Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области терапевтических моноклональных антител, в частности к антителу против TSLP и к применению антитела в лечении заболеваний.

Предпосылки создания изобретения

Тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP) представляет собой IL7-подобный воспалительный цитокин, который преимущественно секретируется эпителиальными клетками, например кожи, легких, тимуса и желудочно-кишечного тракта, в ответ на микроорганизмы, физические повреждения или воспалительные цитокины (например, IL-1β и TNF), и также может секретироваться стромальными клетками, кератиноцитами, дендритными клетками (DC) и тучными клетками и т.д. при патологических состояниях, таких как воспаление. TSLP играет важную роль в инициации аллергического и адаптивного воспаления дыхательных путей. TSLP экспрессируется на высоком уровне в дыхательных путях пациента с астмой по сравнению с контрольной группой здоровых субъектов, и его уровень коррелирует с экспрессией TH2 цитокинов и хемокинов, а также с тяжестью заболеваний. TSLP может индуцировать созревание дендритных клеток (DC), повышающе регулировать экспрессию OX40L, взаимодействие OX40-OX40L вовлечено в T-клеточно-индуцированную начальную поляризацию TH2 клеток, которые высвобождают цитокины, такие как IL-4, IL-5, IL-13, после дифференциации, способствуя мастоцитарной и эозинофильной инфильтрации и ряду аллергических воспалительных ответов, а также патологическим изменениям в дыхательных путях, вызывая, таким образом, приступ астмы. TSLP эффективен в активации мастоцитов и природных киллерных T-клеток (NKT), продуцирующих TH2 цитокины, такие как IL-13, усиливая, таким образом, развитие и прогрессирование воспаления дыхательных путей.

Рецептор для TSLP представляет собой гетеродимерный рецепторный комплекс, состоящий из IL-7Rα и уникальной TSLPR цепи (CRFL2). Связывание гетеродимерного рецептора TSLP вызывает активацию STAT5 и клеточную пролиферацию. TSLPR и IL-7Rα высокоэкспрессируются в DC клетках.

Поэтому крайне необходимо разработать анти-TSLP антитела с высокой специфичностью и аффинностью, низкими токсическими и побочными эффектами, а также отличной клинической эффективностью, обеспечив таким образом выборы лечения для пациентов с астмой.

Сущность изобретения

В настоящем раскрытии, авторы настоящего изобретения сначала разработали химерные антитела с отличными свойствами, которые способны связываться с человеческим TSLP. На основании этого авторы настоящего изобретения разработали полностью человеческие антитела из химерных антител путем исследования и модификации химерных антител. Полностью человеческие антитела по изобретению имеют по существу такие же (или даже лучшие) биологические функции, как у химерных антител. Полностью человеческие антитела не только имеют высокую аффинность в отношении TSLP, но также могут эффективно блокировать TSLP-индуцированную пролиферацию Ba/F3 клеток и блокировать способность TSLP, связанную с активацией PBMC и секрецией ими цитокинов. Таким образом, изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и к ее применению для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний.

Антитело по изобретению имеет чрезвычайно высокую степень гуманизации, даже является полностью человеческим антителом, поэтому его можно безопасно вводить человеку, не инициируя где иммуногенный ответ. Поэтому антитело по изобретению имеет большое клиническое значение.

Антитело по изобретению

В одном аспекте изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с TSLP, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющие комплементарность области (CDR), представленные ниже:

(a) CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи (VH), представленной в SEQ ID NO:1, 17, 30, 40, 53 или 68; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи (VL), представленной в SEQ ID NO:2, 18, 31, 41, 54 или 69; или

(b) CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO:1; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO:17; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO:18.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO:30; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO:31.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO:40; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO:41.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO:53; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO:54.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR-H1 или вариант ее последовательности, CDR-H2 или вариант ее последовательности и CDR-H3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VH, представленной в SEQ ID NO:68; и/или CDR-L1 или вариант ее последовательности, CDR-L2 или вариант ее последовательности и CDR-L3 или вариант ее последовательности, содержащиеся в VL, представленной в SEQ ID NO:69.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант последовательности представляет собой CDR, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или добавление 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с CDR, из которой она происходит.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления замена представляет собой консервативную замену.

Предпочтительно CDR определены в соответствии с системой нумерации AbM, Chothia, Kabat или IMGT.

В некоторых вариантах осуществления VH и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасные области (FR) иммуноглобулина человеческого происхождения.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с TSLP человека и/или TSLP обезьяны.

В одном аспекте изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с TSLP, включающие: вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит следующие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), где CDR определены в соответствии с системой нумерации IMGT:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:3, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:4, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:5; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:6, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:7, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:7, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:8, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:8;

(b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:19, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:19, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:20, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:21, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:21; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:22, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:23, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:23, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:24;

(c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:32, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:33, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:33, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:34; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:35, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:35, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:23, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:23, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:24;

(d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:42, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:43, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:43, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:44, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:44; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:45, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:45, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:46, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:46, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:47, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:47;

или

(e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:55, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:55, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:56, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:56, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:57, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:57; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:58, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:58, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:59, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:59, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:60, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:60.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит следующие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), где CDR определены в соответствии с системой нумерации IMGT:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:7, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:8;

(b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:19, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:21; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:23, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24;

(c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:33, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:35, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:23, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24;

(d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:43, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:44; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:45, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:46, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:47;

или

(e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:55, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:56, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:57; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:58, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:59, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:60.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит следующие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), где CDR определены в соответствии с системой нумерации AbM:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:9, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:9, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:10, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:10, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:11; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:12, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:13, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:13, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:8, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:8;

(b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:25, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:25, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:26, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:27, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:27; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:28, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:29, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:29, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:24;

(c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:36, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:37, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:37, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:38; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:39, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:39, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:29, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:29, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:24;

(d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:48, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:48, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:49, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:49, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:50, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:50; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:51, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:51, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:52, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:52, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:47, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:47;

или

(e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:61, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:61, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:62, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:62, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:63, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:63; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:64, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:64, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:65, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:65, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:60, или последовательностью с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:60.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит следующие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), где CDR определены в соответствии с системой нумерации AbM:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:9, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:10, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:13, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:8;

(b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:25, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:26, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:27; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:28, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:29, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24;

(c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:37, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:39, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:29, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24;

(d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:48, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:49, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:50; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:51, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:52, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:47;

или

(e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-H1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:61, CDR-H2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:62, CDR-H3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:63; и/или

вариабельную область легкой цепи (VL), включающую 3 CDR, представляющие собой следующие: CDR-L1 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:64, CDR-L2 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:65, CDR-L3 с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:60.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), где, по сравнению с CDR, определенными в соответствии с IMGT или AbM, как описано выше, по меньшей мере одна CDR в вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL) содержит мутацию, где мутация представляет собой замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление 1, 2 или 3 аминокислот, или любую их комбинацию).

