ВОВЛЕКАЮЩИЕ NK МОЛЕКУЛЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C07K16/46 C12N5/00 A61K35/17 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Данная заявка заявляет приоритет в соответствии с параграфом 119(e) Раздела 35 Кодекса законов США по США № 62/747983, поданной 19 октября 2018 года, все содержимое которой включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ФИНАНСИРОВАНИЕ

[002] Данное изобретение было выполнено при правительственной поддержке в рамках CA111412 и CA65493, выданных Национальными институтами здравоохранения, в рамках CA36725, Ca72669, Ca077598 и Ca197292, выданных Национальным институтом рака, и в рамках CA150085, выданного Департаментом обороны США. Правительство имеет определенные права в изобретении.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[003] Материал в прилагаемом перечне последовательностей тем самым включен посредством ссылки на данную заявку. Прилагаемый текстовый файл перечня последовательностей, с названием GTBIO2090_1WO_SAXE_LISTING.TXT, был создан 15 октября 2019 года и имеет размер 23 Кб. Файл можно просмотреть с помощью Microsoft Word на компьютере, который использует ОС Windows.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[004] Изобретение в целом относится к иммунотерапии и более конкретно к композициям, полезным в вовлечении клеток естественных киллеров (NK) в иммунный ответ.

ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ

[005] Клетки естественные киллеры (NK) представляют собой цитотоксические лимфоциты врожденной иммунной системы, способные к иммунному наздору. Как и цитотоксические Т-лимфоциты, клетки NK доставляют запас мембран-проникающих и апоптоз-индуцирующих гранул гранзимов и перфоринов. В отличие от T-лимфоцитов, клетки NK не требуют индукции антигеном и распознают цели посредством вовлечения активирующими рецепторами при отсутствии распознавания ГКГС. Клетки NK экспрессируют CD16, рецептор активации, который связывается с частью Fc антитела IgG и участвует в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Клетки NK регулируются ИЛ-15, что может вызвать повышенную антиген-зависимую цитотоксичность, лимфокин-активированную активность киллера, и/или ответы, опосредованные интерфероном (ИФН), фактором некроза опухоли (ФНО) и/или гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ). Все эти функции, активированные ИЛ-15, способствуют улучшению защиты от рака.

[006] Терапевтически целесообразный адоптивный перенос клеток NK может, например, индуцировать ремиссию у пациентов с рефрактерным острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), в сочетании с лимфоцит-истощающей химиотерапией и ИЛ-2 с целью стимуляции выживания и размножения in vivo клеток NK. Данная терапия может быть ограничена отсутствием антигенной специфичности и опосредованной ИЛ-2 индукцией регуляторных T-лимфоцитов (Treg), которые подавляют пролиферацию и функцию клеток NK. Создание реагента, который управляет антигенной специфичностью, размножением и/или выживанием клеток NK, в тоже время избегая отрицательных эффектов ингибирования Treg, может усовершенствовать виды иммунотерапий на основе клеток NK.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[007] Данное изобретение относится к соединениям и композициям для активации клеток NK для стимуляции иммунного ответа для лечения рака и других нарушений. В одном варианте осуществления, изобретение предлагает соединение, включающее в себя вовлекающий NK домен; активирующий NK домен, функционально связанный с вовлекающим NK доменом; и нацеливающий домен, который выборочно связывается с целевой клеткой, и функционально связанный с активирующими NK доменом и вовлекающим NK доменом, при этом нацеливающий домен выборочно связывается с CLEC12A.

[008] В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен включает в себя фрагмент, который выборочно связывается с CD16. В некоторых вариантах осуществления, фрагмент вовлекающего NK домена включает в себя антитело, или его связывающий фрагмент, или нанотело, также известное как однодоменное антитело (sdAb или VHH). В некоторых вариантах осуществления, фрагмент связывания антитела включает в себя scFv, F(ab)2, или Fab. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело, является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело, является верблюжьим.

[009] В некоторых вариантах осуществления, активирующий NK домен включает в себя цитокин или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, активирующий NK домен включает в себя ИЛ-15 или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, ИЛ-15 включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или его функциональный вариант. В одном аспекте, функциональный вариант ИЛ-15 включает в себя аминокислотную замену N72D, или N72A, по сравнению с SEQ ID NO: 9.

[0010] В некоторых вариантах осуществления, фрагмент нацеливающего домена включает в себя антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело. В некоторых вариантах осуществления, фрагмент связывания антитела включает в себя scFv, F(ab)2, или Fab.

[0011] В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен включает в себя фрагмент, который выборочно связывается с CD16, активирующий NK домен включает в себя ИЛ-15, а нацеливающий домен выборочно связывается с CLEC12A.

[0012] В некоторых вариантах осуществления, соединения и композиции, описанные в данном документе, содержат, по меньшей мере, одну фланкирующую последовательность, соединяющую два домена. В некоторых вариантах осуществления, соединения и композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат вторую фланкирующую последовательность, соединяющую два связанных домена с третьим доменом. В некоторых вариантах осуществления, фланкирующие последовательности фланкируют активирующий NK домен. В некоторых вариантах осуществления, первая фланкирующая последовательность является C-концевой по отношению к вовлекающему NK домену, а вторая фланкирующая последовательность является N-концевой по отношению к анти-CLEC12A нацеливающему домену.

[0013] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагается выделенная аминокислотная последовательность, включающая в себя SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагается выделенная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

[0014] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагается выделенная аминокислотная последовательность, включающая в себя SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагается выделенная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

[0015] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагается выделенная аминокислотная последовательность, включающая в себя SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагается выделенная последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

[0016] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагаются композиции, включающие в себя соединения, описанные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0017] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагаются способы, включающие в себя: введение субъекту соединения, описанного в данном документе, в количестве, эффективном для индукции NK-опосредованного уничтожения целевой клетки. В некоторых вариантах осуществления, целевая клетка представляет собой раковую клетку.

[0018] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагаются способы стимуляции деления in vivo клеток NK, включающие в себя: введение субъекту количества соединения, описанного в данном документе, эффективного для стимуляции размножения клеток NK в субъекте.

[0019] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагаются способы лечения рака у субъекта, включающие в себя: введение субъекту количества соединения, описанного в данном документе, эффективного для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, рак включает в себя: рак предстательной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак мочевого пузыря, меланому, рак почки, почечный рак, рак полости рта, рак глотки, рак поджелудочной железы, рак матки, рак щитовидной железы, рак кожи, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак яичника, или гемопоэтический рак. В некоторых вариантах осуществления, предложенные в данном документе способы дополнительно включают в себя введение соединения до, одновременно с, или после химиотерапии, хирургической резекции опухоли, или лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления, химиотерапия включает в себя альтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, коласпазу, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитофосфан, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, фторурацил, флударабин, фотемустин, ганцикловир, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митомицин С, нимустина, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, прокарбазин, ралтитрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, тиотепа, топотекан, винбластин, винкрестин, виндезин, и винорелбин. В некоторых вариантах осуществления, гемопоэтический рак представляет собой ОМЛ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0020] Фиг. 1A-1C иллюстрируют пролиферацию клеток NK (Фиг. 1A), уничтожение NK клетками (Фиг. 1B), и функциональный анализ (Фиг. 1C) при лечении с помощью CLEC12A TriKE.

[0021] Фиг. 2 иллюстрирует процент экспрессии CD33 и Clec12A на поверхности на первичных образцах ОМЛ из 10 пациентов.

[0022] Фиг. 3A-3B иллюстрируют CD16-IL15-CLEC12A TriKE (Фиг. 3A) и механизм действия (Фиг. 3B).

[0023] Фиг. 4 иллюстрирует связывание CD16-IL15-CLEC12A TriKE с целями, которые экспрессируют CLEC12A.

[0024] Фиг. 5A-5B иллюстрируют способствование CD16-IL15-CLEC12A TriKE пролиферации клеток NK.

[0025] Фиг. 6A-6C иллюстрируют индукцию CD16-IL15-CLEC12A TriKE дегрануляции (Фиг. 6A) и продукции цитокинов (Фиг. 6B-C) против целевых клеток ОМЛ.

[0026] Фиг. 7A-7B иллюстрируют индукцию CD16-IL15-CLEC12A TriKE уничтожения целевых клеток ОМЛ.

[0027] Фиг. 8A-8D иллюстрируют индуцированное CD16-IL15-CLEC12A TriKE уничтожение первичных целей ОМЛ in vitro.

[0028] Фиг. 9A-9C иллюстрируют индукцию CD16-IL15-CLEC12A TriKE пролиферации клеток NK.

[0029] Фиг. 10A-10D иллюстрируют валидацию функции CD16-IL15-CLEC12A TriKE.

[0030] Фиг. 11A-11C иллюстрируют индукцию CD16-IL15-CLEC12A TriKE уничтожения целевых клеток в анализе визуализации в реальном времени. Показаны опухолевые цели THP-1.

[0031] Фиг. 12A-12G иллюстрируют CD16-IL15-CLEC12A TriKE-индуцированное уничтожение первичных бластных клеток ОМЛ.

[0032] Фиг. 13A-13G иллюстрируют то, что CD16-IL15-CLEC12A ограничивает TriKE рост опухоли in vivo.

[0033] Фиг. 14A-14C иллюстрируют валидацию связывания CD16-IL15-CLEC12A TriKE.

[0034] Фиг. 15A-15B иллюстрируют индукцию CD16-IL15-CLEC12A TriKE уничтожения целевых клеток в анализе визуализации в реальном времени. Показаны опухолевые цели HL-60.

[0035] Фиг. 16A-16B иллюстрируют CD16-IL15-CLEC12A TriKE-опосредованное уничтожение целей. Показаны стратегия гейтирования целей (Фиг. 16A) и уничтожение целевых клеток (Фиг. 16B). Показаны цели в виде бластных клеток ОМЛ.

[0036] Фиг. 17 иллюстрирует стратегию гейтинга для индентификации раковых стволовых клеток в образцах костного мозга из пациентов ОМЛ.

[0037] Фиг. 18a-18B иллюстрируют экспрессию CLEC12A и CD33 в пределах компартмента предшественников CD34pos в костном мозге. Показаны популяции клеток из двух репрезентативных доноров (Фиг. 18A) и клеточные колонии после обработки указанным TriKE (Фиг. 18B).

[0038] Фиг. 19 иллюстрирует стратегию гейтинга для определения различных субпопуляций предшественников CD34pos в образцах костного мозга из здоровых субъектов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0039] Клетки естественные-киллеры (NK) представляют собой цитотоксические лимфоциты врожденной иммунной системы, способные к иммунному наздору. Как и цитотоксические Т-лимфоциты, клетки NK доставляют запас мембран-проникающих и апоптоз-индуцирующих гранул гранзимов и перфоринов. В отличие от T-лимфоцитов, клетки NK не требуют индукции антигеном и распознают цели посредством вовлечения активирующими рецепторами при отсутствии распознавания ГКГС. Клетки NK экспрессируют CD16, рецептор активации, который связывается с частью Fc антитела IgG и участвует в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Клетки NK регулируются ИЛ-15, что может вызвать повышенную антиген-зависимую цитотоксичность, лимфокин-активированную активность киллера, и/или ответы, опосредованные интерфероном (ИФН), фактором некроза опухоли (ФНО) и/или гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ). Все эти функции, активированные ИЛ-15, способствуют улучшению защиты от рака.

[0040] Терапевтически целесообразный адоптивный перенос клеток NK может, например, индуцировать ремиссию у пациентов с рефрактерным острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), в сочетании с лимфоцит-истощающей химиотерапией и ИЛ-2 с целью стимуляции выживания и размножения in vivo клеток NK. Данная терапия может быть ограничена отсутствием антигенной специфичности и опосредованной ИЛ-2 индукцией регуляторных T-лимфоцитов (Treg), которые подавляют пролиферацию и функцию клеток NK. Создание реагента, который управляет антигенной специфичностью, размножением и/или выживанием клеток NK, в тоже время избегая отрицательных эффектов ингибирования Treg, может усовершенствовать виды иммунотерапий на основе клеток NK.

[0041] Данное раскрытие изобретения описывает генерацию триспецифичной молекулы, которая включает в себя два домены, способные направлять опосредованное NK-клетками уничтожение опухолевых клеток (например, CD33+ и/или CD33- опухолевых клеток), и внутримолекулярный активирующий NK домен, способный генерировать сигнал самоподдержания NK клеток. Триспецифичная молекула может активизировать пролиферацию клеток NK и/или усиливать обусловленную клетками NK цитотоксичность против, например, целей HL-60, раковых клеток, или клеточных линий, полученных из раковых клеток.

[0042] Изобретение основано на разработке триспецифических CD16/ИЛ-15/CD33, вовлекающих клетки-киллеры, молекул (TriKE) для поражения клеток острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) с помощью клеток естественных киллеров. Данная молекула содержит анти-CD16 верблюжье нанотело для активации клеток NK, анти-CD33 одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) для вовлечения раковых целей, и молекулу ИЛ15, которая управляет примированием, размножением и выживанием клеток NK. Используя более раннюю версию данной молекулы, было показано, что CD33 TriKE эффективна в активации клеток NK против целей ОМЛ in vitro и in vivo. Эти доклинические данные привели к запуску клинических испытаний у рефрактерных пациентов с ОМЛ в Университете Миннесоты, с запуском Q3 2018. Хотя эти предыдущие исследования проверили использование TriKE в качестве эффективной стратегии приспосабливания клеток NK к иммунотерапии рака, CD33 имеет ограничения в качестве целевого антигена.

