Способ культивирования Cyanobacterium sp. для получения полисахаридов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 C12P19/04 C12R1/89 

Изобретение относится к биотехнологии водорослей и может быть использовано для получения смеси природных полисахаридов.

Мезофильная цианобактерия Cyanobacterium sp., также называемые Cyanophyta, представляют собой тип грамотрицательных бактерий, которые получают энергию посредством фотосинтеза [Kultschar and Llewellyn, 2018]. Цианобактерии используют фотосинтетические пигменты, такие как каротиноиды, фикобилины и различные формы хлорофилла, которые поглощают энергию света. В отличие от гетеротрофных прокариот, цианобактерии имеют внутреннюю мембрану. Фототрофные прокариоты, цианобактерии дифференцированы в специализированные органеллы, такие как хлоропласта, хромопласты, этиопласты и лейкопласты, известные под общим названием пластиды.

Цианобактерии продуцируют внеклеточные полисахариды, содержащие сульфатные группы. У цианобактерий синтез полисахаридов осуществляется в цитоплазме [Kehr and Dittmann, 2015, Costa et al., 2021]. Основные стадии синтеза полисахаридов в микроводорослях: образование активированных Сахаров (прекурсоров); их сборка с помощью гликозилтрансфераз и экспорт полимеров во внеклеточное пространство или встраивание в мембрану клетки [Dantas et al., 2019, Tiwari et al., 2020].

Природные полисахариды являются эффективными иммуностимуляторами растений, животных и человека, проявляют антилипемический эффект, оказывают радиопротекторное, противоопухолевое, противовирусное и антибактериальное действие, используются как криопротекторы. Чаще всего полисахариды микроводорослей и цианобактерий представлены гетерополисахаридами, которые состоят из шести или более различных моносахаров [Pereira et al., 2009]. В составе полисахаридов цианобактерий обнаружены такие сахара, как глюкоза, галактоза, манноза, рибоза, арабиноза, ксилоза, фукоза и рамноза. Известно, что цианобактерии являются одним из наиболее богатых и легко возобновляемых источников широко известных, интересных по структуре и биологической активности водорастворимых полисахаридов.

В связи с этим перспективным сырьем для получения полисахаридов являются цианобактерии, встречающиеся в естественных водоемах и открытом море. Это затрудняет получение сырья с заданными свойствами, т.е. известным высоким содержанием полисахаридов. Известны патенты, в которых выход полисахаридов из микроводорослей при известных способах выделения, как правило, не превышает 5-11% [патент РФ №2645965, МПК С08В 37/18, опубл. 28.02.2018], а из макроводорослей, в том числе из фукуса - 3,9% от сухой массы водоросли [патент РФ №2240816, МПК, A61K 35/80 A61K 31/715, опубл. 27.11.2004; патент РФ №2135518, МПК С08В 37/00, С08В 37/18, С07Н 1/08, опубл. 27.08.1999; патент РФ №2028153, МПК A61K 35/80, опубл. 1995; патент РФ 1642725, МПК С08В 37/18, опубл. 15.11.1983].

Кроме того, использование культивируемых микроводорослей для производства полисахаридов ограничивается тем, что в основном предприятия, занимающиеся культивированием микрововодрослей, ориентированы на производство пищевого продукта и отчуждение части урожая для производства полисахарида им экономически невыгодно.

Наиболее близким к представляемому способу является способ получения полисахарида ламинарана из микроводоросли Streblonema sp. [патент РФ. №2645965 С1, МПК, С08В 37/18, опубл. 28.02.2018].

В данном изобретении проблема решается за счет того, что обогащение микроводоросли Streblonema sp.полисахаридом ламинараном ведут в два этапа, на первом этапе накапливают биомассу микроводоросли Streblonema sp. путем ее культивирования на питательной среде не менее 10 суток, температуре 8-18°С и освещенности - от 35 до 100 мкЕ/м² с еженедельной заменой питательной среды, на втором этапе непосредственно накапливают ламинаран в микроводоросли Streblonema sp., для чего в накопленной биомассе микроводоросли Streblonema sp.меняют состав питательной среды на безнитратную, и затем на ней в течение не менее 7 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp., при температуре 8-18°С и освещенности - от 35 до 100 мкЕ/м². Содержание ламинарана в микроводоросли при реализации данного способа составляет, % от сух. масс. 21.9±3.0.

Техническая проблема, стоящая перед представляемым изобретением: найти новый источник получения полисахаридов и разработать технологический процесс, позволяющий выделить высокое содержание полисахаридов.