Предпочтительно замена в соответствии с изобретением представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением содержит каркасные области (FR), полученные из вариабельной области тяжелой цепи (VH) человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасные области (FR), полученные из вариабельной области легкой цепи (VL) человеческого иммуноглобулина. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением является полностью человеческим.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) каркасную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или ее вариант, где вариант имеет консервативные замены до 20 аминокислот (например, консервативные замены до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном антитела зародышевого типа, из которой она происходит; и/или

(b) каркасную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина или ее вариант, где вариант имеет консервативные замены до 20 аминокислот (например, консервативные замены до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью гена антитела зародышевого типа, из которой она происходит.

В некоторых вариантах осуществления степень гуманизации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению составляет по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, 17, 30, 40, 53 или 68;

(ii) последовательности, включающей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, 17, 30, 40, 53 или 68; или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, 17, 30, 40, 53 или 68;

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, 18, 31, 41, 54 или 69;

(v) последовательности, включающей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, 18, 31, 41, 54 или 69; или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, 18, 31, 41, 54 или 69.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит VH с SEQ ID NO:1, и/или VL с SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит VH с SEQ ID NO:17, и/или VL с SEQ ID NO:18.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит VH с SEQ ID NO:30, и/или VL с SEQ ID NO:31.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит VH с SEQ ID NO:40, и/или VL с SEQ ID NO:41.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит VH с SEQ ID NO:53, и/или VL с SEQ ID NO:54.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит VH с SEQ ID NO:68, и/или VL с SEQ ID NO:69.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) VH с SEQ ID NO:1, и VL с SEQ ID NO:2;

(b) VH с SEQ ID NO:17, и VL с SEQ ID NO:18;

(c) VH с SEQ ID NO:30, и VL с SEQ ID NO:31;

(d) VH с SEQ ID NO:40, и VL с SEQ ID NO:41;

(e) VH с SEQ ID NO:53, и VL с SEQ ID NO:54;

(f) VH с SEQ ID NO:68, и VL с SEQ ID NO:69;

(g) вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) независимо имеют идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с VH и VL в любом из (a)-(f), соответственно; или

(h) вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) независимо имеют замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с VH и VL в любом из (a)-(f), соответственно. Предпочтительно замена представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит константную область тяжелой цепи (CH) человеческого иммуноглобулина или ее вариант, где вариант имеет консервативные замены до 50 аминокислот (например, консервативные замены до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой она происходит. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит константную область легкой цепи (CL) человеческого иммуноглобулина или ее вариант, где вариант имеет консервативные замены до 50 аминокислот (например, консервативные замены до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой она происходит.

В некоторых вариантах осуществления константная область является измененной, например мутированной, для модификации свойств молекулы анти-TSLP антитела (например, для изменения одной или нескольких из следующих характеристик: связывание с Fc рецептором, гликозилирование антитела, количество цистеиновых остатков, эффекторные клеточные функции или функции комплемента). Функции можно изменить путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка в константной области антитела другим остатком, например, для изменения аффинности антитела в отношении эффекторного лиганда (например, FcR или комплемент C1q), таким образом изменяя (например, снижая) эффекторные функции. Fc область антитела опосредует некоторые важные эффекторные функции, такие как ADCC, фагоцитоз (ADCP), CDC и т.п.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит константную область тяжелой цепи (Fc), которая выбрана из константных областей тяжелой цепи, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE; в частности IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и более конкретно IgG1 (например, человеческого IgG1). В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 представлена в SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит константную область легкой цепи, которая выбрана из, например, константной области каппа или лямбда легкой цепи, предпочтительно константной области каппа легкой цепи (например, константной области каппа легкой цепи человека).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область человеческого IgG1, представленную в uniprot ID P01857 (SEQ ID NO:74).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 (например, SEQ ID NO:74) или ее вариант, где вариант является мутированным по меньшей мере в одном из сайтов 234, 235, 237, 265, 297, 331, 329 и 434 в соответствии с системой нумерации ЕU. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит по меньшей мере одну из мутаций L234A, L235A, D265A, N297A, L234F, L235E, P331S, P329G, N434A, N434Y, N434F, N434W, N434S, N434G, N434H и N434Q. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит по меньшей мере одну из мутаций L234A, L235A, G237A и N434A. В некоторых вариантах осуществления вариант константной области тяжелой цепи IgG1 содержит L234A, L235A и G237A. В некоторых вариантах осуществления вариант константной области тяжелой цепи IgG1 содержит L234A, L235A, G237A и N434A.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CH, представленную в SEQ ID NO:14 или ее вариант, где вариант содержит консервативные замены до 20 аминокислот (например, консервативные замены до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:14, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO:14. Вариант содержит N297A и/или N434A в соответствии с системой нумерации ЕС. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит N434A.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CH, представленную в SEQ ID NO:15, или ее вариант, где вариант имеет консервативные замены до 20 аминокислот (например, консервативные замены до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:15, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO:15.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG4 (например, SEQ ID NO:75) или ее вариант, где вариант является мутированным по меньшей мере в одном из сайтов 228 и/или 434 в соответствии с системой нумерации ЕС.

В некоторых вариантах осуществления мутант содержит S228P и/или N434A. В некоторых вариантах осуществления вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG4 содержит S228P и N434A.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CH, представленную в SEQ ID NO:70, или ее вариант, где вариант имеет консервативные замены до 20 аминокислот (например, консервативные замены до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:70, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO:70.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи содержит константную область каппа легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи содержит константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16, или ее вариант, где вариант содержит консервативные замены до 20 аминокислот (например, консервативные замены до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативные замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO:16, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO:16;

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:15, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:70, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления указанная выше мутация(мутации) придает антителу или его антигенсвязывающему фрагменту такое свойство, что они вообще не имеют или имеют пониженную ADCP, ADCC и/или CDC активность по сравнению с соответствующим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, включающим человеческий IgG4 или константную область тяжелой цепи IgG4.

В некоторых вариантах осуществления указанная выше мутация(мутации) придает антителу или его антигенсвязывающему фрагменту такое свойство, что они вообще не имеют или имеют пониженную ADCP, ADCC и/или CDC активность по сравнению с соответствующим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, не имеющим мутации или замены, описанной выше.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, включающей последовательность VH с SEQ ID NO:1, и последовательность CH, представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70;

(ii) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

(b) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, включающей последовательность VL с SEQ ID NO:2, и последовательность CL, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv).

В некоторых вариантах осуществления замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, включающей последовательность VH с SEQ ID NO:17, и последовательность CH, представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70;

(ii) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

(b) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, включающей последовательность VL с SEQ ID NO:18, и последовательность CL, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv).

В некоторых вариантах осуществления замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, включающей последовательность VH с SEQ ID NO:30, и последовательность CH, представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70;

(ii) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

(b) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, включающей последовательность VL с SEQ ID NO:31, и последовательность CL, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv).

