СПОСОБ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛАКТОБАЦИЛЛЫ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и диетотерапии, и может быть использовано при доклиническом исследовании противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих латобациллы, предназначенных для диетотерапии больных с пищевой аллергией.

Влияние микрофлоры на иммунитет человека обуславливает возможность использования пробиотиков в качестве иммунотропных средств [1, 2, 3]. Оценка противоаллергических свойств пробиотиков in vitro [4] не дает комплексного представления о противоаллергическом действии разрабатываемых пробиотиков, поэтому актуальным является создание моделей аллергий.

Известен способ создания модели пищевой аллергии, заключающийся в интраперитонеальной сенсибилизации мышей ежедневно в течение 7 дней с последующим определением в сыворотке крови уровня гистамина, IgE [5].

Также известен способ воспроизведения модели пищевой аллергии, заключающийся в интраперитонеальной сенсибилизации мышей с интервалом 7 дней (1 и 7 день) и общей продолжительностью 14 дней с дальнейшим определением в сыворотке крови IgE, IgG [6].

Основным недостатком обоих аналогов является то, что они не эффективны для доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, в связи с отсутствием сочетания показателей сыворотки крови и кишечника, информативного как при пищевой аллергии, так и при противоаллергенном действии перорально применяемых пищевых продуктов, содержащих лактобациллы.

Прототипом заявляемого технического решения является способ определения противоаллергического действия бифидобактерий и/или лактобацилл, заключающийся в первоначальном введении мышам линии С3Н/HeJ бифидобактерий и/или лактобацилл Lactobacillus acidophilus AD031, Bifidobacterium lactis AD011 и их сочетания с последующей сенсибилизацией животных овальбумином с холерным токсином общей продолжительностью 7 недель с определением в сыворотке крови уровня овальбумин-специфических IgE, IgG1, IgG2a и sIgA в экстракте фекальных гранул, с определением ИЛ-4, ИЛ-10 и уровня IFN-γ из клеток селезенки животных с гистологическим исследованием тонкого кишечника, с последующей оценкой на основании указанных выше показателей реакции гиперчувствительности [7].

Основными недостатками прототипа являются его сложность и то, что он не эффективен для доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии в связи с отсутствием информативного сочетания показателей сыворотки крови и кишечника, связанных как с манифестацией пищевой аллергией, так и с особенностями противоаллергенного действия перорально применяемых пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии.

Главной задачей заявляемого способа является достижение эффективности доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии при упрощении способа.

Задача решена тем, что согласно заявляемому способу в течение 7 дней экспериментальным животным в двух группах самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящих из 10 особей в каждой группе, ежедневно внутрибрюшинно вводят по 10 мкг аллергена апельсина или аллергена лимона, а затем через 7 дней после последнего внутрибрюшинного его введения в течение 7 дней им вводят перорально по 10 мг того же аллергена, после этого в течение 5 дней животным одной из групп вводят перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ, на 27 день эксперимента исследуют в сыворотке крови всех животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса Ε и определяют в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 16,82-24,55 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Ε 15,9-21,2 нг/мл, уксусной кислоты 0,936-1,092 мкмоль/г, масляной кислоты 3,97-5,71 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 11,42-14,44 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Ε 10,22-14,97 нг/мл, уксусной кислоты 1,42-1,48 мкмоль/г, масляной кислоты 3,852-3,878 мкмоль/г - устанавливают лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

В результате проведенных нами исследований: 1) выбраны животные - мыши линии BALB/c, наиболее чувствительные к введению пищевого продукта с лактобациллами при манифестации пищевой аллергии; 2) у выбранных экспериментальных животных установлен минимальный перечень биохимических и иммунологических показателей сыворотки крови и гомогената кишечника, сравнение значений которых в их сочетании, обеспечивает эффективное доклиническое определение противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии.