Техническая проблема решается тем, что в качестве сырья для получения комплекса биологически активных соединений (смеси природных полисахаридов) предложено использовать Cyanobacterium sp., представляющую собой тип грамотрицательных бактерий, способную получать энергию посредством фотосинтеза.

Заявителем впервые обнаружено, что в качестве альтернативного источника для получения растворимых полисахаридов может быть использована цианобактерия Cyanobacterium sp.

Установлено, что она обладает высокой скоростью роста, а благодаря своим микроскопическим размерам она может культивироваться в контролируемых условиях, что позволяет получать биомассу с воспроизводимым химическим составом, что в конечном результате позволит снизить себестоимость конечного продукта.

Заявленная техническая проблема решается также тем, что обогащение Cyanobacterium sp. полисахаридами ведут в два этапа, на первом этапе накапливают биомассу Cyanobacterium sp. путем ее культивирования на питательной среде ВВМ в стерильных условиях, в режиме свет/темнота 12/12 ч, белый свет с интенсивностью 5000 lx. Культивирование проводят в термостатируемом шейкере (или аналогичном оборудовании) со скоростью ротора 100 об/мин. Продолжительность культивирования составляет 21 сутки.

В качестве питательной среды используют питательную среду ВВМ, следующего состава (г/л): MgSO₄×7H₂O - 0,075; KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; NaNO₃ - 0,75; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Накопление полисахаридов в биомассе Cyanobacterium sp. (второй этап) обеспечивается культивированием на питательной среде без добавления NaNO₃ и Mg₂SO₄.

В качестве безнитратной и бессульфатной питательной среды используют питательную среду, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Использование безнитратной и бессульфатной среды приводит к повышению содержания полисахаридов.

Культивирование на безнитратной и бессульфатной питательной среде при рН=6,0 при скорости вращения ротора 100 об/мин ведут 21 сутки. Заявителем установлено, что именно, начиная с 14 суток культивирования, наблюдается значительное повышение содержания полисахаридов в Cyanobacterium sp.

Смесь полисахаридов, состоящая из уроновых кислот и нейтральных Сахаров, может выделяться методом экстракции. Экстракцию полисахаридов из культуральной жидкости Cyanobacterium sp.ведут изопропиловым спиртом при модуле экстракции 1:3 и температуре 5°С. При данных параметрах экстракции наблюдается наибольший выход полисахаридов 4030,77 мг/г.

Пример 1

На первом этапе накапливают биомассу Cyanobacterium sp.путем ее культивирования на питательной среде ВВМ в стерильных условиях, в режиме свет/темнота 12/12 ч, белый свет с интенсивностью 5000 lx. Культивирование проводят в термостатируемом шейкере со скоростью ротора 100 об/мин. Продолжительность культивирования составляет 21 сутки.

В качестве питательной среды используют питательную среду ВВМ, следующего состава (г/л): MgSO₄×7H₂O - 0,075; KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCL₂(×2H₂O) - 0,025; NaNO₃ - 0,75; агаро-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Накопление полисахаридов в биомассе Cyanobacterium sp. (второй этап) обеспечивается культивированием на питательной среде без добавления NaNO₃ и Mg₂SO₄.

В качестве безнитратной и бессульфатной питательной среды используют питательную среду, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Культивирование на безнитратной и бессульфатной питательной среде при рН=6,0 при скорости вращения ротора 100 об/мин ведут 21 сутки.

Смесь полисахаридов, состоящая из уроновых кислот и нейтральных Сахаров, выделяют методом экстракции. Экстракцию полисахаридов из культуральной жидкости Cyanobacterium sp. ведут изопропиловым спиртом при модуле экстракции 1:3 и температуре 5°С. При данных параметрах экстракции наблюдается наибольший выход полисахаридов 4030,77 мг/г. в 10 раз больше чем в других примерах.

Пример 2

На первом этапе накапливают биомассу Cyanobacterium sp. путем ее культивирования на питательной среде ВВМ в стерильных условиях, в режиме свет/темнота 12/12 ч, белый свет с интенсивностью 5000 lx. Культивирование проводят в термостатируемом шейкере со скоростью ротора 100 об/мин. Продолжительность культивирования составляла 7 суток.

