АНТИ-IL1RAP АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЛЮДЕЙ Российский патент 2016 года по МПК C07K16/28 A61K45/00 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящеееизобретение относится к агентам для применения при лечении и диагностике солидных опухолей, таких как рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, меланомы, рак мочевого пузыря, рак мозга/ЦНС, рак шейки матки, рак пищевода, рак желудка, рак головы/шеи, рак почки, рак печени, лимфомы, рак яичника, рак поджелудочной железы и саркомы.

Предшествующий уровень техники

Устойчивость к лекарственным препаратам является основным фактором, который ограничивает эффективность химиотерапии солидных опухолей. Такие опухоли могут быть устойчивы по своей природе до химиотерапии, или устойчивость может быть приобретена в ходе лечения опухолей, изначально чувствительных к химиотерапии.

К тому же, в процессе приобретения устойчивости опухоль может стать перекрестно-устойчивой к диапазону химиотерапии, что приводит к устойчивости, которая, в конце концов, приводит к неэффективности лечения больше чем у 90% пациентов с метастатическим заболеванием.

Соответственно, настоящее изобретение направлено на создание новых агентов и способов для применения при лечении и диагностике солидных опухолей.

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретения предлагается агент, содержащий или состоящий из связывающей составляющей со специфичностью к акцессорному белку рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP) для применения при индукции клеточной смерти (либо напрямую, либо косвенно через переключение иммунной системы) и/или при ингибировании роста (т.е. размера), и/или пролиферации (т.е. числа) клеток, ассоциированных с солидной опухолью, где клетки экспрессируют IL1RAP. Таким образом, в изобретении предлагаются агенты для применения при лечении или профилактике солидной опухоли у пациента.

Во втором, связанном аспекте изобретения предлагается агент, содержащий или состоящий из связывающей составляющей со специфичностью к акцессорному белку рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP) для применения при детекции клеток, ассоциированных с солидной опухолью, где клетки экспрессируют IL1RAP.

Под «акцессорным белком рецептора интерлейкина-1», «IL1RAP» и «IL1-RAP» мы, в частности, понимает человеческий белок IL1RAP, например, описанный под учетным номером GenBank AAB84059, эталонной последовательностью NCBI: NP_002173.1 и учетным номером UniProtKB/Swiss-Prot Q9NPH3-1 (см. также Huang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(24), 12829-12832). IL1RAP также известен в научной литературе как IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1RAcP и EG3556.

Под «связывающей составляющей» мы понимаем все типы химического структурного элемента (например, олигонуклеотиды, полинуклеотид, полипептиды, пептидомиметики и низкомолекулярные соединения), которые способны связывать IL1RAP. Предпочтительно, если связывающая составляющая способна связывать IL1RAP в физиологических условиях селективно (т.е. преимущественно). Связывающая составляющая предпочтительно обладает специфичностью к человеческому IL1RAP, который может быть локализован на поверхности клетки (например, клетки солидной опухоли).

Под «клетками, ассоциированными с солидной опухолью» мы понимаем клетки солидной опухоли per se. Кроме того, такие клетки включают патологические стволовые клетки (т.е. злокачественные стволовые клетки или ЗСК) и клетки-предшественники, которые ответственны (прямо или косвенно) за развитие солидной опухоли у индивидуума. Примеры ЗСК описаны в Visvader & Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8:755-768.

В одном воплощении первого аспекта изобретения солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком. Например, солидная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из злокачественных опухолей предстательной железы, молочной железы, кожи, толстой кишки, легкого, органов мочевой системы и матки. В другом воплощении солидная опухоль может быть выбрана из групп, состоящих из рака предстательной железы, меланом, рака шейки матки, рака пищевода и рака головы и/или шеи.

В дополнительном воплощении первого аспекта изобретения, солидной опухолью является меланома.

В отношении диагностических аспектов изобретения, достаточно, чтобы агент всего лишь был способен связывать IL1RAP, присутствующий на поверхности клеток, ассоциированных с солидной опухолью (без оказания какого-либо функционального воздействия на эти клетки).

В отношении терапевтического и профилактического аспектов изобретения, специалистам в данной области следует понимать, что связывание агента с IL1RAP, присутствующим на поверхности клеток, ассоциированных с солидной опухолью, может привести к модуляции (т.е. увеличению или уменьшению) биологической активности IL1RAP. Однако такой модулирующий эффект не является существенным; например, агенты изобретения могут проявлять терапевтический и профилактический эффект просто посредством связывания с IL1RAP на поверхности клеток, ассоциированных с солидной опухолью, что, в свою очередь, может переключать иммунную систему на индукцию клеточной смерти (например, с помощью ADCC и/или из-за наличия в агенте цитотоксической/радиоактивной составляющей).

Под «биологической активностью IL1RAP» мы понимает любое взаимодействие или сигнальное событие, в которое вовлечен IL1RAP в клетках, ассоциированных с солидной опухолью. Например, в одном воплощении агент способен блокировать связывание одного или нескольких корецепторов с IL1RAP (таких как IL1R1, ST2, C-KIT и/или IL1RL2).

Такое ингибирование биологической активности IL1RAP агентом изобретения может быть полным или частичным. Например, агент может ингибировать биологическую активность IL1RAP, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% или 90%, и наиболее предпочтительно на 100% по сравнению с биологической активностью IL1RAP в клетках, ассоциированных с солидной опухолью, которая не была подвергнута действию агента. В предпочтительном воплощении, агент способен ингибировать биологическую активность IL1RAP на 50% или больше по сравнению с биологической активностью IL1RAP в клетках, ассоциированных с солидной опухолью, которая не была подвергнута действию агента.

Подобным образом, следует иметь в виду, что ингибирование роста и/или пролиферации клеток, ассоциированных с солидной опухолью, может быть полным или частичным. Например, агент может ингибировать рост и/или пролиферацию клеток, ассоциированных с солидной опухолью, например, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% или 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 100% по сравнению с ростом и/или пролиферацией клеток, ассоциированных с солидной опухолью, которые не были подвергнуты действию агента.

В дополнительном предпочтительно воплощении агент приводит к уничтожению клеток, ассоциированных с солидной опухолью. В частности, агент может приводить к клеточной смерти путем апоптоза или аутофагии. Например, агент может индуцировать апоптоз антителозависимой клеточной опосредованной цитотоксичностью (ADCC).

Как указано выше, агенты изобретения могут включать или состоять из любого подходящего химического структурного элемента, представляющего собой связывающую составляющую со специфичностью к IL1RAP.

Способы детектирующих взаимодействий между тестируемым химическим структурным элементом и IL1RAP хорошо известно в данной области. Например, могут быть использованы способы ультрафильтрации с ионораспыляющей масс-спектрометрией/ВЭЖХ, или другие физические и аналититические способы. Кроме того, могут быть использованы способы резонансного переноса энергии флуоресценции, в котором связывание двух флуоресцентно меченных структурных элементов может быть измерено измерением взаимодействия флуоресцентных меток, когда они находятся в непосредственной близости друг от друга.

Альтернативные способы обнаружения связывания IL1RAP с макромолекулами, например, ДНК, РНК, белками и фосфолипидами, включают поверхностный плазменный резонанс, например, как описано в Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348. Такие способы могут использовать полипептид, меченный, например, радиоактивной или флуоресцентной меткой.

Дополнительным способом идентификации химического структурного элемента, который способен связывать IL1RAP, является способ, в котором белок экспонируется соединению, и любое связывание соединения с указанным белком детектируется и/или измеряется. Константа связывания для связывания соединения с полипептидом может быть определена. Подходящие способы для детекции и/или измерения (количественной оценки) связывания соединения с полипептидом хорошо известны специалистам в данной области и могут быть осуществлены, например, с помощью способа, позволяющего осуществить высокопроизводительные операции, например, способа на основе чипов. Новая технология, названная «VLSIPS™», позволяет произвести очень маленькие чипы, которые содержат сотни тысяч или больше различных молекулярных зондов. Эти биологические чипы имеют зонды, расположенные в виде матрицы, в которой каждый зонд установлен в заданном месте. Были получены биологические чипы, в которых каждое место размещения имеет масштаб, например, десять микрон. Чипы могут быть использованы для определения того, могут ли молекулы-мишени взаимодействовать с любым из зондов на чипе. После экспонирования матрицы молекулами-мишенями в селективных тестовых условиях, сканирующие устройства могут проверить каждое место размещения в матрице и определить, имело ли место взаимодействие молекулы-мишени с зондом в заданном месте.

Другим способом идентификации соединений со связывающей аффинностью по отношению к IL1RAP является дрожжевая дигибридная система, в которой полипептиды изобретения могут быть использованы для «захвата» белков, которые связывают IL1RAP. Дрожжевая дигибридная система описана в Fields & Song, Nature 340:245-246 (1989).

В одном предпочтительном воплощении, агент содержит или состоит из полипептида.

Например, агент может содержать или состоять из антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента со связывающей специфичностью к IL1RAP, или варианта, химеры, или производного указанного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, или химеры его указанного варианта или производного, которые сохраняют связывающую специфичность к IL1RAP.

Под «антителом» мы понимает фактически интактные молекулы антитела, а также химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела (где, по меньшей мере, одна аминокислота мутирована относительно естественных человеческих антител), одноцепочечных антител, биспецифичных антител, антительных тяжелых цепей, антительных легких цепей, гомодимеров и гетеродимеров антительных тяжелых и/или легких цепей, и антигенсвязывающих фрагментов и производных этого же.

Под «антигенсвязывающим фрагментом» мы понимаем функциональный фрагмент антитела, который способен связывать IL1RAP.

Предпочтительно, если антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из Fv-фрагментов (например, одноцепочечных Fv, дисульфид-связанных Fv и доменных антител) и Fab-подобных фрагментов (например, Fab-фрагментов, Fab′-фрагментов и F(ab)₂-фрагментов), одиночных вариабельных доменов (например, доменов V_H и V_L) и доменных антител (dAb, в том числе в одиночном и двойном формате [например, dAb-линкер-dAb]).

Преимуществ использования антительных фрагментов, а не целых антител, несколько. Меньший размер фрагментов может привести к улучшенным фармакологическим свойствам, таким как улучшенное проникновение в плотную ткань. Более того, антигенсвязывающие фрагменты, такие как антительные фрагменты Fab, Fv, ScFv и dAb, могут быть экспрессированы в Е. coli и секретированы из них, что, таким образом, позволяет осуществить не требующее усилий производство больших количеств указанных фрагментов.

Также в рамки изобретения включены модифицированные версии антител и их антигенсвязывающих фрагментов, например, модифицированных ковалентным присоединением полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера (см. ниже).

Способ получения антител и антительных фрагментов хорошо известны в данной области. Например, антитела могут быть получены через любой из числа нескольких способов, в которых используется индукция in vivo выработки молекул антител, скрининнг иммуноглобулиновых библиотек (Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) или получение молекул моноклональных антител с помощью клеточных линий в культуре. Они включают, без ограничения перечисленным метод гибридом, метод гибридом с человеческими В-клетками, и метод гибридом с вирусом Эпштейна-Барр (EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).

Подходящие моноклональные антитела к выбранным антигенам могут быть получены известными методами, например, теми, что описаны в «Monoclonal Antibodies: A manual of techniques)), H Zola (CRC Press, 1988) и в «Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications», J G R Hurrell (CRC Press, 1982).

Антительные фрагменты также могут быть получены способами, хорошо известными в данной области (см., например, Harlow & Lane, 1988, «Antibodies: A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Например, антительные фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены протеолитическим гидролизом антитела или экспрессией в Е. coli или в клетках млекопитающих (например, в культуре клеток яичника китайского хомяка или в других экспрессирующих белок системах) кодирующего фрагмента ДНК. В ином случае, антительные фрагменты могут быть получены гидролизом пепсином или папаином целых антител обычным образом.

Специалистам следует иметь в виду, что для терапии или диагностики людей, человеческие или гуманизированные антитела являются предпочтительными. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител являются генетически сконструированными химерными антителами или антительными фрагментами, предпочтительно обладающими минимальными частями, полученными из нечеловеческих антител. Гуманизированные антитела включают антитела, в которых гипервариабельные участки человеческого антитела (реципиентного антитела) замещены остатками из гипервариабельного участка нечеловеческих видов (донорного антитела), таких как мышь, крыса или кролик, обладающего искомой функциональностью. В некоторых случаях остатка Fv-каркаса человеческого антитела замещены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, которые не обнаруживаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях гипервариабельного участка или каркаса. В общем, гуманизированное антитело будет содержать фактически все, по меньшей мере, из одного, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или фактически все гипервариабельные участки, соответствовали участкам нечеловеческого антитела и все, или практически все каркасные участки соответствуют участкам, релевантным человеческой консенсусной последовательности. Гуманизированные антитела необязательно также включают, по меньшей мере, часть антительного константного участка, такого как Fc-участок, как правило, полученного из человеческого антитела (см., например, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596).

