АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ, СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ Российский патент 2012 года по МПК A61K36/62 A61K47/02 C12N1/14 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микологии, в частности к получению вакцины против кожного кандидоза плотоядных животных, преимущественно, серебристо-черных лисиц, собак и кошек. До настоящего времени животных, больных кандидозом, лечили различными антимикотиками и антисептиками.

Известен протективный антиген гриба Candida albicans, предназначенный для иммунопрофилактики кандидоза желудочно-кишечного тракта у свиней. Антиген получен центрифугированием из биомассы штамма Candida albicans ВКПГУ-401/NCTC-885-653.

Способ изготовления препарата заключается в следующем:

- выращивание культуры гриба в чашках Петри на агаре Сабуро при 32-340°C в течение 2-х суток;

- съем культуры стерильным 0,15-молярным раствором NaCl;

- фильтрация через 2 слоя марли;

- центрифугирование (2500-3000 об/мин в течение 20 минут);

- дозировка биомассы при помощи оптического стандарта мутности ГКИ им. Тарасевича (осадок клеток ресуспензируют в 0,15 молярном растворе NaCl до концентрации 1,5×10⁸ клеток в 1 см³);

- добавление формалина до 0,5%-ной конечной концентрации формальдегида;

- выдерживание при 36-37°C в течение 2-х суток;

- контроль на стерильность;

- добавление стерильного 0,15 молярного раствора NaCl (около 70 объемных процентов);

- адсорбирование на стерильном геле гидроокиси алюминия (около 20 объемных процентов);

- выдерживание при 37°C в течение 10 дней при частом помешивании для лучшего растворения адъюванта по поверхности антигена;

- контроль на стерильность и безвредность.

Протективный антиген, содержащий в 1 см³ 15 млн гр. т., вводят с профилактической целью двукратно, с интервалом 14 дней внутримышечно в область внутренней поверхности бедра в дозах: супоросным свиноматкам за 2 месяца до опороса - 5,0 см³, поросятам 20-дневного возраста - 1,5 см³; аэрозольно с применением аэрозольных генераторов ДАГ-2 в дозах: супоросным свиноматкам за 2 месяца до опороса - 5,0 см³/м², поросятам 20-дневного возраста- 1,5 см³/м².

У свиноматок, привитых в вышеуказанных дозах, формируется противокандидозный иммунитет продолжительностью до 2-х месяцев [1].

Известна также вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных, предназначенная для профилактики висцеральных микозов телят и поросят. Вакцина включает растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов, полученных из депонированного во ВГНКИ вакцинного штамма Candida albicans №253 разрушением клеток грибов способом ультразвуковой дезинтеграции с последующим освобождением от поврежденных стенок и целых клеток методом фильтрации через мембраны при помощи вакуум-насоса.

Способ изготовления вакцины заключается в следующем:

- инкубация культуры гриба в пробирках на агаре Сабуро при 28°C в течение 3-х сут;

- съем культуры физ. раствором NaCl;

- выращивание культуры на матрасах на питательном агаре с солевым р-ром Хенкса при 28°C в течение 6 сут;

- съем культуры дистиллированной водой из расчета 25 см³ на каждый матрас;

- определение концентрации бластоспор (колеблется в пределах 8×10⁸-1×10⁹ спор/см³);

- дозировка биомассы (концентрацию спор доводят до 4,5×10⁸-5,5×10⁸ м. т. 1 в см³ дистиллированной водой);

- выделение антигена из клеточной стенки и цитоплазмы полученной суспензии грибов методом разрушения клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора (при длине волны 10-20 кГц и экспозиции 60 минут);

- освобождение от разрушенных и неразрушенных клеток методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА-МА №3 при помощи вакуум-насоса (полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов);

- оценка полученных антигенов по индексу агломерации лейкоцитов (для изготовления вакцины используют антигены, имеющие индекс 6-10%);

- добавление формалина в конечном разведении смеси 0,4%;

- добавление адъюванта - 6% раствора гидроокиси алюминия в соотношении 10:1;

- выдерживание при 37°С в течение 21 суток.

