СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ МУЖСКИХ ГАМЕТ С ПОМОЩЬЮ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ОПЛОДОТВОРЕНИИ МЕТОДОМ ИНТРАЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ИНЪЕКЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ В ООЦИТ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/76 A61B17/425 A61P15/08 

Эффективность применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) зависит не только от множества гинекологических факторов, но и от качества генетического материала будущего отца. Одним из путей повышения эффективности ВРТ является отбор наиболее качественных сперматозоидов для последующего введения в ооцит.

Сперматозоиды - сложные и уязвимые клетки, функция которых может нарушаться из-за сравнительно небольших морфологических, физиологических или биохимических изменений. Даже если бесплодие в паре связано не с мужским фактором как таковым, эти изменения способны оказать отрицательное влияние на результат ВРТ. Подготовка мужчины с целью оптимизации сперматогенеза и улучшения пула сперматозоидов является задачей уролога-андролога, но все последующие этапы находятся в зоне ответственности репродуктолога и клинического эмбриолога.

Принятие решения о выборе метода обработки мужского биологического материала и какого-либо специфического способа отбора сперматозоидов зависит от результатов ранее выполненной спермограммы и продвинутых спермиологических тестов, а также от качества эякулята, полученного непосредственно в день трансвагинальной пункции фолликулов. Методы селекции направлены на отбор сперматозоидов с высоким качеством ДНК и хорошим потенциалом фертилизации.

В клинической практике при выполнении процедуры ИКСИ эмбриолог при выборе сперматозоида для оплодотворения ориентируется преимущественно на морфологию мужской половой клетки (нормально сформированная головка, целостная акросома, отсутствие цитоплазматических капель на шейке сперматозоида, недеформированный жгутик) и его подвижность. Однако эти параметры не коррелируют ни с целостностью ДНК, ни с другими физиологическими характеристиками мужской гаметы. В рутинную практику был введен единственный метод отбора сперматозоидов по физиологическим характеристикам - ПИКСИ, или отбор по связыванию с гиалуроновой кислотой в чашке Петри. Метод показал свою эффективность, но только на определенной когорте пациентов с фактором мужского бесплодия (Liperis et al., 2022). Поэтому поиск других, более физиологичных (приближенных к естественным условиям в женских репродуктивных путях) методов отбора сперматозоидов для оплодотворения ИКСИ является актуальной задачей вспомогательных репродуктивных технологий (Pinto et al., 2021).

В настоящее время показано, что сперматозоиды человека способны реагировать на градиенты хемоаттрактанта посредством хемотаксиса (Gakamsky et al., 2009), на температурный градиент посредством термотаксиса (Boryshpolets et al., 2015) и на поток жидкости посредством реотаксиса (Schiffer et al., 2020), причем все три являются потенциальными механизмами, которые необходимы сперматозоидам для достижения ооцита в маточных трубах.

В последние годы с активным изучением внеклеточных везикул биологических жидкостей организма человека интересным становится изучение хемотаксиса и его использование в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Нами были отработаны методы выделения внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости женщин, а также было оценено влияние везикул на морфофункциональные характеристики сперматозоидов (Sysoeva et al., 2021).

Целью настоящего изобретения является разработка метода использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости женщин для отбора сперматозоидов при оплодотворении методам ИКСИ.

Эта задача решается с помощью модификации чашки Петри для ИКСИ, которая отличается тем, что внутри чашки создается дополнительный резервуар с внеклеточными везикулами фолликулярной жидкости, который способствует «привлечению» сперматозоидов, потенциально более зрелых и более фертильных. На рисунке показана модель данной чашки Петри для ИКСИ для селекции сперматозоидов с помощью внеклеточных везикул фолликулярной жидкости.

Протокол селекции сперматозоидов при ИКСИ включает следующие этапы.

1. Подготовка чашки Петри. Разлить чашку Петри для ИКСИ согласно рисунку 1, создав дополнительную каплю с внеклеточными везикулами фолликулярной жидкости (50 мкл, капля 2). Покрыть чашку культуральным маслом.

2. Добавление сперматозоидов. Сразу добавить в каплю со средой (капля 1), содержащей HEPES, сперматозоиды.

3. Селекция мужских гамет для ИКСИ. Выдержать в термостате при температуре 37°С 10 мин для сбора выделенных сперматозоидов в рабочей капле поливинилпирролидона (PVP, капля 3). Для оплодотворения методам ИКСИ использовать выделенную фракцию сперматозоидов.

4. Процедура оплодотворения. Далее выполнять ИКСИ традиционно, согласно утвержденным стандартным операционным процедурам лаборатории.

Разработанный метод позволяет отобрать сперматозоиды, которые реагируют на хемоаттрактанты внеклеточных везикул фолликулярной жидкости, что способствует имитации естественного оплодотворения в маточной трубе женщин, а именно моделирует дистантное взаимодействие гамет.