В некоторых вариантах осуществления замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, включающей последовательность VH с SEQ ID NO:40, и последовательность CH, представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70;

(ii) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

(b) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, включающей последовательность VL с SEQ ID NO:41, и последовательность CL, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv).

В некоторых вариантах осуществления замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, включающей последовательность VH с SEQ ID NO:53, и последовательность CH, представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70;

(ii) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

(b) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, включающей последовательность VL с SEQ ID NO:54, и последовательность CL, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv).

В некоторых вариантах осуществления замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит:

(a) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) последовательности, включающей последовательность VH с SEQ ID NO:68, и последовательность CH, представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70;

(ii) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

(b) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(iv) последовательности, включающей последовательность VL с SEQ ID NO:69, и последовательность CL, представленную в SEQ ID NO:16;

(v) последовательности, имеющей замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательности, имеющей идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv).

В некоторых вариантах осуществления замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению содержит: тяжелую цепь, включающую VH с SEQ ID NO:1, и константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70, и легкую цепь, включающую VL с SEQ ID NO:2, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению содержит: тяжелую цепь, включающую VH с SEQ ID NO:17, и константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70, и легкую цепь, включающую VL с SEQ ID NO:18, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению содержит: тяжелую цепь, включающую VH с SEQ ID NO:30, и константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70, и легкую цепь, включающую VL с SEQ ID NO:31, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению содержит: тяжелую цепь, включающую VH с SEQ ID NO:40, и константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70, и легкую цепь, включающую VL с SEQ ID NO:41, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению содержит: тяжелую цепь, включающую VH с SEQ ID NO:53, и константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70, и легкую цепь, включающую VL с SEQ ID NO:54, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению содержит: тяжелую цепь, включающую VH с SEQ ID NO:68, и константную область тяжелой цепи (CH), представленную в SEQ ID NO:14, 15 или 70, и легкую цепь, включающую VL с SEQ ID NO:69, и константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь и легкую цепь,

где тяжелая цепь содержит:

(i) последовательность с SEQ ID NO:66 или 73;

(ii) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

легкая цепь содержит:

(iv) последовательность с SEQ ID NO:67;

(v) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv);

предпочтительно замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением содержит тяжелую цепь и легкую цепь,

где тяжелая цепь содержит:

(i) последовательность с SEQ ID NO:71;

(ii) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

легкая цепь содержит:

(iv) последовательность с SEQ ID NO:72;

(v) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление до 50, до 45, до 40, до 35, до 30, до 25, до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот, или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью в (iv); или

(vi) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (iv);

предпочтительно замена в (ii) или (v) представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением выбраны из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv фрагментов, дисульфид-связанных Fv (dsFv) и диатела.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением могут демонстрировать по меньшей мере одно из следующих свойств:

(a) связывание с TSLP (например, человеческим TSLP) с KD меньше чем около 50 нМ, например меньше чем около 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 1 пМ, 0,1 пМ или меньше, где KD измеряют методом, хорошо известным в данной области, таким как Fortebio или ELISA;

(b) связывание с TSLP (например, человеческим TSLP) с EC50 меньше чем около 50 нМ, например, меньше чем около 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 1 пМ, 0,1 пМ или меньше, где EC50 измеряют методом, хорошо известным в данной области, таким как проточная цитометрия или ELISA, например, аффинный ELISA или клеточный конкурентный ELISA;

(c) ингибирование связывания TSLP с IL7Rα/TSLPR с IC50 меньше чем около 50 нМ, например, около 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 1 пМ, 0,1 пМ или меньше, где IC50 измеряют методом ELISA;

(d) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной экспрессии OX40L;

(e) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток;

(f) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG);

(g) ингибирование или блокирование секреции Th2 Цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5;

(h) хорошая аффинность в отношении связывания с FcRn;

(i) изоэлектрическая точка (PI) от около 6,5 до около 8,5, например около 6,5, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,7, около 7,9, около 8,0, около 8,2 или около 8,5.

Кроме того, антитело по изобретению обладает хорошей аффинностью к FcRn. В некоторых вариантах осуществления KD (M) значение аффинности к FcRn находится на уровне 10^-9. Антитело по изобретению имеет более долгий период полужизни in vivo. Антитело по изобретению также имеет хорошую гидрофильность. В некоторых вариантах осуществления время гидрофобного взаимодействия антитела по изобретению определено как составляющее от 8 минут до 14 минут с использованием хроматографической колонки.

Производные антител

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением может быть дериватизирован, например связан с другой молекулой (например, другим полипептидом или белком). Как правило, дериватизация (например, мечение) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента не оказывает негативного влияния на его связывание с TSLP (в частности, с человеческим TSLP). Таким образом, также предполагается, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением охватывает такие производные формы. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением может быть связан (путем химического связывания, слияния генов, нековалентно или другим образом) с одним или несколькими другими молекулярными фрагментами, например, другим антителом (например, с образованием биспецифического антитела), реагентом для детекции, фармацевтическим реагентом и/или белком или полипептидом, способным опосредовать связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой (например, авидин или полигистидиновая метка).

Один тип дериватизированного антитела (например, биспецифическое антитело) получают перекрестным связыванием двух или более антител (относящихся к одному и тому же или разным типам). Способы получения биспецифического антитела хорошо известны в данной области, и примеры способов включают, но не ограничиваются этим, химическую сшивку, клеточную инженерию (гибридома) или генную инженерию.

Другой тип дериватизированного антитела представляет собой меченое антитело. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут быть связаны с детектируемым маркером. Детектируемый маркер по изобретению может быть любым веществом, которое может быть обнаружено флуоресцентными, спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунологическими, электрическими, оптическими или химическими методами. Такие маркеры хорошо известны в данной области, и их примеры включают, но не ограничиваются этим, ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу и т.д.), радионуклиды (например, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C или ³²P), флуоресцентные красители (например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), флуоресцеин, тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC), фикоэритрин (PE), техасский красный, родамин, квантовые точки или производные цианинового красителя (например, Cy7, Alexa 750)), сложные эфиры акридинов, магнитные шарики (например, Dynabeads®), калориметрические маркеры, такие как коллоидное золото или шарики из цветного стекла или пластика (например, из полистирола, полипропилена, латекса и т.д.), и биотин, используемый для связывания с авидином (например, стрептавидином), модифицированным вышеуказанными маркерами. Использование таких маркеров описано в документах, включающих, но не ограничивающихся этим, патенты США №№ 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149; и 4366241, все из которых включены в настоящую заявку в качестве ссылки. Детектируемый маркер, описанный выше, может быть обнаружен способами, известными в данной области. Например, радиоактивный маркер можно обнаружить с использованием фотопленки или сцинтилляционного счетчика, а флуоресцентный маркер можно обнаружить с использованием фотодетектора для детекции излучаемого света. Ферментный маркер обычно можно обнаружить путем обеспечения субстрата для фермента и детекции продукта реакции, образующегося при действии фермента на субстрат; калориметрический маркер может быть обнаружен при помощи простого визуального окрашивающего маркера. В некоторых вариантах осуществления такие маркеры можно использовать в иммуноанализах (например, иммуноферментном анализе, радиоиммуноанализе, иммунофлуоресцентном анализе, иммунохемилюминесцентном анализе и т.д.). В некоторых вариантах осуществления детектируемые маркеры, описанные выше, могут быть связаны с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в соответствии с изобретением через линкеры различной длины для снижения потенциальных стерических затруднений.