Вакцину вводят с профилактической целью внутримышечно двукратно с интервалом между введениями в 7-10 дней. В зависимости от вида и возраста животных оптимальными дозами являются: телятам в возрасте 1-2 месяца - 1-2,0 см³; 3-5 месяцев - 5,0 см³; поросятам в возрасте 1-2 месяца - 1-2,0 см³; 2-4 месяца - 3,0 см³. После проведения массовой иммунизации молодняка случаи возникновения заболеваний прекращаются на период до 6 месяцев [2]. ПРОТОТИП.

Задачей наших исследований было получение вакцины для профилактики и терапии кожного кандидоза, обеспечивающей создание в организме плотоядных животных напряженного длительного иммунитета.

Нами получена ассоциированная вакцина, преимущественно, против кожного кандидоза серебристо-черных лисиц, собак и кошек, включающая бластоспоры штаммов грибов Candida albicans «Лисица» и Candida tropicalis «Змея» с концентрацией бластоспор 10-40 млн в 1 см³ 0,8-1%-ного серноватистокислого натрия, взятых в равных соотношениях.

Указанные вакцинные штаммы депонированы в Музее грибных культур лаборатории микологии и антибиотиков ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко г.Москва (Candida albicans «Лисица» под №95, Candida tropicalis «Змея» под №87). Справку о депонировании прилагаем.

Штамм С.ALBICANS №95 обладает следующими вакцинными свойствами.

КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. На сусле-агаре образует сметанообразные, гладкие, выпуклые, блестящие колонии беловатого цвета, мягкие по консистенции, однородные, с ровными или волнистыми краями. Глубокое врастание в питательную среду по краям или под колониями выражено отчетливо. Диаметр колоний 2-3 см. Клетки округлые 2-6 мкм в диаметре. На жидком сусле глубинный рост и образование осадка. Не образует поверхностной пленки и пристеночного кольца. Клетки круглые и слегка овальные размером 3-6,5×3,5-12,5 мкм. На картофельном и кукурузном агарах развитый древовидный псевдомицелий обнаруживают на 3-5-е сутки культивирования. Около нитей псевдомицелия крыловидные или шаровидные вертициллы. Нити псевдомицелия длиной от 260 до 2000 мкм, прямые или слегка изогнутые. Преобладающий тип филаментации - Mycotorula. Хламидоспоры крупные (9-15 мкм), круглые, двухконтурные располагаются на боковых и концевых веточках по краям колонии. Хламидоспоры обнаруживают также на морковно-картофельном и рисовом агарах через 24-48 ч после посева. На жидких белковых средах клетки С. albicans №95 в течение 2,5-3 ч прорастают, образуя короткие ростковые трубки.

ВИРУЛЕНТНЫЕ СВОЙСТВА. ЛД₅₀ двухсуточной сусло-агаровой культуры С.albicans №95 при внутрибрюшинном введении белым мышам составляет 45-55 млн бластоспор. Гибель мышей наступает на 2-3 сутки после заражения.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. При двукратной вакцинации белых мышей вакциной с содержанием бластоспор 5,0-20 млн в 1 см³ развивается невосприимчивость к экспериментальному заражению (срок наблюдения 6 мес).

РЕАКТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Внутримышечное введение вакцины у белых мышей, собак, кошек и серебристо-черных лисиц не приводит к изменению клинического состояния животных.

Штамм С.TROPICALIS №87 обладает следующими свойствами.

КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. На сусле-агаре формируются складчатые круглые колонии с зубчатыми краями, коричневатые, вначале сметанообразные, позднее пленчатые, компактные (диаметром 3,5-4,5 см) с приподнятым неправильно бугристым центром и с радиально исчерченными неровными краями. Врастание в субстрат умеренное. Характерно образование петель, которые придают колониям своеобразный и характерный вид. Дрожжевые клетки овоидной формы размером 4,3-7,2×5,8-10,8 мкм. Псевдомицелий обильный, состоящий из длинных разветвленных нитей. Преобладающий тип роста - Mycotoruloides. На жидком сусле образуются поверхностная пленка с пузырьками, тонкое пристеночное кольцо и обильный осадок на дне. Микроскопически на жидком сусле клетки овальные (встречаются и круглые), размером 5-9×6-12 мкм. На бульоне Сабуро в поверхностной пленке овальные клетки (4-6×3,3-5,3 мкм), в осадке более крупные овальные клетки. В трех-пятисуточных культурах - клетки и нити псевдомицелия. На картофельном и кукурузном агарах развитый псевдомицелий обнаруживают на 3-5-е сутки. Нити длиной 500-2000 мкм и более с множеством боковых ответвлений и относительно небольшими крыловидными вертициллами и псевдоконидиями. Тип филаментации Mycotoraloides. Хламидоспоры отсутствуют.

ВИРУЛЕНТНЫЕ СВОЙСТВА. ЛД₅₀ двухсуточной сусло-агаровой культуры С. tropicalis №87 при внутрибрюшинном введении белым мышам составляет 73-83 млн бластоспор. Гибель мышей наступает на 2-5 сутки после заражения.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. При двукратной вакцинации белых мышей вакциной с содержанием бластоспор 5,0-20,0 млн в 1 см³ развивается невосприимчивость к экспериментальному заражению (срок наблюдения 6 мес.).

РЕАКТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Внутримышечное введение вакцины у белых мышей, собак, кошек и серебристо-черных лисиц не приводит к изменению клинического состояния животных.

Вакцину готовят следующим образом:

- раздельно выращивают вакцинные штаммы на сусле-агаре (на матрасах) при 26-30°C в течение 2-3 суток;

- добавляют официнальный физ. раствор NaCl (по 200-300 см³ на каждый матрас);

- полученные суспензии пересевают с помощью пипетки Мора на новые матрасы с суслом-агаром (из расчета 5-7 см³ суспензии на 1 матрас);

- посевы инкубируют при 26-30°C в течение 3-5 суток;

- выращенные культуры снимают с питательной среды с помощью стерильного металлического скребка;

- биомассы грибов раздельно гомогенизируют со стерильным раствором 0,8-1%-ного серноватистокислого натрия в гомогенизаторах с вертикальными стаканами и нижним приводом (режимы: 10 минут - при скорости 3-6 тысяч оборотов в минуту или 3-5 минут - при скорости 9-12 тысяч оборотов в минуту);

- концентрированные гомогенаты выдерживают в течение 9-11 дней при 2-6°C;

- определяют содержание бластоспор грибов в гомогенатах путем подсчета в камере Горяева;

- определяют контаминацию грибного гомогената посторонней микрофлорой;

- стандартизируют грибные гомогенаты по определенным количествам грибных клеток в единице объема разбавителя (0,8-1% серноватистокислый натрий);

- стандартные грибные гомогенаты смешивают в соотношении 1:1 (от 10 до 40 млн бластоспор грибов в 1 см³ вакцины);

- грибные клетки в вакцинном гомогенате ступенчато инактивируют температурой 45-55°C (грибные суспензии прогревают в течение 14-18 час, затем оставляют при комнатной температуре на 5-9 час; такое чередование температур проводят 3 раза);

- гомогенат контролируют на стерильность;

- стандартизируют соединенный гомогенат по количеству бластоспор;

- pH вакцинного гомогената доводят до 7,0-7,2;

- разливают и укупоривают препарат;

- повторно инактивируют температурой 45-55°C в том же режиме;

- этикетируют;

- контролируют препарат согласно лабораторному регламенту.

Вакцину хранят при температуре от 2 до 25°C. Срок годности 2 года (срок наблюдения).

Представляем конкретные варианты вакцины с различным содержанием бластоспор грибов в 1 см³ препарата.

1 вариант: по 2,5 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

2 вариант: по 5 млн. бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

3 вариант: по 10 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

4 вариант: по 15 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

5 вариант: по 20 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

6 вариант: по 25 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

7 вариант: по 30 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см³ вакцины.

