2; NaCI - 0,2; CaSOt 0,1; (IMH4)2Mo04 - следы; маннит - 20,0; люпиновая мука - 10,0; агар - 20,0. рН среды 6,8-7,0, При 28°С штрих 3-х суточной культуры обильный, беловатый, слизистый, слабовыпуклый, сильно-стекающий, блестящий, При 28°С колонии появляются на 3-й сутки; на 5-е сутки имеют размер 2-3 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, беловатые.

3. Маннитно-дрожжевой агар (МДА), г/л: маннит - 10,0; КаНРО-з - 0,5; Мд504х7НгО - 0,2; NaCI - 0,1; дрожжевой экстракт - 0,4; агар - 15,0. рН среды 6,8-7,0. При 28°С штрих 3-суточной культуры обильный, беловатый, слизистый, слабо-выпуклый, сильно-стекающий, блестящий. При 28°С колонии появляются через 3-е суток; на 5 сутки имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, беловатые.

Рост в жидкой среде.

Молоко с лакмусом при 28°С не пепто- низирует, на вторые сутки слабо подщелачивает; интенсивность подщелачивания с возрастом не меняется. На поверхности лакмусового молока через 3-е суток образуется слизистая прозрачная зона, которая достигает максимальных размеров - 5 мм - через 15 суток.

Физиолого-биохимические свойства. Симбионт. Макросимбионт - бобовое растение пажитник.

Отношение к; а) кислороду - аэроб.

б)Т°; максимальная 40°С; минимальная 10°С; оптимальная - 26-30°С.

в) рН: максимальная 7,5; минимальная 5,5; оптимальная 6,8-7,0. Источники углерода

ge

глюкозаАк (-) галактоза А к (-) сахароза Ак (-) 5 лактоза Ак (-) маннит Ак (-} сорбит Ак (-) рамноза Ак (-) ксилоза Ак (-) 0 мальтоза . Ак (-) декстрин Ак (-) клетчатка крахмал . - Жидкая среда Нориса, Т- 28°С. 5 Источники азота

ж . NaNOs+

(NH4)2S04+ тирозин + 0 МПА +

Фиксирует азот из воздуха в симбиозе с пажитником,

Другие характерные физиологические особенности. 5 Желатину не разжижает.

Штамм не патогенен. См. Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов. М., Наука, 1976, с. 87. Штамм 2502 хранится на люпиновом 0 агаре указанного выше состава, рН 6,8-7,0, при 4-5°С и пересевается 1 раз в б месяцев. Условия проведения вегетационных и полевых опытов.

Стерильный микровегетационный опыт 5 проводят в стеклянных цилиндрах объемом 800-900 см3 с 50 г вермикулита. В цилиндры , добавляют 110мл среды Красильникова-Ко- реняко следующего состава (г/л): К2НР04 - 1,0; MgS04x7H20 - 1,0; Саз(Р04)2 - 0,2 1 мл 0 смеси микроэлементов по прописи /И.В.Федорова (г/л): НзВОз - 5,0; (NH&MoOt - 5,0; KJ - 0,5; NaBr - 0,5; ZnS04x7H20 - 0,3; Al2(S04)3x18H20-0,3; 0,2; CuS04- 0,2. Стерилизация в автоклаве, Семена па- 5 житника сорта Нахичеванская шамбала стерилизуют концентрированной серной кислотой в течение 4-х минут, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через

двое суток проращивания в асептических условиях раскладывают в цилиндры по 2 проростка, Опыты ставят в 10-ти кратной повторное™. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом гороховом агаре в пробирках в течение 3-х суток при 28°С и смывают стерильным раствором микроэлементов по 1 мл.

Через двое суток после посева семян в каждый цилиндр с растениями вносят по 10 мл инокулюма, имеющего концентрацию 107 клеток в 1-мл. Растения выращивают в фитотроне при 22-24°С до стадии цветения (45 суток).

Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерново-подзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова; но без азота, г/кг почвы: KCI - 0,15; MgSO - 0,06; СаНР04-0,172; .ООЗ; борная кислота - 0,003; (ЫНфМоСМ - 0,001. Повтор- ность опыта 4-х кратная. Используется районированный сорт пажитника Нахиче- ванская шамбала. Для инокуляции семян пажитника чистую культуру бактерий выращивают на скошенном гороховом агаре указанного выше состава в течение 3-х суток. Культуру в пробирках с титром 3-5 млрд смывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена пажитника, разложенные в лунки, сделанные в почве каждого сосуда. В сосуд вносят 10 клеток.

