СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОСАХАРИДОВ В ВАГИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 G01N30/02 

Изобретение относится к медицине, в частности гинекологии, и касается методики определения моносахаридов в вагинальной жидкости для ранней диагностики бактериального вагиноза.

Известен способ определения моносахаридов при использовании для анализа тонкослойной хроматографии путем нанесения водного раствора исследуемой пробы (10 мкл) на стартовую линию пластинки силуфол, двухкратном элюировании в смеси растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1 C3):(2 C5), соответственно с последующим обнаружением анилинфталатом. (1).

Недостатком данного способа является невозможность определения глюкопиранозы, D-галактозы, фукозы, глюкозы, D-галактозы, D-ксилопиранозы, гексапиранозы, D-Галактопиранозы, D-маннозы, D-маннопиранозы в вагинальной жидкости.

Известен способ определения моносахаридов когда для проведения газохроматографического анализа используют ацетилированные альдононитрилы моносахаридов сыворотки крови, анализ проводят на двухметровой колонке диаметром 3 мм, заполненной 3% Selicone XE-60 на отмытом кислотой хроматоне при температуре 220°C в изотермическом режиме или режиме программирования температур от 210 до 245°C со скоростью 12°C в минуту. (2).

Недостатком данного способа является трудоемкость процесса и невозможность определения глюкопиранозы, D-галактозы, фукозы, глюкозы, D-галактозы, D-ксилопиранозы, гексапиранозы, D-Галактопиранозы, D-маннозы, D-маннопиранозы в вагинальной жидкости. Данный способ принят за прототип.

Целью изобретения является совершенствование ранней персонифицированной диагностики бактериального вагиноза за счет определения изменения моносахаридов в вагинальной жидкости при бактериальном вагинозе, что позволит своевременно и эффективно начать лечение.

Эта цель достигается использованием метода газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для анализа образцов, подготовленных путем высушивания 10 см³ вагинального смыва при температуре 30°C в течение 24 часов для получения сухого остатка, затем получением триметилсилильных производных моносахаридов по следующей схеме: навеска сухого остатка массой 35 мг обрабатывается 300 мкл смеси N, O-бис-(триметилсилил)-ацетамида, триметилхлорсиланом, N-триметилсилилимидазолом в соотношении 3:2:3 (Sylon BTZ, Supelco) и 40 мкл N, О-бис-(триметилсилил)-трифторацетамида, далее смесь выдерживается в виале при 80°C в течение 15 минут, затем полученные производные исследуют на хромато-масс-спектрометре с масс-селективным детектором при температуре аналитического интерфейса 280°C и температуре испарителя 280°C; разделение осуществляют на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм при программировании температуры: 120°C в течение 5 мин, далее нагрев со скоростью 10°C/мин до 130°C, выдержка системы - 0 мин, далее со скоростью 3°C/мин до 210°C - 0 мин, затем со скоростью 15°C/мин до 240°C - 0 мин, со скоростью 3°C/мин до 265°C - 10 мин и со скоростью 15°C/мин до 295°C - 15 мин., время анализа - 70 мин, скорость потока газа-носителя (гелия) - 1 см³/мин, средняя линейная скорость газа-носителя - 37,6 см/сек, диапазон сканирования m/z 45.0-350.0 а.е.м., объем вводимой пробы - 5 мкл; для идентификации ТМС-производных моносахаридов по их масс-спектрам используется база данных NIST, входящая в состав штатной программы обработки данных масс-спектрометра; определяются 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)-глюкопираноза, 2,3,4,5,6-пентакис-O-(триметилсилил)-D-галактоза, тетракис(триметилсилиловый)эфир L(-)-фукозы, 5-(триметилсилил)-глюкоза, 5-(триметилсилил)-D-галактоза, 1,2,3,4-тетракис-O-(триметилсилил)-.beta.-D-ксилопираноза, 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)гексапираноза, 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)-.alpha.-D-галактопираноза, 2,3,4,5,6-пентакис-O-(триметилсилил)-талоза, 2,3,4,5,6-пентакис-O-(триметилсилил)-D-манноза, пер-ТМС фукоза, 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)-D-маннопираноза.

Количественную оценку компонентного состава вагинальной жидкости оценивали методом абсолютной градуировки в идентичных условиях пробоподготовки.

Предлагаемый способ позволяет в течение 70 мин получить данные о качественном и количественном содержании ТМС-производных глюкопиранозы, D-галактозы, фукозы, глюкозы, D-галактозы, D-ксилопиранозы, гексапиранозы, D-Галактопиранозы, D-маннозы, D-маннопиранозы в вагинальной жидкости с целью ранней диагностики бактериального вагиноза.