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением также могут быть дериватизированы с использованием химических групп, таких как полиэтиленгликоль (PEG), метил или этил, или гликозил. Эти группы можно использовать для улучшения биологических характеристик антитела, таких как увеличение периода полужизни в сыворотке.

Поэтому в одном аспекте изобретения обеспечивается конъюгат, включающий моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением и связывающий компонент, где связывающий компонент представляет собой детектируемый маркер, описанный выше, такой как радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, окрашенное вещество или фермент. Связывающий компонент также может представлять собой терапевтическое средство.

В качестве одного из производных антитела изобретение обеспечивает мультиспецифическое антитело, включающее первое антитело или его фрагмент и дополнительное антитело или его фрагмент, или миметик антитела, где первое антитело или его фрагмент, дополнительное антитело или его фрагмент, или миметик антитела сохраняет его исходную специфичность связывания. Первое антитело или его фрагмент представляет собой любое из (моноклональных) антител или их антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с изобретением, связывающихся с TSLP. В контексте настоящей заявки “миметик антитела” относится к веществу, которое специфически связывается с антигеном как антитело, но без структуры антитела. Обычно это искусственные пептиды или белки, имеющие молярную массу около 3-20 кДа, например, сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin) и финомер. Сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin) может быть связан с IgG антителом, scFv-Fc фрагментом антитела или их комбинацией, как описано в CN104341529A. Биспецифический слитый полипептид получают путем слияния финомера против IL-17a с анти-IL-6R антителом, как описано в WO2015141862A1.

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело получают путем связывания первого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с другим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, или миметиком антитела, где каждое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или миметик антитела сохраняет его исходную специфичность связывания, и первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело, или триспецифическое антитело, или тетраспецифическое антитело.

Получение антител

Антитело по изобретению можно получить различными способами, известными в данной области, например, генно-инженерныеми рекомбинантными методами. Например, молекулу ДНК, кодирующую гены тяжелой и легкой цепи антитела по изобретению, получают с использованием химического синтеза или ПЦР амплификации. Полученную молекулу ДНК вставляют в вектор экспрессии с последующим трансфицированием клеток-хозяев. Затем трансфицированные клетки-хозяева культивируют в спецфических условиях для экспрессии антитела по изобретению.

Антигенсвязывающие фрагменты по изобретению можно получить путем гидролиза интактной молекулы антитела (см. Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Кроме того, эти антигенсвязывающие фрагменты также можно получить непосредственно с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (см. Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)). Например, Fab' фрагменты можно получить непосредственно из клеток-хозяев; Fab' фрагменты могут быть химически связаны с образованием F(ab')₂ фрагментов (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Кроме того, Fv, Fab или F(ab')₂ фрагменты также можно выделить непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методы для получения этих антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны специалистам в данной области.

Таким образом, в другом аспекте изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением, или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, или одну или несколько его CDR. Учитывая вырожденность кодонов, как известно в данной области, в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность может варьироваться в соответствии с вырожденностью кодонов. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной.

В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением содержит: (i) первую нуклеиновую кислоту и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением, соответственно, или (ii) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением, или (iii) первую нуклеиновую кислоту и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, первая и вторая нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, имеющие вырожденную последовательность, или по существу идентичную ей последовательность, любой из первой и второй нуклеиновых кислот в вышеуказанных (i)-(iii). В некоторых вариантах осуществления вырожденная последовательность или по существу идентичная последовательность относится к последовательности, имеющей по меньшей мере около 85%, 90%, 95%, 99% или больше идентичности последовательности, или имеющей одну или несколько нуклеотидных замен, или имеющей разницу не более чем 3, 6, 15, 30 или 45 нуклеотидов по сравнению с молекулами нуклеиновых кислот в (i)-(iii).

В другом аспекте обеспечивается вектор (например, клонирующий вектор или вектор экспрессии), который содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления вектор в соответствии с изобретением представляет собой, например, плазмиду, космиду, фаг, лентивирус или т.п. В некоторых вариантах осуществления вектор спсособен экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением in vivo в организме субъекта (например, млекопитающего, например человека).

В другом аспекте обеспечивается клетка-хозяин, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением или вектор в соответствии с изобретением. Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку (например, клетку млекопитающего, клетку насекомого, клетку дрожжей) или прокариотическую клетку (например, Escherichia coli). Подходящие эукариотические клетки включают, но не ограничиваются этим, NS0 клетки, Vero клетки, Hela клетки, COS клетки, CHO клетки, HEK293 клетки, BHK клетки и MDCKII клетки. Подходящие клетки насекомого включают, но не ограничиваются этим, Sf9 клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку млекопитающего, такую как CHO (например, CHO-K1, CHO-S, CHO DXB11, CHO DG44).

В другом аспекте обеспечивается способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением, включающий культивирование клетки-хозяина в соответствии с изобретением в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры, содержащей культивированные клетки-хозяева.

Применения, терапевтические методы и фармацевтические композиции

В другом аспекте изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяин, мультиспецифическое антитело и/или конъюгат в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением содержит клетку-хозяина в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент, где клетка-хозяин содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, описанные выше.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением содержит мультиспецифическое антитело в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением содержит конъюгат в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

В другом аспекте антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин, мультиспецифическое антитело или конъюгат в фармацевтической композиции в соответствии с изобретением должны обеспечивать по меньшей мере одну из следующих биологических активностей у субъекта:

(1) ингибирование или блокирование связывания TSLP с TSLPR/IL7Rα;

(2) понижающая регуляция или устранение активности TSLP;

(3) понижающая регуляция или блокирование экспрессии OX40L;

(4) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG);

(5) ингибирование или блокирование секреции Th2-подобных цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5;

(6) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин, мультиспецифическое антитело или конъюгат в фармацевтической композиции по изобретению способны ингибировать или блокировать связывание TSLP с TSLPR/IL7Rα. Связывание TSLP с TSLPR/IL7Rα может вызывать различные аллергические воспалительные заболевания, включая аллергические заболевания и неаллергические заболевания. Эти заболевания включают, но не ограничиваются этим, астму (включая тяжелую астму), идиопатический фиброз легких, атопический дерматит (AD), аллергический конъюнктивит, аллергический ринит (AR), синдром Незертона (NS), эозинофильный эзофагит (EoE), пищевую аллергию, аллергическую диарею, эозинофильный гастроэнтерит, аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA), аллергический грибковый синусит, ревматоидный артрит, COPD, системный склероз, келоид, язвенный колит, хронический синусит (CRS) и назальные полипы, хроническую эозинофильную пневмонию, эозинофильный бронхит; заболевания органов брюшной полости, такие как эозинофильный гастроэнтерит, синдром Чарга-Стросса; связанные с эозинофилами желудочно-кишечные заболевания, такие как эозинофилия/эозинофильная гранулема с полиангиитом, эозинофильный эзофагит и воспалительное заболевание кишечника; крапивницу, системный мастоцитоз, кожный мастоцитоз и рецидивирующий идиопатический ангионевротический отек. Поэтому антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин, мультиспецифическое антитело или конъюгат в фармацевтической композиции по изобретению способны предотвращать или лечить вышеуказанные заболевания.