[0043] Высокая смертность и низкие показатели выживаемости в течение пяти лет (26%) для пациентов с ОМЛ могут быть связаны с устойчивостью к химиотерапии и рецидивом заболевания. Большинство из лейкозных стволовых клеток (ЛСК), устойчивых к химиотерапии, для которых предсказано содействие рецидиву, не экспрессируют CD33. Кроме того, все гемопоэтические стволовые клетки и нормальные миелоидные клетки экспрессируют CD33, таким образом, нацеливание на этот антиген может привести к тяжелым дефектам гемопоэза и целевой/неопухолевой токсичности. Для устранения этих ограничений, в данном документе описывается разработка TriKE, которая нацелена на CLEC12A или молекулу 1, подобную лектину С-типа (CLL1). CLEC12A в значительной степени экспрессируется на клетках ОМЛ и более 70% CD33-отрицательных клеток экспрессируют CLEC12A. Она была отнесена к маркеру стволовых клеток при ОМЛ, который выборочно сверхэкспрессируется в ЛСК. CLEC12A экспрессируется CD34+/CD38- ЛСК, но не обычным CD34+/CD38 гемопоэтическими стволовыми клетками в регенерирующем костном мозге, тем самым минимизируя мимоцелевые эффекты. Член А семейства 12 с доменом лектина С-типа - белок, который у людей кодируется геном CLEC12A. Этот ген кодирует члена суперсемейства лектин C-типа/лектин C-типа-подобный домен (CTL/CTLD). Члены этой семьи имеют характерный фолдинг белка и имеют разнообразные функции, такие как адгезия клеток, сигналинг клетка-клетка, обращение гликопротеина, и роли в воспалении и иммунном ответе. Белок, кодируемый этим геном, является негативным регулятором функции гранулоцитов и моноцитов. Было описано несколько вариантов транскриптов данного гена, как результат альтернативного сплайсинга, но не было определено происхождение некоторых полноразмерных транскриптов из этих вариантов. Этот ген тесно связан с другими членами суперсемейства CTL/CTLD в области генного комплекса естественного киллера на хромосоме 12p13.

[0044] Соединения BiKE и TriKE

[0045] Были произведены биспецифические гибриды, которые содержат анти-человеческий анти-CD16 scFv, полученный посредством технологии библиотеки фагового дисплея человека (McCall et al., 1999. Mol Immunol. 36:433-445). Клетки NK опосредуют антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) через рецептор CD16 (FcγRIII). Сигналинг через рецептор CD16 индуцирует потоки кальция и фосфорилирование ITAM, вызывая высвобождение литических гранул и цитокинов, таких как интерферон (ИФНγ) и фактор некроза опухоли (ФНОα). Биспецифическая молекула была разработана для того, чтобы приводить в действие рецептор CD16 в сочетании с другими молекулами-мишенями (Gleason et al. Blood. 2014 (19):3016-26), в качестве так называемой биспецифической, вовлекающей киллера, молекулы (BiKE). С одним scFv, распознающим клетки NK, и вторым scFv, распознающим опухолевый антиген, BiKE может заметно усиливать цитотоксическое уничтожение при различных раковых заболеваниях человека. Одна иллюстративная BiKE нацелена на CD33 и усиливала ответы клеток NK против острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и миелодипластического синдрома (МДС). МДС - это клональное гетерогенное нарушение стволовых клеток, характеризующееся нормальным или гиперклеточным костным мозгом (КМ) с цитопениями периферической крови (ПК) и повышенным риском прогрессирования к ОМЛ.

[0046] Клетки NK реагируют на различные цитокины, включая, например, ИЛ-15, который участвует в гомеостазе, пролиферации, выживании, активации и/или развитии клеток NK. Например, ИЛ-15 может активировать клетки NK и может восстанавливать функциональные дефекты у вживленных клеток NK после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). ИЛ-15 и ИЛ-2 имеют общие несколько компонентов сигналинга, включая ИЛ-2/ИЛ-15Rβ (CD122) и общую гамма цепь (CD132). В отличие от ИЛ-2, ИЛ-15 не стимулирует Treg, позволяя активировать клетки NK, обходя подавление иммунного ответа клетками Treg. Помимо способствования гомеостазу и пролиферации клеток NK, ИЛ-15 может восстанавливать функциональные дефекты клеток NK, которые могут возникнуть в условиях после трансплантации. ИЛ-15 также может стимулировать функцию CD8+ Т-лимфоцитов, дополнительно усиливая их иммунотерапевтический потенциал. Кроме того, на основании доклинических исследований профили токсичности ИЛ-15 могут быть более предпочтительными, чем ИЛ-2 при низких дозах. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, описанные в данном документе композиции можно использовать для активации клеток NK и управления примированием, размножением и выживанием клеток NK.

[0047] Данное раскрытие изобретения описывает, в одном аспекте, вовлекающие киллеров триспецифические молекулы (TriKE), которые, как правило, включают в себя один, или один или большее количество нацеливающих доменов (которые нацелены, например, на опухолевую клетку или инфицированную вирусом клетку), и один или большее количество доменов активации NK цитокинами (например, ИЛ-15, ИЛ-12, ИЛ-18, ИЛ-21 или другими цитокинами, хемокинами и/или активирующими молекулами, усиливающими функции клеток NK), причем каждый домен функционально связан с другими доменами. В контексте данного документа, термин «функционально связанный» относится к прямому или непрямому ковалентному связыванию. Таким образом, два функционально связанных домены могут быть напрямую ковалентно соединены друг с другом. Напротив, два функционально связанных домены могут быть соединены посредством совместного ковалентного связывания с промежуточным фрагментом (например, и фланкирующей последовательностью). Два домены могут считаться функционально связанными, если, например, они разделены третьим доменом, с или без, одной или большего количества промежуточных фланкирующих последовательностей.

[0048] Иллюстративные молекулы или соединения BiKE и TriKE описаны в WO2017062604, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[0049] В данном раскрытии изобретения описаны, в некоторых вариантах осуществления, соединения, которые включают в себя вовлекающий NK домен; активирующий NK домен, функционально связанный с вовлекающим NK доменом; и нацеливающий домен, который выборочно связывается с целевой клеткой и функционально связан с активирующим NK доменом и вовлекающим NK доменом, при этом нацеливающий домен выборочно связывается с целевой молекулой. Целевая молекула может экспрессироваться, например, на поверхности целевой клетки. Целевая клетка может быть, например, опухолевой. В некоторых вариантах осуществления, целевой домен выборочно связывается с CLEC12A.

[0050] В контексте данного документа, термины «выборочное связывание» или «выборочно связывается» применительно к взаимодействию связывающей молекулы или домена, описанного в данном документе, например, антитела или домена вовлечения, домена активации или домена нацеливания, и его партнера по связыванию, например, антигена или рецептора, означает, что взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры, например антигенной детерминанты, или эпитопа, или аминокислотной последовательности, у партнера по связыванию. Другими словами, связывающая молекула или домен преимущественно связывают или распознают партнера по связыванию, даже когда партнер по связыванию присутствует в смеси других молекул. Связывание может быть опосредовано ковалентным или нековалентным взаимодействиям, или комбинацией обеих. Термины «выборочно связывающийся(айся)» или «выборочно связывается», и «специфически связывающийся(айся)» или «специфически связывается», могут использоваться взаимозаменяемо.

[0051] Соединения, описанные в данном документе, могут иметь или не иметь тэг His. Тэг His делает возможной очистку белка и может быть полезным, например, в исследовательских разработках, например. Тэг His может быть помещен на C-конце или на N-конце соединений или молекул, описанных в данном документе, и может включать в себя спейсер, N-концевой или C-концевой по отношению к тэгу His. Например, тэг His, который помещают на C-конце соединения или молекулы, описанных в данном документе, может включать в себя спейсер, N-концевой по отношению к тэгу His. В качестве другого примера, тэг His, который помещают на N-конце соединения или молекулы, описанных в данном документе, может включать в себя спейсер, C-концевой по отношению к тэгу His. Иллюстративный тэг His с спейсером представляет собой SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 может быть размещен на C-конце соединений, описанных в данном документе. Специалист в данной области техники примет во внимание, что любое количество повторов His может составлять тэг His, и что может быть использована или не использована любая спейсерная последовательность любой длины.

[0052] В некоторых вариантах осуществления, соединение или молекула TriKE, что выборочно связывается с CLEC12A, включает в себя аминокислотую последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, соединение или молекула TriKE, что выборочно связывается с CLEC12A, включает в себя аминокислотую последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, нацеливающий домен соединений, описанных в данном документе, что выборочно связывается с CLEC12A, включает в себя выделенную аминокислотую последовательность SEQ ID NO: 4.

[0053] В данном документе также описаны последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4. Например, SEQ ID NO: 1 может кодироваться SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 2 может кодироваться SEQ ID NO: 6, и SEQ ID NO: 4 может кодироваться SEQ ID NO: 7. Специалист в данной области техники примет во внимание, что любые функциональные варианты молекул нуклеиновой кислоты, предложенные в данном документе, предусмотрены в данном раскрытии изобретения. Функциональные варианты представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, которые могут быть транслированы для обеспечения аминокислотной последовательности, гомологичной или идентичной таковой транслированной исходной молекулы.

[0054] Вовлекающий NK домен

[0055] Вовлекающий NK домен может включать в себя любой фрагмент, который связывается и/или активирует клетку NK, и/или любой фрагмент, который блокирует ингибирование клетки NK. Иллюстративные домены вовлечения клеток NK включают в себя фрагмент, который связывается, например, CD16, CD16+CD2, CD16+DNAM, или CD16+NKp46. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий домен включает в себя фрагмент, который выборочно связывается с CD16. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен активирует клетку NK. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен блокирует ингибирование клетки NK.

[0056] В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может включать в себя антитело, которое выборочно связывается с компонентом поверхности клетки NK. В других вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может включать в себя лиганд или малую молекулу, которая выборочно связывается с компонентом поверхности клетки NK. В контексте данного документа, термин «выборочно связывает» относится к способности различения между двумя или большим количеством вариантов, такой как, например, наличие различающейся аффинности, в любой степени, к конкретной цели. В контексте данного документа, «антитело» в целом относится к иммуноглобулину или его фрагменту, и, таким образом, охватывает моноклональное антитело, его фрагмент (например, scFv, Fab, F(ab’)2, Fv или другие модифицированные формы), комбинацию моноклональных антител и/или его фрагментов, и/или комбинацию поликлональных антител. Таким образом, для краткости, отсылка к антителу, которое выборочно связывается с компонентом поверхности клетки NK, включает в себя любой фрагмент антител, который проявляет описанный характер связывания. Подобным образом, отсылка к лиганду, который выборочно связывается с компонентом поверхности клетки NK, включает в себя любой фрагмент лиганда, который проявляет описанный характер связывания.

[0057] В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может выборочно связываться с рецептором, по меньшей мере, частично расположенным на поверхности клетки NK. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может обеспечивать функцию связывания клетки NK, и тем самым приводить NK в пространственную близость с целью, с которой нацеливающий домен - более подробно описанный ниже - выборочно связывается. Однако, в некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может выборочно связываться с рецептором, который активирует клетку NK и, следовательно, также обладает функцией активации. Как описано выше, активация рецептора CD16 может вызвать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может включать в себя по меньшей мере часть анти-рецептор CD16 антитела, эффективного для выборочного связывания с рецептором CD16. В других вариантах осуществления, вовлекающий NK клетки домен может препятствовать механизмам, которые ингибируют клетки NK. В таких вариантах осуществления, вовлекающий NK домен может включать в себя, например, анти-PD1/PDL1, анти-NKG2A, анти-TIGIT, анти-иммуноглобулиновый рецептор киллера (KIR), и/или любой другой домен, блокирующий ингибирование.

[0058] Можно спроектировать вовлекающий NK домен для получения желаемой степени селективности NK и, следовательно, желаемого иммунного характера вовлечения. Например, CD16 был определен как рецепторы Fc: FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIIb (CD16b). Данные рецепторы связываются с частью Fc антител IgG, которая затем активирует клетку NK для антитело-зависимой клеточной цитотоксичности. Анти-CD16 антитела выборочно связываются с клетками NK, но также могут связываться с нейтрофилами. Анти-CD16a антитела выборочно связываются с клетками NK, но не связываются с нейтрофилами. Вариант осуществления TriKE, который включает в себя вовлекающий NK домен, который включает в себя анти-CD16a антитело, может связываться с клетками NK, но не связывается с нейтрофилами. Таким образом, в обстоятельствах, когда требуется вовлечь клетки NK, но не вовлечь нейтрофилы, можно разработать вовлекающий NK домен для TriKE, чтобы включить анти-CD16a антитело.

[0059] Хотя и описан в данном документе в контексте различных вариантов осуществления, в которых вовлекающий NK домен содержит анти-рецептор CD16 scFv, вовлекающий NK домен может включать в себя любое антитело или другой лиганд, который выборочно связывается с рецептором CD16. Более того, вовлекающий NK домен может включать в себя антитело или лиганд, который выборочно связывается с любым рецептором клетки NK, таким как, например, рецептор 2B4 клеточной цитотоксичности, низкоаффинным Fc рецептором CD16, рецепторами, подобными иммуноглобулину клетки-киллера (KIR), CD2, NKG2A, TIGIT, NKG2C, LIR-1, и/или DNAM-1. В одном варианте осуществления, композиция по изобретению представляет собой конструкцию в функциональной связи NKG2C/ИЛ-15/CD33. Следует понимать, что размещение фрагментов может быть изменено на основе анализов активности (например, CD33/ИЛ-15/NKG2C).

[0060] В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен включает в себя антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело. Связывающий фрагмент антитела может представлять собой scFv, F(ab)2, или Fab. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающий NK домен включает в себя нанотело. В некоторых вариантах осуществления, молекула вовлечения клетки NK может включать в себя использование гуманизированной молекулы вовлечения CD16, полученной из животного нанотела. В то время как scFv имеет компонент вариабельной области тяжелой цепи и компонент вариабельной области легкой цепи, соединенные линкером, нанотело состоит из одной мономерной вариабельной области цепи, то есть вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, которая способна специфически вовлекать цель. Нанотело может быть получено из антитела любого подходящего животного, такого как, например, верблюжьего животного (например, ламы или верблюда), или хрящевой рыбы. Нанотело может обеспечить превосходную физическую стабильность, способность связываться с глубокими желобками, и повышенный выход продукта по сравнению с более крупными фрагментами антител.

[0061] В одном иллюстративном варианте осуществления, вовлекающая NK молекула на основе нанотела может включать в себя гуманизированное нанотело CD16, полученное из опубликованного нанотела ламы (последовательность GeneBank EF561291; Behar et al., 2008. Protein Eng Des Sel. 21(1):1-10), обозначенного как EF91. EF91 ламы изначально было встроено в BiKE, содержащую CD19, чтобы проверить способность этой молекулы вовлечения CD16 приводить к активации клеток NK. Она показала функциональность, аналогичную ритуксимаб-опосредованому уничтожению в анализе высвобождения хрома с целями Raji. После подтверждения функциональности молекулы, CDR были клонированы в гуманизированный верблюжий каркас (Vincke et al., 2009. J Biol Chem. 284(5):3273-3284) для гуманизации молекулы, вовлекающей CD16, теперь обозначенной как HuEF91. Связывание HuEF91 является эквивалентным связыванию, наблюдаемому при использовании стандартного CD16 scFv, что указывает на то, что встраивание вариабельной области тяжелой цепи нанотела ламы в гуманизированный каркас не препятствует специфичности молекулы. Использование HUEF91 в качестве молекулы вовлечения NK в вовлекающих молекулах TriKE, описанных в данном документе, может увеличить выход лекарства, увеличить устойчивость, и/или увеличить эффективность АЗКЦ, опосредованной клетками NK.