Клинические примеры

Пример 1

Супружеская пара С., женщина 30 лет, мужчина 36 лет. В анамнезе 5 лет отсутствия беременности при регулярной половой жизни. По результатам полного клинико-лабораторного анализа выявлена причина бесплодия - непроходимые маточные трубы. Начата стимуляция функции яичников для программы экстракорпорального оплодотворения. В день трансвагинальной пункции фолликулов получено 8 ооцит-кумулюсных комплексов, 7 ооцитов зрелых на стадии MIL. По результатам спермограммы до цикла ВРТ - нормозооспермия, однако в день оплодотворения морфологически нормальных форм сперматозоидов 2%. Супружеской паре предложен метод селекции сперматозоидов с помощью внеклеточных везикул фолликулярной жидкости. Проведена обработка фолликулярной жидкости и выделение фракции внеклеточных везикул. ИКСИ проведено мужскими половыми клетками, отобранными на внеклеточных везикулах. Через 18 часов зарегистрировано нормальное оплодотворение в 7 ооцитах, на 5-е сутки культивирования - 4 эмбриона на стадии бластоцисты. Один эмбрион перенесен в полость матки, 3 эмбриона криоконсервированы методом витрификации. Наступила клиническая беременность. Роды в срок. Ребенок развивается согласно возрасту.

Пример 2

Супружеская пара А., женщина 29 лет, мужчина 49 год, обратилась по поводу лечения бесплодия (3 года половой жизни без предохранения) методами ВРТ и переноса эмбрионов. Проведено полное клиническое обследование супругов. Из анамнеза женщины - наружный генитальный эндометриоз I стадии распространения, беременностей 0. У мужчины в предыдущем браке 2 детей. По результатам спермограммы -тератозооспермия, процент морфологически нормальных форм 1%.

Супруге была проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормонами, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 4 зрелых ооцита. Показатели эякулята в день оплодотворения: 10 млн/мл, PR%=39%, морфологически нормальных сперматозоидов 1%. Супружеской паре было предложено использовать метод селекции сперматозоидов с внеклеточными везикулами фолликулярной жидкости. Пара подписала добровольное информированное согласие. Из 4 ооцитов оплодотворение наступило в 3 (1 ооцит не оплодотворился). На 5-е сутки культивирования один эмбрион на стадии бластоцисты был перенесен в полость матки, один криоконсервирован. Наступила беременность, которая закончилась родами здоровым ребенком.

Таким образом, разработанная техника использования внеклеточных везикул фолликулярной жидкости для селекции сперматозоидов при ИКСИ позволяет отобрать более полноценные гаметы, что может повысить эффективность программ лечения бесплодия методами ВРТ, при этом не увеличивая трудозатраты и финансовую составляющую цикла экстракорпорального оплодотворения.

Список литературы

1. Liperis G, Sharma К, Ammar OF, Fraire-Zamora JJ, Martins da Silva S, Thomson A, Pini T, Mincheva M. #ESHREjc report: are sperm selection techniques a panacea? Indications for the use of physiological intracytoplasmic sperm injection (PICSI) in medically assisted reproduction. Hum Reprod. 2022 Sep 30; 37(10):2492-2496. doi: 10.1093/humrep/deacl82. PMID: 35962973.

2. Pinto S, Carrageta DF, Alves MG, Rocha A, Agarwal A, Barros A, Oliveira PF. Sperm selection strategies and their impact on assisted reproductive technology outcomes. Andrologia. 2021 Mar;53(2):e 13725. doi: 10.111 l/and.13725. Epub 2020 Jun 28. PMID: 32596880.

3. Gakamsky A, Armon L, Eisenbach M. Behavioral response of human spermatozoa to a concentration jump of chemoattractants or intracellular cyclic nucleotides. Hum Reprod. 2009 May;24(5): 1152-63. doi: 10.1093/humrep/den409. Epub 2009 Jan 23. PMID: 19168594.

4. Boryshpolets, Sergii & Perez-Cerezales, Serafin & Eisenbach, Michael. (2015). Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: A role for hyperactivation. Human reproduction (Oxford, England). 30. 10.1093/humrep/dev002.

5. Schiffer C, Rieger S, Brenker C, Young S, Hamzeh H, Wachten D, Tuttelmann F, Röpke A, Kaupp UB, Wang T, Wagner A, Krallmann C, Kliesch S, Fallnich C, Strünker T. Rotational motion and rheotaxis of human sperm do not require functional CatSper channels and transmembrane Ca2+ signaling. EMBO J. 2020 Feb 17; 39(4):el02363. doi: 10.15252/embj.2019102363. Epub 2020 Jan 19. PMID: 31957048; PMCID: PMC7024840.

6. Sysoeva AP, Makarova NP, Silachev DN, Lobanova NN, Shevtsova YA, Bragina EE, Kalinina EA, Sukhikh GT. Influence of Extracellular Vesicles of the Follicular Fluid on Моrphofunctional Characteristics of Human Sperm. Bull Exp Biol Med. 2021 Dec; 172(2):254-262. doi: 10.1007/s10517-021-05372-4. Epub 2021 Dec 2. PMID: 34855079.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу селекции сперматозоидов при оплодотворении ИКСИ. Способ предусматривает выделение внеклеточных везикул из фолликулярной жидкости и их добавление в модифицированную чашку Петри для ИКСИ, в которой создается дополнительный резервуар с внеклеточными везикулами фолликулярной жидкости. Способ эффективен для отбора фертильных сперматозоидов и лечения бесплодия в циклах ВРТ. 1 ил., 2 пр.

Способ селекции мужских гамет с помощью внеклеточных везикул фолликулярной жидкости, при оплодотворении методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит, отличающийся тем, что применяют дополнительный физиологический критерий отбора более зрелого и более фертильного сперматозоида из среды со сперматозоидами в виде внеклеточных везикул, выделенных из фолликулярной жидкости женщин непосредственно во время процедуры оплодотворения методом ИКСИ в модифицированной чашке Петри, в которой создается дополнительный резервуар с внеклеточными везикулами фолликулярной жидкости.