ДИЭТИЛ (3,5-БИС(АРИЛИДЕН)-4-ОКСОПИПЕРИДИН-1-ИЛ)-(АРИЛ)-МЕТИЛФОСФОНАТЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2016 года по МПК C07F9/59 A61K31/66 A61P35/00 

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, в частности онкологии, и касается синтеза новых соединений диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-л)(арил)метилфосфонатов, обладающих антипролиферативным свойством и низкой острой токсичностью, и может быть использовано для лечения ряда онкологических заболеваний, связанных с пролиферацией опухолевых клеток, в частности рабдомиосаркомы, карциномы кишечника, аденокарциномы молочной железы, и др. злокачественных новообразований.

В настоящее время лечение выше пеечисленных заболеваний представляет собой проблему, поскольку известные химиотерапевтические агенты, применяемые с этой целью, отличаются высокой острой токсичностью, что приводит к сужению терапевтического индекса и сопряжено с различными побочными эффектами в отношении здоровых клеток.

Для предотвращения пролиферации опухолевых клеток известны разнообразные антипролиферативные агенты, действующие на различные стадии клеточного цикла опухолевых клеток и активные в отношении различных клеточных мишеней. Побочные эффекты таких известных агентов обусловлены их неселективностью, то есть тем фактом, что они способны повреждать нормальные клетки, а также оказывать мутагенное воздействие на них. Поэтому в данной области техники продолжает существовать потребность в новых антипролиферативных агентах, подавляющих пролиферацию злокачественных клеток, но не проявляющих мутагенных свойств в отношении нормальных клеток.

Известен патент (US 7582655 В2, МПК A61K 31/445, опубл. 2007-07-05), в котором заявлены соединения, принадлежащие к классу сопряженных диенонов на основе 4-пиперидинона общей формулы

где Ar представляет собой арил или гетероарил, n находится в диапазоне от 0 до 3, причем заместитель R при атоме азота не содержит атома фосфора. В случае n=0 приведенная структурная формула соответствует обобщенной структурной формуле 3,5-бис(арилиден)-4-пиперидинонов. Предполагаемый механизм действия данных соединений включает алкилирование клеточных тиолов и сильфгидрильных групп белков в результате их реакции с винильными связями 3,5-бис(арилиден)-4-пиперидинонов, причем аминные и гидроксильные группы нуклеиновых оснований не вступают в такую реакцию, вследствие чего 3,5-бис(арилиден)-4-пиперидиноны могут быть лишены мутагенных свойств (U. Das et al., Current Medicinal Chemistry, 2009, 16, 2001-2020; R.K. Anchoori et al., Cancer Cell, 2013, 24, 791-805).

Однако, данные соединения, обнаруживая антипролиферативные свойства в субмикромолярных концентрациях ингибирования IC50, имеют высокую острую токсичность.

Наиболее близкой группой соединений, обладающих антипролиферативными свойствами, и принятой за прототип, являются диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил) метилфосфонаты (M.V. Makarov et al., Eur. J. Med. Chem., 2009, 44, 2135-2144):

где FG=NMe₂, F, NO₂, а диэтилфосфонатная группа связана с атомом азота 4-пиперидинонового цикла через одно метиленовое звено.

Однако эти соединения имеют острую токсичность порядка 200-300 мг/кг и выраженную селективную противоопухолевую активность только в отношении клеточных линий рака лимфатической системы, а данные по противоопухолевой активности в отношении опухолей мышечной ткани отсутствуют.

Предлагаемое изобретение решает задачу создания новых противоопухолевых препаратов, обладающих расширенным спектром антипролиферативных свойств и одновременно низкой острой токсичностью, для лечения онкологических заболеваний, связанных с пролиферацией опухолевых клеток.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям - диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(арил)метилфосфонатам, общей формулы 1

в которой R¹=Н, F, ОМе;

R²=Н, F.