В результате испытаний на безвредность (использовано 140 белых мышей) из дальнейших опытов исключены 6-й и 7-й варианты вакцины, введение больших доз которых оказалось реактогенным для белых мышей. Остальные (1-5) варианты были испытаны на иммуногенность на лабораторных животных (198 белых мышей).

Все варианты вакцины иммуногенны - спустя 1 мес. после ревакцинации не удалось заразить ни одно животное (табл.1).

Таблица 1 Определение длительности поствакцинального иммунитета Вариант вакцины Количественный состав С. albicans + С. tropicalis, бластоспоры, млн в 1 см³ Количество животных Результаты экспериментального заражения белых мышей через: 1 мес 3 мес 6 мес 1 2,5+2,5 36 - 1 (+), 2 (+-) 3 пали, 2 (+), 3 (+-) 2 5+5 36 - - 1 (+), 3 (+-) 3 10+10 36 - - 1 (+-) 4 15+15 36 - - 1 (+), 1 (+-) 5 20+20 36 - - 1(+) Контроль - 18 4(+), 3(+), 4(+), 1 (+-), 1 (-) 3(+-) 2(+-) Примечания: (-) - не заболели; (+) - заболели; (+-) - вначале незначительное угнетение, затем самопроизвольное выздоровление.

Изучение длительности поствакцинального иммунитета показало, что мыши, привитые 1 вариантом вакцины, уже через 3 мес после повторной вакцинации в результате экспериментального заражения проявляют клиническую картину кандидоза (табл.1).

Как видно из таблицы 1, мыши, привитые 2, 3, 4 и 5 вариантами вакцины, спустя 1 и 3 мес после иммунизации не реагировали на экспериментальное заражение. Однако через 6 мес после иммунизации в каждой группе заболевало кандидозом около 15% экспериментально зараженных животных. При этом наименее иммуногенным оказался 2 вариант вакцины, а наиболее иимуногенными - 3 и 5. Поскольку в 3 варианте вакцины содержание бластоспор грибов меньше, чем в 5, а по профилактической эффективности оба варианта равны, оптимальной для использования мы сочли 3 вариант.

Полученную вакцину (3 вариант) применяли двукратно с интервалом 12-16 дней внутримышечно (в симметричные точки тела) с профилактической и лечебной целями на серебристо-черных лисицах, собаках и кошках в дозах, приведенных в табл.2.

Таблица 2 Рекомендуемые лечебно-профилактические дозы для плотоядных животных в зависимости от их возраста и массы тела Вид животных Возраст животных Живая масса Объем препарата, см³ Лисицы с 30 до 45 сут - 0,3-0,7 старше 45 сут - 0,8-1,2 Собаки старше 45 сут до 1 кг 0,3-0,7 от 1 до 35 кг 0,8-1,2 от 35 и более кг 1,3-1,7 Кошки старше 45 сут до 1 кг 0,3-0,7 от 1 и более кг 0,8-1,2

Результаты испытаний показали, что вакцина является безвредной и создает напряженный иммунитет длительностью до 6 мес. Наиболее оптимальным для иммунизации серебристо-черных лисиц является возраст от 30 дней, собак и кошек - старше 45 дней. Профилактический эффект через 3 мес после ревакцинации составил 100%, через 6 мес - 86,7% (90% у собак и кошек, 80% у лисиц) и через 9 мес - 56,7% (50% у собак, 60% у кошек и лисиц). Терапевтический эффект составил 100%. Терапевтический эффект от иммунизации начинал проявляться спустя 2-5 сут после первого введения вакцины, а через 3-5 сут после повторного применения препарата наступало полное выздоровление.

Предложенная вакцина апробирована нами в 2008-2010 гг. в лабораторных (лаборатория микологии и антибиотиков им. А.Х.Саркисова ВИЭВ) и практических (ООО «Агрофирма Прозоровская» Калининградской области, ООО «Валента» г.Владимир, ОАО «Племенной зверосовхоз Салтыковский» Московской обл.) условиях с положительными результатами на поголовье 142 серебристо-черных лисиц, 169 собак, 174 кошек, 40 белых мышей.