Связывание TSLP с TSLPR/IL7Rα также связано с аутоиммунными заболеваниями. Поэтому антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин, мультиспецифическое антитело или конъюгат в фармацевтической композиции по изобретению способны предотвращать или лечить аутоиммунные заболевания, такие как диабет, тяжелая миастения, гастрит, пузырчатка, первичный билиарный цирроз, рассеянный склероз, волчанка, колит, ревматоидные заболевания, псориаз и заболевания щитовидной железы.

В некоторых вариантах осуществления в фармацевтической композиции антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением и дополнительное фармацевтически активное средство находятся в виде отдельных компонентов или как компоненты одной композиции. Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации или отдельно, одновременно или последовательно, с дополнительным фармацевтически активным средством.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция также может включать дополнительное фармацевтически активное средство.

Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить отдельно или в комбинации с другими активными средствами. Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить отдельно, одновременно или последовательно с одним или несколькими другими активными средствами.

Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с любым подходящим иммуносупрессантом, включая, но не ограничиваясь этим, противовоспалительные средства, в частности путем ингаляционного, интранального или парентерального введения кортикостероидов, таких как будесонид, беклометазон дипропионат, флутиказон пропионат, циклесонид, мометазон фуроат, флутиказон фуроат, флутиказон пропионат, будесонид, циклесонид, беклометазон дипропионат, мометазон фуроат, триамцинолон ацетонид и преднизолон. В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с фиксированной дозой ингаляционных кортикостероидов, например с фиксированной дозой флутиказона фуроата или флутиказона пропионата. В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с нестероидным агонистом глюкокортикоидного рецептора: антагонистами LTD4 или антагонистами LTB4, включая монтелукаст, пранлукаст, зафирлукаст, Акколат и т.д.; агонистами A2A; антагонистами A2B; агонистами дофаминовых рецепторов; или ингибиторами PDE4. В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с пирфенидоном или Нинтеданибом, или антагонистами avB6.

Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с бронходилататорами, такими как агонисты бета-2-адренергических рецепторов и/или мускариновые антагонисты. Подходящие агонисты бета-2-адренергических рецепторов включают вилантерол, салметерол, салбутамол, формотерол, салмефамол, фенотерол, кармотерол, этантерол, наминтерол, кленбутерол, пирбутерол, флеробутерол, репротерол, бамбутерол, индакатерол, тербуталин и их соли. Подходящие мускариновые антагонисты включают умеклидиния бромид, тиотропия бромид, гликопиррония бромид, ипратропий и их соли, такие как гидробромид умеклидиния бромида. В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить в комбинации с фиксированной дозой агонистов бета-2-адренергических рецепторов и/или мускариновых антагонистов, такой как фиксированная доза вилантерола трифенилацетата или умеклидиния бромида, или вилантерола трифенилацетата и умеклидиния бромида.

Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с одним или несколькими бронходилататорами и ингаляционными стероидами. Такая комбинация может включать двойную комбинацию, такую как флутиказона фуроат и вилантерола трифенилацетат, флутиказона фуроат и умеклидиния бромид, флутиказона пропионат и салметерол, будесонид и формотерол или мометазон и формотерол, и тройную терапию, такую как флутиказона фуроат, вилантерола трифенилацетат и умеклидиния бромид. В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить в комбинации с фиксированной дозой ингаляционных кортикостероидов и одного или нескольких бронходилататоров, такой как фиксированная доза флутиказона фуроата и вилантерола трифенилацетата, или флутиказона пропионата и салметерола, или флутиказона фуроата и умеклидиния бромида, или флутиказона фуроата, вилантерола трифенилацетата и умеклидиния бромида.

В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с антагонистом цитокинового рецептора, таким как антагонист CCR-1, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 и CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5. В одном варианте осуществления анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с антителом к другому цитокину или цитокиновому рецептору, таким как анти-IgE антитело, анти-L31 антитело, анти-IL31R антитело, анти-IL13 антитело, антитело к эндоглину, анти-IL1b антитело, другое анти-TSLP антитело или анти-hTSLPR антитело или их комбинация.

Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации со следующими: антагонисты лейкотриенов, такие как монтелукаст, зафирлукаст и пранлукаст; ингибиторы PDE4, такие как рофлумиласт; ксантен; анти-IgE антитела; антагонисты IL-13; антагонисты IL-6 и антагонисты IL-1, IL-33, IL-25 или TNF-α.

Анти-TSLP антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с антигистаминными или противокашлевыми лекарственными средствами, такими как цетиризина гидрохлорид, ацетаминофен, клемастина фумарат, прометазин, лоратадин, дезлоратадин, дифенгидрамин и фексофенадина гидрохлорид, активастин, астазол, азеластин, эбастин, эпинастин, мизоластин и тефенадин.

TSLP-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением можно вводить в комбинации с одним или несколькими другими активными средствами, выбранными из иммунодепрессантов (например, кортикостероидов, нестероидных агонистов глюкокортикоидных рецепторов, антагонистов лейкотриена D4, антагонистов лейкотриена B4, агонистов A2A, антагонистов A2B, агонистов дофаминовых рецепторов, пирфенидона, нинтеданиба или антагонистов avB6), бронходилататоров (например, агонистов бета-2-адренергических рецепторов, мускариновых антагонистов, агонистов β2-рецепторов короткого действия, длительно действующих агонистов β2-рецепторов, антихолинергических лекарственных средств короткого действия, метилксантинов, антихолинергических лекарственных средств длительного действия), других антагонистов цитокинов или цитокиновых рецепторов или антител (например, антагонистов IL-13, антагонистов IL-6, антагонистов IL-1, IL-33, IL-25 или TNF-альфа, анти-IgE антител, анти-IL31 антител, анти-IL31R антител, анти-IL13 антител, антител к эндоглину, анти-IL1b антител, другого анти-TSLP антитела или анти-hTSLPR антитела), антибиотиков, лучевой терапии, антагонистов лейкотриенов (например, монтелукаста, зафирлукаста или пранлукаста), ингибиторов PDE4 (например, рофлумиласта, ксантена), антигистаминов или противокашлевых лекарственных средств.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят одновременно, раздельно или последовательно с другими лечениями, например до, одновременно или после дополнительного фармацевтически активного средства.