[0062] Так, согласно некоторым вариантам осуществления, антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело, является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления, антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело, является верблюжьим.

[0063] Активирующий NK домен

[0064] Активирующий NK домен может включать в себя аминокислотную последовательность, которая активирует клетки NK, способствует поддержанию клеток NK, или иным образом способствует активности клеток NK. Активирующий NK домен может представлять собой, или может быть получен из, один(одного) или больше цитокинов, которые могут активировать и/или поддерживать клетки NK. В контексте данного документа, термин «полученный из» относится к аминокислотному фрагменту цитокина (например, ИЛ-15), которого достаточного для обеспечения активирующей и/или поддерживающей клетки NK активности. В вариантах осуществления, которые включают в себя больше чем один активирующий NK домен, активирующие NK домены могут быть предоставлены последовательно или в любой другой комбинации. Дополнительно, каждый активирующий NK домен на основе цитокина может включать в себя либо полную аминокислотную последовательность цитокина, либо может представлять собой аминокислотный фрагмент, не зависимо от характера других активирующих NK доменов, включенных в молекулу TriKE. Иллюстративные цитокины, на которых может основываться активирующий NK домен, включают в себя, например, ИЛ-15, ИЛ-18, ИЛ-12 и ИЛ-21. Таким образом, хотя и подробно описано в данном документе в контексте иллюстративного модельного варианта осуществления, в котором активирующий NK домен получают из ИЛ-15, TriKE может быть спроектирована с использованием активирующего NK домена, который является, или получают из, любым(ого) подходящим(его) цитокином(а).

[0065] Для краткости в данном описании отсылка к активирующему NK домену путем определения цитокина, на котором он основан, включает в себя полную аминокислотную последовательность цитокина, любой подходящий аминокислотный фрагмент цитокина, и также модифицированную версию цитокина, которая включает в себя одну или большее количество аминокислотных замен. Таким образом, отсылка к активирующему NK домену «ИЛ-15» включает в себя активирующий NK домен, который включает в себя полную аминокислотную последовательность ИЛ-15, активирующий NK домен, который включает в себя фрагмент ИЛ-15, или активирующий NK домен, такой как, например, ИЛ-15N72D или ИЛ-15N72A, который включает в себя аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью ИЛ-15 дикого типа.

[0066] Использование активирующего NK домена ИЛ-15 в TriKE может обеспечить устойчивую активность клеток NK - как показано в мышиной модели, демонстрирующей, что уровень клеток NK человека резко увеличивается, а раковых - снижается, даже спустя три недели. Клетки NK активируются у мышей для продуцирования набора противораковых факторов и цитокинов. Кроме того, активирующий NK домен ИЛ-15 может изменять химию данных молекул, так что они легче повторно свертываются и/или выделяются с большим выходом, что делает молекулы TriKE более подходящими для клинического масштабирования.

[0067] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, активирующий NK домен включает в себя цитокин или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, активирующий домен включает в себя ИЛ-15 или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, ИЛ-15 является ИЛ-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, ИЛ-15 является человеческим. В некоторых вариантах осуществления, ИЛ-15 представляет собой человеческий ИЛ-15 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, ИЛ-15 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или его функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления, функциональный вариант ИЛ-15 содержит аминокислотные замены N72D или N72A по сравнению с SEQ ID NO: 9.

[0068] В контексте данного документа, термин «функциональный вариант» относится к молекуле, включая связывающую молекулу, например, содержащую нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая изменена на один или большее количество нуклеотидов и/или аминокислот по сравнению с нуклеотидными и/или аминокислотными последовательностями исходной молекулы. Для связывающей молекулы, функциональный вариант все еще способен конкурировать за связывание с партнером по связыванию с исходной связывающей молекулой. Другими словами, модификации в аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности исходной связывающей молекулы существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания связывающей молекулы, кодируемой нуклеотидной последовательностью, или содержащей аминокислотную последовательность, т. е. связывающая молекула все еще способна распознавать и связывать свою цель. Функциональный вариант может иметь консервативные модификации последовательности, включая нуклеотидные и аминокислотные замены, вставки и делеции. Эти модификации могут быть внесены с помощью стандартных методов, известных в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и случайный мутагенез, опосредованный ПЦР.

[0069] Функциональные варианты могут также включать в себя, но не ограничиваются лишь производными, которые по существу сходны по первичной структурной последовательности, но которые содержат, например, модификации in vitro или in vivo, химические и/или биохимические, которые не обнаруживаются в исходной связывающей молекуле. Такие модификации включают в себя, среди прочего: ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование, убиквитинирование и т. п.

[0070] Нацеливающий домен и цели

[0071] Нацеливающий домен может включать в себя любой фрагмент, который выборочно связывается с предполагаемой целью, такой как, например, опухолевая клетка, цель в раковой строме, цель на ингибирующей клетке, такой как супрессорные клетки, происходящие из миелоидных, которые являются CD33+, или целью на зараженной вирусом клетке. Таким образом, нацеливающий домен может включать в себя, например, противоопухолевое антитело, такое как: ритуксимаб (анти-CD20), афутузумаб (анти-CD20), трастузумаб (анти-HER2/neu), пертузумаб (анти-HER2/neu), лабетузумаб (анти-CEA), адекатумумаб (анти-EpCAM), цитатузумаб богатокс (анти-EpCAM), эдреколомаб (анти-EpCAM), аркитумомаб (анти-CEA), бевацизумаб (анти-VEGF-A), цетуксимаб (анти-EGFR), нимотузумаб (анти-EGFR), панитумумаб (анти-EGFR), залутумумаб (анти-EGFR), гемтузумаб озогамицин (анти-CD33), линтузумаб (анти-CD33), этарацизумаб (анти-интегрин α_vβ₃), интетумумаб (анти-CD51), ипилимумаб (анти-CD152), ореговомаб (анти-CA-125), вотумумаб (противоопухолевый антиген CTAA16.88) или пемтумумаб (анти-MUC1), анти-CD19, анти-CD22, анти-CD133, анти-CD38, антимезотелин, анти-ROR1, CSPG4, SS1 или IGFR1. Любой маркер опухоли может быть целью. В некоторых вариантах осуществления, нацеливающий домен, или антиген-цель, связанный с опухолью, может включать в себя: CD133, CD20, HER2, CEA, EpCAM, VEGF-A, EGFR, CD33, интегрин αVβ3, CD51, CD152, CD125, CTAA16.88, MUC1, CD19, CD22, CD38, мезотелин, ROR1, CSPG4, SS1 или IGFR1, членов семейства NKG2, включая, без ограничения, 2A, 2B, 2C и т. п., BCMA, APRIL, B7H3 и PSMA, в качестве примера.

[0072] В некоторых вариантах осуществления, целевая клетка представляет собой опухолевую клетку. В некоторых вариантах осуществления, опухолевая клетка является CD33+. В некоторых вариантах осуществления, опухолевая клетка является CD33-. В некоторых вариантах осуществления, опухолевая клетка представляет собой гемопоэтическую злокачественную клетку. В некоторых вариантах осуществления, опухолевая клетка представляет собой лейкозную клетку. В некоторых вариантах осуществления, лейкозная клетка представляет собой клетку острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). В других вариантах осуществления, нацеливающий домен может выборочно связываться с целью на клетке, инфицированной вирусом, таким как, например, EBV, HBV, HCV и/или HPV. В некоторых вариантах осуществления, вирусная цель представляет собой опухолевый маркер или опухолевый антиген. Целью может быть любой вирусный опухолевый маркер или невирусный опухолевый маркер.

[0073] Фрагмент нацеливающего домена может включать в себя антитело или связывающий фрагмент антитела, или нанотело, как описано выше. Связывающий фрагмент антитела может содержать scFv, F(ab)2, или Fab.

[0074] В некоторых конкретных вариантах осуществления, нацеливающий домен может включать в себя анти-CLEC12A антитело. В других конкретных вариантах осуществления, может быть встроен второй нацеливающий домен. Второй нацеливающий домен может включать в себя фрагмент, который может связываться с любой из целей, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления, второй нацеливающий домен может выборочно связываться с CD33.

[0075] В некоторых вариантах осуществления, соединения, описанные в данном документе, включают в себя вовлекающий NK домен, имеющий фрагмент, который выборочно связывается с CD16, активирующий домен, имеющий ИЛ-15, и нацеливающий домен, который выборочно связывается с CLEC12A. Термины «CLEC12A Trike», «1615CLEC12A TriKe» и «CD16-IL15-CLEC12A TriKE» могут использоваться взаимозаменяемо для обозначения TriKE, которая нацелена на CLEC12A, до тех пор, пока контекст явно не указывает на иное.

[0076] Фланкирующие последовательности

[0077] В некоторых вариантах осуществления, соединения, описанные в данном документе, могут дополнительно включать в себя фланкирующую последовательность или линкерную последовательность, которая может соединять два из вышеописанных доменов. Термины «фланкирующая последовательность» и «линкерная последовательность» могут использоваться взаимозаменяемо, если контекст явно не указывает на иное. В некоторых вариантах осуществления, присутствие фланкирующей последовательности может дополнительно увеличивать активацию клеток NK. Любая аминокислотная последовательность может быть фланкирующей последовательностью или линкерной последовательностью. Одна иллюстративная фланкирующая последовательность включает в себя 20 аминокислот SEQ ID NO: 13. Другая иллюстративная фланкирующая последовательность включает в себ семь аминокислот SEQ ID NO: 14. Еще другие иллюстративные фланкирующие последовательности включают в себя SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 15. В качестве еще одного примера, любое количество повторов аминокислотной последовательности может являться фланкирующей последовательностью или линкерной последовательностью. Например, любое количество повторов последовательности SEQ ID NO: 15 может являться фланкирующей последовательностью или линкерной последовательностью. Повторы последовательности могут быть полными или частичными, а полные или частичные повторы могут быть в начале, т. е. на N-конце, или в конце, то есть на C-конце, фланкирующей последовательности или линкерной последовательности. Фланкирующие последовательности могут иметь любую ориентацию.

[0078] Некоторые варианты осуществления (например, 1615CLEC12A TriKE без тэга His, SEQ ID NO: 1 или 1615CLEC12A TriKE с тэгом His, SEQ ID NO: 2) могут включать в себя больше чем одну фланкирующую последовательность. В качестве одного примера, SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2 включают в себя фланкирующую последовательность SEQ ID NO: 11 для связывания вовлекающего NK домена (например, анти-рецептор CD16 scFv) с активирующим NK доменом (например, ИЛ-15). SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2 также включают в себя фланкирующую последовательность SEQ ID NO: 12 для связывания активирующего NK домена с нацеливающим доменом (например, анти-CLEC12A scFv). Фланкирующие последовательности, которые соединяют домены молекулы, могут быть одинаковыми или разными. Например, одинаковые или разные фланкирующие последовательности могут соединять вовлекающий NK домен (например, анти-рецептор CD16 scFv) с активирующим NK доменом (например, ИЛ-15), и активирующий NK домен с нацеливающим доменом (например, анти-CLEC12A scFv). В некоторых вариантах осуществления, конструкции, в которых отсутствует фланкирующая последовательность, проявляют пониженную активность по сравнению с конструкциями, которые обладают фланкирующей последовательностью.

[0079] В некоторых вариантах осуществления, соединения, описанные в данном документе, включают в себя по меньшей мере одну фланкирующую последовательность, соединяющую два домены. В некоторых вариантах осуществления, соединения, описанные в данном документе, дополнительно включают в себя вторую фланкирующую последовательность, соединяющую два соединенных домена с третьим доменом. В некоторых вариантах осуществления, фланкирующие последовательности являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления, фланкирующие последовательности являются разными.

[0080] В некоторых вариантах осуществления, фланкирующие последовательности фланкируют активирующий NK домен. В некоторых вариантах осуществления, первая фланкирующая последовательность является C-концевой по отношению к домену вовлечения NK. В некоторых вариантах осуществления, вторая фланкирующая последовательность является N-концевой по отношению к анти-CLEC12A нацеливающему домену. В некоторых вариантах осуществления, первая фланкирующая последовательность является C-концевой по отношению к вовлекающему NK домену, а вторая фланкирующая последовательность является N-концевой по отношению к анти-CLEC12A нацеливающему домену.

[0081] Готовые формы

[0082] Соединения, описанные в данном документе, могут быть приготовлены с фармацевтически приемлемым носителем. В контексте данного документа, термин «носитель» включает в себя любой растворитель, дисперсионную среду, переносчик, покрытие, разбавитель, антибактериальный и/или противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий абсорбцию, буфер, раствор носителя, суспензию, коллоид и т. п. Использование таких сред и/или агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любая обычная среда или агент несовместимы с активным ингредиентом, предполагается их использование в терапевтических композициях. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты. В контексте данного документа, термин «фармацевтически приемлемый» относится к материалу, который не является нежелательным с биологической или иной точки зрения, т. е. материал может вводиться индивиду вместе с молекулой TriKE, не вызывая каких-либо нежелательных биологических эффектов, или не взаимодействуя вредным образом с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в которой он содержится.

[0083] Таким образом, молекула TriKE может быть приготовлена в виде фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в различных формах, адаптированных к предпочтительному пути введения. Таким образом, композиция может быть введена через известные пути, включая, например, пероральный, парентеральный (например, внутрикожный, чрескожный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный и т.д.) или местный (например, интраназальный, внутрилегочный, интрамаммарный, интравагинальный, внутриматочный, внутрикожный, чрескожный, ректальный и др.). Фармацевтическая композиция может быть нанесена на поверхность слизистой оболочки, например, путем нанесения, например, на слизистую оболочку носа или дыхательных путей (например, с помощью спрея или аэрозоля). Композиция также может быть введена путем устойчивого или отсроченного высвобождения.