В качестве питательной среды используют питательную среду ВВМ, следующего состава (г/л): MgSO₄×7H₂O - 0,075; KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; NaNO₃ - 0,75; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Накопление полисахаридов в биомассе Cyanobacterium sp.(второй этап) обеспечивается культивированием на питательной среде без добавления NaNO₃ и Mg₂SO₄ следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Культивирование на безнитратной и бессульфатной питательной среде при рН=6,0 при скорости вращения ротора 100 об/мин ведут 7 суток,

Смесь полисахаридов, состоящая из уроновых кислот и нейтральных сахаров выделяют методом экстракции изопропиловым спиртом при модуле экстракции 1:1 и температуре 25°С. При данных параметрах экстракции наблюдается наибольший выход полисахаридов 423,08 мг/г.

Пример 3

На первом этапе накапливают биомассу Cyanobacterium sp. путем ее культивирования на питательной среде ВВМ в стерильных условиях, в режиме свет/темнота 12/12 ч, белый свет с интенсивностью 5000 lx. Культивирование проводят в термостатируемом шейкере со скоростью ротора 100 об/мин. Продолжительность культивирования составляла 28 суток.

В качестве питательной среды используют питательную среду ВВМ, следующего состава (г/л): MgSO₄×7H₂O - 0,075; KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; NaNO₃ - 0,75; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Накопление полисахаридов в биомассе Cyanobacterium sp.(второй этап) обеспечивается культивированием на питательной среде без добавления NaNO₃ и Mg₂SO₄ следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3Н₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; агар-агар - 17; дистиллированная вода остальное.

Культивирование на безнитратной и бессульфатной питательной среде при рН=8,0 при скорости вращения ротора 100 об/мин ведут 28 суток.

Смесь полисахаридов, состоящую из уроновых кислот и нейтральных Сахаров выделяют методом экстракции изопропиловым спиртом при модуле экстракции 1:1 и температуре 25°С. При данных параметрах экстракции наблюдается наибольший выход полисахаридов 539,12 мг/г.

Как видно из представленных примеров, Cyanobacterium sp. может стать альтернативным источником получения комплекса биологически активных соединений - природных полисахаридов. Разработанный заявителем способ не только позволяет наработать необходимое количество биомассы Cyanobacterium sp., но и значительно повысить в ней содержание целевого продукта полисахаридов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения смеси природных полисахаридов, заключающийся в том, что получение ведут в два этапа, на первом этапе накапливают биомассу Cyanobacterium sp. путем ее культивирования на питательной среде ВВМ следующего состава (г/л): MgSO₄×7H₂O - 0,075; KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; СаС₂(×2H₂O) - 0,025; NaNO₃ - 0,75; агар-агар - 17; дистиллированная вода – остальное; в стерильных условиях в режиме свет/темнота 12/12 ч, белый свет с интенсивностью 5000 lx в термостатируемом шейкере со скоростью ротора 100 об/мин в течение 21 сут; на втором этапе меняют питательную среду на безнитратную и бессульфатную следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; агар-агар - 17; дистиллированная вода - остальное; и культивирование ведут при рН=6,0 со скоростью вращения ротора 100 об/мин в течение 21 сут. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения комплекса биологически активных соединений - смеси природных полисахаридов. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ получения смеси природных полисахаридов, заключающийся в том, что получение ведут в два этапа, на первом этапе накапливают биомассу Cyanobacterium sp. путем ее культивирования на питательной среде ВВМ следующего состава (г/л): MgSO₄×7H₂O - 0,075; KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; СаС₂(×2H₂O) - 0,025; NaNO₃ - 0,75; агар-агар - 17; дистиллированная вода – остальное; в стерильных условиях в режиме свет/темнота 12/12 ч, белый свет с интенсивностью 5000 lx в термостатируемом шейкере со скоростью ротора 100 об/мин в течение 21 сут; на втором этапе меняют питательную среду на безнитратную и бессульфатную следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,175; KCl - 0,025; K₂HPO₄(×3H₂O) - 0,075; Fe+EDTA - 1,00 мл; CaCl₂(×2H₂O) - 0,025; агар-агар - 17; дистиллированная вода - остальное; и культивирование ведут при рН=6,0 со скоростью вращения ротора 100 об/мин в течение 21 сут.

2. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивирование Cyanobacterium sp. для накопления биомассы и ее обогащения смесью природных полисахаридов ведут при температуре 26°С.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что смесь полисахаридов из культуральной жидкости Cyanobacterium sp. выделяют экстракцией, проводят изопропиловым спиртом при модуле экстракции 1:3 и температуре 5°С.