СПОСОБ ПОДБОРА ПРОДУКТИВНЫХ ПАР ФОТОТРОФНЫХ И ГЕТЕРОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/00 C12N1/12 C12N1/20 

Изобретение относится к фотобиотехнологии, промышленной микробиологии, аквакультуре, экологии, может быть также использовано в пищевой промышленности, животноводстве при производстве кормов, медицинской и ветеринарной микробиологии.

Имеются источники, в которых описано выделение нативных (прижизннных) экзометаболитов в среду у культур сине-зеленых водорослей (цианобактерий), суточные ритмы выделения, оцениваются масштабы выделения (Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Царенко В.М. Суточные колебания содержания внеклеточных органических веществ в культуре сине-зеленых водорослей и в природной воде при «цветении». Гидробиол. журнал, 1980, т. 16, №2, с. 83-88).

В других источниках исследовалась реакционная способность (PC) летучих и водорастворимых экзометаболитов, выделяемых в среду, отдельных культур цианобактерий (сине-зеленых водорослей), бактерий, грибов и актиномицетов (Тамбиев А.Х. О реакционной способности летучих и водорастворимых экзометаболитов. В кн.: Биоантиокислители. - М.: Наука, 1975, с. 96-99).

В литературе описаны природные условия, в которых микроорганизмы образуют сообщества и ассоциативные комплексы и в которых связывающим звеном между фототрофными и гетеротрофными микроорганизмами являются нативные экзометаболиты (Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. - М.: Наука, 2003, 348 с.).

Известна монография, посвященная изучению экзометаболитов высших и низших растений, выделяемых в среду в процессе нормальной жизнедеятельности, которая содержит их общую классификацию на основе осуществляемых ими функций и описание важной роли в формировании и поддержании наземных и водных биоценозов. Описан ряд методов и в том числе метод «химических моделей» или определения реакционной способности (PC) среды, в которую поступают нативные экзометаболиты растущих в ней микроорганизмов, интегральные свойства которой (окислительные - OA или антиокислительные - АОА) могут меняться в зависимости от физиологического состояния культур (Тамбиев А.Х. Реакционная способность экзометаболитов растений. - М.: Изд.-во МГУ, 1984, 72 с.).

Известен способ, позволяющий использовать реакционную способность (PC) нативных экзометаболитов, выделяемых в среду микроорганизмами, как критерий совместимости при подборе смешанных культур и искусственных ассоциаций (Тамбиев А.Х., Лукьянов А.А. Реакционная способность нативных экзометаболитов, выделяемых в среду микроорганизмами, как критерий совместимости при подборе смешанных культур и искусственных ассоциаций. Вестник Московского Университета, сер. 16 биология, 2011, №1, с. 32-35). Данный способ целесообразно взять за прототип.

К недостаткам прототипа относится длительность, так как суждения по подбору пар принимаются на 21-е сутки роста микроорганизмов.

Раскрытие изобретения.

Технический результат заключается в ускорении процесса определения пар для повышения прироста биомассы при культировании смешанных культур фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов. Для его достижения требуется ряд условий, изложенных в данной заявке.

Определяют реакционную способность (PC) нативных (прижизненных) экзометаболитов, выделяемых в среду культивирования при росте микроорганизмов. В качестве индикатора PC берут раствор 3,4-диоксифенилаланина (ДОФА), изменяющий оптическую плотность в процессе автоокисления, а также ускоряющий его под действием окислительной активности (OA), либо замедляющий его под действием антиокислительной активности (АОА) выделяемых в среду экзометаболитов микроорганизмов в процессе роста. Значения OA и АОА экзометаболитов измеряются на чистых и смешанных культурах микроорганизмов.

Контролем служит среда культивирования вместе с индикатором PC без присутствия в ней нативных экзометаболитов микроорганизмов, значения контроля откладываются по оси абсцисс.

Для подбора наиболее продуктивных пар фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов используют представителей, имеющих противоположные значения PC экзометаболитов, а именно OA и АОА, которые предварительно определяют у чистых культур в самом начале экспоненциальной фазы роста через 1,5-2 суток после посева. Проведенное определение делает предлагаемый способ ускоренным.

Чистые культуры цианобактерий, микроводорослей и актиномицетов, а также подобранные пары выращивают в погружной культуре на жидкой модифицированной среде Громова №6 с добавлением растворимого крахмала в количестве 8 г/л. В качестве объектов участников пар в настоящей заявке используют чистые культуры различных таксонов фототрофных микроорганизмов - цианобактерий Anabaena variabilis Kutz. АТСС 29413 и зеленых микроводорослей, представитель - Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., а в качестве гетеротрофных микроорганизмов используют актиномицеты видов Streptomyces cinereorectus и Streptomyces xanthoromogenes.