С учетом проведения заявителем патентно-информационного поиска аналог заявляемого способа с идентичными существенными признаками не обнаружен. На основе этого правомерно сделать вывод о соответствии заявляемого объекта критерию новизны. В заявляемом способе совокупность существенных признаков необходима и достаточна для реализации поставленной заявителем целей для получения запланированного технического результата. Каждый существенный признак в отдельности необходим для получения технического результата при реализации изобретения. В заявляемом способе причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и реализацией поставленной цели. Отсюда следует правомерный вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень». Данный способ может быть реализован многократно без дополнительного изобретательства, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Техническим результатом заявляемого изобретения является достижение эффективности доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии при упрощении способа.

Сущность заявляемого изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих достижение эффективности доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии при упрощении способа, связанного с меньшим числом используемых показателей по сравнению с прототипом.

Пример 1.

Использовали две группы самцов половозрелых инбредных мышей BALB/с, состоящие из 10 особей в каждой группе. Каждая группа содержалась в стандартных условиях вивария изолированно. В течение 7 дней экспериментальным животным ежедневно внутрибрюшинно вводили по 10 мкг аллергена апельсина. Затем, через 7 дней после последнего внутрибрюшинного введения пищевого аллергена, в течение 7 дней, с 15 по 21 день эксперимента, им вводили перорально по 10 мг того же аллергена. После этого в течение 5 дней, с 22 по 26 день эксперимента, одной из групп животных вводили перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ и на 27 день эксперимента исследовали в сыворотке крови животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса E, определяли в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 16,82-20,13 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 15,9-18,2 нг/мл, уксусной кислоты 0,936-1,08 мкмоль/г, масляной кислоты 3,97-5,01 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 11,42-13,09 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 10,22-13,42 нг/мл, уксусной кислоты 1,42-1,47 мкмоль/г, масляной кислоты 3,852-3,865 мкмоль/г установили лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

Пример 2.

Использовали две группы самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящие по 10 особей, в каждой группе. Каждая группа содержалась в стандартных условиях вивария изолированно. В течение 7 дней экспериментальным животным ежедневно внутрибрюшинно вводили по 10 мкг аллергена апельсина. Затем, через 7 дней после последнего внутрибрюшинного введения пищевого аллергена, в течение 7 дней, с 15 по 21 день эксперимента, им вводили перорально по 10 мг того же аллергена. Затем в течение 5 дней, с 22 по 26 день эксперимента, одной из групп животных вводили перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ и на 27 день эксперимента исследовали в сыворотке крови животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса E, определяли в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 17,01-23,27 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 16,8-19,6 нг/мл, уксусной кислоты 0,975-1,09 мкмоль/г, масляной кислоты 4,97-5,31 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 12-13,8 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 11,07-13,42 нг/мл, уксусной кислоты 1,438-1,457 мкмоль/г, масляной кислоты 3,865-,867 мкмоль/г установили лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

Пример 3.

Использовали две группы самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящие из 10 особей в каждой группе. Каждая группа содержалась в стандартных условиях вивария изолированно. В течение 7 дней экспериментальным животным ежедневно внутрибрюшинно вводили по 10 мкг аллергена апельсина. Затем, через 7 дней после последнего внутрибрюшинного введения пищевого аллергена, в течение 7 дней, с 15 по 21 день эксперимента, им вводили перорально по 10 мг того же аллергена. После этого в течение 5 дней, с 22 по 26 день эксперимента, одной из групп животных вводили перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ ΚΟΕ и на 27 день эксперимента, исследовали в сыворотке крови животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса E, определяли в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 18,45-24,55 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Е17,3-21,2 нг/мл, уксусной кислоты 1,031-1,092 мкмоль/г, масляной кислоты 4,98-5,71 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 12,77-14,44 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 12,21-14,97 нг/мл, уксусной кислоты 1,438-1,484 мкмоль/г, масляной кислоты 3,859-3,878 мкмоль/г установили лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

Пример 4.