[0084] Таким образом, молекула TriKE может быть предоставлена в любой подходящей форме, включая, без ограничения, раствор, суспензию, эмульсию, спрей, аэрозоль или любую форму смеси. Композиция может быть доставлена в готовой форме с любым фармацевтически приемлемым эксципиентом, носителем или переносчиком. Например, препарат может быть доставлен в обычной дозированной готовой форме для местного применения, такой как, например, крем, мазь, аэрозольный состав, неаэрозольный спрей, гель, лосьон и т. п. Готовая форма может дополнительно включать в себя одну или большее количество добавок, включая, например, адъювант, усилитель проникновения через кожу, краситель, вкусовую добавку, ароматизатор, увлажнитель, загуститель и т. п.

[0085] Композиция может быть удобно представлена в виде дозированной единицы готовой формы и может быть приготовлена с помощью способов, хорошо известных в области фармацевтики. Способы приготовления композиции с фармацевтически приемлемым носителем включают в себя этап объединения молекулы TriKE с носителем, который вмещает один или большее количество вспомогательных ингредиентов. В целом, готовая форма может быть приготовлена путем равномерного и/или тщательного объединения активной молекулы с жидким носителем, тонко измельченным твердым носителем, или с обеими, а затем, если необходимо, придания продукту формы желаемых лекарственных форм.

[0086] Способы лечения

[0087] В некоторых вариантах осуществления, в данном документе предлагаются способы, включающие в себя введение субъекту соединения или молекулы, описанных в данном документе, в количестве, эффективном для индукции NK-опосредованного уничтожения целевой клетки. Любая клетка может быть целевой клеткой. В некоторых вариантах осуществления, целевая клетка представляет собой раковую клетку. Описанные в данном документе способы могут включать в себя введение субъекту молекулы TriKE в количестве, эффективном для индукции NK-опосредованного уничтожения целевых клеток у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, молекулы TriKE вводят для лечения заболевания или патологии у субъекта.

[0088] В контексте данного документа, термин «лечить» или его варианты относятся к уменьшению, ограничению прогрессирования, облегчению или устранению, в любой степени, симптомов или признаков, связанных с патологией. В контексте данного документа, термин «облегчение» относится к любому уменьшению степени, тяжести, частоты, и/или вероятности симптома или клинического признака, характерного для конкретной патологии; «симптом» относится к любому субъективному свидетельству заболевания или патологии пациента; а «признак» или «клинический признак» относится к объективному физическому обнаружению, относящемуся к определенной патологии, которая может быть обнаружена кем-либо, кроме субъекта или пациента.

[0089] В контексте данного документа, термин «субъект» относится к любому человеку или пациенту, на котором выполняются способы, раскрытые в данном документе. Термин «субъект» может использоваться взаимозаменяемо с термином «индивид» или «пациент». «Субъект» может представлять собой любое животное, такое как, например, млекопитающее (например, собака, кошка, лошадь, корова, овца, коза, обезьяна и т. д.). В некоторых вариантах осуществления, субъект может представлять собой человека.

[0090] «Лечение» может быть терапевтическим или профилактическим. «Терапевтический» и его варианты относятся к лечению, которое облегчает один или большее количество существующих симптомов или клинических признаков, связанных с патологией. «Профилактический» и его варианты относятся к лечению, которое ограничивает в любой степени развитие и/или появление симптома, или клинического признака, патологии. В целом, «терапевтическое» лечение начинают после того, как патология проявляется у субъекта, тогда как «профилактическое» лечение начинают до того, как патология проявляется у субъекта. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, способ может включать в себя профилактическое лечение субъекта с риском развития патологии. «Под риском» относится к субъекту, который может или не может фактически иметь описанный риск. Таким образом, например, субъект «под риском» развития обозначенной патологии, - это субъект, который имеет один или большее количество признаков повышенного риска приобретения или развития у него указанной патологии по сравнению с людьми, у которых отсутствует один или большее количество признаков, независимо от того, проявляет ли субъект какие-либо симптомы или клинические признаки приобретения или развития у него патологии. Иллюстративные признаки патологии могут включать в себя, например, генетическую предрасположенность, происхождение, возраст, пол, географическое местоположение, образ жизни или клинические сведения. Лечение также может быть продолжено после исчезновения симптомов, например, для предотвращения или отсрочки их повторения.

[0091] В других вариантах осуществления, в данном документе предлагаются способы стимуляции размножения клеток NK in vivo, которые включают в себя введение субъекту соединения или молекулы, описанных в данном документе, в количестве, эффективном для стимуляции размножения клеток NK у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, молекулы TriKE вводят для лечения заболевания или патологии у субъекта. Использование молекулы TriKE в качестве части лечения in vivo может сделать клетки NK антиген-специфическими, с одновременной костимуляцией, повышением выживаемости, и размножением, что может быть антиген-специфическим. В других случаях, TriKE можно использовать in vitro в качестве адъюванта для терапии в виде адоптивного переноса клеток NK.

[0092] В еще других вариантах осуществления, в данном документе предлагаются способы лечения рака, которые включают в себя введение субъекту соединения или молекулы, описанных в данном документе, эффективных для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления, рак представляет собой рак предстательной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак мочевого пузыря, меланому, рак почки, почечный рак, рак полости рта, рак глотки, рак поджелудочной железы, рак матки, рак щитовидной железы, рак кожи, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак яичника, или гемопоэтический рак. В некоторых вариантах осуществления, гемопоэтический рак представляет собой миелодиспластический синдром (МДС). В некоторых вариантах осуществления, гемопоэтический рак представляет собой лимфому. В некоторых вариантах осуществления, гемопоэтический рак представляет собой лейкоз. В некоторых вариантах осуществления, гемопоэтический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (ОМЛ).

[0093] В контексте данного документа, термин «миелоидный лейкоз» относится к лейкозу, характеризующемуся пролиферацией миелоидной ткани и аномальным увеличением количества гранулоцитов, миелоцитов и миелобластов в циркулирующей крови. Данный термин является синонимом терминов миелоцитарный лейкоз, миелогенный лейкоз, миеломный лейкоз и гранулоцитарный лейкоз. Термин «миелоидный лейкоз» может обозначать, помимо прочего, острый и хронический миелоидный лейкоз (ОМЛ и ХМЛ), острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ), хронический миеломоноцитарный лейкоз («ХММЛ»), миелодиспластический синдром и ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, в который вовлечены миелоидные элементы костного мозга (например, лейкоциты, эритроциты и мегакариоциты), и включает в себя все подтипы, которые определяются морфологическими, гистохимическими и иммунологическими методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Подтипы ОМЛ включают в себя согласно классификации FAB: FAB-M0, FAB-M1, FAB-M2, FAB-M3, FAB-M4, FAB-M5, FAB-M6 и FAB-M7.

[0094] В контексте данного документа, термин «миелодиспластический синдром» охватывает гетерогенную группу тесно связанных клональных гемопоэтических нарушений, которые возникают в ранних кроветворных клетках костного мозга. Все нарушения характеризуются нарушением морфологии и созревания клеток костного мозга (дисмиелопоэз), и цитопенией периферической крови, возникающей в результате неэффективного производства клеток крови. Другими словами, созревающие клетки крови часто умирают в костном мозге, прежде чем достигают полной зрелости и попадают в кровь, что объясняет низкие концентрации клеток крови. У пациентов, страдающих от миелодиспластического синдрома, также может наблюдаться скопление очень незрелых клеток костного мозга, называемых лейкемическими бластными клетками.

[0095] Количество вводимой молекулы TriKE может варьироваться в зависимости от различных факторов, включающих в себя, но без ограничения, конкретную используемую молекулу TriKE, массу, физическое состояние, и/или возраст субъекта, и/или путь введения. Таким образом, абсолютная масса молекулы TriKE, включенной в данную единицу дозированной формы, может широко варьировать, и зависит от таких факторов, как вид, возраст, масса и физическое состояние субъекта, и/или способ введения. Соответственно, нецелесообразно устанавливать, в целом, количество которое составляет количество молекулы TriKE, эффективное для всех возможных применений. Однако, специалисты в данной области техники могут легко определить подходящее количество с должным учетом таких факторов.

[0096] В некоторых вариантах осуществления, способ может включать в себя введение субъекту достаточных количеств молекулы TriKE для обеспечения дозы, например, от около 100 нг/кг до около 50 мг/кг, хотя в некоторых вариантах осуществления, способы могут быть выполнены путем введения молекулы TriKE в дозе за пределами данного диапазона. В некоторых из данных вариантов осуществления, способ включает в себя введение субъекту достаточных количеств молекулы TriKE для обеспечения дозы от около 10 мкг/кг до около 5 мг/кг, например, дозы от около 100 мкг/кг до около 1 мг/кг.

[0097] В альтернативном варианте, доза может быть рассчитана с использованием фактической массы тела, полученной прямо перед началом курса лечения. Для рассчитанных таким образом доз, площадь поверхности тела (м2) рассчитывается до начала курса лечения по способу Дюбуа: м2 = (масса кг 0,425 × рост см 0,725) × 0,007184.

[0098] В некоторых вариантах осуществления, способ может включать в себя введение достаточных количеств молекулы TriKE, чтобы обеспечить дозу, например, от около 0,01 мг/м2 до около 10 мг/м2.

[0099] В некоторых вариантах осуществления, молекула TriKE может вводиться в виде, например, от одной дозы до множества доз в неделю, хотя в некоторых вариантах осуществления способ может выполняться путем введения молекулы TriKE с частотой за пределами данного диапазона. В некоторых вариантах осуществления, молекула TriKE может быть введена от около одного раза в месяц до около пяти раз в неделю.

[00100] В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает в себя введение одного или большего количества дополнительных терапевтических агентов. Один или большее количество дополнительных терапевтических агентов может быть введено до, после и/или одновременно с введением молекулы TriKE. Молекула TriKE и дополнительные терапевтические агенты могут вводиться совместно. В контексте данного документа, термин «совместно вводимый» относится к двум или большему количеству компонентов комбинации, которые вводятся таким образом, что терапевтические или профилактические эффекты комбинации могут быть больше, чем терапевтические или профилактические эффекты каждого компонента, вводимого отдельно. Два компонента могут быть введены совместно или последовательно. Одновременно совместно вводимые компоненты могут быть предоставлены в одной или большем количестве фармацевтических композиций. Последовательное совместное введение двух или большего количества компонентов включает в себя случаи, в которых компоненты вводят таким образом, что каждый компонент может присутствовать в месте лечения одновременно. В альтернативном варианте, последовательное совместное введение двух компонентов может включать в себя случаи, в которых по меньшей мере один компонент был удален с участка лечения, но по меньшей мере один клеточный эффект введения компонента (например, продукция цитокинов, активация определенной популяции клеток и т. д.) сохраняется в участке лечения до тех пор, пока один или большее количество дополнительных компонентов не будут введены в участок лечения. Таким образом, совместно вводимая комбинация может, в определенных обстоятельствах, включать в себя компоненты, которые никогда не существуют в химической смеси друг с другом. В других вариантах осуществления, молекула TriKE и дополнительный терапевтический агент могут вводиться как часть смеси или коктейля. В некоторых аспектах, введение молекулы TriKE может обеспечивать эффективность более низкой дозы других терапевтических методов по сравнению с введением другого терапевтического агента или агентов самых по себе, тем самым уменьшая вероятность, тяжесть и/или степень токсичности, наблюдаемых при введении более высокой дозы другого терапевтического агента или агентов.

[00101] Иллюстративные дополнительные терапевтические агенты включают в себя: альтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, коласпазу, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитофосфан, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, фторурацил, флударабин, фотемустин, ганцикловир, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митомицин С, нимустин, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, прокарбазин, ралтитрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, тиотепа, топотекан, винбластин, винкрестин, виндезин, и винорелбин.

[00102] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, предложенные в данном документе способы лечения рака дополнительно включают в себя введение соединения, молекулы, композиции, или готовой формы, описанных в данном документе, до, одновременно с, или после химиотерапии, хирургической резекции опухоли, или лучевой терапии. Химиотерапия включает в себя, например: альтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, коласпазу, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитофосфан, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, фторурацил, флударабин, фотемустин, ганцикловир, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митомицин С, нимустин, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, прокарбазин, ралтитрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, тиотепа, топотекан, винбластин, винкрестин, виндезин, и винорелбин.

[00103] В некоторых вариантах осуществления, предложенные в данном документе способы, могут включать в себя введение достаточного количества молекул TriKE, как описано в данном документе, и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, с введением молекул TriKE и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, демонстрирующего терапевтический синергизм. В некоторых аспектах способов согласно данному изобретению, результат измерение ответа на лечение, наблюдаемого после введения как молекулы TriKE, как описано в данном документе, так и дополнительного терапевтического агента, улучшается по сравнению с таким же результатом измерения ответа на лечение, наблюдаемого после введения по отдельности либо молекулы TriKE, либо дополнительного терапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления, дополнительный терапевтический агент может включать в себя дополнительный агент, нацеленный на EpCAM, включая, например, моноклональное антитело, специфичное к EpCAM, такое как, например, катумаксомаб, моноклональное гибридное антитело, нацеленное на EpCAM и CD3.

[00104] В контексте данного документа, термин «и/или» означает один или все перечисленные элементы, или комбинацию любых двух или большего количества из перечисленных элементов; термины «содержит», «содержащий» и их варианты должны толковаться как открытые, т. е. дополнительные элементы или этапы являются необязательными, и могут присутствовать или отсутствовать.

[00105] В контексте данного документа, формы единственного числа включают в себя формы множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. До тех пор, пока не указано иное, формы единственного числа и «по меньшей мере один» могут использоваться взаимозаменяемо, и могут означать один или больше чем один. Таким образом, например, упоминания в виде «способ» включают в себя один или больше количество способов, и/или этапов типа, описанного в данном документе, которые станут очевидны специалистам в данной области техники после прочтения данного раскрытия изобретения, и т. д.

[00106] В контексте данного документа, перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает в себя все числа, входящие в этот диапазон (например, от 1 до 5 включает в себя 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и т. д.).

[00107] «Около» в контексте данного документа, когда термин относится к измеряемой величине, такой как количество, продолжительность и т. п., подразумевается, что он охватывает отклонения ± 20%, или ± 10%, или ± 5%, или даже ± 1% от указанного значения, поскольку такие отклонения подходят для раскрытых способов или для выполнения раскрытых способов.