Полевые опыты проводят в районах, рекомендованных для возделывания пажитника, на почвах, типичных для этих районов. Используется агротехника выращивания пажитника, принятая в каждом конкретном районе. Доза препарата 200 г на гектарную норму семян. В опытах используется районированный сорт пажитника Нахичеван- ская шамбала либо сортообразец из коллекции ВИЛР. Повторность опытов 4-х кратная. В полевых опытах семена пажитника обрабатывают торфяным препаратом ризоторфином, изготовленным на опытных штаммах.

Способ внесения препарата: 200 г ри- зоторфина разводят в 1 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают до равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву. Площадь опытных делянок 2-10 м2.

Примеры конкретного использования штамма.

Эффективность симбиотической азот- фиксации у штамма 2502 в сравнении с известными штаммами 425а и 282 определена . в вегетационных и полевых опытах по величине урожая сухой зеленой массы и зерна пажитника и накоплению в них азота или белка.

Пример 1. Данные, полученные в 5 стерильном вегетационном опыте, поставленном по описанной выше методике, приведены в табл.1.

Из табл.1 видно, что симбиоз клубеньковых бактерий донника штамма 282 с па0 житником был неэффективным, образованные ими мелкие, белые клубеньки не снабжали растения дополнительным азотом, в результате чего продуктивность пажитника в этом варианте не увеличивалась,

5 Наиболее эффективным симбионтом пажитника являются бактерии штамма 2502, при инокуляции которыми урожай зеленой массы растений был на 59% выше, чем при использовании штамма 425а.

0П р и м е р 2. Аналогичные результаты, полученные в вегетационном опыте, также поставленном по описанной выше методике, приведены в табл.2.

Данные табл.2 подтверждают, что клу5 беньковые бактерии тригонеллы штамма 2502 обеспечивают наиболее высокую эффективность азотфиксации в симбиозе с пажитником, в результате чего урожай зеленой массы растзний, иьокулированных

0 этим штаммом, на 44,4% выше, чем у растений, бактеризованных штаммом 425з. Со- -держание общего азота у растений, инокулированных штаммом 2502, также выше. В итоге общее накопление азота расте5 ниями этого варианта более чем в 2 раза выше, чем при использовании штамма 425а. Продуктивность пажитника, бактеризованного штаммом 282, была на уровне неи- нокулированных растений.

0 Приведенные материалы свидетельствуют о достаточно высоком уровне специфичности пажитника к г икросимбионтам из вида R.meliloti. Наиболее эффективный симбиоз выявлен при инокуляции пажитника

5 штаммом 2502, выделенным из клубеньков этого жэ вида бобовых растений. Значительно меньшая продуктивность наблюдается у растений, инокулированных штаммом 425а, выделенного из клубеньков люцерны; сим0 биоз пажитника со штаммом 282, выделенным из клубеньков донника, неэффективен. Ввиду этого в дальнейшие опыты штамм 282 . не включался.

Пример 3. Эффективность штамма

5 2502 определена в полевых опытах по конкурсному испытанию штаммов клубеньковых бактерий в научных учреждениях Географической сети опытов с азотфиксиру- ющими микроорганизмами в 1983-1988 г.г. . Примеры конкретных полевых опытов, где

сравнивается штамм 2502 с известным штаммом 425а, приведены в табл.3.

Как показывают данные табл.3, штамм 2502 обеспечивает высокую прибавку урожая зерна и зеленой массы пажитника, а штамм-прототип 425а в этих условиях неэффективен.

Сводные материалы по результатам испытаний эффективности штамма 2502 в сравнении с известным штаммом 425а в полевых опытах представлены; в табл.4.

Данные табл.4 показывают, что предлагаемый штамм 2502 отличается от из.вестно- го штамма 425а более высокой и стабильной эффективностью. Средняя прибавка урожая зерна и зеленой массы пажитника от инокуляции предлагаемым infaMMOM составляет 5,1 ц/га и 21,7 ц/га соответственно, что на 4,3 ц/га (53,4%) и 15,9 ц/га (45,1%) соответственно превышает урожай, полученный при использовании штамма 425 а, который лишь в одном из шести опытов (№ 5) обеспечил достоверное повышение урожая.

Высокая эффективность- симбиоза пажитника с бактериями штамма 2502 обеспечивает также улучшение качества урожая за счет более интенсивного накопления в нем белка, содержание которого в зеленой массе растений в этом варианте на 4,19% и в зерне на 5,06% выше, чем при применении штамма 425а (табл. № 5).

Пример 4. Клубеньковые бактерии тригонеллы штамма 2502 обладают хорошей технологичностью и по основным технологическим параметрам не уступают бактериям штамма 425а, т.е. интенсивно размножаются на жидких регламентных средах, дают высокие титры в торфяном препарате (ризоторфине). Об этом свидетельствуют данные табл.б.