Предлагаемый способ за счет большой чувствительности (до 0,005 мкг вещества) может быть использован для диагностики моносахаридов в вагинальной жидкости, состав которых лабораторно соответствуют ранним дисбиотическим изменениям во влагалище.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Способ определения моносахаридов в сыворотке крови (патент РФ №2163722) Строев Е.А., Бухов В.А., Окороков В.Г., Чурилов Г.И

2. Способ определения галактозы в сыворотке крови (патент РФ №2101705) Кадырова Р.Г., Зухрабов М.Г.

Изобретение касается способа определения моносахаридов в вагинальной жидкости и заключается в том, что используют метод газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Образцы подготаливают путем высушивания 10 см³ вагинального смыва при 30°C в течение 24 ч. Навеску сухого остатка массой 35 мг обрабатывают 300 мкл смеси N, O-бис-(триметилсилил)-ацетамида, триметилхлорсиланом, N-триметилсилилимидазолом в соотношении 3:2:3 и 40 мкл N, О-бис-(триметилсилил)-трифторацетамида, приготовленную смесь выдерживают в виале при 80°C в течение 15 мин. Полученные производные исследуют на хромато-масс-спектрометре с масс-селективным детектором при температуре аналитического интерфейса 280°C и температуре испарителя 280°C. Разделение осуществляют на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS. Далее нагревают со скоростью 10°C/мин до 130°C, выдерживают систему - 0 мин, далее со скоростью 3°C/мин до 210°C - 0 мин, затем со скоростью 15°C/мин до 240°C - 0 мин, со скоростью 3°C/мин до 265°C - 10 мин и со скоростью 15°C/мин до 295°C - 15 мин, время анализа - 70 мин, скорость потока газа-носителя (гелия) - 1 см³/мин, средняя линейная скорость газа-носителя - 37,6 см/сек, диапазон сканирования m/z 45.0-350.0 а.е.м., объем вводимой пробы - 5 мкл. Для идентификации ТМС-производных моносахаридов по их масс-спектрам используют базу данных NIST, входящих в состав штатной программы обработки данных масс-спектрометра. Использование способа позволяет с высокой точностью определять моносахариды в вагинальной жидкости.

Способ определения моносахаридов в вагинальной жидкости, отличающийся тем, что используют метод газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для анализа образцов, подготовленных путем высушивания 10 см³ вагинального смыва при температуре 30°C в течение 24 ч для получения сухого остатка, затем получают триметилсилильные производные моносахаридов по следующей схеме: навеска сухого остатка массой 35 мг обрабатывают 300 мкл смеси N, О-бис-(триметилсилил)-ацетамида, триметилхлорсиланом, N-триметилсилилимидазолом в соотношении 3:2:3 (Sylon BTZ, Supelco) и 40 мкл N, О-бис-(триметилсилил)-трифторацетамида, приготовленную смесь выдерживают в виале при 80°C в течение 15 мин, затем полученные производные исследуют на хромато-масс-спектрометре с масс-селективным детектором при температуре аналитического интерфейса 280°C и температуре испарителя 280°C; разделение осуществляют на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм при программировании температуры: 120°C в течение 5 мин, далее нагревают со скоростью 10°C/мин до 130°C, выдерживают систему - 0 мин, далее со скоростью 3°C/мин до 210°C - 0 мин, затем со скоростью 15°C/мин до 240°C - 0 мин, со скоростью 3°C/мин до 265°C - 10 мин и со скоростью 15°C/мин до 295°C - 15 мин, время анализа - 70 мин, скорость потока газа-носителя (гелия) - 1 см³/мин, средняя линейная скорость газа-носителя - 37,6 см/сек, диапазон сканирования m/z 45.0-350.0 а.е.м., объем вводимой пробы - 5 мкл; для идентификации ТМС-производных моносахаридов по их масс-спектрам используют базу данных NIST, входящих в состав штатной программы обработки данных масс-спектрометра; определяют 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)-глюкопиранозу, 2,3,4,5,6-пентакис-O-(триметилсилил)-D-галактозу, тетракис (триметилсилиловый) эфир L(-)-фукозы, 5-(триметилсилил)-глюкозу, 5-(триметилсилил)-D-галактозу, 1,2,3,4-тетракис-O-(триметилсилил)-.beta.-D-ксилопиранозу, 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил) гексапиранозу, 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)-.alpha.-D-галактопиранозу, 2,3,4,5,6-пентакис-O-(триметилсилил)-талозу, 2,3,4,5,6-пентакис-О-(триметилсилил)-D-маннозу, пер-TMC фукозу, 1,2,3,4,6-пентакис-O-(триметилсилил)-D-маннопиранозу.