Среди соединений общей формулы (1), составляющих один из объектов настоящего изобретения, предпочтительными являются:

диэтил (3,5-бис(бензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(фенил)метилфосфонат, имеющий формулу

диэтил (3,5-бис(бензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(4-фторфенил)метилфосфона, имеющий формулу

и диэтил (3,5-бис(4-фторбензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(4-метоксифенил)метилфосфона, имеющий формулу

Структура соединений формул (1а-с) доказана данными мультиядерной спектроскопии ЯМР (на ядрах ¹Н, ³¹Р, ¹³С и ¹⁹F при наличии атомов фтора), а индивидуальность и химическая чистота - данными элементного анализа.

Еще одним аспектом изобретения является обнаруженные нами антипролиферативные свойства соединений общей формулы 1.

Технический эффект заявляемой группы изобретений проявляется сочетанием низкой острой токсичности (более 1000 мг/кг) и расширенным спектром антипролиферативных свойств в отношении опухолей мышечной ткани, что ранее было неизвестно из уровня техники для 3,5-бис(арилиден)-4-пиперидинонов, к которым относятся заявляемые соединения.

Отсутствие источников информации, содержащих ту же совокупность признаков, что и в предлагаемых в изобретении объектах, сообщает им соответствие критерию «новизна».

Та же совокупность признаков позволяет получить новый непредсказуемый эффект - получение соединений, сочетающих низкую острую токсичность (более 1000 мг/кг) и расширенный спектр антипролиферативных свойств, и таким образом сообщает ей соответствие критерию «изобретательский уровень».

Получение новых соединений с использованием известного оборудования с помощью известных компонентов сообщает разработанному изобретению соответствие критерию «промышленная применимость».

В Таблице 1 приведены результаты определения концентрации исследуемых веществ, вызывающих 50% ингибирование роста популяции клеток и острую токсичность соединений. Сравнительные данные (*)взяты из работы: F.R. Quinn, G.W.A. Milne, "Toxicities Derived from Anti-tumor Screening Data". Fundam. Appl. Toxicol. 1986, 6, 270-277.

Приведенные ниже примеры подтверждают, но не ограничивают предлагаемое изобретение.

Синтез соединений формулы 1 проводили по приведенной ниже схеме исходя из известных закономерностей, используя в качестве исходных соединений диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(арил) метилфосфонаты, а именно диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(фенил)метилфосфонат, диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(4-фторфенил)метилфосфонат и диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(4-метоксифенил)метилфосфонат (их получение описано в статье M.V. Makarov et al., Mendeleev Commun., 2015, 25, 232-233), путем реакции с ароматическими альдегидами в присутствии эфирата трехфтористого бора в качестве кислоты Льюиса, катализирующей альдольно-кротоновую конденсацию, в среде ацетонитрила при комнатной температуре (20-25°С).

В синтезе заявляемых соединений использовали следующие коммерческие реагенты и растворители, доступные от фирмы Acros Organics: бензальдегид, 4-фторбензальдегид, эфират трехфтористого бора, ацетонитрил, хлористый метилен, сульфат натрия (осушитель), силикагель для колоночной хроматографии, петролейный эфир, ацетон.

В спектрах ³¹Р синглетный сигнал при δ_P в диапазоне 21,6-21,9 м.д. свидетельствует о наличии фосфонатной группы (C-P(O)(OEt)₂); в спектрах ¹³С сигнал карбонильной группы проявляется при δ_C в диапазоне 187,2-187,7 м.д., в спектрах ¹³С наблюдается характеристичный дублетный сигнал в диапазоне 65,5-66,5 м.д. с константной спин-спинового взаимодействия ^lJ_PC приблизительно равной 160 Гц, свидетельствующий о наличии в молекулах связи С-Р; в спектрах ¹⁹F синглетный сигнал δ_F при приблизительно -113 м.д. свидетельствует о наличии атома фтора, связанного с фенильным кольцом. Спектры ¹Н также полностью соответствуют структуре соединений 1а-с.