В другом аспекте изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин, конъюгат или мультиспецифическое антитело по изобретению обеспечивается для применения для (1) ингибирования или блокирования связывания TSLP с TSLPR/IL7Rα; (2) даун-регуляции или устранения активности TSLP; (3) даун-регуляции или блокирования экспрессии OX40L; (4) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток, (5) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG); (6) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции Th2 цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5; и/или (7) профилактики или лечения аллергических заболеваний, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний.

В другом аспекте изобретения обеспечивается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, конъюгата или мультиспецифического антитела по изобретению для получения лекарственного средства для:

(1) ингибирования или блокирования связывания TSLP с TSLPR/IL7Rα;

(2) даун-регуляции или устранения активности TSLP;

(3) даун-регуляции или блокирования экспрессии OX40L;

(4) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток;

(5) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG);

(6) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции Th2 цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5; и/или

(7) профилактики или лечения аллергических заболеваний, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний.

В некоторых вариантах осуществления при использовании для получения лекарственного средства клетка-хозяин по изобретению содержит выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, описанные выше.

В некоторых вариантах осуществления, когда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяина, мультиспецифическое антитело или конъюгат используют для получения лекарственного средства, лекарственное средство используют для профилактики и/или лечения астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний у субъекта (например, человека).

В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, в том числе отличное от человека млекопитающее и человек. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяина, мультиспецифическое антитело, конъюгат или лекарственное средство по изобретению используют для профилактики и/или лечения аллергических воспалительных заболеваний, включая аллергические заболевания и неаллергические заболевания. Эти заболевания включают, но не ограничиваются этим, астму (включая тяжелую астму), идиопатический фиброз легких, атопический дерматит (AD), аллергический конъюнктивит, аллергический ринит (AR), синдром Незертона (NS), эозинофильный эзофагит (EOE), пищевую аллергию, аллергическую диарею, эозинофильный гастроэнтерит, аллергический бронхолегочный аспергиллез (ABPA), аллергический грибковый синусит, ревматоидный артрит, хроническую обструктивную болезнь легких(COPD), системный склероз, келоид, язвенный колит, хронический синусит (CRS) и назальные полипы, хроническую эозинофильную пневмонию, эозинофильный бронхит; заболевания органов брюшной полости, такие как эозинофильный гастроэнтерит, синдром Чарга-Стросса; связанные с эозинофилами желудочно-кишечные заболевания, такие как эозинофилия/эозинофильная гранулема с полиангиитом, эозинофильный эзофагит и воспалительное заболевание кишечника; крапивницу, системный мастоцитоз, кожный мастоцитоз и рецидивирующий идиопатический ангионевротический отек.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяина, мультиспецифическое антитело или конъюгат по изобретению используют для профилактики и/или лечения аутоиммунных заболеваний. В некоторых вариантах осуществления заболевания включают, но не ограничиваются этим, гипертиреоидизм, диабет, тяжелую миастению, язвенный колит, гастрит, пузырчатку, первичный билиарный цирроз, рассеянный склероз, эритематозную волчанку, ревматоидный артрит и т.п.

В другом аспекте изобретение обеспечивает способ для in vivo или in vitro по меньшей мере одного из следующих: (1) ингибирования или блокирования связывания TSLP с TSLPR/IL7Rα; (2) даун-регуляции или устранения активности TSLP; (3) даун-регуляции или блокирования экспрессии OX40L; (4) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG); (5) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции Th2-подобных цитокинов; (6) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток, включающий: введение любого из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, мультиспецифического антитела, конъюгата или фармацевтической композиции по изобретению в клетки или субъекту.

Необязательно, дополнительное фармацевтически активное средство вводят одновременно, до или после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, мультиспецифического антитела, конъюгата или фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, в том числе отличное от человека млекопитающее и человек; предпочтительно субъектом является человек.

Таким образом, в другом аспекте изобретение обеспечивает способ профилактики и/или лечения астмы, аллергических реакций, аллергического воспаления или аутоиммунных заболеваний у субъекта, включающий введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, мультиспецифического антитела, конъюгата или фармацевтической композиции по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяина, мультиспецифическое антитело, конъюгат или фармацевтическую композицию по изобретению можно сформулировать в любую лекарственную форму, известную в области медицины, такую как таблетки, пилюли, суспензии, эмульсии, растворы, гели, капсулы, порошки, гранулы, эликсиры, таблетки для рассасывания, суппозитории, инъекции (включая растворы для инъекций, стерильные порошки для инъекций и концентрированные растворы для инъекций), лекарственные формы для ингаляций, спреи и т.д. Предпочтительная лекарственная форма зависит от предполагаемого пути введения и используемого лечения. Фармацевтическая композиция по изобретению должна быть стерильной и стабильной в условиях изготовления и хранения и может быть получена в форме для инъекции.

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением могут присутствовать в фармацевтической композиции в виде единичной дозы для облегчения введения.

Фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, мультиспецифического антитела или конъюгата в соответствии с изобретением. «Профилактически эффективное количество» означает количество, достаточное для предотвращения, остановки или задержки возникновения заболевания. «Терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для излечения или по меньшей мере частичного предотвращения заболевания и его осложнений у пациента, страдающего этим заболеванием, например от 0,1 мг/мл до 5000 мг/мл.

В изобретении субъектом может быть млекопитающее (в том числе отличное от человека млекопитающее и человек), такое как человек.

Способы детекции и наборы

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способны связываться с TSLP, таким образом, их можно использовать для детекции присутствия или уровня TSLP в образце.

Таким образом, в другом аспекте изобретение обеспечивает набор, включающий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением несет детектируемый маркер. В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит вторичное антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Предпочтительно вторичное антитело также содержит детектируемый маркер.

В изобретении детектируемый маркер может быть любым веществом, которое может быть обнаружено флуоресцентными, спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунологическими, электрическими, оптическими или химическими методами. Особенно предпочтительно, чтобы такие маркеры могли быть пригодны для иммуноанализов (например, иммуноферментного анализа, радиоиммуноанализа, флуоресцентного иммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа и т.д.). Такие маркеры хорошо известны в данной области, и их примеры включают, но не ограничиваются этим, ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу и т.д.), радионуклиды (например, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C или ³²P), флуоресцентные красители (например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), флуоресцеин, тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC), фикоэритрин (PE), техасский красный, родамин, квантовые точки или производные цианинового красителя (например, Cy7, Alexa 750)), сложные эфиры акридинов, магнитные шарики (например, Dynabeads®), калориметрические маркеры, такие как коллоидное золото или шарики из цветного стекла или пластика (например, из полистирола, полипропилена, латекса и т.д.), и биотин, используемый для связывания авидина (например, стрептавидина), модифицированного вышеуказанными маркерами. Использование таких маркеров описано в патентах, включая, но не ограничиваясь этим, патенты США №№ 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149; и 4366241, все из которых включены в настоящую заявку в качестве ссылки. Маркеры, охватываемые изобретением, могут быть обнаружены способами, известными в данной области. Например, радиоактивный маркер можно обнаружить с использованием фотопленки или сцинтилляционного счетчика, а флуоресцентный маркер можно обнаружить с использованием фотодетектора для детекции излучаемого света. Ферментный маркер обычно можно обнаружить путем обеспечения субстрата для фермента и детекции продукта реакции, образующегося при действии фермента на субстрат; калориметрический маркер может быть обнаружен при помощи простого визуального окрашивающего маркера. В некоторых вариантах осуществления детектируемые маркеры, описанные выше, могут быть связаны с рекомбинантным белком по изобретению через линкеры различной длины для снижения потенциальных стерических затруднений.