Способы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны в данной области. В целом, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называются импортированными остатками, и, как правило, заимствуются из импортируемого вариабельного домена. Гуманизация может быть в принципе осуществлена как описано (см., например, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-15361; US 4,816,567) заменой человеческих гипервариабельных участков на соответствующие гипервариабельные участки грызунов. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами, в которых по существу меньше чем человеческий интактный домен был заменен соответствующей последовательностью из вида, не являющегося человеком. На практике это означает, что гуманизированные антитела, как правило, могут быть человеческими антителами, в которых некоторые остатки гипервариабельных участков и, возможно, некоторые остатки каркаса заменены на остатки из аналогичных участков антител грызунов.

Человеческие антитела также могут быть идентифицированы с помощью различных техник, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея (см., например, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp.77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95).

Если подходящие антитела получены, их можно протестировать на активность, например, с помощью тИФА.

В альтернативном воплощении первого аспекта изобретения, агент содержит или состоит из неиммуноглобулиновой связывающей составляющей, например, описанной Skerra, Curr Opin Biotechnol. 2007 Aug;18(4):295-304.

В дополнительном альтернативном воплощении агент содержит или состоит из аптамера. Например, агент может содержать или состоять из пептидного аптамера или нуклеотидного аптамера (см. Hoppe-Seyler & Butz, 2000, J Mol Med. 78(8):426-30; Bunka DH & Stockley PG, 2006, Nat Rev Microbiol. 4(8):588-96 and Drabovich et al., 2006, Anal Chem. 78(9): 3171-8).

В еще одном дополнительном альтернативном воплощении, агент содержит или состоит из низкомолекулярной химической единицы. Такие единицы с IL1RAP-связывающими свойствами могут быть идентифицированы скринингом коммерческих библиотек малых соединений (например, таких, которые можно приобрести у «ChemBridge Corporation», Сан-Диего, США).

В дополнение к связывающей составляющей, агенты изобретения могут дополнительно содержать составляющую для увеличения периода полужизни агента in vivo, например, без ограничения перечисленным, полиэтиленгликоль, человеческий сывороточный альбумин, группы гликозилирования, жирные кислоты и декстран. Такие дополнительные составляющие могут быть конъюгированы или, в ином случае, объединены со связывающей составляющей с помощью способов, хорошо известных в данной области.

Аналогично, следует иметь в виду, что агенты изобретения могут дополнительно содержать цитотоксичную составляющую.

Например, цитотоксичная составляющая может содержать или состоять из радиоизотопа, такого как астат-211, висмут-212, висмут-213, йод-131, итрий-90, лютеций-177, самарий-153 и палладий-109.

В ином случае цитотоксическая составляющая может содержать или состоять из токсина (такого как сапонин или калихеамицин).

В еще одном случае цитотоксичная составляющая может содержать или состоять из химиотерапевтического агента (такого как антиметаболит).

Подобным образом, следует иметь в виду, что агенты изобретения могут дополнительно содержать детектируемую составляющую.

Например, детектируемая составляющая может содержать или состоять из радиоизотопа, такого как технеций-99 м; индий-111; галлий-67; галлий-68; мышьяк-72; цирконий-89; йод-12 или таллий-201.

В ином случае детектируемая составляющая содержит или состоит из парамагнитного изотопа, такого как гадолиний-157, марганец-55; диспрозий-162; хром-52 или железо-56.

Цитотокичная и детектируемая составляющие могут быть конъюгированы или в ином случае объединены со связывающей составляющей с помощью способов, хорошо известных в данной области (например, существующая иммуноконъюгатная терапия, гемтузумаб озогамицин [торговое название: «Mylotarg®»], содержит моноклональное антитело, соединенное с цитотоксином калихеамицином).

В третьем аспекте изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество агента, определенного относительно первого или второго аспектов изобретения, вместе с фармацевтически приемлемым буфером, разбавителем, носителем, адъювантом или наполнителем.

Также в композиции могут быть включены дополнительные соединения, включая хелатирующие агенты, такие как EDTA, цитрат, EGTA или глутатион.

Фармацевтические композиции могут быть получены известным в данной области образом, т.е. в достаточной степени стабильными при хранении и подходящими для введения людям и животным. Например, фармацевтические композиции могут быть лиофилизированы, например, с помощью лиофильной сушки, распылительной сушки, охлаждения распылением или получением частиц из сверхкритического флюида.

Под «фармацевтически приемлемым» мы понимаем нетоксичный материал, который не уменьшает эффективность IL1RAP-связывающей активности агента изобретения. Такие фармацевтически приемлемые буферы, носители или вспомогательные вещества хорошо известны в данной области (см. Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), описание которых включено в данный документ ссылкой).

Термин «буфер» предназначен для обозначения водного раствора, содержащего кислотно-щелочную смесь для стабилизации рН. Примерами буферов являются Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, фосфат, карбонат, ацетат, цитрат, гликолят, лактат, борат, ACES, ADA, тартрат, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, какодилат, CHES, DIPSO, EPPS, эатноламин, глицин, HEPPSO, имидазол, имидазол молочная кислота, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO и TES.

Термин «разбавитель» предназначен для обозначения водного или неводного раствора для разведения агента в фармацевтическом препарате. Разбавитель может быть одним из числа солевого раствора, воды, полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, этанола или масел (таких как сафлоровое масло, кукурузное масло, ореховое масло, хлопковое масло или кунжутное масло).

Термин «адъювант» предназначен для обозначения любого соединения, добавляемого к составу для увеличения биологического эффекта агента изобретения. Адъювант может быть одним или несколькими из числа солей цинка, меди или серебра с различными анионами, например, без ограничения перечисленным, фторидом, хлоридом, бромидом, йодидом, тиоцинатом, сульфитом, гидроксидом, фосфатом, карбонатом, лактатом, гликолятом, цитратом, боратом, тартратом и ацетатами различных ацильных композиций. Адъювант также может быть катионными полимерами, такими как катионные простые эфиры целлюлозы, катионные сложные эфиры целлюлозы, деацетилированная гиалуроновая кислота, хитозан, катионные дендримеры, катионные синтетические полимеры, такие как поли(винилимидазол), и катионные полипептиды, такие как полигистидин, полилизин, полиаргинин и пептиды, содержащие эти аминокислоты.

Вспомогательное вещество может быть одним или несколькими из числа углеводов, полимеров, липидов и минеральных веществ. Примеры углеводов включают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннитол и циклодекстрины, которые добавляют к композиции, например, для облегчения лиофилизации. Примерами полимеров являются крахмал, простые эфиры целлюлозы, целлюлоза карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, карагенаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, полисульфонат, полиэтиленгликол/полиэтилен оксид, сополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза, и поливинилпирролидон, все различной молекулярной массы, которые добавляются к композиции, например, для контроля вязкости, для получения биоадгезии, или для защиты липидов от химической или протеолитической деградации. Примеры липидов и жирных кислот, фосфолипидов, моно-, ди- и триглицеридов, церамидов, сфинголипидов и гликолипидов с различной длиной ацильной цепи и с различной насыщенностью, яичный лецитин, соевый лецитин, гидрогенированный яичный и соевый лецитин, которые добавляют к композиции по причинам, схожим с причинами для полимеров. Примерами минеральных веществ являются тальк, оксид магния, оксид цинка и оксид титана, которые добавляют к композиции для получения полезных свойств, таких как снижение накопления жидкости или предпочтительные пигментные свойства.

Агенты изобретения могут быть составлены в виде фармацевтической композиции любого типа, известного в данной области как подходящие для их доставки.

В одном воплощении фармацевтические композиции изобретения могут быть в форме липосомы, в которой агент объединен, в дополнение к другим фармацевтически приемлемьм носителям, с амфипатическими агентами, такими как липиды, которые существуют в агрегированных формах, таких как мицеллы, нерастворимые монослои и жидкие кристаллы. Подходящие липиды для липосомного состава включают, без ограничения перечисленным, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и т.п. Подходящие липиды также включают вышеперечисленные липиды, модифицированные поли(этиленгликолем) в полярной головной группе для пролонгирования времени циркуляции в кровотоке. Препарат таких липосомных составов может быть обнаружен, например, в US 4235871, описание которой включено в данный документ ссылкой.

Фармацевтические композиции изобретения также могут быть в форме биодеградируемых микросфер. Алифатические полиэфиры, такие как поли(молочная кислота) (PLA), поли(гликолевая кислота) (PGA), кополимеры PLA и PGA (PLGA) или поли(капролктон) (PCL), и полиангидриды широко использовались в качестве биодеградируемых полимеров при производстве микросфер. Препараты таких микросфер могут быть обнаружены в US 5851451 и в ЕР 0213303, описание которых включено в данный документ ссылкой.

В дополнительном воплощении, фармацевтические композиции изобретения предлагаются в форме полимерных гелей, в которых полимеры, такие как крахмал, простые эфиры целлюлозы, целлюлоза карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, карагинаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, поливинилимидазол, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, кополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон используются для загущения раствора, содержащего агент. Полимеры также могут содержать желатин или коллаген.

В ином случае агенты могут быть просто растворены в солевом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле или маслах (таких как сафлоровое масло, кукурузное масло, ореховое масло, хлопковое масло или кунжутное масло).

Следует иметь в виду, что фармацевтические композиции изобретения могут включать ионы и иметь определенное значение рН для потенциирования действия активного агента. Кроме того, композиции могут быть подвергнуты обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация и/или могут содержать обычные адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, буферы, наполнители и т.п.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены подходящим путем, известным специалистам в данной области. Таким образом, возможные пути введения включают парэнтеральное (внутривенное, подкожное и внутримышечное), местное, глазное, носовое, легочное, щечное, пероральное, вагинальное и ректальное. Также возможно введение из имплантов.

В одном предпочтительном воплощении фармацевтические композиции вводят параэнтерально, например внутривенно, интрацеребровентрикулярно, внутрисуставно, внутриартериально, внутрибрюшинно, интратекально, интравентрикулярно, надчревно, инракранеально, внутримышечно или подкожно, или они могут быть введены методами инфузии. Фармацевтические композиции обычно используются в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, соли или глюкозу в количестве, достаточном для получения изотонического с кровью раствора. Водные растворы должны быть соответствующим образом забуферены (предпочтительно с рН от 3 до 9), в случае необходимости. Получение подходящих парентеральных составов в стерильных условиях легко осуществляется стандартными фармацевтическим методами, хорошо известными специалистам в данной области.

Составы, подходящие для парентерального введения включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворы, которые делают состав изотоничным с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Составы могут присутствовать в контейнерах для единичных доз или для множественных доз, например, в запаянных ампулах и флаконах, и могут храниться в сухом замороженном (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, сразу же перед использованием. Инъекционные растворы и суспензии, приготовляемые для немедленного приема, могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа.

Таким образом, фармацевтические композиции изобретения особенно подходят для парентерального, например, внутривенного, введения.

В ином случае, фармацевтические композиции могут быть введены интраназально или ингаляцией (например, в форме подачи аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея или небулайзера с применением подходящего пропеллента, такого как дихлородифторометан, трихлорофторометан, дихлоротетрафтороэтан или гидрофторалкан, такого как 1,1,1,2-тетрафуторэтан (HFA 134A3 или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан (HFA 227EA3), диоксид углерода или другой подходящий газ). В случае аэрозоля под давлением дозировочная единица может быть определена предоставлением клапана для доставки измененного количества. Контейнер под давлением, насос, спрей или небулайзер может содержать раствор или суспензию активного полипептида, например, с использованием смеси этанола и пропеллента в качестве растворителя, который может дополнительно содержать смазывающее вещество, например сорбитан триолеат. Капсулы и картриджи (сделанные, например, из желатина) для применения в ингаляторе или инсуфляторе могут быть составлены так, чтобы они содержали порошкообразную смесь соединения изобретения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Фармацевтические композиции будут вводиться пациенту в фармацевтически эффективной дозе. При использовании в данном документе «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» или «терапевтически эффективное» относятся к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект в данных условиях и режиме введения. Это заранее определенное количество активного материала рассчитанное так, чтобы продуцировать искомый терапевтический эффект вместе с требуемыми добавкой и растворителем, т.е. основы или носителя для введения. Кроме того, они предназначены для обозначения количества, достаточного для снижения и наиболее предпочтительно предотвращения, клинически значимого дефицита активности, функционировании и ответа реципиента. В ином случае, терапевтически эффективное количество является достаточным для того, чтобы вызвать улучшение клинически значимого состояния реципиента. Как известно специалистам в данной области, количество соединения может варьировать в зависимости от его конкретной активности. Подходящие дозируемые количества могут содержать количество активной композиции, рассчитанной для выработки искомого терапевтического эффекта совместно с требуемым разбавителем. В способе и применении для изготовления композиций изобретения предлагается терапевтически эффективное количество изобретения. Терапевтически эффективное количество может быть определено обычным медицинским или ветеринарным работником, на основании характеристик пациента, таких как возраст, масса, пол, состояние, осложнения, другие заболевания и т.п., хорошо известных в данной области. Введение фармацевтически эффективной дозы может быть проведено как одиночным введением в форме индивидуальной однократной дозы или же более мелкими однократными дозами, а также множественными введениями дробных доз со специфическими интервалами. В ином случае, доза может быть представлена в виде непрерывной инфузии в течение длительного периода времени.