Пример 1. Способ получения диэтил (3,5-бис(бензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(фенил)метилфосфоната (1а)

В колбе смешивали диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(фенил)метилфосфонат (0,49 г; 1,5-ммоль), бензальдегид (0,32 г; 3,0-ммоль), ацетонитрил (2 мл) и эфират трехфтористого бора (1,5 г, 7 эквивалентов, 10,5 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси прибавляли раствор карбоната натрия (1,0 г) в воде и CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, промывали водой, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали при пониженном давлении досуха. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (колонка: l, 30 см, d, 2 см). Использовали градиентное элюирование смесями петролейный эфир/ацетон с соотношением от 10:1 до 5:1. Подходящие элюаты упаривали при пониженном давлении с получением желтого кристаллического вещества (0,42 г, 56%), т.пл. 137-142°С. ³¹Р-ЯМР (CDCl₃, 161,98 МГц), δ: 21,73. ¹Н-ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц), δ: 0,97 и 1,10 (два т, 6Н, ³J_HH=7,0 Гц, Р(OCH₂CH₃)₂), 3,57-3,65 (м, 1Н, 0,5 РОСН₂), 3,82-4,02 (м, 5Н, СН₂ (пиперидин) + 1,5 РОСН₂), 4,09 (д, 1Н, СНР, ²J_PH=20,0 Гц), 4,27-4,31 (м, 2Н, СН₂ (пиперидин)), 7,25-7,42 (м, 13Н, C_PhH), 7,31-7,43 (м, 13Н, C_PhH), 7,49 (д, 2Н, ³J_HH=7,0 Гц, C_PhH), 7,78 (с, 2Н, винил). ¹³С-ЯМР (CDCl₃, 100,61 МГц), δ: 16,12 и 16,31 (два д, ³J_PC=5,6 Гц, РОСН₂СН₃), 52,96 (д, ³J_PC=8,4 Гц), 62,53 и 62,84 (два д, ²J_PC=6,9 Гц, РОСН₂), 66,43 (д, ¹J_PC=159 Гц, РСН), 128,35, 128,42, 128,56, 129,03, 130,16 (д, ³J_PC=8,0 Гц), 130,36, 132,42, 133,32, 135,14, 136,49, 187,56 (карбонил). Вычислено для C₃₀H₃₂NO₄P (%): С, 71,84; Н, 6,43; N, 2,79. Найдено (%): С, 71,74; Н, 6,57; N, 2,75.

Пример 2. Способ получения диэтил (3,5-бис(бензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(4-фторфенил)метилфосфоната (1b)

Диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(4-фторфенил)метилфосфонат (1,5·ммоль) смешивали с бензальдегидом (0,37 г; 3,0·ммоль), прибавляли ацетонитрил (2 мл) и эфират трехфтористого бора (1,5 г, 7 эквивалентов, 10,5 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси прибавляли раствор карбоната натрия (1,0 г) в воде и CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, промывали водой, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали при пониженном давлении досуха. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (колонка: l, 33 см, d, 2 см). Использовали градиентное элюирование смесями петролейный эфир/ацетон с соотношением от 12:1 до 6:1. Подходящие элюаты упаривали при пониженном давлении с получением желтого кристаллического вещества (0,44 г, 58%), т.пл. 96,6-99,3°С. ³¹Р-ЯМР (CDCl₃, 161,98 МГц), δ: 21,63. ¹⁹F-ЯМР (CDCl₃, 376,50 МГц), δ: -113,39. ¹Н-ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц), δ: 0,97 и 1,08 (два т, 6Н, ³J_HH=7,1 Гц, Р(OCH₂CH₃)₂), 3,56-3,78 (м, 1Н, 0,5 РОСН₂), 3,78-4,00 (м, 5Н, СН₂ (пиперидин) + 1,5 РОСН₂), 4,04 (д, 1Н, СНР, ²J_HH=20,0 Гц), 4,23-4,27 (м, 2Н, СН₂ (пиперидин)), 6,95 (т, 2Н, ³J_HH=³J_HF=8,6 Гц, C_Ph), 7,31-7,43 (м, 12Н, C_PhH), 7,78 (с, 2Н, винил). ¹³С-ЯМР (CDCl₃, 100,61 МГц), δ: 16,14 и 16,27 (два д, ³J_PC=5,8 Гц, РОСН₂СН₃), 52,80 (д, ³J_PC=8,8 Гц), 62,57 и 62,85 (два д, ²J_PC=7,3 Гц, РОСН₂), 66,31 (д, ¹J_PC=160 Гц, РСН), 115,33 (д, ²J_FC=21,3 Гц), 128,57, 128,58, 129,10, 130,32, 131,74 (т, ³J_PC=³J_FC=8,0 Гц), 133,08, 135,06, 136,77, 162,61 (д, ¹J_CF=250 Гц, F-C_Ph), 187,44 (карбонил). Вычислено для C₃₀H₃₁FNO₄P (%): С, 69,35; Н, 6,01; N, 2,70. Найдено (%): С, 69,07; Н, 6,09; N, 2,61.