В другом аспекте изобретение относится к способу детекции присутствия или уровня TSLP в образце, включающему стадию использования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением.

В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением несет детектируемый маркер.

В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно содержит детекцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению с использованием реагента с детектируемым маркером.

Этот способ можно использовать в диагностических или недиагностических целях (например, исследования пути TSLP-TSLP/IL-7Ra, скрининг лекарственных средств, гистохимический анализ и т.д.). В некоторых вариантах осуществления образец для недиагностических целей представляет собой клеточный образец, такой как клеточная линия или культура клеток ex vivo.

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ детекции присутствия или уровня TSLP в образце, включающий контактирование образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и TSLP и обнаружение образования комплекса.

В другом аспекте, изобретение обеспечивает способ диагностирования астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний у субъекта, включающий:

- контактирование образца от субъекта с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, мультиспецифическим антителом или конъюгатом в соответствии с изобретением в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и TSLP,

- обнаружение образования комплекса,

где повышенный уровень TSLP является признаком астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний, по сравнению со здоровым контролем.

Необязательно, субъектом является млекопитающее, в том числе отличное от человека млекопитающее и человек. Предпочтительно субъектом является человек.

Предпочтительно аллергическое воспаление, аллергические реакции или аутоиммунные заболевания являются такими, которые описаны выше.

В другом аспекте изобретение обеспечивает применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, мультиспецифического антитела, конъюгата или фармацевтической композиции в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства или набора для диагностирования астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний.

В другом аспекте обеспечивается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с изобретением для получения набора для детекции присутствия или уровня TSLP в образце. В другом аспекте изобретение обеспечивает диагностический или терапевтический набор, включающий одно или несколько из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, мультиспецифического антитела, конъюгата или фармацевтической композиции в соответствии с изобретением. Необязательно, диагностический или терапевтический набор также содержит инструкции.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением обладает высокой аффинностью в отношении связывания с TSLP и хорошей специфичностью. Поэтому антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением является подходящим для профилактики и/или лечения астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний. Полностью человеческое антитело по изобретению имеет чрезвычайно высокую степень человеческого происхождения и является безопасным для введения субъекту-человеку, не инициируя где иммуногенный ответ. Поэтому антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с изобретением имеет большое клиническое значение.

Определения терминов

Если не указано иное, все научные и технические термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, как и те, которые обычно понимаются специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Кроме того, клеточная культура, биохимия, химия нуклеиновых кислот, иммунологические лабораторные исследования и другие используемые операции, являются обычными стадиями, широко используемыми в соответствующих областях. Между тем, чтобы лучше понять изобретение, ниже приведены определения и пояснения соответствующих терминов.

В контексте настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения в форме единственного числа, , включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, слово в единственном числе содержит значение “один или несколько”.

В контексте настоящей заявки термин "антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая, как правило, состоит из двух пар полипептидных цепей, каждая из которых имеет легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (HC). Легкие цепи классифицируются как легкие цепи каппа (κ) или лямбда (λ). Тяжелые цепи могут классифицироваться как μ, δ, γ, α или ε, и изотипы антитела могут быть определены как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области объединены "J" сегментом примерно из 12 или более аминокислот, где тяжелая цепь также содержит "D" сегмент примерно из 3 или более аминокислот. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов (CH1, CH2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Константный домен не вовлечен непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как опосредование связывания иммуноглобулина с тканью или фактором хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. VH и VL области также можно подразделить на гипервариабельные области (называемые определяющими комплементарность областями (CDR)), перемежающиеся с относительно консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области (VH и VL) каждой пары тяжелая цепь/легкая цепь образуют антигенсвязывающие сайты, соответственно.

В настоящей заявке CDR, содержащиеся в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте в соответствии с изобретением, могут определяться в соответствии с различными системами нумерации, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления CDR, содержащиеся в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте по изобретению, предпочтительно определяются в соответствии с системой нумерации Kabat, Chothia, AbM или IMGT.

В контексте настоящей заявки термины “каркасная область” или “FR” остатки относятся к тем аминокислотным остаткам в вариабельной области антитела, которые отличны от CDR остатков, определенных выше.

В контексте настоящей заявки термин “ген антитела зародышевой линии” представляет собой ген, кодирующий иммуноглобулин, экспрессируемый не лимфоцитом, который не подвергался процессам созревания генетической перестройки и созревания, приводящим к экспрессии специфического иммуноглобулина. Преимущество, обеспечиваемое различными вариантами осуществления изобретения, проистекает из консенсуса, что аминокислотные последовательности, кодируемые генами антител зародышевой линии, сохраняют более важные структуры аминокислотных последовательностей, демонстрирующие характеристики отдельного вида животных, чем те, которые кодируются зрелыми генами антител. Поэтому, при терапевтическом применении для этого вида они реже распознаются этим видом как экзогенное вещество.

Термин “антитело” не ограничивается конкретным способом получения антител. Например, он содержит рекомбинантные антитела, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Антитело может представлять собой антитело различных изотипов, такое как IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4 подтип), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM антитело.

В контексте настоящей заявки термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к полипептидному фрагменту антитела, такому как полипептидный фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность к специфическому связыванию с тем же антигеном, который связывается полноразмерным антителом, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, который также известен как "антигенсвязывающая часть". В общем смысле см. Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd Edition, Raven Press, N.Y. (1989), который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для всех целей. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно получить методами рекомбинантной ДНК или методом ферментативного или химического расщепления интактного антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают фрагменты Fab, Fab', F (ab')₂, Fd, Fv, dAb и определяющие комплементарность области (CDR), одноцепочечное антитело (например, scFv), химерное антитело, диатело, линейное антитело, нанотело (например, с использованием технологии от Ablynx), доменное антитело (например, с использованием технологии от Domantis) и полипептид, включающий по меньшей мере часть антитела, достаточную для придания специфической антигенсвязывающей способности полипептиду. Конструирование модифицированных вариантов антител рассматривается в Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136.