[00108] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой принадлежит это изобретение.

[00109] В контексте данного документа, термин «белок» относится к любой полимерной цепи аминокислот. Термины «пептид» и «полипептид» используются взаимозаменяемо с термином «белок», и также относятся к полимерной цепи аминокислот. Термин «белок» охватывает нативные или искусственные белки, фрагменты белков и аналоги полипептидов белковой последовательности. Белок может быть мономерным или полимерным. Термин «белок» охватывает его фрагменты и варианты (включая фрагменты вариантов), если иное не противоречит контексту.

[00110] В контексте данного документа, термин «нуклеиновая кислота» относится к любой молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), молекуле рибонуклеиновой кислоты (РНК), или аналогам нуклеиновой кислоты. Молекула ДНК или РНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и может быть любого размера. Примеры нуклеиновых кислот включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: хромосомную ДНК, плазмидную ДНК, кДНК, внеклеточную ДНК (вкДНК), мРНК, тРНК, рРНК, миРНК, микроРНК (микроРНК или миР), гяРНК. Иллюстративные нуклеиновые аналоги включают в себя пептидные нуклеиновые кислоты, морфолино- и закрытые нуклеиновые кислоты, гликолевые нуклеиновые кислоты, и треозные нуклеиновые кислоты.

[00111] В предшествующем описании, для ясности отдельно могут быть описаны определенные варианты осуществления. Если специально не указано иное, что признаки конкретного варианта осуществления несовместимы с признаками другого варианта осуществления, то определенные варианты осуществления могут включать в себя комбинацию совместимых признаков, описанных в данном документе в связи с одним или большим количеством вариантов осуществления.

[00112] Для любого раскрытого в данном документе способа, который включает в себя дискретные этапы, этапы могут выполняться в любом осуществимом порядке. Дополнительно, при необходимости, любая комбинация двух или большего количества этапов может быть осуществлена одновременно.

[00113] Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и процедуры следует интерпретировать в широком смысле в соответствии с объемом и духом изобретения, как изложено в данном документе.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

[00114] Данные пример описывает разработку CD16-ИЛ15-CLEC12A TriKE.

[00115] TriKE 1615CLEC12A была разработана в клеточной системе млекопитающего, чтобы гарантировать наличие соответствующих пост-трансляционных модификаций. Было подтверждено специфическое связывание TriKE с целевыми клетками HL60 и THP1, которые экспрессируют CLEC12A, по сравнению с клетками Raji, которые не экспрессируют CLEC12A. Обработка мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) с помощью 1615CLEC12A TriKE приводила к значительному увеличению специфической пролиферации клеток NK в течение 7 дней, как было измерено с помощью разбавления CellTrace, по сравнению с обработкой по отдельности CLEC12A scFv или ИЛ15 (69,7 ± 6,7% по сравнению с 11,9 ± 2,5% по сравнению с 38,4 ± 7,3%) (Фиг. 1А). Для измерения уничтожения клеток NK был проведен анализ IncuCyte Zoom. В нем целевые клетки HL-60 были помечены реагентом каспаза 3/7, изменение цвета которого указывает на гибель целевой клетки. 1615CLEC12A TriKE была способна индуцировать большее уничтожение целевых клеток, чем scFv или ИЛ-15 CLEC12A, что измерялось по количеству живых целевых клеток в конце 48-часового анализа (53,9 ± 1,9% по сравнению с 103,3 ± 3,4% по сравнению с 71,1 ± 1,4%). 1615CLEC12A TriKE индуцировала увеличение дегрануляции клеток NK, измеренное по экспрессии CD107a, против опухолевых целей HL60 ОМЛ в 4-часовом функциональном анализе, по сравнению с обработкой по отдельности scFv или ИЛ15 CLEC12A (62,3 ± 1,1% по сравнению с 19,4 ± 3,8% по сравнению с 27,5 ± 4,9%). В этом анализе также было увеличение продукции цитокинов, измеренное по ИФНg и ФНОa соответственно (16,7 ± 4,2% по сравнению с 2,3 ± 1,5% по сравнению с 4,7 ± 1,9% и 18,0 ± 5,1% по сравнению с 2,5 ± 1,7% по сравнению с 4,6 ± 2,5%) (Фиг. 1B). Наблюдали аналогичный усиленный функциональный ответ с опухолевыми целями THP1 ОМЛ. В этих функциональных анализах обработка 1615CLEC12A TriKE вызвала меньшую фоновую активацию по сравнению с CD33 TriKE, что указывает на меньшее мимоцелевое воздействие на МКПК. Чтобы подтвердить клиническую значимость данной молекулы, была протестирована эффективность 1615CLEC12A TriKE против первичных целей ОМЛ. Бластные клетки ОМЛ были идентифицированы как клетки с низким БС (боковым светорассеянием), промежуточным уровнем CD45 и высоким уровнем CD34. Из 9 протестированных образцов ОМЛ 7-мь экспрессировали высокие уровни CD33 (70,4 ± 6,3%) и CLEC12A (78,1 ± 5,2%). В функциональных анализах с данными образцами 1615CLEC12A TriKE была способна индуцировать большую экспрессию CD107a и ИФНg, а также усиливать уничтожение опухолевых целей, как измерено с помощью окрашивания живых/мертвых, по сравнению с CLEC12A scFv или ИЛ15 (Фиг. 1C). В этих анализах эффективность 1615CLEC12A TriKE была сопоставима с эффективностью CD33 TriKE. Эти данные демонстрируют, что 1615CLEC12A TriKE стимулирует специфическую пролиферацию клеток NK, дегрануляцию, секрецию цитокинов и уничтожение опухолевых целей in vitro. Помимо ОМЛ, CLEC12A экспрессируется на раковых клетках и ЛСК у пациентов с миелодиспластическими синдромами (МДС). Эти результаты подчеркивают клинический потенциал 1615CLEC12A TriKE отдельно или в комбинации с CD33 TriKE для лечения МДС и ОМЛ.

ПРИМЕР 2

[00116] В данном примере описывается экспрессия CD33 и CLEC12A на клетках ОМЛ.

[00117] Большинство всех случаев смерти от злокачественных гемопоэтических заболеваний вызвано острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), пятилетняя выживаемость для которого составляет всего лишь 26%, что подчеркивает необходимость новых способов лечения. Наиболее распространенным антигеном, используемым для нацеливания на клетки ОМЛ, является CD33. Однако существует много ограничений в разработке лекарств против CD33. Например, не все раковые клетки экспрессируют CD33, включая раковые клетки у пациентов с рефрактерным ОМЛ. Кроме того, все клетки миелоидной линии и некоторые клетки лимфоидной линии, такие как активированные клетки NK и Т-лимфоциты, экспрессируют CD33, что приводит к мимоцелевой токсичности. Кроме того, раковые стволовые клетки, которые, как считается, способствуют рецидиву, не экспрессируют CD33.

[00118] Новый антиген, названный подобная лектину С-типа молекула 1 (CLL-1) или CLEC12A был сделан целью для устранение вышеуказанных ограничений.

[00119] Фиг. 2 демонстрирует процент поверхностной экспрессии CD33 и CLEC12A, измеренный с помощью анализа проточной цитометрии первичных образцов ОМЛ из 10 пациентов. CLEC12A экспрессируется на высоком уровне на клетках ОМЛ. Около 70% CD33-отрицательных клеток экспрессировали CLEC12A. Экспрессия CLEC12A была ограничена субпопуляцией миелоидных клеток, что ограничивало мимоцелевую токсичность. CLEC12A присутствует на лейкозных стволовых клетках, но не на гемопоэтических стволовых клетках.

[00120] Эти данные доказывают то, что CLEC12A является поверхностным маркером как на первичных клетках ОМЛ, которые экспрессируют CD33, так и у которых нет экспрессии CD33. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления, CLEC12A может быть нацелен триспецифической, вовлекающей клетку киллера молекулой (TriKE) на ОМЛ и другие клетки, которые экспрессируют или лишены CD33.

ПРИМЕР 3

[00121] В данном примере описывается триспецифическая, вовлекающая клетку киллера молекула (TriKE), нацеленная на CLEC12A.

[00122] Для нацеливания на раковые клетки с использованием клеток естественных киллеров (NK) была разработана триспецифическая, вовлекающая клетку киллера молекула (TriKE), содержащая анти-CD16 антитело с тяжелой цепью, которое активирует клетки NK, молекулу ИЛ-15, которая управляет примированием, размножением и выживанием клеток NK, и анти-CLEC12A одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который вовлекает раковые цели. Схема CD16-IL15-CLEC12A TriKE и механизм действия показаны на Фиг. 3A-B.

[00123] TriKE содержит анти-CD16 антитело с тяжелой цепью, сконструированное путем включения CDR анти-CD16 V_HH ламы в гуманизированный какркас V_HH (Фиг. 3А). Оно соединено с молекулой ИЛ-15 дикого типа, которая соединена с scFv из анти-CLEC12A антитела. TriKE (SEQ ID NO: 1) продуцировали в системе млекопитающего с клетками Expi-293, и она содержала тэг His, который использовали для очистки молекулы. Согласно некоторым вариантам осуществления, в молекуле TriKE может отсутствовать тэг His. Молекула TriKE, в которой отсутствует тэг His, может быть подходящей для использования в клинических применениях, хотя также можно использовать молекулу TriKE, содержащую тэг His. TriKE создает иммунологическую связь между опухолевой клеткой CLEC12A+ и клеткой NK, способствуя высвобождению цитотоксических гранул и секреции цитокинов, которые уничтожают целевую клетку (Фиг. 3B).

[00124] Помимо scFv из анти-CLEC12A антитела, описанного выше в качестве иллюстративного примера (SEQ ID NO: 4; соответствует SC02-357 патента США № 7741443), нацеливающий домен TriKE может содержать любую последовательность, способную к нацеливанию на или связыванию с CLEC12A, например, scFvs SC02-378 и SC02-161, и любыми производными scFvs SC02-357, SC02-378 и SC02-161. scFvs SC02-357, SC02-378 и SC02-161 описаны в патенте США №7741443, раскрытие которого включено в данный документ в полном объеме, в частности в отношении последовательностей scFvs SC02-357, SC02-378 и SC02-161.

ПРИМЕР 4

[00125] В данном примере описывается подтверждение связывания CD16-IL15-CLEC12A TriKE с целевыми клетками.

[00126] Цели CLEC12A+ HL-60 и CLEC12A- Raji инкубировали с 1615CLEC12A TriKE или scFv в эквимолярных концентрациях. Связывание оценивали с помощью анти-His антитела, которое связывается с тэгом His на TriKE или scFv. Было использовано вторичное стрептавидиновое антитело, которое детектировали с помощью проточной цитометрии. Данные на Фиг. 4 показывают, что 1615CLEC12A TriKE связан с целями HL-60, но не с целями Raji.

[00127] Связывание различных компонентов 1615CLEC12A TriKE тестировали с помощью ИФА против CD16 (Фиг. 14A), рецептора ИЛ15 альфа (Фиг. 14B) и внеклеточного домена CLEC12A (ED; Фиг. 14C). TriKE был протестирован в 3-кратных серийных разведениях от 900 нМ до 0,4 нМ и имел наивысшее связывание при 30 нМ, которое использовали в последующих экспериментах, если не указано иное.

[00128] Эти данные показывают, что каждый компонент 1615CLEC12A TriKE связывается со своей соответствующей целевой молекулой и что CD16-IL15-CLEC12A TriKE специфически связывается с целями, экспрессирующими CLEC12A.

ПРИМЕР 5

[00129] В данном примере описывается пролиферация клеток NK, индуцированная CD16-IL15-CLEC12A TriKE.

[00130] МКПК метили Cell Trace и инкубировали с эквимолярными концентрациями ИЛ-15, CLEC12A scFv или CLEC12A TriKE в течение 7 дней (Фиг. 5A). Популяцию клеток NK оценивали путем оценки разбавления красителя Cell Trace в популяции CD56+ CD3- с использованием проточной цитометрии (Фиг. 5B). Процент поделившихся клеток NK рассчитывали с помощью FlowJo Analyzer. Статистика отражает значительные различия между группами, рассчитанные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, * P <0,05, ** P <0,005, N=10. Более высокий процент поделившихся клеток NK наблюдали в присутствии CLEC12A TriKE по сравнению с ИЛ-15 или CLEC12A scFv.

[00131] В других экспериментах МКПК выделяли из свежих образцов здоровых доноров (n=6), метили CellTrace Violet, и инкубировали в течение 7 дней с 1615CLEC12A TriKE или контрольными агентами при 30 нМ, как описано выше. После периода инкубации клетки собирали и пролиферацию клеток NK (CD3-, CD56+) оценивали с помощью проточной цитометрии.

[00132] Объединенные данные (Фиг. 9A) и репрезентативные гистограммы (Фиг. 9B) показывают пролиферацию клеток NK (посредством разбавления CellTrace) для различных групп обработки. Фиг. 9C демонстрирует объединенное количество клеток NK (45 секунд при постоянной скорости) во время сбора продукта. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями использовался для расчета различий по сравнению с группой 1615CLEC12A. Планки погрешностей указывают +/- среднеквадратическая ошибка среднего. Статистическая значимость определяется как ** P <0,005, **** P <0,0001. Значительно больший процент поделившихся клеток NK наблюдали при обработке CLEC12A TriKE по сравнению с отсутствием обработки, обработкой ИЛ-15 или обработкой CLEC12A scFv.

[00133] Эти данные показывают, что 1615CLEC12A TriKE индуцировал сильную пролиферацию клеток NK.

ПРИМЕР 6

[00134] В этом примере описывается функциональная проверка CD16-IL15-CLEC12A TriKE.

[00135] МКПК инкубировали с клетками CLEC12A+ HL-60 и THP1 при соотношении эффектора к цели 2:1 в присутствии ИЛ-15, CLEC12A scFv или CLEC12A TriKE в эквимолярных концентрациях. Анализировали поверхностный CD107a, для оценки дегрануляции (Фиг. 6A), внутриклеточный ИФНg (Фиг. 6B), и ФНОa для оценки продукции воспалительных цитокинов (Фиг. 6C), на клетках CD56⁺CD3^- NK с помощью проточной цитометрии. Статистическое сравнение обработки CLEC12A TriKE с обработкой контрольными ИЛ-15 или CLEC12A scFv, отражает значительные различия между группами, рассчитанные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, ** P < 0,005, N=6. Более высокий процент поверхностного окрашивания CD107a и более высокие проценты внутриклеточного окрашивания ИФНg и ФНОa на клетках NK наблюдали в присутствии CLEC12A TriKE по сравнению с отсутствием обработки, обработкой ИЛ-15 или обработкой CLEC12A scFv целевых клеток HL60 и THP1.