Полипептиды могут быть представлены в различных концентрациях, в зависимости от эффективности/токсичности используемого соединения. Предпочтительно, состав содержит активный агент в концентрации от 0,1 мкМ до 1 мМ, более предпочтительно от 1 мкМ до 500 мкМ, от 500 мкМ до 1 мМ, от 300 мкМ до 700 мкМ, от 1 мкМ до 100 мкМ, от 100 мкМ до 200 мкМ, от 200 мкМ до 300 мкМ, от 300 мкМ до 400 мкМ, от 400 мкМ до 500 мкМ и наиболее предпочтительно около 500 мкМ.

Специалистам в данной области следует иметь в виду, что фармацевтические композиции изобретения могут быть введены отдельно или в комбинации с другими терапевтическими агентами, используемыми при лечении солидных опухолей, такие как антиметатоболиты, алкилирующие агенты, антрациклины и другие цитотоксические антибиотики, алколоиды барвинка, этопозид, соединения платины, таксаны, ингибиторы топоизомеразы I, антипролиферативные иммуносупрессанты, кортикостероиды, половые гормоны и антагонисты гормонов и другие терапевтические антитела (такие как трастузумаб).

В четвертом аспекте изобретения предлагается набор, содержащий агент, определенный относительно первого или второго аспектов изобретения, или фармацевтическую композицию по третьему аспекту изобретения.

В пятом аспекте изобретения предлагается применение агента, определенного относительно первого или второго аспектов изобретения, в препарате лекарственного средства для индукции клеточной смерти и/или роста и/или пролиферации клеток, ассоциированных с солидной опухолью, где клетки экспрессируют IL1RAP.

В связанном шестом аспекте изобретения предлагается применение агента, определенного относительно первого или второго аспектов изобретения, в препарате диагностического агента для детекции клеток, ассоциированных с солидной опухолью, где клетки экспрессируют IL1RAP. Таким образом, лекарственное средство для применения при лечении или предотвращении солидной опухоли у пациента.

В связанном седьмом аспекте изобретения предлагается применение агента, определенного относительно первого или второго аспектов изобретения для детекции клеток, ассоциированных с солидной опухолью, где клетки экспрессируют IL1RAP.

В одном воплощении вышеуказанных аспектов изобретения на применение, солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком. Например, солидная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из злокачественных опухолей предстательной железы, молочной железы, кожи, толстой кишки, легкого, органов мочевой системы и матки. В другом воплощении солидная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, меланом, рака шейки матки, рака пищевода и рака головы и/или шеи.

В дополнительном воплощении первого аспекта изобретения, солидной опухолью является меланома.

В восьмом аспекте изобретения предлагается способ индукции клеточной смерти, и/или ингибирования роста, и/или пролиферации клеток, ассоциированных с солидной опухолью в индивидууме, включающий стадию введения индивидууму эффективного количества агента, определенного относительно первого или второго аспектов изобретения, или фармацевтической композиции по третьему аспекту изобретения, где клетки экспрессируют IL1RAP.

Таким образом, в изобретении предлагается способ лечения солидных опухолей. Под «лечением» мы понимаем как терапевтическое, так и профилактическое лечение пациента. Термин «профилактический» используется для охвата применения полипептида или состава, описанного в данном документе, которое либо предотвращает, либо снижает вероятность образования солидной опухоли у пациента или объекта.

В девятом аспекте изобретения предлагается способ детекции клеток, ассоциированных с солидной опухолью у индивидуума, включающий стадию введения индивидууму эффективного количества агента, определенного относительно первого или второго аспектов изобретения, или фармацевтической композиции по третьему аспекту изобретения, где клетки экспрессируют IL1RAP.

В одном воплощении вышеуказанных аспектов изобретения на способ, солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/ шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком. Например, солидная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из злокачественных опухолей предстательной железы, молочной железы, кожи, толстой кишки, легкого, органов мочевой системы и матки. В другом воплощении солидная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, меланом, рака шейки матки, рака пищевода и рака головы и/или шеи.

В дополнительном воплощении первого аспекта изобретения, солидной опухолью является меланома.

Далее будут описаны предпочтительные, неограничивающие примеры, которые охватывают некоторые аспекты изобретения, со ссылкой на следующие чертежи.

Фигура 1. Экспрессия Р210 BCR/ABL1 индуцирует экспрессию IL1RAP в CD34⁺ клетках пуповинной крови.

Проточный цитометрический анализ подтверждает, что экспрессия IL1RAP, индуцируется в ходе ретровирусной экспрессии Р210 BCR/ABL1 в CD34⁺ клетках пуповинной крови, три дня после трансдукции. CD34⁺GFP⁺ клетки гейтированы согласно гейтам в точечной диаграмме. На гистограмме представлена экспрессия IL1RAP для отрицательного контроля (белый), MIG контроля (светло-серый) и MIG-P210 (темно-серый). Числа на точечных диаграммах обозначают процент клеток в пределах индивидуальных гейтов/квадрантов. Представлен репрезентативный эксперимент из трех.

Фигура 2. IL1RAP положительно регулирован в примитивных клетках ХМЛ.

FACS-анализ на CD34⁺ клетках из пяти пациентов с ХМЛ и на 2 нормальных образцах костного мозга. Точечная диаграмма FACS, демонстрирующая гейтинг для CD34⁺CD38⁺ или CD34⁺CD38⁺ клеток в репрезентативном пациенте с ХМЛ (А). Гистограмма, демонстрирующая экспрессию IL1RAP в CD34⁺CD38⁺ клетках (В). Гистограмма, демонстрирующая экспрессию IL1RAP в CD34⁺CD38⁺ клетках (С). Белым обозначены образцы, окрашенные контролем, а серым обозначены образцы, окрашенные по IL1RAP. На гистограммах обведены сортировочные гейты для CD34⁺CD38^-IL1RAP^- и CD34⁺CD38⁺IL1RAP⁺ клеток. Числа на точечной диаграмме и гистограммах демонстрируют процент клеток в пределах индивидуальных гейтов/квадрантов.

Фигура 3. Экспрессия IL1RAP позволяет отличить Ph⁺ от Ph^- ХМЛ-клеток в пределах CD34⁺CD38^- клеточного компартмента.

Flow-drop-FISH на CD34⁺CD38^-IL1RAP^- и CD34⁺38^-IL1RAP⁺ клетках ХМЛ из 5 образцов пациентов с ХМЛ выявил почти полное разделение между BCR/ABL1^- и BCR/ABL⁺ клетками соответственно. Черные столбики представляют отрицательные по BCR/ABL1 клетки, а белые столбики представляют собой положительные по BCR/ABL1 клетки. Подчеркнутое в верхней части каждого столбика является количеством Ph⁺ положительных клеток в общем количестве подсчитанных ядер.

Фигура 4. Экспрессия IL1RAP позволяет отличить Ph⁺ стволовые клетки ХМЛ от нормальных ГСК.

Количество LTC-CFC, полученное из CD34⁺CD38^-IL1RAP^- и CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клеток (А). Черные столбики представляют IL1RAP^- клетки, а белые столбики представляют IL1RAP⁺ клетки. Интерфазная FISH на LTC-CFC (В). Черные столбики представляют отрицательные по BCR/ABL1 клетки, а белые столбики представляют собой положительные по BCR/ABL1 клетки. Выделенное вверху каждого столбика является количеством Ph⁺ клеток от общего количества подсчитанных ядер.

Фигура 5. Уничтожение клеточной линии ХМЛ с помощью антитела, нацеленного на IL1RAP.

Гистограмма, демонстрирующая экспрессию IL1RAP клетками KU812, полученными из пациента с ХМЛ, содержащей филадельфийскую хромосому, по сравнению с экспрессией клетками KG-1, утратившими филадельфийскую хромосому (А).

Белым обозначены контрольные окрашенные образцы, а серым - образцы, окрашенные КМТ-1. Лейкозная клеточная линия KG-1 лишена экспрессии IL1RAP, тогда как KU812 экспрессирует IL1RAP (В). Вследствие этого клеточную смерть, индуцируемую антителом на низком уровне, наблюдали в KG-1, тогда как дозозависимый эффект при использовании КМТ-1 наблюдали на клетках KU812 (В). В качестве контроля неспецифических эффектов ADCC в этих экспериментах использовали кроличьи IgG антитела. На диаграмме представлено среднее и стандартное отклонение для индуцированной антителом клеточной смерти из трех независимых экспериментов.

Фигура 6. Уничтожение стволовых клеток ХМЛ направленным воздействием антител на IL1RAP.

При использовании КМТ-1 нормальные CD34+CD38- клетки костного мозга окрашивались отрицательно по IL1RAP, тогда как CD34+CD38+ и CD34+CD38- ХМЛ клетки экспрессируют IL1RAP. Гистограммы по ХМЛ-1 показаны из репрезентативного эксперимента (А). Белым обозначены контрольные окрашенные образцы, а серым - образцы, окрашенные КМТ-1. В соответствии с уровнем экспрессии IL1RAP очевидного эффекта ADCC не наблюдалось при использовании CD34+CD38- клеток нормального костного мозга, при этом КМТ-1 индуцировали сильный дозозависимый эффект ADCC как в CD34+, так и в CD34+CD38- клетках ХМЛ (В). В качестве контроля для неспецифических эффектов ADCC в этих экспериментах использовали кроличьи IgG антитела. На диаграмме представлено среднее и стандартное отклонение для индуцированной антителом клеточной смерти из трех независимых экспериментов с использованием CML-1, CML-3, CML-4 и четырех образцов нормального костного мозга.

Фигура 7. IL1RAP также экспрессируется в первичных стволовых клетках ОЛЛ и ОМЛ.

Клетки острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) получали из пациентов при диагностике. Представлена экспрессия IL1RAP на CD34+CD38- и CD34+CD38+ клетках из репрезентативного пациента с ОМЛ (А). Клеточная линия ОМЛ, MONO-MAC-6 и клеточная линия ОЛЛ, REH, экспрессируют IL1RAP (В). Клетки острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) получали из пациентов при диагностике. Представлена экспрессия IL1RAP на CD34+CD38- и CD34+CD38+ клетках из репрезентативного пациента с Ph+ОЛЛ (С). Бельм обозначены контрольные окрашенные образцы, а серым - образцы, окрашенные по IL1RAP.

Фигура 8. Уничтожение клеточных линий ОМЛ и ОЛЛ антителами, нацеленными на IL1RAP.

В анализе ADCC дозозависимую от КМТ-1 клеточную смерть вызывали как в клеточной линии MONO-MAC-6, так и в клеточной REH, что позволяет предположить, что нацеленные на IL1RAP антитела могут иметь более широкое терапевтическое окно, чем просто ХМЛ. В качестве контроля неспецифических эффектов ADCC в этих экспериментах использовали кроличьи IgG антитела. На диаграмме представлено среднее и стандартное отклонение для индуцированной антителом клеточной смерти из трех независимых экспериментов.

Фигура 9. Уничтожение стволовых клеток ОМЛ и ОЛЛ антителом, нацеленным на IL1RAP.

В анализе ADCC индуцированную КМТ-1 клеточную смерть наблюдали как в первичных ОМЛ CD34+CD38- (А) клетках, так и в ОЛЛ CD34+CD38- (В), что подтверждает, что нацеленные на IL1RAP антитела также могут оказывать терапевтическое воздействие на ОМЛ и ОЛЛ с положительной регуляцией IL1RAP на поверхности их клеток. В качестве контроля для неспецифических эффектов ADCC в этих экспериментах использовали кроличьи IgG антитела. В диаграмме показана клеточная смерть, индуцированная специфическим антителом.

Фигура 10. IL1RAP экспрессируется на лейкозных стволовых клетках из пациентов с МПЗ и МДС.

Графики с изолиниями, демонстрирующие экспрессию IL1RAP на CD34+CD38- клетках двух пациентов с МПЗ (MPD-1 и MPD-2) с или без мутации в JAK2 (А). В гистограмме показана экспрессия IL1RAP в пациентах с МДС, прогрессирующей в ОМЛ (В). Белым обозначены контрольные окрашенные образцы, а серым - образцы, окрашенные анти-IL1RAP антителами.

Фигура 11. IL1RAP экспрессируется на поверхности злокачественных опухолевых клеток из солидных опухолей.