Условия культивирования подобранной пары включают в себя первоначальное качание в течение двух суток в темноте при 160-180 об/мин при 26-28°С, дальнейшее культивирование проводят при 60-80 об/мин и постоянном освещении (16,4 мкмол·m^-2·s^-1) при температуре 26-28°С.

В качестве инокулята гетеротрофных микроорганизмов используют споровую суспензию актиномицетов с концентрацией спор 10⁶ кл/мл. Концентрация фототрофных клеток микроорганизмов - цианобактерий и зеленых микроводорослей составляет 10⁴ кл/мл. Соотношение частей актиномицетного компонента к фототрофному составляет 2:1. Биомассу цианобактерий и зеленых микроводорослей определяют нефелометрическим методом по калибровочным кривым. Биомассу актиномицетов и подобранных пар определяют весовым методом.

Следующие материалы иллюстрируют раскрытие технического результата.

Из табл. 1 видно, что пара №1, состоящая из фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов, показывает наиболее интенсивный рост, накапливая за 21 сутки значительное количество суммарной биомассы, пара №2 показывает за то же время хороший рост, пара №3 показывает заметный рост и пара №4 обнаруживает лишь минимальный рост по сравнению с контролем.

На фиг. 1 и 2 даны изменения реакционной способности экзаметаболитов, выделяемых в среду в процессе роста микроорганизмов.

На фиг. 1 представлено изменение PC нативных экзометаболитов (OA или АОА) в процессе роста пары №1 (табл. 1) - смешанной культуры актиномицета и цианобактерий, а также отдельно у ее партнеров. Обозначения: 1- Streptomyces xanthochromogenes, 2 - Anabaena variabilis, 3 - смешанная культура. Видно, что пара №1, обладающая из представленных наиболее интенсивным ростом и самым значительным накоплением биомассы, имеет противоположные активности OA и АОА в чистых культурах в процессе их роста, что видно уже в начале экспоненциальной фазы (1,5-2 суток) роста и что говорит о наибольшей совместимости партнеров. Суммарная кривая PC (фиг. 1, кривая 3) подобранной пары, как видно, является результирующим показателем и находится сначала в области OA под влиянием быстрорастущего партнера (актиномицета), а затем в области АОА вследствие выделения экзометаболитов цианобактериями, что связано с интенсивным накоплением суммарной биомассы у этой пары.

На фиг. 2 видно, что у пары №4 с начала экспоненциальной фазы роста кривые PC обоих партнеров и суммарная кривая этой смешанной культуры на протяжении всего роста находилась в одной области, а именно OA, и выход биомассы этой пары был практически минимальным по сравнению с другими парами.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять уровень совместимости участников пар (смешанных культур) из чистых культур фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов на ранних сроках экспоненциального роста (1,5-2 суток) в искусственных условиях и может быть полезен при массовом культивировании.

Примеры

Пример 1

Берут пару №1 (табл. 1) (смешанную культуру) фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов Anabaena variabilis и Streptomyces xanthochromogenes, готовят раствор ДОФА в соотношении: в 25 мл дистиллироваонной воды растворяют 10 мг 3,4-диоксифенилаланина (ДОФА). В кюветы для измерения PC помещают 2,5 мл приготовленного раствора ДОФА и 1,5 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащие нативные экзометаболиты чистых культур и смешанной культуры. Контролем служит раствор ДОФА, внесенный в кювету с культуральной средой, не содержащий нативные (прижизненные) экзометаболиты, его значения откладывают по оси абсцисс. Для определения PC измеряют оптическую плотность в кювете, находящейся в термостатированной камере при 45°С. Фиксируют отклонения PC чистых культур и смешанной культуры от контроля как в сторону OA, так и в сторону АОА через 1,5 суток роста.

Взятую пару (смешанную культуру) выращивают при первоначальном качании в течение 2 суток в темноте при 160 об/мин при 26°С. Дальнейшее выращивание проводят при 60 об/мин и постоянном освещении (16,4 мкмоль·m^-2·s^-1) при температуре 26-28°С. Для определения биомассы пары №1 (смешанной культуры) ее выращивают до 21-х суток. Для данной пары (смешанной культуры) на 21-е сутки роста получают биомассу, равную 0,58 г/л.

Пример 2

Берут ту же пару №1 (табл. 1), что и в примере 1. Приготавливают раствор ДОФА в соотношении: в 30 мл дистиллированной воды растворяют 12 мг ДОФА. В кюветы для измерения PC помещают 2,0 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащей нативные экзометаболиты чистых и смешанных культур. Контроль тот же, что и в примере 1. Фиксируют отклонения PC чистых культур и смешанной культуры после 2-х суток роста.