[00136] В других экспериментах, замороженные МКПК из здоровых доноров (n=6) инкубировали с указанными агентами обработки (30 нМ) для оценки экспрессии CD107a как маркера дегрануляции (Фиг. 10A), внутриклеточной продукции ИФНg (Фиг. 10B) или внутриклеточной экспрессии ФНОa в клетках NK (CD3-, CD56 +; Фиг. 10C) в 4-часовом анализе. Клетки оценивали только с МКПК или в присутствии целей THP1 и HL-60 при соотношении эффектор/цель 2:1. Активацию клеток NK (CD3-, CD56+) в МКПК оценивали с использованием экспрессии CD69 в 4-часовом анализе только с МКПК или в присутствии целей THP1 и HL-60 при соотношении эффектор/цель 2:1 (Фиг. 10D). Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями использовали для расчета различий по сравнению с группой 1615CLEC12A. Планки погрешностей указывают +/- среднеквадратическая ошибка среднего. Статистическая значимость определяется как * P, ,05, ** P, ,01, *** P, ,001 и **** P, ,0001.

[00137] Наблюдалась более значительная активация клеток NK, что продемонстрировано увеличенным окрашиванием по CD107a, ИФНg, ФНОa и CD69 при инкубации с CLEC12A TriKE по сравнению с отсутствием обработки, обработкой ИЛ-15 или обработкой scFv как для целевых клеток THP1, так и для целевых клеток HL60 (Фиг. 10A-D).

[00138] Эти данные показывают, что 1615CLEC12A TriKE индуцировала дегрануляцию и продукцию цитокинов против целевых клеток ОМЛ, включая цели THP1 и HL-60.

ПРИМЕР 7

[00139] В этом примере описывается индуцированное CD16-IL15-CLEC12A TriKE уничтожение целей ОМЛ.

[00140] Обогащенные клетки NK инкубировали с целями CLEC12A+ HL-60 (Фиг. 7A) и THP1 (Фиг. 7B) при соотношении эффектора к цели 2:1 в присутствии ИЛ-15, CLEC12A scFv или CLEC12A TriKE в эквимолярных концентрациях. Целевые клетки метили красителем CellTrace Far Red и реагентом для анализа апоптоза Caspase 3/7 green (Essen Biosciences). Уничтожение оценивали с помощью машины Incucyte Zoom и анализировали путем нормализации количества клеток к исходному количеству целевых клеток. Графики на Фиг. 7A-B отображают следующее (начиная сверху): (i) отсутствие обработки (первый сверху); (ii) обработка CLEC12A scFv (второй сверху); (iii) обработка ИЛ-15 (третий сверху/второй снизу); (iv) обработка CLEC12A TriKE (четвертый сверху/снизу). Процент живых целевых клеток был самым низким при обработке CLEC12A TriKE.

[00141] 1615CLEC12A TriKE-опосредованную индукцию уничтожения целевых клеток оценивали в анализе визуализации в реальном времени. Обогащенные клетки NK (CD3-, CD56+) инкубировали с клетками THP-1, меченными CellTrace Far Red, при соотношении эффектора к цели 2:1 с указанными агентами обработки (30 нМ) в течение 48 часов в визуализаторе IncuCyte S3. Измеряли количество мертвых клеток THP-1 с использованием реагента Caspase 3/7. Фиг. 11A демонстрирует количественную оценку процента живых опухолевых целей THP-1 (CellTrace Far Red/Caspase 3/7), нормализованных только к целям в момент времени 0 часов. Считывания данных проводили каждые 30 минут в течение 48 часов. Представление 3 отдельных экспериментов. Первый сверху соответствует отсутствию обработки, второй сверху соответствует обработке CLEC12A scFv, третий сверху соответствует обработке ИЛ-15, четвертый сверху соответствует обработке CLEC12A TriKE. Самый низкий процент живых клеток THP-1 был замечен в присутствии CLEC12A TriKE.

[00142] Фиг. 11B является типичными изображениями (оригинальное увеличение 34: 2,82 мм/пиксель) в 0, 18 и 36 часов, показывающими клетки THP-1 (более крупные клетки) и клетки NK (клетки меньшего размера). В 0 часов имелось несколько мертвых клеток для всех обозначенных условий обработки. В 18 и 36 часов наблюдали несколько кластеров мертвых клеток THP-1 для условий - без обработки и CLEC12A scFv, причем присутствовали некоторые кластеры умирающих клеток THP-1 для обработки с помощью ИЛ-15, и присутствовало намного больше кластеров умирающих клеток для обработки с помощью CLEC12A TriKE.

[00143] Фиг. 11С демонстрирует количественную оценку процентной доли живых опухолевых целей THP-1 при различных соотношениях эффектора к цели (1:1, 2:1 и 5:1). Первый, второй и третий начиная сверху соответствуют только NK, четвертый начиная сверху соответствует 1:1 NK+CLEC12A TriKE, пятый начиная сверху соответствует 2:1 NK+CLEC12A TriKE, шестой начиная сверху соответствует 5:1 NK+CLEC12A TriKE. Более низкие процентные доли живых клеток THP-1 наблюдали для всех соотношений эффектора к цели, по сравнению с только клетками NK, при этом соотношение эффектора к цели 5:1 дает наименьший процент живых клеток THP-1, но это снижение жизнеспособности клеток THP-1 было максимальным, когда присутствовала обработка CLEC12A TriKE.

[00144] В других экспериментах, обогащенные клетки NK инкубировали с клетками HL-60, мечеными CellTrace Far Red, при соотношении эффектора к цели 2:1, с указанными агентами обработки (30 нМ для каждого) в течение 48 часов в визуализаторе IncuCyte s3. Количество мертвых клеток HL-60 измеряли с использованием реагента Caspase 3/7.

[00145] Фиг. 15А демонстрирует количественное определение процента живых опухолевых целей HL-60 (Celltracace Dar Red/Caspase 3/7), нормализованных к только целям, и точку времени 0 часов. Считывания данных проводили каждые 30 минут в течение 48 часов. Представление 3 отдельных экспериментов. Первый сверху соответствует отсутствию обработки, второй сверху соответствует обработке CLEC12A scFv, третий сверху соответствует обработке ИЛ-15, четвертый сверху соответствует обработке CLEC12A TriKE. Самый низкий процент живых клеток HL-60 наблюдали в присутствии CLEC12A TriKE.

[00146] Фиг. 15B является типичными изображениями в 0, 18 и 36 часов, показывающими целевые клетки HL-60 (более крупные клетки) и клетки NK (клетки меньшего размера). В 0 часов имелось несколько мертвых клеток для всех обозначенных условий обработки. В 18 и 36 часов наблюдали несколько кластеров мертвых клеток HL-60 для условий - без обработки и CLEC12A scFv, причем присутствовали некоторые кластеры умирающих клеток HL-60 для обработки с помощью ИЛ-15, и присутствовало намного больше кластеров умирающих клеток для обработки с помощью CLEC12A TriKE.

[00147] Эти данные демонстрируют индуцированное CD16-IL15-CLEC12A TriKE, уничтожение целей ОМЛ, включая целевые клетки THP-1 и HL-60.

ПРИМЕР 8

[00148] Данный пример иллюстрирует индуцированное CD16-IL15-CLEC12A TriKE уничтожение первичных целевых бластных клеток ОМЛ in vitro.

[00149] Обогащенные клетки NK инкубировали с первичными бластными клетками ОМЛ при соотношении эффектора к цели 2:1 в присутствии ИЛ-15, CLEC12A scFv, CLEC12A TriKE или CD33 TriKE при эквимолярных концентрациях. Фиг. 8А демонстрирует схему гейтирования для определения бластных клеток ОМЛ с использованием FlowJo Analyzer. Фиг. 8B демонстрирует процент уничтожения бластных клеток ОМЛ, определенный с помощью маркера живой/мертвый после гейтинга бластных клеток после 48 часов. Определяли экспрессию на поверхности CD107a для оценки дегрануляции (Фиг. 8C), и внутриклеточного ИФНg для оценки продуцирования воспалительных цитокинов (Фиг. 8D) на клетках CD56⁺CD3^- NK с помощью проточной цитометрии после 4 часов. Статистический анализ показывает значительные различия между группами, рассчитанные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, * P < 0,05 ** P < 0,005, N=10. Процент мертвых бластных клеток ОМЛ и процентные доли окрашивания для CD107A и ИФНg были значительно выше при инкубации с CLEC12A TriKE по сравнению с инкубацией с ИЛ-15 или инкубацией с CLEC12A scFv (Фиг. 8B-D).

[00150] В других экспериментах, оценивали первичные бластные клетки ОМЛ (БС-В Low, CD45int, CD117+, CD14-, CD34+) по экспрессии CD33 и CLEC12A с использованием проточной цитометрии (Фиг. 12А). Клетки экспрессировали CD33, CLEC12A, или как CD33, так и CLEC12A, как продемонстрировано.

[00151] Обогащенные клетки NK (CD56+, CD3-) из здоровых доноров (n=10) инкубировали с первичными бластными клетками ОМЛ с указанными агентами обработки (30 нМ) для оценки экспрессии CD107a как маркера дегрануляции (Фиг. 12B) и продуцирования внутриклеточного ИФНg (Фиг. 12C) в 4-часовом анализе при соотношении эффектора к цели 2:1. CLEC12A TriKE и CD33 TriKE индуцировали дегрануляцию и продукцию ИФНg как показано. Уничтожение целевых клеток также оценивали с использованием проточной цитометрии и маркера живой/мертвый через 48 часов (Фиг. 12D). Обработка ИЛ-15, CLEC12A TriKE, и CD33 TriKE приводила к уничтожению бластных клеток ОМЛ как показано, с более значительным CLEC12A TriKE-опосредованным уничтожением.

[00152] Соотношение различных групп бластных клеток ОМЛ (исходя из экспрессии CD33 и CLEC12A) отслеживали через 48 часов для оценки специфичности 1615CLEC12A TriKE по сравнению с 1615CD33 TriKE (Фиг. 12E). Столбцы демонстрируют % живых бластных клеток ОМЛ, соответствующих следующему (начиная сверху каждого столбца): (i) для отсутствия обработки, CLEC12A+CD33+ и CLEC12A+CD33-; (ii) для ИЛ-15, CLEC12A+CD33+, CLEC12A+CD33-, и CLEC12A-CD33-; (iii) для CLEC12A scFv, CLEC12A+CD33+, CLEC12A+CD33-, CLEC12A-CD33+, и CLEC12A-CD33-; (iv) для CLEC12A TriKE, CLEC12A+CD33+, CLEC12A-CD33+, и CLEC12A-CD33-; (v) для CD33 TriKE, CLEC12A+CD33+ и CLEC12A+CD33-. Эти данные подтверждают специфичность 1615CLEC12A TriKE по сравнению с 1615CD33 TriKE.

[00153] В других экспериментах, обогащенные клетки NK (CD56+, CD3-) из здоровых доноров (n=5) инкубировали с образцами костного мозга из пациентов с ОМЛ с указанными агентами обработки (30 нМ) для оценки уничтожения раковых стволовых клеток (БС-В Low, CD45int, CD34+, CD38-) в 4-часовом анализе при соотношении эффектор/цель 2:1 (Фиг. 12F). Типичные графики цитометрии показывают уничтожение раковых стволовых клеток, положительных по CLEC12A и CD33.

[00154] Фиг. 12G демонстрирует комбинированные данные из анализа уничтожения раковых стволовых клеток, показывающие процент раковых стволовых клеток, присутствующих в конце анализа. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями использовали для расчета различий по сравнению с группой 1615CLEC12A. Планки погрешностей указывают +/- среднеквадратическая ошибка среднего. Статистическая значимость определяется как * P, .05, ** P, .01, *** P, .001 и **** P, .0001. Обработка CLEC12A приводила к значительному уменьшению процентной доли ЛСК по сравнению с отсутствием обработки.

[00155] Чтобы проверить первичные бластные клетки ОМЛ в качестве целевых клеток для уничтожения, опосредованного CLEC12A TriKE, была использована стратегия гейтинга. Стратегия гейтинга для выявления первичных бластных клеток ОМЛ продемонстрирована на Фиг. 16а. Первичные бластные клетки ОМЛ (n=5) затем инкубировали с указанными агентами обработки (30 нМ) для оценки уничтожения целевых клеток с использованием проточной цитометрии и маркера живой/мертвый через 48 часов (Фиг. 16B). Показан процент мертвых бластных клеток ОМЛ к 48 часу.

[00156] Эти данные показывают, что 1615CLEC12A TriKE индуцировала небольшое увеличение количества уничтоженных первичных бластных клеток ОМЛ в образцах пациентов во время бластного кризиса, когда ограничивают клетки NK.

ПРИМЕР 9

[00157] В данном примере описывается ограничение роста опухоли in vivo, опосредованное 1615CLEC12A TriKE.

[00158] Фиг. 13A демонстрирует схему экспериментов с мышами HL-60luc. Модель была создана путем подготовки мышей NSG (225 сГр) и затем внутривенной инъекции клеток HL-60luc (7,5 × 10⁵ клеток/мышь). Через три дня вводили инфузией 1 × 10⁶ клеток NK человека от здорового донора (рассчитано из магнитно-истощенного продукта CD3/CD19), активированных в течение ночи с помощью 10 нг/мл ИЛ-15. 1615CLEC12A TriKE или 161533 TriKE (20 мкг) вводили ПнВтСрЧтПт в течение следующих 3 недель исследования (всего 15 доз), а контрольная группа получала только клетки HL-60luc.

[00159] Количественная оценка люминесценции четырех обработанных групп на 7-й, 14-й и 21-й день после инфузии NK показана на Фигуре 13B. Каждая точка обозначает разную мышь, а столбцы обозначают среднее +/- среднеквадратическое отклонение. Для расчета различий по сравнению с группой 1615CLEC12A использовали односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) без сравнений сопоставлением. Статистическая значимость была определена как * P, 0,05, *** P, 0,001 и **** P, 0,0001. Фиг. 13C демонстрирует индивидуальную фотолюминесценцию мыши (темные области) после 2-минутной экспозиции на 7, 14 и 21 день. Обработка CLEC12A TriKE привела к уменьшению опухолевой нагрузки во всех исследованных временных точках по сравнению с контролем HL60. Кроме того, на 21 день наблюдалось значительное снижение опухолевой нагрузки при обработке CLEC12A TriKE по сравнению с обработкой контролем клеток NK.