Различные клеточные линии, полученные из человеческих солидных опухолей, были окрашены против человеческого IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC (каталожный номер FAB676A, «R&D system») (черные линии) и изотипическим контролем (серые линии). Анализ проточной цитометрией продемонстрировал экспрессию IL1RAP на COLO829 (злокачественная меланома), НСС1954 (дуктальная карцинома молочной железы), NCI-8228 (аденокарцинома легкого), NCI-H716 (рак толстой кишки), OV-90 (аденокарцинома яичника), Н716 (рак толстой кишки), Н2228 (аденокарцинома легкого), SH-4 (меланома), SR (лимфома) и SW 1783 (астроцитома).

Фигура 12. IL1RAP экспрессируется на поверхности злокачественных опухолевых клеток из солидных опухолей.

Гистограмма анализа проточной цитометрией клеток из четырех различных человеческих злокачественных опухолевых линий, меченных мАТ 81.2, антителом против IL1RAP, демонстрирует экспрессию на Н716 (рак толстой кишки), Н2228 (аденокарцинома легкого), НСС1954 (дуктальная карцинома молочной железы) и SH-4 (меланома).

Фигура 13. Антитело, нацеленное на IL1RAP, побуждает человеческие NK-клетки к ADCC-воздействию на злокачественные опухолевые клетки человека.

На диаграммах показана степень специфической клеточной смерти, индуцированной антителом мАТ 81.2 против человеческого IL1RAP и человеческими NK-клетками в анализе ADCC. В качестве изотипического контроля в эксперименты было включено человеческое IgGI-антитело.

Фигура 14. Воздействие мАТ 81.2 на рост in vivo клеточной линии меланомы SK-MEL-5.

мАТ 81.2 вводили в концентрации 10 мг/кг массы тела внутрибрюшинно дважды в неделю. Контрольных мышей обрабатывали равными объемами PBS. В каждой экспериментальной группе было десять мышей. Результаты представлены как средний объем опухоли (мм³); планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего (SEM).

Пример 1

IL1RAP является биомаркером клеточной поверхности для стволовых клеток хронического миелоидного лейкоза.

Сущность

Терапевтические стратегии для хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), направленные на достижение стойкого выздоровления, потребуют полного уничтожения стволовых клеток ХМЛ. Стволовые клетки ХМЛ, разделяя с нормальными гематопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) способность к самообновлению, представляют собой малую популяцию лейкозных клеток, которые до сих поры были неотличимы от нормальных (ГСК) при использовании маркеров клеточной поверхности. Одна стратегия мечения стволовой клетки ХМЛ будет заключаться в идентификации биомаркера клеточной поверхности стволовых клеток ХМЛ, на который могут быть нацелены будущие терапевтические антитела. В данном исследовании с помощью глобальных анализов генной экспрессии мы идентифицировали IL1RAP как часто положительно регулированный в примитивных CD34+ клетках ХМЛ в результате эктотопической экспрессии BCR/ABL1. Мы дополнительно продемонстрировали, что экспрессия IL1RAP разделяет редкую популяцию CD34+CD38- клеток, несущую как ХМЛ, так и нормальные ГСК, на две фракции; одна из которых имеет низкую/отсутствующую экспрессию, а другая имеет более высокую экспрессию IL1RAP. После настройки протокола, позволяющего детектировать BCR/ABL1 с помощью FISH в небольшом количестве отсортированных клеток, мы обнаружили, что в CD34+CD38- клетках ХМЛ IL1RAP+клетки были BCR/ABL1+, тогда как IL1RAP- клетки были почти исключительно BCR/ABL1-. При дальнейшем проведении анализа клеток, инициирующих длительную культуру (англ. long-term culture initiating cell, LTC-IC) на двух клеточных популяциях мы обнаружили, что кандидатные стволовые клетки ХМЛ и нормальные ГСК могут быть разделены в соответствии с ожиданиями. В этом исследовании, таким образом, IL1RAP был идентифицирован как первый биомаркер клеточной поверхности, позволяющий отличить стволовые клетки ХМЛ от нормальных ГСК и были открыты новые возможности для терапевтических и диагностических стратегий при ХМЛ а также в схожих расстройствах, таких как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), миелопролиферативные заболевания (МПЗ) и миелодиспластический синдром (МДС).

Введение

Для идентификации биомаркера клеточной поверхности стволовых клеток ХМЛ мы провели глобальные анализы генной экспрессии и идентифицировали акцессорный белок рецептора интерлейкина 1 (IL1RAP) в качестве основного кандидата, положительно регулированного в клетках пациента с примитивным ХМЛ и в результате эктопической экспрессии Р210 BCR/ABL1. При разработке анализа для детекции BCR/ABL1 в малом количестве отсортированных клеток мы показали, что экспрессия IL1RAP позволяет в перспективе осуществить разделение примитивных лейкозных и нормальных клеток. С помощью анализов клеток, инициирующих длительную культуру, мы дополнительно продемонстрировали, что IL1RAP является биомаркером клеточной поверхности для стволовых клеток ХМЛ, что впервые позволит осуществить проспективное отделение стволовых клеток ХМЛ от нормальных ГСК.

Материалы и методы

Коллекция клеток пациентов с ХМЛ

Выделение и трансдукция CD34⁺ клеток пуповинной крови

Кровь и иногда образцы костного мозга от больных ХМЛ, были получены в момент постановки диагноза до начала лечения после информированного согласия в соответствии с протоколом, одобренным местным этическим комитетом. Образцы получили как из отделения гематологии госпиталя Лундского университета, так и из Ригсгоспиталя, Копенгаген, Дания. Мононуклеарные клетки (МНК) отделяли с помощью «Lymphopre™» («Axis-Shield PoC AS», Осло, Норвегия) согласно инструкциям производителя, a CD34 клетки обогащали с помощью набора для выделения CD34⁺ клеток («Miltenyi Biotech», Бергиш-Гладбах, Германия) как описано ранее²², на постоянной основе, что давало на выходе чистоту CD34⁺ клеток выше 95%. Субфракцию мононуклеарных клеток в жизнеспособном виде хранили в жидком азоте до начала окрашивания антителами. CD34⁺ клетки разделяли на две фракции; одну фракцию отмывали в PBS, ресуспендировали в «Trizol» и замораживали при -80°C, тогда как другую фракцию замораживали в жидком азоте. В качестве эталонных образцов, образцы костного мозга из здоровых волонтеров получали после информированного согласия в госпитале университета Лунда, с последующим выделением CD34-клеток, как описано выше.

Анализ на микрочипах

Анализ на микрочипах осуществляли на пластинах с олигонуклеотидами из «Swegene DNA Microarray Resource Center» при Лундскогом университете, Швеция. Гибридизацию осуществляли с помощью универсального набора для гибридизации «Pronto» («Coming Inc», Корнинг, Нью-Йорк). Выделение РНК и анализ на микрочипах осуществляли по существу так, как ранее было описано. Визуализацию данных осуществляли с помощью программного обеспечения «Qlucore Omics Explorer 2.0» («Qlucore», Лунд, Швеция).

Анализ проточной цитометрией

Анализы проточной цитометрией осуществляли на «FACS Canto», а сортировку проточной цитометрией осуществляли на «FACS Aria» (оба устройства от «BD»). Перед окрашиванием клеток CD34⁺ клетки размораживали согласно стандартным процедурам и отмывали однократно в PBS, содержащем 2% FCS (среда для отмывки). Меченное биотином козье поликлональное антитело против IL1RAP человека (партия 667, «R&D Systems», Абингдон, Великобритания) использовали в разведении 1:100 для окрашивания клеток в течение 30 минут на льду. Затем клетки, отмывали и на 30 минут добавляли РЕ-конъюгированный стрептавидин в разведении 1:200. АРС-конъюгированные анти-CD34 и FITC-конъюгированные анти-CD38 моноклональные антитела использовали для совместного окрашивания (за исключением IL1RAP все использованные антитела были приобретены у «Beckton-Dickinson Immunocytometry Systems», Маунтин-Вью, Калифорния). Перед сортировкой клеток клетки отмывали дважды для того, чтобы избежать неспецифического связывания РЕ-конъюгированного стрептавидина. Изотипические контрольные антитела использовали в качестве отрицательного контроля.

Сортировка клеток и FISH в интерфазе

Стеклянные пластины обрабатывали 0,01% поли-Д-лизином («Sigma-Aldrich», Стокгольм, Швеция) в течение двух часов во влажной камере, отмывали однократно в воде и сушили на нагревательной пластине при 37°C до высыхания. Затем гидрофобную ручку («Daido Sangyo Co., Ltd.», Токио, Япония) использовали для того, чтобы нарисовать круги, используя 96-луночный культуральный планшет в качестве шаблона. Перед сортировкой клеток, но после, по меньшей мере, двух часов сушки при комнатной температуре, 25 µл PBS наносили на круги для формирования капель. В ходе клеточной сортировки от 30 до 3000 клеток сортировали одновременно прямо в две капли. Для прикрепления клеток к поверхности и для того, чтобы избежать высыхания капель, пластины выдержали во влажной камере на льду в течение 30 минут перед фиксированием клеток в метаноле: уксусной кислоте (3:1) в течение 10 минут. Затем пластины инкубировали при 70°C в печи в течение ночи, после чего проводили FISH. Использовали зонды с двойной окраской BCR/ABL1 («Abbot», Висбаден, Германия).

Клетки, инициирующие длительную культуру (LTC-IC)

M₂10B₄ стромальные клетки культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FCS как ранее описано^{24, 25}. За два дня перед сортировкой клеток, стромальные клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета при плотности 50000 клеток на мл в 20 µл среды «Myelocult» («Stem Cell Technologies», Ванкувер, Канада), содержащей 10^-6 М гидрокортизона («Sigma-Aldrich», Стокгольм, Швеция). За двадцать четыре часа до сортировки клеток стромальные клетки облучали 1000 Rad. В ходе сортировки клеток, 100-500 клеток сортировали прямо в предварительно покрытые стромой лунки в двух повторах и 100 µл среды заменяли через 3 ч. Один раз в неделю замену 100 µл культуральной среды повторяли. Через 5-6 недель в культуре, клетки отмывали и помещали в среду с метилцеллюлозой (MethoCult H44435; «Stem Cell Technologies») в 24-луночном планшете. Через две недели подсчитывали количество колоний. Колонии из индивидуальных лунок объединяли, отмывали и наносили в каплях PBS на пластины с последующим FISH-анализом, как описано выше.

Экспрессия Р210 BCR/ABL1 в CD34⁺ клетках пуповинной крови

Образцы пуповинной крови собирали при нормальных родах после получения информированного согласия согласно протоколу, разрешенному местным этическим комитетом. CD34⁺ клетки обогащали, как ранее описано²², с получением на выходе чистоты CD34⁺ клеток выше 95%. В данном исследовании использовали RD114, псевдотипированные вирусными векторами MSCV-IRES-GFP (MIG) и MIG-P210²³. CD34⁺ клетки культивировали и трансдуцировали в SFMM среде («Stem Cell Technology», Ванкувер, Канада), обогащенной тромбопоэтином (ТРО; 50 нг/мл), фактором стволовых клеток (SCF; 100 нг/мл) и Flt-3-лигандом (FL; 100 нг/мл), как ранее было описано²³.

Результаты и обсуждение

Общий анализ генной экспрессии выявил, что IL1RAP положительно регулирован в CD34⁺ клетках ХМЛ.

Много усилий было вложено в исследования, направленные на выявление биомаркеров клеточной поверхности для Ph+ стволовых клеток ХМЛ (обзор представлен в C Eaves¹⁴). При ХМЛ лейкозные и нормальные клетки достаточно легко могут быть идентифицированы ретроспективно после детекции специфичного для лейкозов химерного гена BCR/ABL1 с помощью FISH, что делает данное заболевание идеальным для оценки попыток проспективно разделить лейкозные и нормальные клетки. Однако до настоящего времени не был идентифицирован маркер клеточной поверхности, который позволил бы осуществить проспективное отделение стволовых клеток ХМЛ от нормальных ГСК. Анализ глобальной генной экспрессии оказался мощной стратегией при поиске новых маркеров ГСК, таких как SLAM-рецепторы, различающих гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники¹⁵. Для поиска положительно регулированных генов, кодирующих кандидантные биомаркеры на поверхности стволовых клеток ХМЛ, сравнивали транскрипционные профили CD34⁺ клеток из 11 пациентов с ХМЛ и 5 образцов нормального костного мозга (bm). Идентифицированные положительно регулированные гены при ХМЛ совпали с категорией «генная онтология» (GO) - «встроенные в плазматическую мембрану», которая была вручную проверена для включения всех известных молекул CD (для подробностей см. Материалы и методы). В целом 13 положительно регулированных генов в CD34⁺ клетках ХМЛ совпали с категорией генов «встроенные в плазматическую мембрану» (данные не показаны). Для того чтобы еще более прямо связать положительно регулированные гены с экспрессией Р210 BCR/ABL1, мы параллельно создали список генов, положительно регулированных вследствие экспрессии Р210 BCR/ABL1 в CD34⁺ клетках пуповинной крови. В результате этого анализа мы получили 23 положительно регулированных гена, совпадающих с перечнем генов из той же самой категории GO (данные не показаны). Интересно, что только один ген, акцессорный белок рецептора интерлейкина 1 (IL1RAP), продемонстрировал сильную положительную регуляцию как в CD34⁺ клетках ХМЛ, так и в CD34⁺ клетках пуповинной крови вследствие экспрессии Р210 BCR/ABL1. Обнаружение того, что IL1RAP присутствует в обоих перечнях геном подтверждает, что его положительная регуляция на примитивных клетках ХМЛ тесно связана с экспрессией Р210 BCR/ABL1 и указывает на то, что IL1RAP является новым ассоциированным с лейкозом антигеном на примитивных клетках ХМЛ.