Вакцина найдет применение в зверохозяйствах, частном секторе, клубах собако- и фелиноводства, цирках, зоопарках, питомниках в качестве эффективного профилактического и терапевтического средства против кандидозов плотоядных животных.

Просим назвать вакцину КАНДИДЕРМ-К согласно утвержденной документации.

Источники информации

1. Автореф. дис.…канд. биол. наук: 03.00.07 / А.М.Шарафутдинов; Ульян, гос. с.-х. акад. - Ульяновск, 2001. - С.6-7. - Технология получения протективного антигена гриба С. albicans и возможность его практического применения.

2. Автореф. дис.…д-ра ветеринар. наук: 16.00.03 / В.А.Агольцов; Нижегор. гос. с.-х. акад. - Нижний Новгород, 2006. - С.30-31, 42. - Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы).

Изобретение относится к области ветеринарной микологии и касается получения вакцины против кожного кандидоза плотоядных животных. Предложенная ассоциированная вакцина против кожного кандидоза плотоядных в качестве антигенов содержит бластоспоры иммуногенных штаммов С.albicans №95 и С.tropicalis №87, взятые в равных соотношениях (1:1) с конечным количеством 10-40 млн бластоспор в 1 см³ 0,8-1% серноватистокислого натрия. Способ изготовления такой вакцины включает раздельную гомогенизацию биомассы бластоспор грибов в растворе серноватистокислого натрия, подсчет содержания бластоспор, стандартизацию гомогенатов до содержания 10-40 млн бластоспор в 1 см³ путем щадящей тиндализации и смешивание полученных гомогенатов. Способ профилактики и терапии кожного кандидоза плотоядных заключается во внутримышечном введении вакцины сначала в одно, а через 12-16 дней, повторно, в противоположное место в лечебно-профилактических дозах. Представленное изобретение позволяет обеспечить создание в организме плотоядных животных напряженного длительного иммунитета. 3 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Ассоциированная вакцина против кожного кандидоза плотоядных, отличающаяся тем, что в качестве антигенов содержит бластоспоры штаммов C.albicans №95 и C.tropicalis №87, депонированные в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ), взятые в равных соотношениях по 10-40 млн бластоспор в 1 см³ 0,8-1%-ного раствора серноватистокислого натрия.

2. Способ изготовления ассоциированной вакцины против кожного кандидоза плотоядных, отличающийся тем, что биомассу бластоспор грибов C.albicans №95 и C.tropicalis №87, депонированные в ВИЭВ, раздельно гомогенизируют в 0,8-1%-ном растворе серноватистокислого натрия, определяют содержание бластоспор грибов в гомогенатах путем подсчета в камере Горяева, стандартизируют грибные гомогенаты до содержания 10-40 млн бластоспор в 1 см³ добавлением 0,8-1%-ного раствора серноватистокислого натрия, гомогенаты смешивают в соотношении 1:1, проводят ступенчатую инактивацию температурой от 45 до 55°С в течение 42-54 ч (грибные суспензии прогревают в течение 14-18 ч, затем оставляют при комнатной температуре на 6-10 ч; такое чередование температур проводят 3 раза - щадящая тиндализация).

3. Способ профилактики и терапии кожного кандидоза плотоядных заключается во внутримышечном введении вакцины, охарактеризованной по п.1, сначала в одно, а через 12-16 дней, повторно, в противоположное место в лечебно-профилактических дозах: серебристо-черным лисицам в возрасте от 30 до 45 сут - 0,3-0,7 см³, старше 45 сут - 0,8-1,2 см³; кошкам и собакам старше 45 сут с массой тела до 1 кг - 0,3-0,7 см³, от 1 до 35 кг - 0,8-1,2 см³, от 35 кг и более - 1,3-1,7 см³.