[00160] Фиг. 13D демонстрирует схему экспериментов с мышами pdx. Модель была создана путем подготовки мышей NSG SGM3 (125 сГр) и затем внутривенной инъекции клеток HL-60luc (7,5 × 10⁵ клеток/мышь). Опухолям позволяли расти до тех пор, пока в крови не появлялось по меньшей мере 1% бластных клеток ОМЛ. Затем вводили инфузией 1 × 10⁶ клеток NK человека от здорового донора (рассчитано из магнитно-истощенного продукта CD3/CD19), активированных в течение ночи с помощью 10 нг/мл ИЛ-15. 1615CLEC12A TriKE или 161533 TriKE (20 мкг) вводили ПнВтСрЧтПт в течение следующих 3 недель исследования (всего 15 доз), а контрольная группа получала только клетки NK без лечения. Мышей умерщвляли на 21 день и подсчитывали процент бластных клеток ОМЛ (CD45int, CD33+) в костном мозге бедренной кости с помощью проточной цитометрии (Фиг. 13E). Каждая точка представляет собой отдельную мышь. Был рассчитан процент клеток NK (CD3-, CD56+) в образцах костного мозга (Фиг. 13F) и периферической крови (Фиг. 13G) с помощью проточной цитометрии. Проявления активности регистрировали в течение 60 секунд и было подсчитано количество актов проявлений активности клеток NK человека. Показаны характерные точечные диаграммы, демонстрирующие количество проявлений активности клеток NK (CD56+ CD3-) в пределах гейтинга CD45+). Для расчета различий по сравнению с группой 1615CLEC12A использовали односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) без сравнений сопоставлением. Планки погрешностей обозначают среднее +/- среднеквадратическое отклонение. Статистическая значимость была определена как * P, 0,05, *** P, 0,001 и **** P, 0,0001. Результаты показывают, что обработка NK+CLEC12A TriKE значительно снижает процент первичных бластных клеток ОМЛ по сравнению с только опухолью (Фиг. 13E). Кроме того, обработка NK+CLEC12A TriKE приводила к значительному увеличению процента клеток NK в костном мозге (Фиг. 13F) и периферической крови (Фиг. 13G) по сравнению с только опухолью или обработкой опухоль+NK.

[00161] Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что 1615CLEC12A TriKE ограничивает рост опухоли in vivo.

ПРИМЕР 10

[00162] Данный пример описывает анализ стволовых клеток и клеток-предшественников.

[00163] Раковые стволовые клетки были идентифицированы в образцах костного мозга с использованием стратегии гейтирования, показанной на Фиг. 17. Стратегия гейтирования для определения различных субпопуляций предшественников CD34^pos в здоровых образцах костного мозга показана на Фиг. 19. Стратегия гейтирования, показанная на Фиг. 19, была использована для анализа популяций клеток, показанных на Фиг. 18A.

[00164] Фиг. 18A демонстрирует экспрессию CLEC12A и CD33 в компартменте предшественников CD34^pos в костном мозге из двух репрезентативных здоровых доноров. ГСК: гемопоэтические стволовые клетки, ППП: плюрипотентный предшественник, ЛППП: лимфоидный плюрипотентный предшественник, ОЛМ: общий лимфоидный предшественник, ОМП: общий миелоидный предшественник, ГМП: гранулоцит-макрофагальный предшественник, МЭП: мегакариоцит-эритроидный предшественник. Экспрессию CLEC12A наблюдали в популяциях ОМП, ГМП и МЭП, но она была относительно ниже в популяциях ГСК, ППП, ОЛП и ЛППП. Кроме того, за исключением популяции ГМП, CLEC12A был обнаружен на более низких уровнях, чем CD33. Колонии эритроидных бурстообразующих единиц (Э-БОЕ) и эритроидных колониеобразующуюх единиц (Э-КОЕ) подсчитывали после обработки 1615CLEC12A TriKE или 161533 TriKE (Фиг. 18B). При обработке 1615CLEC12A TriKE наблюдали большее количество колоний Э-БОЕ и ГМ-КОЕ по сравнению с обработкой 161533 TriKE.

[00165] Данные показывают, что CLEC12A дифференциально экспрессировался в популяциях стволовых клеток и клеток-предшественников нормального донора, и что обработка 161533 TriKE уменьшала формирование и/или дифференцировку стволовых клеток по сравнению с обработкой CLEC12A TriKE. Не ограничиваясь теорией, это указывает на то, что хотя CLEC12A и можно использовать для нацеливания на лейкозные стволовые клетки, он должен обеспечивать нормальное возобновление гематопоэза, тогда как нацеливание на CD33 с большей вероятностью повлияет на возобновление. Другими словами, нацеливание на CLEC12A должно иметь меньше мимоцелевых эффектов с точки зрения нормального миелоидного возобновления.

[00166] Таким образом, вместе взятые, приведенные выше данные показывают, что CD16-IL15-CLEC12A TriKE специфически связывается с целевыми клетками, экспрессирующими CLEC12A, способствовала пролиферации клеток NK, усиливала функцию клеток NK, способствовала уничтожению клеточных линий ОМЛ в анализах Incucyte zoom, и индуцировала уничтожение первичных бластных клеток ОМЛ и МДС.

ПРИМЕР 11

[00167] Этот пример иллюстрирует создание TetraKE, нацеленной на CLEC12A и вторую цель или опухолевый антиген.

[00168] Можно спроектировать молекулу TetraKE (тетрамер), которая содержит больше чем один нацеливающий домен. В качестве примера, TetraKE может содержать вовлекающий NK домен, активирующий NK домен и два нацеливающих домены. Могут быть использованы любые из описанных в данном документе вовлекающих NK доменов и активирующих NK доменов. Нацеливающие домены могут быть нацелены, например, на различные цели или опухолевые антигены. Любая комбинация целей или опухолевых антигенов может быть включена в TetraKE. Например, первый нацеливающий домен может связываться с CLEC12A, тогда как второй нацеливающий домен может связываться с другой целью или опухолевым антигеном.

[00169] Любая из целей или опухолевых антигенов, описанных в данном документе, может быть включена в TetraKE с первым нацеливающим доменом, который связывается с CLEC12A, включающая, например, второй нацеливающий домен, который связывается с CD133, CD20, HER2, CEA, EpCAM, VEGF-A, EGFR, CD33, интегрином αVβ3, CD51, CD152, CD125, CTAA16.88, MUC1, CD19, CD22, CD38, мезотелином, ROR1, CSPG4, SS1, или IGFR1, NKG2C, BCMA, APRIL, B7H3, и PSMA, или вирусным антигеном, полученным из EBV, HBV, HCV и/или HPV. Дополнительно, домены TetraKE могут быть функционально связаны друг с другом с использованием фланкирующих или линкерных последовательностей, как описано в данном документе. Иллюстративный TetraKE включает в себя соединение, которое имеет фрагмент, который выборочно связывается с CD16, активирующий NK домен, который содержит ИЛ-15, первый нацеливающий домен, который выборочно связывается с CLEC12A, и второй нацеливающий домен, который выборочно связывается с CD33.

SEQ ID NO: 1

Mkwvtfisllflfssaysqvqlvesggglvqpggslrlscaasgltfssynmgwfrqapgqgleavasitwsgrdtfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaanpwpvaaprsgtywgqgtlvtvsssggggsggggsggggsggggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintsgstsgsgkpgsgegstkgqvqlqesgpglvkpsetlsltcvvsggsisssnwwswvrqppgkglewigeiyhsgspdynpslksrvtisvdksrnqfslklssvtaadtavyycakvstggffdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseieltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpptfgpgtkveik

SEQ ID NO: 2

Mkwvtfisllflfssaysqvqlvesggglvqpggslrlscaasgltfssynmgwfrqapgqgleavasitwsgrdtfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaanpwpvaaprsgtywgqgtlvtvsssggggsggggsggggsggggsgnwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintsgstsgsgkpgsgegstkgqvqlqesgpglvkpsetlsltcvvsggsisssnwwswvrqppgkglewigeiyhsgspdynpslksrvtisvdksrnqfslklssvtaadtavyycakvstggffdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseieltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpptfgpgtkveikvdehhhhhhhhhh

SEQ ID NO: 3

vdehhhhhhhhhh

SEQ ID NO: 4

qvqlqesgpglvkpsetlsltcvvsggsisssnwwswvrqppgkglewigeiyhsgspdynpslksrvtisvdksrnqfslklssvtaadtavyycakvstggffdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseieltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpptfgpgtkveik

SEQ ID NO: 5

atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggcctcaccttcagtagctataacatgggctggttccgccaggctccagggcaaggccttgaggctgtagcatctattacctggagtggtcgggacacattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaactccaagaacactctctatctgcaaatgaacagcctgcgcgcggaggacacggccgtttattattgtgctgcaaacccctggccagtggcggcgccacgtagtggcacctactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctcatctggcggcggcggttctggtggaggaggtagtggggggggaggaagcggagggggtggctcagggaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttctggcagtaccagcgggtcagggaaacctggcagtggggaaggttccacaaaaggtcaagtacaactccaggagtccgggccagggttggtcaagccatccgagacgcttagtttgacctgtgttgtcagcggaggctctatatcatcttcaaactggtggtcttgggtacggcaaccaccgggcaaggggctcgaatggatcggggaaatctaccactccggaagccccgactataatccgtcactgaagagcagagtcactatatccgtggacaagagcagaaaccaattttctcttaagctctcctcagtgacagcagcagatacagcggtctattattgtgccaaggtatcaacaggcggattcttcgattattggggacagggcactttggttacggtttcttctggaggcgggggaagtggtggaggggggtctgggggaggtggctcagaaatcgaacttacgcagtcaccctcctccctctcagcatccgtaggtgacagagttacgataacctgtagagcaagtcaatccatttctagctaccttaactggtatcagcaaaaacctgggaaagcccccaagctgcttatctatgcggcatcctccctccaaagtggagttcccagtcggttcagtggttccggctcagggactgactttaccctcacaatcagctcattgcaaccagaggactttgcaacgtattactgtcagcaaagctactcaacgccgcctacgttcggtcccggaaccaaagttgagattaaagtagacgaacaccatcatcatcatcaccatcaccaccattga

SEQ ID NO: 6

atgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggcctcaccttcagtagctataacatgggctggttccgccaggctccagggcaaggccttgaggctgtagcatctattacctggagtggtcgggacacattctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaactccaagaacactctctatctgcaaatgaacagcctgcgcgcggaggacacggccgtttattattgtgctgcaaacccctggccagtggcggcgccacgtagtggcacctactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctcatctggcggcggcggttctggtggaggaggtagtggggggggaggaagcggagggggtggctcagggaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttctggcagtaccagcgggtcagggaaacctggcagtggggaaggttccacaaaaggtcaagtacaactccaggagtccgggccagggttggtcaagccatccgagacgcttagtttgacctgtgttgtcagcggaggctctatatcatcttcaaactggtggtcttgggtacggcaaccaccgggcaaggggctcgaatggatcggggaaatctaccactccggaagccccgactataatccgtcactgaagagcagagtcactatatccgtggacaagagcagaaaccaattttctcttaagctctcctcagtgacagcagcagatacagcggtctattattgtgccaaggtatcaacaggcggattcttcgattattggggacagggcactttggttacggtttcttctggaggcgggggaagtggtggaggggggtctgggggaggtggctcagaaatcgaacttacgcagtcaccctcctccctctcagcatccgtaggtgacagagttacgataacctgtagagcaagtcaatccatttctagctaccttaactggtatcagcaaaaacctgggaaagcccccaagctgcttatctatgcggcatcctccctccaaagtggagttcccagtcggttcagtggttccggctcagggactgactttaccctcacaatcagctcattgcaaccagaggactttgcaacgtattactgtcagcaaagctactcaacgccgcctacgttcggtcccggaaccaaagttgagattaaatga

SEQ ID NO: 7

caagtacaactccaggagtccgggccagggttggtcaagccatccgagacgcttagtttgacctgtgttgtcagcggaggctctatatcatcttcaaactggtggtcttgggtacggcaaccaccgggcaaggggctcgaatggatcggggaaatctaccactccggaagccccgactataatccgtcactgaagagcagagtcactatatccgtggacaagagcagaaaccaattttctcttaagctctcctcagtgacagcagcagatacagcggtctattattgtgccaaggtatcaacaggcggattcttcgattattggggacagggcactttggttacggtttcttctggaggcgggggaagtggtggaggggggtctgggggaggtggctcagaaatcgaacttacgcagtcaccctcctccctctcagcatccgtaggtgacagagttacgataacctgtagagcaagtcaatccatttctagctaccttaactggtatcagcaaaaacctgggaaagcccccaagctgcttatctatgcggcatcctccctccaaagtggagttcccagtcggttcagtggttccggctcagggactgactttaccctcacaatcagctcattgcaaccagaggactttgcaacgtattactgtcagcaaagctactcaacgccgcctacgttcggtcccggaaccaaagttgagattaaa

SEQ ID NO: 8

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYNMGWFRQAPGQGLEAVASITWSGRDTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAANPWPVAAPRSGTYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 9

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

SEQ ID NO: 10

Mkwvtfisllflfssays

SEQ ID NO: 11

sggggsggggsggggsggggsg

SEQ ID NO: 12

gstsgsgkpgsgegstkg

SEQ ID NO: 13

PSGQAGAAASESLFVSNHAY

SEQ ID NO: 14

EASGGPE

SEQ ID NO: 15

GGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 16

MGWSCIILFLVATATGVHSS

SEQ ID NO: 17

MGWSCIILFLVATATGVHS

SEQ ID NO: 18

EVQLVESGGELVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYNMGWFRRAPGKEREFVASITWSGRDTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCAANPWPVAAPRSGTYWGQGTQVTVSSVDE

SEQ ID NO Описание SEQ ID NO: 1 CLEC12A TriKE SEQ ID NO: 2 CLEC12A TriKE с тэгом His и спейсером SEQ ID NO: 3 Тэг His и спейсер SEQ ID NO: 4 Домен, нацеливающий на CLEC12A SEQ ID NO: 5 ДНК, кодирующая CLEC12A TriKE с тэгом His и спейсером SEQ ID NO: 6 ДНК, кодирующая CLEC12A TriKE SEQ ID NO: 7 ДНК, кодирующая домен, нацеливающий на CLEC12A SEQ ID NO: 8 Гуманизированная Cam16 SEQ ID NO: 9 ИЛ-15 дикого типа SEQ ID NO: 10 Сигнальный пептид SEQ ID NO: 11 Линкер SEQ ID NO: 12 Линкер SEQ ID NO: 13 Линкер SEQ ID NO: 14 Линкер SEQ ID NO: 15 Линкер SEQ ID NO: 16 Сигнальный пептид SEQ ID NO: 17 Сигнальный пептид SEQ ID NO: 18 Негуманизированная Cam16

[00170] Любые и все ссылки, и цитирования других документов, таких как патенты, патентные заявки, патентные публикации, журналы, книги, статьи, веб-контент, которые были сделаны в данном раскрытии изобретения, тем самым включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00171] Хотя данное изобретение было описано со ссылкой на конкретные детали некоторых вариантов его осуществления в приведенных выше примерах, следует понимать, что модификации и изменения охватываются сущностью и объемом изобретения. Соответственно, данное изобретение ограничено только следующей формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> РЕГЕНТЫ УНИВЕРСИТЕТА МИННЕСОТЫ

MILLER, Jeffrey S.