Использовали две группы самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящие из 10 особей в каждой группе. Каждая группа содержалась в стандартных условиях вивария изолированно. В течение 7 дней экспериментальным животным ежедневно внутрибрюшинно вводили по 10 мкг аллергена лимона. Затем, через 7 дней после последнего внутрибрюшинного введения пищевого аллергена, в течение 7 дней, с 15 по 21 день эксперимента, им вводили перорально по 10 мг того же аллергена. После этого в течение 5 дней, с 22 по 26 день эксперимента, одной из групп животных вводили перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ и на 27 день эксперимента, исследовали в сыворотке крови животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса E, определяли в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 16,91-21,18 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Е15,5-17,3 нг/мл, уксусной кислоты 0,911-1,07 мкмоль/г, масляной кислоты 3,93-4,98 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 12,01-13,18 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 10,18-14,23 нг/мл, уксусной кислоты 1,39-1,43 мкмоль/г, масляной кислоты 3,652-3,771 мкмоль/г установили лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

Пример 5.

Использовали две группы самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящие из 10 особей в каждой группе. Каждая группа содержалась в стандартных условиях вивария изолированно. В течение 7 дней экспериментальным животным ежедневно внутрибрюшинно вводили по 10 мкг аллергена лимона. Затем, через 7 дней после последнего внутрибрюшинного введения пищевого аллергена, в течение 7 дней, с 15 по 21 день эксперимента, им вводили перорально по 10 мг того же аллергена. После этого в течение 5 дней, с 22 по 26 день эксперимента, одной из групп животных вводили перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ и на 27 день эксперимента, исследовали в сыворотке крови животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса E, определяли в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 18,2-23,31 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 16,04-19,5 нг/мл, уксусной кислоты 0,962-1,172 мкмоль/г, масляной кислоты 3,99-5,11 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 13,02-14,01 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 12,01-15,04 нг/мл, уксусной кислоты 1,46-1,5 мкмоль/г, масляной кислоты 3,762-3,841 мкмоль/г установили лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

Пример 6.

Использовали две группы самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящие из 10 особей в каждой группе. Каждая группа содержалась в стандартных условиях вивария изолированно. В течение 7 дней экспериментальным животным ежедневно внутрибрюшинно вводили по 10 мкг аллергена лимона. Затем, через 7 дней после последнего внутрибрюшинного введения пищевого аллергена, в течение 7 дней, с 15 по 21 день эксперимента, им вводили перорально по 10 мг того же аллергена. После этого в течение 5 дней, с 22 по 26 день эксперимента, одной из групп животных вводили перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ и на 27 день эксперимента, исследовали в сыворотке крови животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса E, определяли в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 19,08-25,01 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 17,1-23,2 нг/мл, уксусной кислоты 0,983-1,191 мкмоль/г, масляной кислоты 4,65-5,63 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 12,23-14,98 мкмоль/л, иммуноглобулина класса E 11,01-15,09 нг/мл, уксусной кислоты 1,4-1,511 мкмоль/г, масляной кислоты 3,713-3,842 мкмоль/г установили лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.

Преимуществом заявляемого способа является достижение эффективности доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии при упрощении способа.

Источники информации

1. Алешкин В.Α., Афанасьев С.С., Рубальский О.В., Давыдкин В.Ю., Денисов Л.Α., Давыдкин И.Ю., Гаврин А.Г., Алешкин А.В., Афанасьев Д.С., Афанасьев М.С. Биологически активная добавка: патент RU 2164765, заявка RU 2000120944/13; заявл. 11.08.2000; опубл. 10.04.2001.

2. Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Алешкин В.Α., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Амерханова A.M., Куяров А.В., Рубальский О.В., Ульянова Л.П., Алешкин А.В., Волкова Е.В., Лахтин М.В., Ахминеева А.Х., Рубальский Е.О., Куяров А.А., Афанасьев М.С., Афанасьев Д.С. Иммунобиологическое противоаллергическое средство (варианты), штамм Lactobacillus acidophilus NKJC, штамм Lactobacillus acidophilus JCH, штамм Lactobacillus acidophilus KAA: патент RU 2393214, заявка RU 2009102950/13; заявл. 29.01.2009; опубл. 27.06.2010. Бюл. №18. - 15 с.