IL1RAP положительно регулирован на CD34⁺CD38^- клетках из пациентов с ХМЛ и индуцируется вследствие эктопической экспрессии Р210 BCR/ABL1.

IL1RAP является представителем суперсемейства Толл-подобных рецепторов и хорошо известен как корецептор 1 типа рецептора интерлейкина 1 (IL-1R1)¹⁶. IL1RAP, таким образом, является критически важным в опосредовании эффекта провоспалительного цитокина IL-1, но также вовлечен в опосредование сигнала IL-33 цитокина, который активирует Т-клетки и тучные клетки, через связывание с его рецептором ST2, который затем димеризуется с IL1RAP¹⁷. Ранее было показано, что активация IL-1R1 стимулирует рост колоний интерферон-чувствительных клеток ХМЛ¹⁸, однако IL1RAP, насколько нам известно, ранее напрямую не связывали с ХМЛ.

Поскольку Р210 BCR/ABL1 присутствует в клетках ХМЛ в качестве уникального признака заболевания, в идеале надежный биомаркер клеточной поверхности для ХМЛ должен быть напрямую связан с наличием и экспрессией Р210 BCR/ABL1. В соответствии с данными, полученными на микрочипах, экспрессия IL1RAP действительно положительно регулирована на клеточной поверхности CD34⁺клеток после ретровирусной экспрессии BCR/ABL1 (фиг.1). Это говорит о том, что Р210 BCR/ABL1 регулирует экспрессию IL1RAP, либо напрямую, либо через непрямое воздействие, что делает кандидатуру данного гена в качестве биомаркера ХМЛ более сильной.

Затем мы исследовали экспрессию IL1RAP на поверхности CD34⁺CD38⁺ клеток ХМЛ, отражающих большинство и более зрелые CD34⁺ клетки. В этой клеточной популяции наблюдали положительную регуляцию IL1RAP по сравнению с экспрессией в соответствующих клетках из нормального костного мозга (фиг.2А, В). Нормальные CD34⁺CD38⁺ клетки демонстрировали низкую экспрессию IL1RAP, которая частично перекрывается с экспрессией на клетках ХМЛ. Затем мы обратились к CD34+CD38^- клеточному компартменту нормальных клеток, содержащих ГСК. В соответствии с нашим предшествующим исследованием, эта популяция продемонстрировала низкую экспрессию IL1RAP или ее отсутствие (фиг.2С)¹⁹. Удивительно, но CD34⁺CD38^- клетки из пациентов с ХМЛ, несущие как Ph⁺ стволовые клетки ХМЛ, так и нормальные ГСК, были разделены на две популяции; одна имеющая низкую/отсутствующую экспрессию IL1RAP, и другую, имеющую более высокую экспрессию IL1RAP (фиг.2С). В периферической крови (ПК) пяти пациентов с ХМЛ, положительная по IL1RAP фракция клеток составляла от 75 до 95% CD34⁺CD38^- клеток (n=5). На основании этих открытий, мы предположили, что экспрессия IL1RAP может отличить нормальные от лейкозных клеток в пределах CD34⁺CD38^- клеточного компартмента ХМЛ. Поскольку все стволовые клетки ХМЛ и нормальные ГСК исключительно обнаружены в пуле CD34⁺CD38^- клеток, такое разделение между нормальными и лейкозными клетками позволит осуществить проспективное отделение стволовых клеток ХМЛ от нормальных ГСК.

Flow-drop-FISH показал, что экспрессия IL1RAP позволяет разделить нормальные и лейкозные клетки в пуле CD34⁺CD38^- клеток ХМЛ.

Для проверки позволяет ли экспрессия IL1RAP отличить нормальные (Ph^-) и лейкозные (Ph⁺) клетки в пределах компартмента CD34⁺CD38^- клеток ХМЛ, мы разработали новый протокол для осуществления флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) на небольшом количестве отсортированных клеток (см. Материалы и методы). Первые стадии в этом протоколе частично основаны на способе сортировки в капли на предметных стеклах с последующим иммуноокрашиванием одиночных клеток. Путем применения этого нового протокола, включающего прямую сортировку в капли на стеклах с последующим проведением FISH, что далее в данном документе называется Flow-drop-FISH, мы отсортировали в каплю всего 30 клеток, из которых в 15 ядра были успешно помечены FISH (CML-5, фиг.3). Интересно отметить, что с помощью Flow-drop-FISH мы обнаружили, что CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клетки при ХМЛ были BCR/ABL1⁺, тогда как CD34⁺CD38^-IL1RAP^- клетки при ХМЛ были почти всего исключительно Ph^- (n=5, фиг.3). Эти данные демонстрируют, что экспрессия IL1RAP позволяет разделить лейкозные и нормальные клетки в пределах компартмента CD34⁺CD38^- клеток ХМЛ, что указывает на то, что стволовые клетки ХМЛ и нормальные ГСК проспективно могут быть разделены.

Стволовые клетки ХМЛ являются CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺, тогда как нормальные ГСК являются CD34⁺CD38^-IL1RAP^{-/низкий уровень.}

Исследования стволовых клеток ХМЛ в хронической фазе до настоящего времени основывались на редких пациентах с ХМЛ, у которых компартмент стволовых клеток доминировал над лейкозными клетками после длительного анализа¹⁴. Поскольку клетки ХМЛ в целом демонстрируют плохую прививаемость в иммунодефицитных мышах, анализ клеток, инициирующих длительную культуру (LTC-IC) широко использовался в качестве суррогатного анализа для детекции кандидатных стволовых клеток ХМЛ. Для проверки того, содержат ли однозначно ХМЛ CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ и CD34⁺CD38^-IL1RAP^{-/низкий уровень} кандидатные стволовые клетки ХМЛ и нормальные ГСК, соответственно, мы протестировали две клеточные популяции в анализе LTC-IC. Для CD34⁺ клеток костного мозга из нормального контроля, колониеобразующие клетки в длительной культуре (LTC-CFC) были обнаружены с более >100-кратной частотой среди CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клеток по сравнению с CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клетками (фиг.4А, n=2), что указывает на то, что нормальные CD34⁺CD38^-IL1RAP^- иерархически находятся на вершине CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺клеток. При ХМЛ мы наблюдали в среднем в 3,6 раза более высокую частоту LTC-CFC в пределах CD34⁺CD38^-IL1RAP^- клеток по сравнению с CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клетками (n=5, фиг.4А), предполагая, что CD34⁺CD38^-IL1RAP^- клетки ХМЛ более обогащены по примитивным клеткам. Важно отметить, что хотя более высокое количество LTC-IC было обнаружено среди CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клеток, чем среди CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ клеток как из образцов пациентов с ХМЛ, так и из нормальных образцов, FISH на LTC-колониях ХМЛ выявила почти полную дискриминацию между Ph^- и Ph⁺ клетками в двух группах (фиг.4 В). LTC-колонии ХМЛ, полученные из CD34⁺CD38^-IL1RAP^- клеток, были почти исключительно Ph^-, тогда как CD34⁺CD38^-IL1RAP⁺ были почти исключительно Ph⁺. Эти данные показывают, что IL1RAP является новым биомаркером клеточной поверхности, который можно использовать для отделения стволовых клеток ХМЛ от нормальных ГСК.

В данной работе с помощью анализа глобальной генной экспрессии мы идентифицировали новый поверхностный антиген, IL1RAP, который после проверки во множестве анализов удовлетворяет критериям нового биомаркера клеточной поверхности Ph⁺ стволовых клеток ХМЛ. На основании этого открытия, будущие терапии ХМЛ могут быть разработаны для направленного воздействия на стволовые клетки ХМЛ с сохранением нормальных ГСК при использовании терапевтического антитела, нацеленного на IL1RAP. Кроме того, коктейль антител, содержащий анти-CD34, анти-CD38 и анти-IL1RAP антитела может быть использован для диагностических целей и для исследований с отслеживанием пациентов с ХМЛ при различных типах лечения. Важно отметить, что проспективное разделение нормальных стволовых клеток и стволовых клеток ХМЛ дополнительно позволит в будущем осуществить механистические исследования этих двух клеточных популяций. Более того, мы также продемонстрировали, что Flow-drop-FISH может служить в качестве полезного способа при описании генетических аберраций в малом количестве отсортированных клеток, таких как лейкозные стволовые клетки, тип клеток, который был очищен до все более малых и чистых клеточных популяций²¹. В будущих исследованиях этот способ будет, например, позволять осуществить детекцию генетических аберраций в различных малых популяциях лейкозных стволовых клеток и клеток-предшественников, что позволит по новому взглянуть на то, в каком порядке различные аберрации были приобретены, что является ключевой информацией для понимания лейкемогенеза. Кроме того, Flow-drop-FISH может быть использован для отслеживания терапевтических воздействий на лейкозные стволовые клетки в ходе лечения. Важно отметить, что с помощью Flow-drop-FISH мы идентифицировали, что IL1RAP является первым биомаркером клеточной поверхности, который позволяет отличить стволовые клетки ХМЛ от нормальных ГСК, открытие, которое открывает новые терапевтические возможности для ХМЛ и других неопластических гематологических расстройств, ассоциированных с положительной регуляцией IL1RAP на стволовых клетках и/или клетках-предшественниках.

Ссылки

1. Deininger MW, Goldman J M, Melo JV. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood. 2000; 96:3343-3356.

2. Fialkow PJ, Denman AM, Jacobson RJ, Lowenthal MN. Chronic myelocytic leukemia. Origin of some lymphocytes from leukemic stem cells. J Clin Invest. 1978; 62:815-823.

3. Kavalerchik E, Goff D, Jamieson CH. Chronic myeloid leukemia stem cells. J din Oncol. 2008; 26:2911-2915.

4. Jiang X, Zhao Y, Smith С, et al. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia. 2007; 21:926-935.

5. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et al. Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary ХМЛ but does not eliminate the quiescent fraction. Blood. 2006; 107:4532-4539.

6. Jin L, Hope KJ, Zhai Q, Smadja-Joffe F, Dick JE. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med. 2006; 12:1167-1174.

7. Tavor S, Petit I, Porozov S, et al. CXCR4 regulates migration and development of human acute myelogenous leukemia stem cells in transplanted NOD/SCID mice. Cancer Res. 2004; 64:2817-2824.

8. Jin L, Lee ЕМ, Ramshaw HS, et al. Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells. Cell Stem Cell. 2009, 5:31-42.

9. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009; 138:286-299.

10. Hosen N, et al. CD96 is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:11008-11013.

11. van Rhenen A, van Dongen GA, Kelder A, et al. The novel ОМЛ stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 2007, 110:2659-2666.

12. Eisterer W, Jiang X, Christ O, et al. Different subsets of primary chronic myeloid leukemia stem cells engraft immunodeficient mice and produce a model of the human disease. Leukemia. 2005, 19:435-441.

13. Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94:5320-5325.

14. JiangX, Zhao Y, Forrest D, Smith C, Eaves A, Eaves C. Stem cell biomarkers in chronic myeloid leukemia. Dis Markers. 2008; 24:201-216.

15. Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Terhorst C, Morrison SJ. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 2005; 121:1109-1121.

16. Subramaniam S, Stansberg C, Cunningham C. The interleukin 1 receptor family. Dev Comp Immunol. 2004; 28:415-428.

17. Ali S, Huber M, Kollewe C, Bischoff SC, Falk W, Martin MU. IL-1 receptor accessory protein is essential for IL-33-induced activation of T lymphocytes and mast cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:18660-18665.

18. Estrov Z, et al. Suppression of chronic myelogenous leukemia colony growth by interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors: a novel application for inhibitors of IL-1 activity. Blood. 1991:78:1476-1484.

19. Hystad ME, Myklebust JH, Bo TH, et al. Characterization of early stages of human В cell development by gene expression profiling. J Immunol. 2007, 179:3662-3671.