Пример 3. Способ получения диэтил (3,5-бис(4-фторбензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(4-метоксифенил)метилфосфоната (1с).

Диэтил (4-оксопиперидин-1-ил)(4-метоксифенил)метилфосфонат (1,5·ммоль) смешивали с 4-фторбензальдегидом (3,0·ммоль), прибавляли ацетонитрил (2 мл) и эфират трехфтористого бора (1,5 г, 7 эквивалентов, 10,5 ммоль) и перемешивание продолжали в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси прибавляли раствор карбоната натрия (1,0 г) в воде и CH₂Cl₂. Органический слой отделяли, промывали водой, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали при пониженном давлении досуха. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (колонка: l, 33 см, d, 2 см). Использовали градиентное элюирование смесями петролейный эфир/ацетон с соотношением от 10:1 до 10:3. Подходящие элюаты упаривали при пониженном давлении с получением желтого кристаллического вещества (0,38 г, 48%), т.пл. 135,4-141,3°С. ³¹Р-ЯМР (CDCl₃, 121,49 МГц), δ: 21,99. ¹⁹F-ЯМР (CDCl₃, 282,40 МГц), δ: -112,99. ¹Н-ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц), δ: 0,97 и 1,09 (оба т, 3Н, ³J_HH=7,0 Гц, Р(OCH₂CH₃)₂), 3,53-3,63 (м, 1Н, 0,5 РОСН₂), 3,77 (с, 3Н, ОСН₃), 3,81-3,95 (м, 5Н, СН₂ (пиперидин) + 1.5 РОСН₂), 3,99 (д, 1Н, СНР, ²J_PH=20,0 Гц), 4,22-4,26 (м, 2Н, СН₂ (пиперидин)), 6,81 (д, 2Н, ³J_HH=8,5 Гц), 7,07 (т, 4Н, ³J_HH=³J_HF=8.7 Гц), 7,31 (дд, 4Н, ³J_HH=8,0 Гц, ⁴J_HF=6,0 Гц), 7,36 (д, 2Н, ³J_HH=7,8 Гц), 7,70 (с, 2Н). ¹³С NMR (CDCl₃, 100,61 МГц), δ: 16,15 и 16,29 (оба д, ³J_PC=5,8 Гц, РОСН₂СН₃), 52,61 (д, ³J_PC=8,0 Гц), 55,17 (ОМе), 62,56 и 62,77 (оба д, ²J_PC=7,0 Hz, РОСН₂), 65,47 (д, ^lJ_PC=160 Гц, РСН), 113,77, 115,70 (д, ²J_FC=21,0 Гц), 124,11, 131,29 (д, ⁴J_CF=3,0 Гц), 131,37 (д, ³J_PC=8,0 Гц), 132,29 (д, ³J_CF=8,8 Гц), 132,91, 135,35, 159,61, 162,89 (д, ¹J_CF=250 Гц), 187.27 (С=O). Вычислено для C₃₁H₃₄F₂NO₄P (%): С, 65,60; Н, 5,68; N, 2,47. Найдено (%): С, 65,57; Н, 5,61; N, 2,39.