3. Алешкин В.Α., Галимзянов Х.М., Афанасьев С.С., Караулов А.В., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Рубальский Е.О. Нарушения микробиоценозов у детей: многоцентровое исследование. Сообщение III. Микробиоценоз и дисбактериоз кишечника // Астраханский медицинский журнал. - 2011. - Т. 6, №2. - С. 124-128.

4. Куяров А.В., Воропаева Е.А., Алешкин В.Α., Афанасьев С.С., Рубальский О.В., Клюева Л.А., Давыдкин И.Ю., Рубальская Е.Е. Способ определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий (варианты): патент RU 2299440, заявка RU 2005141166/15; заявл. 28.12.2005; опубл. 20.05.2007. Бюл. №14. - 5 с.

5. Yongchao G., Zhenxing L., Hong L.. Mouse model in food allergy: dynamic determination of shrimp allergenicity. African Journal of Biotechnology Vol. 7 (18), pp. 3352-3356, 17 September, 2008.

6. Dearman R.J., Kimber I. Characterisation of immune responses to food allergens in mice. Proceedings of the Nutrition Society (2005), 64. P. 426-433.

7. Kim J.Y., Young O.C., Geun E.J.. Effect of Oral Probiotics (Bifidobacterium lactis AD011 and Lactobacillus acidophilus AD031) administration on Ovalbumin-Induced Food Allergy Mouse Model. J. Microbiol. Biotechnol. 2008. Vol. - 18 (8). - P. 1393-1400. - прототип.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы. Для этого проводят сенсибилизацию экспериментальных животных: в течение 7 дней в двух группах самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящих из 10 особей в каждой группе, ежедневно внутрибрюшинно вводят по 10 мкг аллергена апельсина или аллергена лимона. Затем через 7 дней после последнего внутрибрюшинного его введения в течение 7 дней им вводят перорально по 10 мг того же аллергена. После этого в течение 5 дней животным одной из групп вводят перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ, на 27 день эксперимента. Исследуют в сыворотке крови всех животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса Е и определяют в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот. При концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 16,82-24,55 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Е 15,9-21,2 нг/мл, уксусной кислоты 0,936-1,092 мкмоль/г, масляной кислоты 3,97-5,71 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 11,42-14,44 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Е 10,22-14,97 нг/мл, уксусной кислоты 1,42-1,48 мкмоль/г, масляной кислоты 3,852-3,878 мкмоль/г - устанавливают лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии. Использование данного способа позволяет проводить доклиническое определение противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, при манифестации пищевой аллергии. 6 пр.

Способ доклинического определения противоаллергического действия пищевых продуктов, содержащих лактобациллы, включающий сенсибилизацию экспериментальных животных, применение продукта с лактобациллами и исследование его влияния на биохимические и иммунологические показатели сыворотки крови, отличающийся тем, что в течение 7 дней экспериментальным животным в двух группах самцов половозрелых инбредных мышей BALB/c, состоящих из 10 особей в каждой группе, ежедневно внутрибрюшинно вводят по 10 мкг аллергена апельсина или аллергена лимона, а затем через 7 дней после последнего внутрибрюшинного его введения в течение 7 дней им вводят перорально по 10 мг того же аллергена, после этого в течение 5 дней животным одной из групп вводят перорально по 0,5 мл продукта с лактобациллами в концентрации 5×10⁷ КОЕ, на 27 день эксперимента исследуют в сыворотке крови всех животных концентрацию гистамина, иммуноглобулина класса Е и определяют в гомогенате кишечника животных концентрации уксусной и масляной кислот и при концентрации у мышей, не получавших продукт с лактобациллами, гистамина 16,82-24,55 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Е 15,9-21,2 нг/мл, уксусной кислоты 0,936-1,092 мкмоль/г, масляной кислоты 3,97-5,71 мкмоль/г, а у животных, получавших продукт с лактобациллами, при концентрации гистамина 11,42-14,44 мкмоль/л, иммуноглобулина класса Е 10,22-14,97 нг/мл, уксусной кислоты 1,42-1,48 мкмоль/г, масляной кислоты 3,852-3,878 мкмоль/г - устанавливают лечебные свойства пищевого продукта с лактобациллами при пищевой аллергии.