Технология приготовления препарата на основе штамма R.meliloti 2502.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или 5-ти литровых бутылях в течение 2-х суток на среде следующего состава (мае. %): гороховый отвар- 10,0; сахар (пищевой) - 1,0; (МНфЗСМ - 0,05; КН2Р04 - 0,05; К2НРСМхЗН20 - 0,05; MgS04x7H20 - 0,02; СаСОз - 0,1; вода водопроводная - до 100,0; рН после стерилизации (0,1 ати, 30 мин) 6,8-7,0. Титр клеток 8-11 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в 5-ти литровых бутылях или фер- ментаторах на среде следующего состава (мас.%): кукурузный экстракт - 1,0; меласса - 2,0; (Ni-M)2SCM - 0,1; KbtePCM - 0,025; К2НР04хЗН20 - 0,025; Мд5Смх7Н20 - 0,02; СаСОз-0,1; вода водопроводная -до . рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встряхивают на качалке в течение 40-48 часов. В ферментаторах бактерии выращивают 18-36 часов при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм при температуре 28-30°С. Титр 6-9 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов - инокулюм - используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа.

Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культу- ральная жидкость + меласса (6%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,3-0,5 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты при температуре 15-20°С 3-5 суток.

Ризоторфин хранят при температуре 3- 8°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов,

Характеристика готового продукта. Ризоторфин на предлагаемом штамме

представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, не растворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 3-6 млрд клубеньковых

бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 месяцев со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян. Таким образом, проведенные исследования показали, что предлагаемый штамм

2502 является высокоэффективным микросимбионтом пажитника, стабильно повы- шает урожай зеленой массы в среднем на 21,7 ц/га или на 60,9%, и зерна на 5,1 ц/га (64,5%), что на 15,9 ц/га (45,1%) и 4,3 ц/га

(53,4%) соответственно превышает-прибав- ку урожая от штамма 425а. При использовании для инокуляции, штамма 2502 содержание белка в зеленой массе расте- ний увеличивается на 5,12% и в зерне на

5,56%, что на4,19% и5,06% соответственно выше, чем от известного штамма. Штамм 2502 обладает хорошими технологическими свойствами.

По решению Межведомственной комиссии Географической сети опытов по селекции азотфиксирующих микроорганизмов от 16 января 1990 г штамм R.meliloti 2502 рекомендован для использования в промышленное™ при выпуске нитрагине под пажитник.

Формула изобретения Штамм бактерий Rhizobium melilotl ВНИИСХМ № 2502 - для производства удобрений под пажитник.

Использование: микробиологическая промышленность, производство микробиологических средств повышения урожайности бобовых культур. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhizobium meiiloti выделен из клубеньков пажитника, депонирован в коллекции ВНИИСХМ под № 2502. При культивировании штамма на жидкой среде, содержащей гороховый отвар, сахар, сернокислый аммоний, однозамещенный и двузамещенный фосфорнокислым калий, сернокислый аммоний, сернокислый магний, углекислый кальций, в течение 18-36 ч при аэрации получают культуральнуго жидкость с титром 6-9 млрд/мл. Полученную культуральную жидкость вводят в герметично закрытый торф из расчета 0,3-0,5 млрд/г, культуру подращивают, выдерживая инокулированный торф при 15-20°С в течение 3-5 сут, полученный таким образом препарат повышает урожай зеленой массы пажитника в среднем на 21,7 ц/га или на 60,9%, зерна на 5,1 ц/га (64,5%) по сравнению с известным штаммом 425 а. 6 табл. пзц

Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 282, 425а и 2502

в симбиозе с пажитником

Примечание . Р - 4,8%; HCPos - 8,8 мг/сосуд

Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 282, 425а и 2502 в симбиозе с пажитником в вегетационном опыте

Примечание.- 3,9%;НСРо5 - 0,3 г/сосуд

Таблица 1

Таблица 2

ТаблицаЗ

Условия проведения полевых опытов/й эффективность штаммов клубеньковых бактерий

Rhlzoblum melllotl 425a и 2502

Показатели

удоб

а

1984 200 г с титром 4

Дерново-подзолистая

хорошо окультуренная

Сортообразец ВИЛР

4

10

РбоКеО

без орошения зерно

7,6

0,9

5,3

4,4

Эффективность нового штамма клубеньковых бактерий тригонеллы 2502 и втамма прототипа 425а в полевых опытах с памитником

Учреждение, где проведен опыт

Тимирязевская СХА

Нахичеванская КЗОС

1984 200 г с титром 4-6 млрд/г

ерново-подзолистая

1987 Серо-коричневая

ахичеванская шамбала 4 2

РэоКдо

Ъ орошением

зеленая масса

20,8 6,5 9,2

Таблица

Влияние штаммов Rhizobium meliloti 425a и 2502 на содержание белка в урожае

(полевые опыты)

Таблица 6 Сравнительная технологическая характеристика штаммов R.meliloti 425a и 2502

Таблица 5