ШТАММ CANDIDA ALBICANS № 253, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/02 A61K39/00 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и иммуногенных препаратов против кандидоза сельскохозяйственных животных и птицы.

Максимальное получение антигенов прямо пропорционально продуктивности штамма по ряду признаков, главным из которых является интенсивность спорообразования.

Указанный признак, а также отсутствие токсигенности и выраженные иммуногенные свойства определяют целесообразность использования штамма для производства дагностикумов и конструирования вакцинных препаратов.

Известно использование штамма Candida albicans для получения антигенов (см. а.с. СССР 1827632 по кл. G 01 N 33/53, опуб. 15.07.93 г.).

Однако данный штамм продуцирует антигены, способные изменять скорость оседания эритроцитов (СОЭ), и используется только при диагностических исследованиях.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Candida albicans HKM 9656, депонированный в "Немецкой Коллекции Микроорганизмов", используемый для получения антигена - полисахарида (см. заявка РФ 98104502 по кл. С 12 Р 21/00, опуб. 20.02.2000 г.).

Однако данный штамм предназначен для получения антигена, проявляющего только антиаллергическую активность при лечении млекопитающих.

Изобретение направлено на решение задачи создания нового штамма - Candida albicans 253, обладающего высокой спорообразующей активностью, отсутствием патогенности, токсигенности и наличием иммуногенных свойств.

Штамм Candida albicans 253 выделен в Саратовской области от теленка 22-дневного возраста, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ), хранится в Саратовской НИВС.

Штамм Candida albicans 253 характеризуется следующими признаками
Морфологические признаки
Культура представлена овальными (2:1) или почти круглыми клетками с хорошо заметными вакуолями с небольшими ядрами.

Культуральные признаки.

На агаре Сабуро через 48 ч культивирования при температуре 28^oС образуются выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. На 5 сутки культивирования поверхность колонии гладкая, матовая, с кремовым оттенком, края слегка волнистые.

При культивировании на жидких питательных средах через 48 ч при 28^oС заметно помутнение бульона и образование компактного осадка.

Ферментативные свойства
Ферментативная активность проявляется на полужидкой среде Гисса: с глюкозой - образованием кислоты и газа; с мальтозой - также кислоты и газа; с сахарозой - только кислоты; с лактозой активность не проявляется.

Видовое определение штамма проводят по способу Е.В.Себрякова в сответствии с а.с. СССР 1104153 (опуб. 23.07.84 г.). В качестве индикатора используют метиловый красный, а перед добавлением индикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в течение 4-6 ч в среде, содержащей сахарозу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации оценку проводят по изменению окраски культуральной жидкости. Происходит изменение цвета среды с резазурином из сине-фиолетового в малиновый в течение 4-6 ч и появление желтой окраски культуральной жидкости после добавления метилового красного.

Антигенные свойства
Штамм Candida albicans 253 продуцирует комплекс белков, полисахаридов и липидов, находящихся в клетке микроорганизма.

Чувствительность к антибиоткам: зона задержки роста штамма леворином составляет 32 мм, нистатином - 45 мм. Ауксотрофность отсутствует.

Вирулентные свойства
При введении культуры белым мышам внутривенно и внутрибрюшинно в дозе 1•10⁹ спор/мл в объеме 0,5 мл, морским свинкам - внутрисердечно в дозе 3•10⁹ спор/мл в объеме 2,0 мл гибели животных не отмечается. Внутримышечное введение культуры штамма кроликам в дозе 3•10⁹ спор/мл и объеме 5 мл вызывает местную гиперемию с небольшим отеком прилежащих тканей, проходящую через 48 - 96 ч. Изменений в общем состоянии животных при этом не отмечается.

Штамм относится к III группе патогенности - условно патогенный.

Штамм Candida albicans 253 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку спообразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались.

Пассажирования на животных не требуется.

Штамм Candida albicans 253 хранят на агаре Сабуро в течение не более 30 сут, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро для получения двухсуточной культуры, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма - в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4^oС до 1 года.

Способ, условия и состав среды для размножения штамма - бульон и агар Сабуро. Культивирование осуществляется при температуре 28-32^oС.

Пример 1
Штамм Candida albicans 253 культивируют на питательных средах: Сабуро, Городковой или разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ 2111245, опуб. 20.05.98 г., содержащей, мас.%: глюкозу 4-5; пептон 0,95 - 1,05; агар 3,5 - 3,6; сыворотку крови крупного рогатого скота 9-11; солевой раствор Хенкса - остальное.

Спорообразование штамма испытано методом подсчета клеток в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства по формуле:
(а • 4000 • 1000) : в = х,
где а - число сосчитанных клеток;
в - число малых квадратов камеры.

Результаты спорообразования штамма 253 С. albicans на твердых питательных средах представлены в таблице 1.

Пример 2
Штамм Candida albicans 253 культивируют при температуре 28^oС в течение 6 суток на питательной среде, разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ 2111245, состав которой описан в примере 1.

Затем методом последовательных 12-кратных замораживаний (-20^oС) и оттаиваний (+20^oС) культуры разрушают клеточную стенку Candida. Фильтрованием через мембрану "Владипор" 3 освобождаются от целых клеток и цитоплазматических мембран. Полученный фильтрат подвергают обезвреживанию раствором формалина 0,4%-ной концентрации и добавляют масляный адъювант в соотношении 5 ч. антигена и 1 ч. адъюванта.

Полученным антигеном иммунизировали лабораторных животных. В последующем их подвергали заражению вирулентным штаммом Candida albicans. В качестве контроля использовали неиммунизированных животных. Результаты иммунизации представлены в таблице 2.

Таким образом, предлагаемый штамм Candida albicans 253 обладает высокой спорообразующей способностью, а продуцируемые штаммом антигены обладают достаточными иммуногенными свойствами.

Изобретение относится к микологии. Штамм Candida albicans 253 используется для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и лечебных препаратов против кандидозов сельскохозяйственных животных и птиц. Штамм обладает высокими иммуногенными свойствами, высокой спорообразующей способностью и является условно патогенным. 2 табл.

Штамм Candida albicans 253, коллекция ВГНКИ, используемый для получения антигена.