FELICES, Martin

VALLERA, Daniel A.

LENVIK, Todd R.

<120> ВОВЛЕКАЮЩИЕ NK МОЛЕКУЛЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> GTBIO2090-1WO

<150> US 62/747983

<151> 2018-10-19

<160> 18

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 534

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 1

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Ala Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp

165 170 175

Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp

180 185 190

Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu

195 200 205

Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

210 215 220

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly

225 230 235 240

Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys

245 250 255

Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe

260 265 270

Ile Asn Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

275 280 285

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

290 295 300

Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly

305 310 315 320

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro

325 330 335

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro

340 345 350

Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys

355 360 365

Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp

370 375 380

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp

385 390 395 400

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr

420 425 430

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

435 440 445

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

450 455 460

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

465 470 475 480

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

485 490 495

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

500 505 510

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly

515 520 525

Thr Lys Val Glu Ile Lys

530

<210> 2

<211> 547

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 2

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Ala Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp

165 170 175

Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp

180 185 190

Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu

195 200 205

Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

210 215 220

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly

225 230 235 240

Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys

245 250 255

Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe

260 265 270

Ile Asn Thr Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

275 280 285

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

290 295 300

Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly

305 310 315 320

Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro

325 330 335

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro

340 345 350

Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys

355 360 365

Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp

370 375 380

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp

385 390 395 400

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr

420 425 430

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

435 440 445

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

450 455 460

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

465 470 475 480

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

485 490 495

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

500 505 510

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly

515 520 525

Thr Lys Val Glu Ile Lys Val Asp Glu His His His His His His His

530 535 540

His His His

545

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 3

Val Asp Glu His His His His His His His His His His

1 5 10

<210> 4

<211> 240

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Arg Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Thr Gly Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

210 215 220

Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 5

<211> 1644

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 5

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcccaggtg 60

cagctggtgg agtctggggg aggcttggtg cagcctgggg gctctctgag actctcctgt 120

gcagcctctg gcctcacctt cagtagctat aacatgggct ggttccgcca ggctccaggg 180

caaggccttg aggctgtagc atctattacc tggagtggtc gggacacatt ctatgcagac 240

tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaactcca agaacactct ctatctgcaa 300

atgaacagcc tgcgcgcgga ggacacggcc gtttattatt gtgctgcaaa cccctggcca 360

gtggcggcgc cacgtagtgg cacctactgg ggccaaggga ccctggtcac cgtctcctca 420

tctggcggcg gcggttctgg tggaggaggt agtggggggg gaggaagcgg agggggtggc 480

tcagggaact gggtgaatgt aataagtgat ttgaaaaaaa ttgaagatct tattcaatct 540

atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc accccagttg caaagtaaca 600

gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcac ttgagtccgg agatgcaagt 660

attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ctagcaaaca acagtttgtc ttctaatggg 720

aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa 780

tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca acacttctgg cagtaccagc 840

gggtcaggga aacctggcag tggggaaggt tccacaaaag gtcaagtaca actccaggag 900

tccgggccag ggttggtcaa gccatccgag acgcttagtt tgacctgtgt tgtcagcgga 960

ggctctatat catcttcaaa ctggtggtct tgggtacggc aaccaccggg caaggggctc 1020

gaatggatcg gggaaatcta ccactccgga agccccgact ataatccgtc actgaagagc 1080

agagtcacta tatccgtgga caagagcaga aaccaatttt ctcttaagct ctcctcagtg 1140

acagcagcag atacagcggt ctattattgt gccaaggtat caacaggcgg attcttcgat 1200

tattggggac agggcacttt ggttacggtt tcttctggag gcgggggaag tggtggaggg 1260

gggtctgggg gaggtggctc agaaatcgaa cttacgcagt caccctcctc cctctcagca 1320

tccgtaggtg acagagttac gataacctgt agagcaagtc aatccatttc tagctacctt 1380

aactggtatc agcaaaaacc tgggaaagcc cccaagctgc ttatctatgc ggcatcctcc 1440

ctccaaagtg gagttcccag tcggttcagt ggttccggct cagggactga ctttaccctc 1500

acaatcagct cattgcaacc agaggacttt gcaacgtatt actgtcagca aagctactca 1560

acgccgccta cgttcggtcc cggaaccaaa gttgagatta aagtagacga acaccatcat 1620

catcatcacc atcaccacca ttga 1644

<210> 6

<211> 1605

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 6

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttcccaggtg 60

cagctggtgg agtctggggg aggcttggtg cagcctgggg gctctctgag actctcctgt 120

gcagcctctg gcctcacctt cagtagctat aacatgggct ggttccgcca ggctccaggg 180

caaggccttg aggctgtagc atctattacc tggagtggtc gggacacatt ctatgcagac 240

tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaactcca agaacactct ctatctgcaa 300

atgaacagcc tgcgcgcgga ggacacggcc gtttattatt gtgctgcaaa cccctggcca 360

gtggcggcgc cacgtagtgg cacctactgg ggccaaggga ccctggtcac cgtctcctca 420

tctggcggcg gcggttctgg tggaggaggt agtggggggg gaggaagcgg agggggtggc 480

tcagggaact gggtgaatgt aataagtgat ttgaaaaaaa ttgaagatct tattcaatct 540

atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc accccagttg caaagtaaca 600

gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcac ttgagtccgg agatgcaagt 660

attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ctagcaaaca acagtttgtc ttctaatggg 720

aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg aggaaaaaaa tattaaagaa 780

tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca acacttctgg cagtaccagc 840

gggtcaggga aacctggcag tggggaaggt tccacaaaag gtcaagtaca actccaggag 900

tccgggccag ggttggtcaa gccatccgag acgcttagtt tgacctgtgt tgtcagcgga 960

ggctctatat catcttcaaa ctggtggtct tgggtacggc aaccaccggg caaggggctc 1020

gaatggatcg gggaaatcta ccactccgga agccccgact ataatccgtc actgaagagc 1080

agagtcacta tatccgtgga caagagcaga aaccaatttt ctcttaagct ctcctcagtg 1140

acagcagcag atacagcggt ctattattgt gccaaggtat caacaggcgg attcttcgat 1200

tattggggac agggcacttt ggttacggtt tcttctggag gcgggggaag tggtggaggg 1260

gggtctgggg gaggtggctc agaaatcgaa cttacgcagt caccctcctc cctctcagca 1320

tccgtaggtg acagagttac gataacctgt agagcaagtc aatccatttc tagctacctt 1380

aactggtatc agcaaaaacc tgggaaagcc cccaagctgc ttatctatgc ggcatcctcc 1440

ctccaaagtg gagttcccag tcggttcagt ggttccggct cagggactga ctttaccctc 1500

acaatcagct cattgcaacc agaggacttt gcaacgtatt actgtcagca aagctactca 1560

acgccgccta cgttcggtcc cggaaccaaa gttgagatta aatga 1605

<210> 7

<211> 720

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 7

caagtacaac tccaggagtc cgggccaggg ttggtcaagc catccgagac gcttagtttg 60

acctgtgttg tcagcggagg ctctatatca tcttcaaact ggtggtcttg ggtacggcaa 120

ccaccgggca aggggctcga atggatcggg gaaatctacc actccggaag ccccgactat 180

aatccgtcac tgaagagcag agtcactata tccgtggaca agagcagaaa ccaattttct 240

cttaagctct cctcagtgac agcagcagat acagcggtct attattgtgc caaggtatca 300

acaggcggat tcttcgatta ttggggacag ggcactttgg ttacggtttc ttctggaggc 360

gggggaagtg gtggaggggg gtctggggga ggtggctcag aaatcgaact tacgcagtca 420

ccctcctccc tctcagcatc cgtaggtgac agagttacga taacctgtag agcaagtcaa 480

tccatttcta gctaccttaa ctggtatcag caaaaacctg ggaaagcccc caagctgctt 540

atctatgcgg catcctccct ccaaagtgga gttcccagtc ggttcagtgg ttccggctca 600

gggactgact ttaccctcac aatcagctca ttgcaaccag aggactttgc aacgtattac 660

tgtcagcaaa gctactcaac gccgcctacg ttcggtcccg gaaccaaagt tgagattaaa 720

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ala Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 114

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly

20

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser

1 5 10 15

Asn His Ala Tyr

20

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ser

20

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 18

<211> 125

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly Thr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Val Asp Glu

115 120 125

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая соединение для активации клеток NK, композицию для применения для индукции пролиферации NK клеток, способ индукции NK-опосредованного уничтожения клетки-мишени у субъекта, способ стимуляции размножения клеток NK in vivo, способ ингибирования роста клеток рака у субъекта, способ стимуляции секреции воспалительных цитокинов клетками NK in vivo, и способ лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у субъекта. Изобретение расширяет арсенал средств для активации клеток NK. 7 н. и 19 з.п. ф-лы, 53 ил., 1 табл., 11 пр.

1. Соединение для активации клеток NK, содержащее:

вовлекающий естественные клетки-киллеры (NK) домен, содержащий фрагмент, который селективно связывается с CD16;

активирующий NK домен, функционально связанный с указанным вовлекающим NK доменом, содержащий антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело; и

нацеливающий домен, который выборочно связывается с клеткой-мишенью, и функционально связан с указанным активирующим NK доменом и вовлекающим NK доменом, при этом указанный нацеливающий домен селективно связывается с CLEC12A.

2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что указанный связывающий фрагмент антитела содержит scFv, F(ab)2 или Fab.

3. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело является человеческим или гуманизированным.

4. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело является верблюжьим.

5. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что активирующий NK домен содержит ИЛ-15 или его функциональный фрагмент.

6. Соединение по п. 5, отличающееся тем, что указанный ИЛ-15 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или ее функциональный вариант.

7. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что фрагмент нацеливающего домена содержит антитело или его связывающий фрагмент, или нанотело.

8. Соединение по п. 7, отличающееся тем, что связывающий фрагмент антитела содержит scFv, F(ab)2 или Fab.

9. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что вовлекающий NK домен содержит фрагмент, который селективно связывается с CD16, активирующий NK домен содержит ИЛ-15, и нацеливающий домен селективно связывается с CLEC12A.

10. Соединение по п. 1, содержащее по меньшей мере одну фланкирующую последовательность, соединяющую два из указанных доменов.

11. Соединение по п. 10, дополнительно содержащее вторую фланкирующую последовательность, соединяющую два соединенных домена с третьим доменом.

12. Соединение по п. 11, отличающееся тем, что указанные фланкирующие последовательности фланкируют активирующий NK домен.

13. Соединение по п. 12, отличающееся тем, что первая фланкирующая последовательность является C-концевой по отношению к вовлекающему NK домену, и при этом вторая фланкирующая последовательность является N-концевой по отношению к анти-CLEC12A нацеливающему домену.

14. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что домен CLEC12A представлен в SEQ ID NO: 4.

15. Композиция для применения для индукции пролиферации NK клеток, содержащая:

соединение по п. 1; и

фармацевтически приемлемый носитель.

16. Способ индукции NK-опосредованного уничтожения клетки-мишени у субъекта, включающий:

введение субъекту соединения по п. 1 в количестве, эффективном для индукции NK-опосредованного уничтожения клетки-мишени.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанная клетка-мишень представляет собой раковую клетку.

18. Способ стимуляции размножения клеток NK in vivo, включающий:

введение субъекту количества соединения по п. 1, эффективного для стимуляции размножения клеток NK у указанного субъекта.

19. Способ ингибирования роста клеток рака у субъекта, включающий:

введение указанному субъекту количества соединения по п. 1, эффективного для ингибирования роста клеток рака.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что рак включает рак предстательной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак мочевого пузыря, меланому, рак почки, почечный рак, рак полости рта, рак глотки, рак поджелудочной железы, рак матки, рак щитовидной железы, рак кожи, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак яичника или гемопоэтический рак.

21. Способ по п. 20, дополнительно включающий введение соединения до, одновременно или после химиотерапии, хирургической резекции опухоли или лучевой терапии.

22. Способ п. 21, отличающийся тем, что химиотерапия включает альтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, коласпазу, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитофосфан, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, фторурацил, флударабин, фотемустин, ганцикловир, гемцитабин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митомицин С, нимустин, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, прокарбазин, ралтитрексед, темозоломид, тенипозид, тиогуанин, тиотепа, топотекан, винбластин, винкрестин, виндезин, и винорелбин.

23. Способ по п. 19, отличающийся тем, что гемопоэтический рак представляет собой острый миелоидный лейкоз (ОМЛ).

24. Способ стимуляции секреции воспалительных цитокинов клетками NK in vivo, где способ включает:

введение субъекту эффективного количества соединения по п. 1 для стимуляции секреции воспалительных цитокинов.

25. Способ по п. 24, где воспалительные цитокины включают IFNγ и TNFα.

26. Способ лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у субъекта, где способ включает:

введение субъекту эффективного количества соединения по п. 1 для лечения ОМЛ.