20. Ema H, Morita Y, Yamazaki S, et al. Adult mouse hematopoietic stem cells: purification and single-cell assays. Nat Protoc. 2006, 1:2979-2987.

21. Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research. Blood. 2008; 112:4793-4807.

22. Nilsson M, Karlsson S, Fan X. Functionally distinct subpopulations of cord blood CD34+cells are transduced by adenoviral vectors with serotype 5 or 35 tropism. Mol Ther. 2004; 9:377-388.

23. Jaras M, Johnels P, Agerstam H, et al. Expression of P 190 and P210 BCR/ABL1 in normal human CD34(+) cells induces similar gene expression profiles and results in a STAT5-dependent expansion of the erythroid lineage. Exp Hematol. 2009; 37:367-375.

24. Hogge DE, et al.. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 1996; 88:3765-3773.

25. Castor A, Nilsson L, Astrand-Grundstrom I, et al. Distinct patterns of hematopoietic stem cell involvement in acute lymphoblastic leukemia. Nat Med. 2005; 11:630-637.

Пример 2

Направленное воздействие антителами на IL1RAP на лейкозных стволовых клетках и клетках-предшественниках вызывает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC)

Сущность

Терапевтические стратегии для лейкозов, направленные на достижение стойкого выздоровления, потребуют полного уничтожения лейкозных стволовых клеток. Лейкозные стволовые клетки, представляют собой малую популяцию лейкозных клеток, которые до настоящего времени были неотличимы от нормальных гематопоэтических клеток (ГСК), с помощью маркеров клеточной поверхности. Новая концепция мечения лейкозных стволовых клеток позволит идентифицировать биомаркер клеточной поверхности лейкозных стволовых клеток, на который могут быть нацелены будущие терапевтические антитела (см. пример 1).

В данном исследовании мы получили антитело против IL1RAP и представили доказательство правильности концепции, согласно которой антитела против IL1RAP, нацеленные на стволовые клетки хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), могут быть использованы для индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), тогда как на нормальных ГСК цитотоксичный эффект не наблюдается. Более того, мы продемонстрировали дозозависимую по IL1RAP ADCC в положительных по IL1RAP клеточных линиях KU812 (ХМЛ), MONO-MAC-6 (острый миелоидный лейкоз; ОМЛ) и REH (клеточная линия острого лимфобластного лейкоза; ОЛЛ). Мы также продемонстрировали, что стволовые клетки МДС и МПЗ имеют повышенную экспрессию IL1RAP, что указывает на то, что будущие терапевтические антитела направленно воздействущие на IL1RAP, будут эффективны также и в случае этих расстройств.

Данное исследование, таким образом, открывает новое терапевтическое направление в лечении ХМЛ, ОМЛ, ОЛЛ, МДС и МПЗ с помощью антитела, направленно воздействующего на IL1RAP на лейкозных стволовых клетках.

Материалы и методы

Получение КМТ-1; поликлональное кроличье антитело против IL1RAP человека

Кроликов иммунизировали внеклеточным доменом IL1RAP. Сыворотку из кроликов очищали стандартными процедурами, за исключением того, что была добавлена дополнительная стадия, в которой антитела, связывающиеся с иммуноглобулиновым доменом, присутствующим на иммунизирующем белке для увеличения периода полужизни, удаляются при связывании с колонками, загруженными иммуноглобулинами. С помощью тИФА подтверждали связывание очищенных антител с внеклеточным доменом IL1RAP и отсутствие антител, связывающих человеческий иммуноглобулиновый домен. При использовании в проточной цитометрии, РЕ-конъюгированное козье антитело против кроличьих IgG использовали в качестве вторичного агента.

Анализ ADCC

Анализ ADCC был основан на ранее описанном протоколе¹. Вкратце клетки-мишени метили с помощью РКН26 («Sigma-Aldrich», Сент-Луис, Миссури) согласно инструкциям изготовителя и клетки были либо прямого помещены в лунки 96-луночного планшета, либо были посеяны в лунки с последующей сортировкой CD34⁺CD38^- клеток. Клеточные линии KU812 и KG-1 и первичные CD34⁺ клетки рассевали в концентрации 10000 клеток на лунку, тогда как первичные CD34⁺CD38^- клетки рассевали в концентрации 2000-3000 клеток на лунку. Затем в лунки добавляли антитела в различных концентрациях и инкубировали в течение 20 минут перед добавлением в каждую лунку 100000 эффекторных NK-клеток. NK-клетки экстрагировали из здоровых волонтеров после информированного согласия с помощью набора выделения клеток, отрицательных по NK-клеткам, согласно инструкциям изготовителя («Miltenyi Biotech», Бергиш-Гладбах, Германия). В экспериментах в качестве контрольного антитела использовали кроличьи антитела IgG, очищенные из неиммунизированного кролика («R&D Systems» Абингдон, Великобритания). 7-AAD положительные клетки для детекции клеточной смерти измеряли с помощью проточного цитометра «FACS CANTO» («BD»). Среднее и стандартное отклонение индуцированной антителами клеточной смерти рассчитывали согласно следующему уравнению: (процент 7-AAD+клеток при определенной концентрации антител - процент 7-AAD+клеток без антитела)/(0,01 (процент 7-AAD-клеток без антитела) на основании, по меньшей мере, трех независимых экспериментов (за исключением фиг.9; только 1 эксперимент).

Образцы из одиннадцати пациентов с ОМЛ и двух Ph+пациентов с ОЛЛ получили из госпиталя университета Лунда, а экспрессию IL1RAP анализировали в CD34⁺CD38⁺ и CD34⁺CD38^- клеточных популяциях с помощью тех же условий, что и при анализе клеток ХМЛ. Клеточную линию ОМЛ, MONO-MAC-6, и клеточную линию ОЛЛ, REH, также тестировали в анализах ADCC в тех же условиях, что клеточные линии KG-1 и KU812.

Результаты

Направленное воздействие на IL1RAP на стволовых клетках и клетках-предшественниках ХМЛ, а также на клеточной линии ХМЛ приводит к проявлению эффекта ADCC NK-клетками.

Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность является консервативным механизмом врожденной иммунной системы, посредством которого несколько терапевтических антител, таких как Ритуксимаб, нацеленного на CD20, как считается, по меньшей мере, частично проявляют свой терапевтический эффект². Для тестирования того, можно ли вызвать ADCC используя IL1RAP в качестве мишени, мы создали поликлональное кроличье антитело против человеческого IL1RAP, далее обозначенного как КМТ-1, поскольку Fc-домен кроличьих антител в отличие от козьих антител распознается клетками человеческой иммунной системы.

Как и ожидалось, низкие уровни ADCC наблюдались в отрицательной по IL1RAP/ с низким уровнем IL1RAP лейкозной клеточной линии KG-1, даже при высоких концентрациях КМТ-1 (фиг.5А, В). Напротив, в клеточной линии ХМЛ, KU812, экспрессирующей IL1RAP, в присутствии КМТ-1 наблюдали опосредованную натуральными киллерами ADCC (фиг.5A, B), что говорит о том, что КМТ-1 имеет потенциал индукции ADCC посредством рекрутирования цитотоксических иммунных клеток к IL1RAP+клеткам-мишеням.

На первичных клетках из пациентов с ХМЛ и из нормальных контролей, КМТ-1 продемонстрировали слегка более слабый, но схожий паттерн окрашивания с ранее использованным поликлональным козьим антителом против человеческого IL1RAP (пример 1, фиг.6А). Незрелые клетки из CML-1, CML-3 и CML-4 (клеток из CML-2 и CML-5 не осталось) тестировали в анализах ADCC параллельно с клетками из образцов здоровых контролей. В CD34⁺клетках из ХМЛ, связывание КМТ-1 приводило к более высоким уровням ADCC, чем в нормальных CD34⁺ контрольных клетках, что коррелирует с уровнем экспрессии IL1RAP, в частности, при более низких концентрациях антитела (фиг.6B). Еще более поразительно то, что среди обогащенного стволовыми клетками CD34+CD38^- клеток, КМТ-1 не вызывает ADCC нормальных CD34+CD38^- клеток, тогда как четкий дозозависимый ADCC-эффект наблюдался в CD34+CD38^- клетках из ХМЛ (фиг.6В), что опять же говорит о сильной корреляции с паттерном экспрессии IL1RAP на этих типах клеток.

Антитела, нацеленные на IL1RAP на клетках ОМЛ и ОЛЛ, приводит к проявлению ADCC-эффекта NK-клетками.

Экспрессию IL1RAP наблюдали в CD34⁺CD38^- ОМЛ в 9 из 11 протестированных образцов (фиг.7А). В популяции CD34⁺CD38⁺ клеток наблюдали схожий паттерн экспрессии IL1RAP (фиг.7А). Кроме того, IL1RAP также экспрессировался в клеточной линии ОМЛ, MONO-MAC-6, и клеточной линии ОЛЛ, REH (фиг.7 В). Экспрессию IL1RAP также наблюдали в Ph+ ОЛЛ CD34⁺CD38^- клетках в 2 из 2 протестированных образцах (фиг.7С). При использовании IL1RAP в качестве мишени, клеточные линии MONOMAC-6 и REH также тестировали в анализах ADCC. В обеих этих клеточных линиях наблюдался дозозависимый от направленного воздействия на IL1RAP эффект ADCC (фиг.8), что демонстрирует, что терапевтические анти-IL1RAP таргетные антитела имеют более широкое применение, чем просто при ХМЛ.

Мы также осуществили эксперименты по вызову ADCC на первичных CD34+CD38- клетках ОМЛ и ОЛЛ, и продемонстрировали правильность принципа действия, что также при этих расстройствах можно достичь повышенной клеточной смерти с помощью КМТ-1 (фиг.9).

Кроме того, CD34+CD38- клетки из одного пациента с МДС при прогрессии в ОМЛ и двух пациентов с МПЗ (у одного из них мутация в JAK2) окрашивались с помощью нацеленного на IL1RAP антитела. Повышенную экспрессию IL1RAP наблюдали при сравнении с CD34+CD38- клетками нормального костного мозга (фиг.10, фиг.2С).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы идентифицировали IL1RAP в качестве первого биомаркера клеточной поверхности, который позволяет отличить кандидатные стволовые клетки ХМЛ от нормальных ГСК, и использовали данную информацию для индукции антителозависимого уничтожения стволовых клеток ХМЛ. Кроме того, мы идентифицировали IL1RAP в качестве положительно регулированного в стволовых клетках ОМЛ, ОЛЛ, МПЗ и МДС, и показали, что и стволовые клетки ОМЛ, и стволовые клетки ОЛЛ, могут быть уничтожены с помощью нацеленного на IL1RAP антитела, тогда как нормальные клетки остаются незатронутыми. На основании открытия того, что стволовые клетки ХМЛ, ОЛЛ и ОМЛ могут быть уничтожены с помощью антител, нацеленных на IL1RAP, ожидается, что также при анализе ADCC могут быть уничтожены стволовые клетки МПЗ и МДС. Эти находки открывают новую концепцию лечения пациентов с лейкозами прямым направленным воздействием на лейкозные стволовые клетки, концепцию, которая отличается от существующей в настоящее время концепции применения ингибиторов тирозинкиназ, которые предпочтительно поражают клетки ниже стволовых клеток ХМЛ^3,4.

Причина, по которой стволовые клетки ХМЛ являются устойчивыми к лекарственным средствам, таким как гливек, частично остается неясной, но факторами, которые могут вносить вклад, являются такие признаки, как латентность, и относительно высокий уровень экспрессии BCR/ABL1, а также комбинаторная экспрессия в этих клетках специфических белков-мембранных транспортеров^3,5,6. С учетом этих признаков стволовых клеток ХМЛ, крайне желательно найти новые подходы лечения для полного уничтожения стволовых клеток ХМЛ. В такой стратегии может быть полезной основанная на антителах терапия, прямо поражающая стволовые клетки, поскольку механизм действия антител не зависит от известных механизмов устойчивости, которые позволяют стволовым клеткам ХМЛ быть невосприимчивыми к обработкам ингибиторами киназ. Основные ограничения для таких разработок заключались в полном отсутствии рецептора клеточной поверхности, который позволял бы различить ХМЛ Ph+от нормальных, здоровых (Ph-) стволовых клеток. В данной работе при анализе глобальной генной экспрессии в качестве мишени мы идентифицировали IL1RAP и, что важно, связали его экспрессию с экспрессией BCR/ABL1 (см. пример 1 выше).