Биологическая активность полученных соединений

Оценка острой токсичности соединений 1а-с проведена согласно экспресс-методу Прозоровского В.Б. на беспородных белых мышах массой 22-24 г [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология, 1978, 41(4), 497-502] при внутрибрюшинном способе введения. Установлено, что ЛД₅₀ соединений больше 1000 мг/кг, таким образом, заявляемые соединения относятся к 5 классу веществ по классификации Сидорова К.К. [Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения // В Сб. «Токсикология новых промышеленных химических веществ» (выпуск 13), Москва: Медицина, 1973, 47-51] и являются практически нетоксичными веществами.

Пример 4. Определение антипролиферативных свойств.

Антипролиферативные свойства исследуемых исследуемых соединений 1а-с были определены по МТТ-тесту [Mather J.P., Roberts Р.Е. Introduction to cell and tissue culture. Theory and technique // New York: Plenum Press, 1998, 175-194]. Культуры клеток человека RD (ATCC^® CCL-136™) и HCT116 (АТСС^® CCL-247™) выращивали в среде DMEM (НЛП ПанЭко), MCF7 (АТСС^® НТВ-22™) выращивали в среде ЕМЕМ (НПП ПанЭко). В ростовую среду добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone®, Thermo Scientific), 2 мМ L-глутамина (НЛП ПанЭко), 1% гентамицина (ОАО Биохимик) в качестве антибиотика и инкубировали при 37°С в атмосфере CO₂ (5%). Клетки сеяли в 96-луночный планшет (CELLTREAT™) в количестве 1-10⁴ клеток/200 мкл и культивировали при 37°С в атмосфере CO₂ (5%). После 24 часов инкубации к культурам клеток были добавлены различные концентрации тестируемых соединений (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 и 1.56 мкМ/л), и далее клетки культивировали в тех же условиях в течение 72 часов. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. Все вещества растворяли в ДМСО (PANREAC QUIMICA S.L.U), конечная концентрация ДМСО в лунке не превышала 1% и не была токсична для клеток. В контрольные лунки добавляли растворитель в количестве 1%. После инкубации в каждую лунку было добавлено 20 мкл МТТ (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) (5 мг/мл) (Sigma-Aldrich) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 часов. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Victor3, PerkinElmer) определяли оптическую плотность при 530 нм, за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм. Значение концентрации, вызывающее 50% ингибирование роста популяции клеток (IC50), было определено на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 9.0. Результаты определения концентрации исследуемых веществ, вызывающих 50% ингибирование роста популяции клеток и острую токсичность соединений, приведены в таблице 1.

Как видно из приведенных примеров, соединения общей формулы I обладают сочетанием низкой острой токсичности более 1000 мг/кг и расширенным спектром антипролиферативных свойств как в отношении аденокарциномы молочной железы (MCF7), карциномы кишечника (НСТ116), так и в отношении опухоли мышечной ткани - рабдомиосаркомы (RD) и, следовательно, могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний, связанных с пролиферацией опухолевых клеток.

Изобретение относится к диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(арил)метилфосфонатам, которые могут найти применение в медицине, общей формулы 1:

в которой R¹=Н, F, ОМе; R²=Н, F.

Предложены новые диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(арил)метилфосфонаты с антипролиферативными свойствами и низкой острой токсичностью для лечения онкологических заболеваний, включая рабдомиосаркому, карциному кишечника, аденокарциному молочной железы. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Диэтил (3,5-бис(арилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(арил)метилфосфонаты общей формулы 1

в которой R¹=Н, F, ОМе;
R²=Н, F.

2. Соединение по п. 1, представляющее
- диэтил (3,5-бис(бензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(фенил)метилфосфонат, имеющий формулу

3. Соединение по п. 1, представляющее
- диэтил (3,5-бис(бензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(4-фторфенил)метилфосфонат, имеющий формулу

4. Соединение по п. 1, представляющее
- диэтил (3,5-бис(4-фторбензилиден)-4-оксопиперидин-1-ил)(4-метоксифенил)метилфосфонат, имеющий формулу

5. Соединения общей формулы 1 по любому из пп. 1-4, обладающие антипролиферативными свойствами.