Дальнейшие операции проводят согласно примеру 1. Для данной пары (смешанной культуры) на 21-е сутки роста получают биомассу, равную 0,62 г/л.

Пример 3

Берут пару №4 (табл. 1). Готовят раствор ДОФА в соотношениях: в 28 мл дистиллированной воды растворяют 12 мг ДОФА. В кювету для измерения оптической плотности наливают 2,5 мл раствора ДОФА и 1,5 мл отфильтрованной культуральной жидкости, содержащей отдельно нативные экзометаболиты чистых культур и смешанной культуры. Все остальные операции проводят согласно примеру 1. Для данной пары (смешанной культуры) на 21-е сутки роста получают биомассу, равную 0,05 г/л.

Пример 4

Берут пару №4 (табл. 1) смешанную культуру. Готовят раствор ДОФА в соотношении: 10 мг ДОФА на 26 мл дистиллированной воды. В кювету добавляют 1,6 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащей нативные экзометаболиты. Все остальные операции проводят согласно примеру 1. Для данной пары (смешанной культуры) получают на 21-е сутки роста биомассу, равную 0,04 г/л.

Пример 5

Берут пару №2 (табл. 1) смешанная культура. Готовят раствор ДОФА в соотношении: 11 мг ДОФА на 28 мл дистиллированной воды. В кювету добавляют 2,0 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащей нативные экзометаболиты. Все остальные операции проводят согласно примеру 1. Для данной пары (смешанной культуры) выход биомассы на 21-е сутки роста равен 0,30 г/л

Пример 6

Берут пару №2 (табл. 1) смешанная культура. Готовят раствор ДОФА в соотношении: 12 мг ДОФА на 30 мл дистиллированной воды. В кювету добавляют 1,5 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащей нативные экзометаболиты. Все остальные операции проводят согласно примеру 1. Выход биомассы на 21-е сутки роста равен 0,32 г/л.

Пример 7

Берут пару №3 (табл. 1) смешанная культура. Готовят раствор ДОФА в соотношении: 12 мг ДОФА на 26 мл дистиллированной воды. В кювету добавляют 1,8 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащей нативные экзометаболиты. Все остальные операции проводят согласно примеру 1. Выход биомассы на 21-е сутки роста равен 0,13 г/л.

Пример 8

Берут пару №3 (табл. 1) смешанная культура. Готовят раствор ДОФА в соотношении: 10 мг ДОФА на 28 мл дистиллированной воды. В кювету добавляют 2,0 мл отфильтрованной культуральной среды, содержащей нативные экзометаболиты. Все остальные операции проводят согласно примеру 1. Выход биомассы на 21-е сутки роста равен 0,15 г/л.

Предлагаемый способ относится к фотобиотехнологии, промышленной микробиологии, аквакультуре, экологии, альгологии, биохимии, может быть также использован в пищевой промышленности, животноводстве при производстве кормов, в медицинской и ветеринарной микробиологии. Способ предусматривает подбор продуктивных по биомассе пар, состоящих из фототрофных (цианобактерий, зеленые микроводоросли) и гетеротрофных микроорганизмов (актиномицеты). У чистых культур и смешанных пар в процессе роста с помощью индикатора диоксифенилаланина (ДОФА) определяют реакционную способность (PC) выделяемых в среду нативных экзометаболитов, которые обладают окислительной (OA) или антиокислительной (АОА) интегральной активностью. Контролем является среда культивирования для микроорганизмов, в которой отсутствуют нативные экзометаболиты. Подобранная продуктивная пара, дающая наибольшую биомассу, имеет противоположные значения PC (OA или АОА), которые определяют в чистых и смешанных культурах в начале экспоненциальной фазы в течение первых 1,5-2 суток роста, что говорит о наилучшей совместимости в ней партнеров. Это не только обеспечивает совместимость партнеров в паре, но и позволяет значительно ускорить подбор пары, а также повысить выход биомассы микроорганизмов. 2 ил., 1 табл., 8 пр.

Способ ускоренного подбора продуктивных пар (смешанных культур) фототрофных и гетеротрофных микроорганизмов путем определения у каждой культуры реакционной способности (PC) нативных экзометаболитов, выделяемых в среду, и выражающейся в их интегральной активности - окислительной (OA) или антиокислительной (АОА), отличающийся тем, что пару микроорганизмов подбирают, исходя из противоположных значений их активностей, которые определяют в начале экспоненциальной фазы роста у чистых культур.