Важно отметить, что получением антитела, направленного на IL1RAP, в данной работе мы впервые представили доказательство правильности концепции, которая заключается направленном воздействии на кандидантные стволовые клетки ХМЛ при сохранении нормальных ГСК. Важно отметить, что поскольку механизм действия антител при ADCC заключается в побуждении иммунологических клеток к уничтожению клеток-мишеней, то терапевтические механизмы не зависят от известных механизмов, вызывающих устойчивость к ингибиторам киназ при лечении ХМЛ с помощью существующих в нестоящее время типов лечения. Поэтому направленное воздействие антителами на стволовые клетки ХМЛ способно уничтожить стволовые клетки ХМЛ, либо самостоятельно, либо в комбинации с существующими в настоящее время схемами лечения, что, в конечном счете, приводит к стойкому выздоровлению пациентов с ХМЛ.

Интересно отметить, что также мы наблюдали, что направленно воздействующие на IL1RAP антитела могут вызвать ADCC в стволовых клетках ОМЛ, наиболее распространенный тип острого лейкоза среди взрослых, имеющий плохой прогноз, а также в стволовых клетках ОЛЛ, наиболее распространенный тип лейкоза среди детей. В совокупности открытие экспрессии IL1RAP на лейкозных стволовых клетках, имеющих иммунофенотип CD34⁺CD38^- при ХМЛ, ОМЛ, ОЛЛ, МДС и МПЗ, и эксперименты с ADCC, демонстрирующие уничтожение клеток зависимым от IL1RAP образом, указывает на то, что эти нарушения можно лечить с помощью анти-IL1RAP терапевтических антител.

В ADCC-экспериментах, представленных в данном документе, использовали поликлональное антитело против человеческого IL1RAP (который по существу является смесью нескольких различных моноклональных антител). Однако специалистам в данной области следует иметь в виду, что также могут быть идентифицированы индивидуальные моноклональные антитела, нацеленные на IL1RAP и обладающие потенциалом ADCC.

Ссылки

1. Wilkinson RW, Lee-MacAry AE, Davies D, Snary D, Ross EL. Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity: a flow cytometry-based assay using fluorophores. J Immunol Methods. 2001; 258:183-191.

2. Morris JC, Waldmann ТА. Antibody-based therapy of leukaemia. Expert Rev Mol Med. 2009; 11:e29.

3. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et al. Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary ХМЛ but does not eliminate the quiescent fraction. Blood. 2006; 107:4532-4539.

4. Jorgensen HG, Allan EK, Jordanides NE, Mountford JC, Holyoake TL. Nilotinib exerts equipotent antiproliferative effects to imatinib and does not induce apoptosis in CD34⁺ХМЛ cells. Blood. 2007; 109:4016-4019.

5. Graham SM, Jorgensen HG, Allan E, et al. Primitive, quiescent, Philadelphiapositive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 2002; 99:319-325.

6. Jiang X, Zhao Y, Smith C, et al. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia. 2007; 21:926-935.

Пример 3. Генная экспрессия в солидных опухолях

Материалы и методы

С помощью поисковой машины «Oncomine» (www.oncomine.org) мы выявили все наборы данных о клеточных линиях, полученных из опухолей различных типов. Наибольшим выявленным набором данных был набор данных «Wooster Cell Line2». Этот набор данных содержал 308 линий злокачественных опухолевых клеток, представляющих 20 различных типов опухолей. Поиск проводили по запросу «IL1RAP» с параметром «205277_at».

Результаты

В целом мы идентифицировали 17 различных типов солидных опухолей, представленных клеточными линиями, соответствующих нашим критериям положительно регулированной экспрессии IL1RAP (см. таблицу 1). Процент клеточных линий по каждому типу опухоли, демонстрирующих положительно регулированный IL1RAP, находится в диапазоне от 4% (колоректальный рак) до 67% (меланома, рак простаты). Среди типов опухолей мы выявили некоторые наиболее распространенные виды злокачественных новообразований у человека, включая злокачественные опухоли молочной железы, толстой кишки, легких, предстательной железы и мочевого пузыря. Кроме того, некоторые типы опухолей, ассоциированных с плохим клиническим прогнозом, такие как меланома и опухоли мозга, демонстрируют повышенную положительно регулированную экспрессию IL1RAP.

Выводы

Мы пришли к выводу, что несколько различных видов опухолей демонстрируют положительно регулируемый уровень экспрессии IL1RAP.

Эти данные указывают на то, что лечение антителами против IL1RAP ляжет в основу нового терапевтического направления при лечении некоторых различных типов злокачественных новообразований человека.

Таблица 1 Положительная регуляция IL1RAP в 308 линиях злокачественных опухолевых клеток, представляющих различные типы опухолей* Тип опухоли Количество опухолей, демонстрирующих положительную регуляцию IL1RAP** Рак мочевого пузыря 3/9 (33%) Рак мозга и ЦНС 7/16 (44%) Рак молочной железы 4/19 (21%) Рак шейки матки 4/7 (57%) Колоректальный рак 1/23 (4%) Рак пищевода 3/4 (75%) Рак желудка 1/5 (20%) Рак головы и шеи 3/6 (50%) Рак почек 1/8 (12%) Рак печени 3/9 (33%) Рак легких 14/73 (19%) Лимфома 2/38 (5%) Меланома 8/12 (67%) Рак яичников 2/5 (40%) Рак поджелудочной железы 3/9 (33%) Рак предстательной железы 2/3 (67%) Саркома 5/13 (38%) * Поиск в массиве данных Вустера на 308 линиях злокачественных опухолевых клеток осуществляли с помощью «Oncomine» (www.oncomine.org). Использовали запрос «IL1RAP» с параметром «205227_at». Платформой, на которой проводились исследования, являлись микрочипы «Human Genome U133 Plus 2.0» («Affymetrix Inc.»)

** Только опухолевые клеточные линии, демонстрирующие равный или более высокий уровень экспрессии IL1RAP, чем в положительной по филадельфийской хромосоме клеточной линии KU812, отмечались как «положительно регулированные». Нами ранее было показано, что KU812 обладают положительно регулированной экспрессией белка IL1RAP на клеточной поверхности (Jaras et al., 2010, PNAS 107(14):16280-5).  

Пример 4. Анализ экспрессии IL1RAP в человеческих клеточных линиях, проведенный проточной цитометрией

Материалы и методы

Реактивы

- Блокаторы Fc-рецептора от «BD Biosciences»

-анти-CD16 человека (кат. №555404)

- анти-CD32 человека (кат. №555447)

- АРС-мышиный IgG1 k изотипический контроль (кат. №555751) от «BD Biosciences»

- Анти-IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC человека (кат. FAB676A) от «R&D system».

Клеточные линии

Таблица 2 Клеточная линия Описание ATCC/DSMZ каталожный № KG-1 Острый миелолейкоз человека (используемый в качестве отрицательного контроля) ACC14 KU-812 Хронический миелоидный лейкоз человека в миелоидный бластный кризис (используется в качестве положительного контроля) ACC 378 NCI-H2228 Аденокарцинома легкого CRL-5935 NCI-H716 Рак толстой кишки CCL-251 НСС 1954 Дуктальная карцинома молочной железы CRL-2338 SR Лимфома CRL-2262 OV-90 Аденокарцинома яичников CRL-11732 COLO 829 Злокачественная меланома CRL-1974 SH-4 Меланома CRL-7724 SW 1783 Астроцитома НТВ-13

Клеточные линии культивировали в стандартных условиях в среде, рекомендованной поставщиками.

Анализ FACS

Клетки (350 000) ресуспендировали в 2 мл буфера для FACS (PBS без кальция и магния, дополненный 0,5% BSA) и центрифугировали в течение 4 мин. при 300×g. Надосадочную жидкость отбрасывали и блокировали Fc-рецепторы инкубацией клеток с анти-CD16/CD32 мАт в концентрации 3 мкг/мл в объеме 30 мкл в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем 55 мкл буфера для FACS и 4 мкл меченного АРС изотипного антитела или 5 мкл меченного АРС моноклонального антитела против человеческого IL1RAP добавляли к клеткам и инкубировали в течение 30 минут при +4°С. Клетки отмывали 3 мл буфера для FACS, центрифугировали в течение 4 минут при 300×g и отбрасывали надосадочную жидкость. Клетки в конце ресуспендировали в 200 мкл буфера для FACS и проводили анализ проточной цитометрией согласно стандартным условиям на проточном цитометре «FACS Canto II» («BD Biosciences»).

Результаты

Уровни экспрессии IL1RAP клеточными линиями солидных опухолей тестировали, как показано в таблице 3 ниже и в фигуре 11.

Таблица 3 Экспрессия IL1RAP в различных клеточных линиях человека.
Значения представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции Клеточная линия Холостая проба Изотип Анти-IL1RAP KG-1 46 52 113 KU-812 62 69 451 NCI-H2228 80 96 587 NCI-H716 60 96 2043 НСС 1954 112 119 410 SR 51 54 2257 OV-90 78 89 1921 COLO 829 77 82 3732 SH-4 40 51 5189 SW 1783 119 153 341

Выводы

Экспрессию IL1RAP наблюдали на клеточных линиях солидных опухолей NCI-H2228, NCI-H716, НСС1954, SR, OV-90, COLO 829, SH-4 и SW 1783. Экспрессия на этих клеточных линиях была сравнимой или более высокой, чем экспрессия на клеточной линии хронического миелоидного лейкоза человека KU-812.

Пример 5. Направленное воздействие антителом против IL1RAP на солидные опухолевые клетки вызывает антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC)

Материалы и методы

Разработка и получение химерного моноклонального антитела 81.2 hIgG1.

Клеточную линию мышиной гибридомы, секретирующую моноклональные антитела, специфичные к внеклеточной части человеческого IL1RAP, получали стандартными процедурами. Вкратце, мышей BALB/c иммунизировали химерным белком, состоящим из внеклеточной части IL1RAP и Fc-части человеческого IgG1 (Pro100-Lys330). Спленоциты сливали с клеточной линией мышиной миеломы Sp2/0 и с помощью скрининга на химерный белок, использованный для иммунизации, и контрскрининга на человеческий IgG1 выделяли клоны, продуцирующие антитела, направленные против внеклеточной части IL1RAP.

Антитела, продуцируемые клоном 81.2 гибридомной клеточной линии, принадлежат к IgG1/каппа типу, и было обнаружено, что они обладают высокой специфичностью к IL1RAP-положительным клеткам и к рекомбинантному белку человеческого IL1RAP (21-367). Из этой клеточной линии выделяли общую РНК, амплифицировали с помощью ПЦР, клонировали и секвенировали кДНК, представляющую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, VH и VK.

Генетический элемент, кодирующий мышиный VK в рамке с константной частью человеческого гена каппа, синтезировали и клонировали в плазмидный вектор для экспрессии в млекопитающих.

Фрагмент ПЦР, кодирующий мышиный VH, объединяли с константными частями человеческого IgG1 и клонировали в плазмидный вектор для экспрессии в млекопитающих.

Клетки НЕК 293 котрансфецировали обеими плазмидами и культивировали в бессывороточной среде, дополненной 100 нг/мл кифунензина. Химерное антитело 81.2 hIgG1 очищали из культуральной среды с помощью хроматографии на протеине G.

Проточная цитометрия

Клетки из четырех различных клеточных линий солидных злокачественных опухолей, Н2228 (аденокарцинома; немелкоклеточный рак легкого), Н716 (колоректальная аденокарцинома), НСС1954 (дуктальная карцинома молочной железы) и SH-4 (меланома) собирали и окрашивали с помощью mab81.2, антитела против человеческого IL1RAP («Cantargia AB», Лунд, Швеция). Для детекции клетки окрашивали вторичным РЕ-конъюгированным антителом против человеческих IgG («Thermo-Fisher», Уолтем, Массачусетс), и анализировали клетки с помощью проточного цитометра «FACS CANTO» («BD Immunocyteometry Systems», Маунтин-Вью, Калифорния).

Анализ ADCC

Анализ ADCC был основан на ранее описанном протоколе (см. Пример 2 выше). Вкратце, клетки-мишени метили РКН26 («Sigma-Aldrich», Сент-Луис, Монтана) в соответствии с инструкциями производителя, и рассевали в 96-луночном планшете с плотностью 10000 клеток на лунку. Затем в лунки добавляли антитела в различных концентрациях и инкубировали в течение 30 минут перед добавлением в каждую лунку 100000 эффекторных NK-клеток. NK-клетки экстрагировали из здоровых волонтеров после информированного согласия с помощью набора выделения клеток, отрицательного по NK-клеткам, согласно инструкциям изготовителя («Miltenyi Biotech», Бергиш-Гладбах, Германия). В экспериментах в качестве контроля использовали неспецифическое человеческое IgG1 антитело («Eureka Therapeutics», Эмеривилль, Калифорния).

Степень клеточной смерти оценивали детекцией 7-AAD положительных клеток с помощью проточного цитометра «FACS CANTO» («BD»). Уровень индуцируемой антителами клеточной смерти рассчитывали согласно следующему уравнению: процент 7-AAD+ клеток при определенной концентрации антитела - процент 7-AAD+ клеток без антитела.

Результаты

Антитело против человеческого IL1RAP метит человеческие нелейкозные злокачественные опухолевые клетки при проточной цитометрии и побуждает NK-клетки к осуществлению ADCC, что приводит к уничтожению человеческих злокачественных опухолевых клеток.

Мы показали, что КМТ1, поликлональное антитело против человеческого IL1RAP, может приводить к осуществлению ADCC NK-клетками, и индуцировать клеточную смерть сильноэкспрессирующей IL1RAP клеточной линии KU812, но не слабоэкспрессирующих IL1RAP клеток KG1 (см. пример 2 выше).

Результаты из настоящего исследования показали, что не только лейкозные клетки являются чувствительными к ADCC, опосредованной IL1RAP, но также клетки из солидных злокачественных опухолей человека. Были исследованы четыре различных линии злокачественных опухолевых клеток человека, представляющих четыре различных типа солидных злокачественных опухолей человека, и все они продемонстрировали экспрессию IL1RAP на клеточной поверхности (фиг.12).

Все четыре протестированные клеточные линии также были показаны как чувствительные к ADCC, опосредованной mab81.2, антителом против человеческого IL1RAP, по-видимому, дозозависимым образом (фиг.13).

Заключение

В настоящем исследовании подтверждено, что IL1RAP экспрессируется на клеточной поверхности нескольких типов человеческих злокачественных опухолей, включая рак легких, рак толстой кишки, рак молочной кишки и злокачественная меланома.

С помощью антитела, направленного против IL1RAP, в ADCC-анализе было показано, что клеточные линии всех четырех типов солидных опухолей подвергаются уничтожению, опосредованному натуральными киллерами.

Пример 6. Эффективность моноклонального антитела 81.2 in vivo в мышиной модели ксенотрансплантата человеческой меланомы SK-MEL-5

Материалы и методы

Разработка и получение мышиного моноклонального антитела 81.2 изотипов IgG1 и IgG2a.

Клеточную линию мышиной гибридомы, секретирующую моноклональные антитела, специфичные к внеклеточной части человеческого IL1RAP, получали стандартными процедурами. Вкратце, мышей BALB/c иммунизировали химерным белком, состоящим из внеклеточной части IL1RAP и Fc-части человеческого IgG1 (Pro100-Lys330). Спленоциты сливали с клеточной линией мышиной миеломы Sp2/0 и с помощью скрининга на химерный белок, использованный для иммунизации, и контрскрининга на человеческий IgG1 выделяли клоны, продуцирующие антитела, направленные против внеклеточной части IL1RAP.

Антитела, продуцируемые клоном 81.2 гибридомной клеточной линии, принадлежат к типу IgG1/каппа, и было обнаружено, что они обладают высокой специфичностью к IL1RAP-положительным клеткам и к рекомбинантному белку человеческого IL1RAP (21-367). Из этой клеточной линии выделяли общую РНК и амплифицировали с помощью ПЦР, клонировали и секвенировали кДНК, представляющую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, VH и VK.

Генетические элементы, кодирующие мышиный VK в рамке с константной частью мышиного гена каппа синтезировали и клонировали в плазмидный вектор для экспрессии в млекопитающих.

Фрагмент ПЦР, кодирующий мышиный VH, объединяли с константными частями мышиного IgG2a и клонировали в плазмидный вектор для экспрессии в млекопитающих.

Клетки НЕК 293 котрансфецировали обеими плазмидами и культивировали в бессывороточной среде. Мышиное антитело 81.2 изотипа IgG2a очищали из культуральной среды с помощью хроматографии на протеине G.

Проточная цитометрия

Для подтверждения экспрессии IL1RAP в клеточной линии человеческой злокачественной меланомы, SK-MEL-5, и сравнения с экспрессией в клеточной линии человеческого ХМЛ, KU812, обе клеточные линии инкубировлаи согласно стандартным процедурам и поддерживали в логарифмической фазе роста. При количестве клеток 3,5-5,0×10⁵ клеток/мл клетки метили мышиным IgG1 моноклональным антителом 81.2 в концентрации 1-50 мкг/мл. В качестве контроля использовали контрольное антитело изотипа IgG1. Окрашивание анализировали с помощью проточного цитометра «Accuri С6».

Лекарственные средства и обработка

Таблица 4 Группа n Лекарственное средство/Тестируемый агент Агент мг/кг Путь Схема Контроль 10 Носитель (PBS) - вб biwk × 6 Обработанный 10 mAb 81.2 10 вб biwk × 6

In vivo введение мАТ 81.2, специфичного к IL1RAP человека или носителя

8-12 недельных самок ТКИН-мышей CD.17 инъецировали 1×10⁷ опухолевых клеток SK-MEL-5 в 50% матригеле на животное, подкожно в лапу. Обработку начинали примерно через одну неделю после инъекции клеток меланомы, когда опухоли достигали размера 108-128 мм³. Провели подбор пар по размеру опухоли среди 20 животных, что дало 10 мышей в каждой из двух обрабатываемых групп.

81.2, мышиное IgG2a моноклональное антитело, вводили в PBS в дозировке 10 мг/кг, и в объеме 10 мл/кг. Контрольные животные получили равные объемы PBS. Обработки проводились внутрибрюшинно. Объем опухоли, измеряемый штангенциркулем, и общие массы отслеживали дважды в неделю.

Конечный критерий исследования заключался в задержке опухолевого роста.

Результаты

Проточная цитометрия

Таблица 5 Экспрессия IL1RAP на клеточной линии человеческой меланомы SK-MEL-5 и человеческой клеточной линии хронического миелоидного лейкоза (CNL) KU812. Значения представляют среднюю интенсивность флуоресценции Клеточная линия Название образца Концентрация Экспрессия IL1RAP   Без метки N/A 473 SK-MEL-5 81.2 1 мкг/мл 501   81.2 10 мкг/мл 19010   81.2 50 мкг/мл 17560   Изотипический контроль 10 мкг/мл 605   Изотипический контроль 50 мкг/мл 548   Только вторичные 1 мкг/мл 497   Без метки N/A 291 KU812 81.2 1 мкг/мл 1188   81.2 10 мкг/мл 2156   81.2 50 мкг/мл 1868   Изотипический контроль 10 мкг/мл 715   Изотипический контроль 50 мкг/мл 463   Только вторичные 1 мкг/мл 309

In vivo активность примерного мАТ 81.2

Анализ исследования на 33 день с начала введения доз показал статистически значимое замедление роста опухоли в обрабатываемой группе по сравнению с контрольной группой на 22 день (p<0,05), 26 и 29 (p<0,001) и на 33 день (p<0,0001) (см. фиг.14).

Заключение

Экспрессию IL1RAP подтвердили проточной цитометрией на опухолевой клеточной линии меланомы SK-MEL-5 и продемонстрированная экспрессия была выше, чем экспрессия в человеческой клеточной линии хронического миелоидного лейкоза KU812.

Данные in vivo указывают на то, что человеческое специфичное к IL1RAP моноклональное антитело, 81.2, вводимое дважды в неделю в дозе 10 мг/кг, вызывает ингибирование роста опухолевых клеток экспрессирующей IL1RAP человеческой клеточной линии меланомы SK-MEL-5.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно предлагаются агенты и их применение, содержащие антитела со специфичностью к акцессорному белку рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP), что может быть использовано в медицине. Полученные агенты применяют для лечения и профилактики солидных опухолей, экспрессирующих IL1RAP у пациента. Изобретение также позволяет детектировать клетки солидной опухоли, экспрессирующие IL1RAP. 7 н. и 33 з.п. ф-лы, 14 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Агент, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со специфичностью к акцессорному белку рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP) для применения при лечении или профилактике солидной опухоли у пациента, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP, где агент способен уничтожить солидные опухолевые клетки и где агент необязательно включает группу для увеличения in vivo периода полужизни агента и/или цитотоксическую группу.

2. Агент, содержащий (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со специфичностью к акцессорному белку рецептора интерлейкина-1 (IL1RAP) и (b) детектируемую группу для применения при детекции солидной опухоли у пациента, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP и где агент вводят пациенту.

3. Агент по п. 1 или 2, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественных новообразований предстательной железы, молочной железы, кожи, толстой кишки, легкого, мочевыводящих органов и матки.

4. Агент по п. 1 или 2, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, меланом, рака шейки матки, рака пищевода и рака головы и/или шеи.

5. Агент по п. 4, в котором солидной опухолью является меланома.

6. Агент по п. 1, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет специфичность к человеческому IL1RAP.

7. Агент по п. 1, в котором IL1RAP локализован на поверхности клетки.

8. Агент по п. 1, который способен блокировать связывание одного или большего количества корецепторов с IL1RAP.

9. Агент по п. 8, в котором один или несколько корецепторов выбирают из группы, состоящей из IL1R1, ST2, C-KIT и IL1RL2.

10. Агент по п. 1, который способен индуцировать апоптоз солидных опухолевых клеток.

11. Агент по п. 1, в котором уничтожение клеток индуцируется антителозависимой клеткоопосредованной цитотоксичностью (ADCC).

12. Агент по п. 1, в котором агент содержит или состоит из интактного антитела.

13. Агент по п. 1, который содержит или состоит из антигенсвязывающего фрагмента антитела.

14. Агент по п. 13, в котором антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, состоящей из Fv-фрагментов (например, одноцепочечных Fv, дисульфид-связанных Fv и доменных антител) и Fab-подобных фрагментов (например, Fab-фрагментов, Fab′-фрагментов и F(ab)₂-фрагментов).

15. Агент по п. 1, в котором антитело является рекомбинантным антителом.

16. Агент по п. 1, в котором антитело является моноклональным антителом.

17. Агент по п. 1, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является человеческим или гуманизированным.

18. Агент по п. 1, дополнительно содержащий составляющую для увеличения периода полужизни агента in vivo.

19. Агент по п. 18, в котором составляющую для увеличения периода полужизни in vivo выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), человеческого сывороточного альбумина, групп гликозилирования, жирных кислот и декстрана.

20. Агент по п. 1, дополнительно содержащий цитотоксическую составляющую.

21. Агент по п. 20, в котором цитотоксическая составляющая содержит или состоит из радиоизотопа.

22. Агент по п. 21, в котором радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из астата-211, висмута-212, висмута-213, йода-131, итрия-90, лютеция-177, самария-153 и палладия-109.

23. Агент по п. 20, в котором цитотоксичная составляющая содержит или состоит из токсина.

24. Агент по п. 20, в котором цитотоксичная составляющая содержит или состоит из химиотерапевтического агента.

25. Агент по п. 2, дополнительно содержащий детектируемую составляющую.

26. Агент по п. 25, в котором детектируемая составляющая содержит или состоит из радиоизотопа.

27. Агент по п. 26, в котором радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из технеция-99 м; индия-111; галлия-67; галлия-68; мышьяка-72; циркония-89; йода-12; таллия-201.

28. Агент по п. 25, в котором детектируемая составляющая содержит или состоит из парамагнитного изотопа.

29. Агент по п. 28, в котором парамагнитный изотоп выбирают из группы, состоящей из гадолиния-157; марганца-55; диспрозия-162; хрома-52; железа-56.

30. Применение агента по п. 1 при приготовлении медикамента для лечения или профилактики солидной опухоли у пациента, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, и где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP.

31. Применение агента по п. 2 при приготовлении медикамента для детекции солидной опухоли у пациента, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP и где агент вводят пациенту.

32. Применение по п. 30 или 31, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественных новообразований предстательной железы, молочной железы, кожи, толстой кишки, легкого, мочевыводящих органов и матки.

33. Применение по п. 30 или 31, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, меланом, рака шейки матки, рака пищевода и рака головы и/или шеи.

34. Применение по п. 33, в котором солидной опухолью является меланома.

35. Способ лечения или профилактики солидной опухоли у индивидуума, включающий стадию введения индивидууму эффективного количества агента по п. 1, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP.

36. Способ детекции солидной опухоли у пациентов, включающий стадию введения индивидууму эффективного количества агента по п. 2, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP.

37. Способ по п. 36, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественных новообразований предстательной железы, молочной железы, кожи, толстой кишки, легкого, мочевыводящих органов и матки.

38. Способ по п. 36, в котором солидную опухоль выбирают из группы, состоящей из рака предстательной железы, меланом, рака шейки матки, рака пищевода и рака головы и/или шеи.

39. Способ по п. 38, в котором солидной опухолью является меланома.

40. Применение in vitro агента по п. 2 для детекции солидных опухолевых клеток в образце из пациента, где солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, меланом, рака мочевого пузыря, рака мозга/ЦНС, рака шейки матки, рака пищевода, рака желудка, рака головы/шеи, рака почки, рака печени, лимфом, рака яичника, рака поджелудочной железы и сарком, и где солидные опухолевые клетки экспрессируют IL1RAP.