В контексте настоящей заявки термин “полноразмерное антитело” означает антитело, состоящее из двух “полноразмерных тяжелых цепей” и двух “полноразмерных легких цепией”. Где, "полноразмерная тяжелая цепь" относится к полипептидной цепи, которая, от N-конца к C-концу, состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH), домена CH1 константной области тяжелой цепи, шарнирной области (HR), домена CH2 константной области тяжелой цепи и домена CH3 константной области тяжелой цепи; и когда полноразмерное антитело представляет собой IgE изотип, оно необязательно дополнительно содержит домен CH4 константной области тяжелой цепи. Предпочтительно “полноразмерная тяжелая цепь” представляет собой полипептидную цепь, состоящую из VH, CH1, HR, CH2 и CH3 от N-конца к C-концу. "Полноразмерная легкая цепь" представляет собой полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL) от N-конца к C-концу. Две пары цепей полноразмерного антитела связаны дисульфидным мостиком между CL и CH1 и дисульфидым мостиком между HRs двух полноразмерных тяжелых цепей. Полноразмерное антитело по изобретению может происходить от одного вида, такого как человек; а также может представлять собой химерное антитело или гуманизированное антитело. Полноразмерное антитело по изобретению содержит два антигенсвязывающих сайта, образованных VH и VL парами, соответственно, где такие сайты специфически распознают/связываются с одним и тем же антигеном.

В контексте настоящей заявки термин “Fd фрагмент” означает фрагмент антитела, состоящий из VH и CH1 доменов; термин “dAb фрагмент” означает фрагмент антитела, состоящий из VH домена (Ward et al., Nature 341: 544 546 (1989)); термин “Fab фрагмент” означает фрагмент антитела, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов; термин “F(ab')₂ фрагмент” означает фрагмент антитела, включающий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; термин “Fab' фрагмент” означает фрагмент, полученный восстановлением дисульфидного мостика, связывающего два фрагмента тяжелой цепи в F(ab')₂ фрагменте, который состоит из полной легкой цепи и Fd фрагмента (состоящего из VH и CH1 доменов) тяжелой цепи.

В контексте настоящей заявки термин "Fv фрагмент" означает фрагмент антитела, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела. Fv фрагмент обычно считается наименьшим фрагментом антитела, который может образовывать полный антигенсвязывающий сайт. Обычно считается, что шесть CDR сообщают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже одна вариабельная область (такая как Fd фрагмент, который содержит только три антиген-специфические CDR) может распознавать и связывать антиген, хотя она возможно имеет более низкую аффинность по сравнению с полным сайтом связывания.

В контексте настоящей заявки термин "Fc фрагмент" означает фрагмент антитела, образованный путем связывания второй и третьей константных областей первой тяжелой цепи антитела с второй и третьей константными областями второй тяжелой цепи антитела через дисульфидный мостик. Fc фрагмент антитела имеет много различных функций, но не участвует в связывании антигена.

В контексте настоящей заявки термин "scFv" относится к одной полипептидной цепи, включающей VL и VH домены, где VL и VH связаны линкером (см., например, Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); и Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Ed. Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)). Такие scFv молекулы могут иметь общую структуру: NH₂-VL-Линкер-VH-COOH или NH₂-VH-Линкер-VL-COOH. Подходящий линкер, известный в данной области, состоит из повторяющихся GGGGS аминокислотных последовательностей или их вариантов. Например, можно использовать линкер, включающий аминокислотную последовательность (GGGGS)₄ или ее вариант (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в изобретении, описаны в Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731; Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106; Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061; Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. В некоторых случаях дисульфидный мостик также может присутствовать между VH и VL scFv. В контексте настоящей заявки термин "ди-scFv" относится к фрагменту антитела, образованному связыванием двух scFv.

В контексте настоящей заявки термин "диатело" означает, что VH и VL домены экспрессированы на одной полипептидной цепи, но используемый линкер слишком короткий для спаривания между двумя доменами одной и той же цепи, таким образом, вынуждая домен спариваться с комплементарным доменом другой цепи и образуя два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), and Poljak R.J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)).

В контексте настоящей заявки "миметик антитела" относится к специфически связывающемуся с антигеном, как и антитело, но без структуры антитела. Обычно это искусственные пептиды или белки, имеющие молярную массу около 3-20 кДа. Примеры включают сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin) и финомер. Сконструированный белок с анкириновым повтором (DARPin) может быть связан с IgG антителом, scFv-Fc фрагментом антитела или их комбинацией, как описано в CN104341529A. Анти-IL-17a финомер связывается с анти-IL-6R антителом, как описано в WO2015141862A1.

Каждый из описанных выше фрагментов антител сохраняет способность к специфическому связыванию с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном.

Антигенсвязывающий фрагмент (например, фрагмент антитела, описанный выше) можно получить из данного антитела (например, антитела, обеспечиваемого изобретением) с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области (например, методов рекомбинантной ДНК или методов ферментативного или химического расщепления), и антигенсвязывающий фрагмент антитела подвергают специфическому скринингу таким же образом, как интактное антитело.

В настоящей заявке, если из контекста явно не следует иное, термин “антитело” содержит не только интактное антитело, но также его антигенсвязывающий фрагмент.

В контексте настоящей заявки термины “моноклональное антитело”, “McAb” и “mAb” имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо, и они относятся к антителу из популяции высокогомологичных молекул антител, т.е. популяции идентичных молекул антител, за исключением природных мутаций, которые могут возникать спонтанно. Моноклональное антитело обладает высокой специфичностью в отношении одного эпитопа на антигене. По сравнению с моноклональным антителом поликлональные антитела обычно содержат по меньшей мере два или более разных антитела, которые обычно распознают разные эпитопы на антигене. Кроме того, определение “моноклональный” просто указывает, что характерные признаки антитела получены из популяции высокогомологичных антител, и не должно рассматриваться как требующее какого-либо конкретного способа получения антитела.

В контексте настоящей заявки термин “химерное антитело” означает такое антитело, где одна часть его легкой цепи или/и тяжелой цепи происходит из одного антитела (которое может быть получено от конкретного вида или может относиться к конкретному классу или подклассу антител), а другая часть легкой цепи или/и тяжелой цепи происходит из другого антитела (которое может быть получено от того же самого или другого вида или может относиться к тому же самому или другому классу или подклассу антител), которое в любом случае сохраняет активность связывания с антигеном-мишенью (патент США № 4816567, выданный Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 6855 (1984)).

В настоящем изобретении ожидаемые свойства антитела по изобретению включают: (1) ингибирование или блокирование связывания TSLP с TSLPR/IL7Rα; (2) даун-регуляцию или устранение активности TSLP; (3) даун-регуляцию или блокирование экспрессии OX40L; (4) ингибирование или блокирование секреции Th2-подобных цитокинов; (5) профилактику и/или лечение аллергических воспалительных заболеваний. Гуманизированное антитело по изобретению сохраняет одно или несколько из вышеуказанных ожидаемых свойств исходного антитела (человеческого антитела или мышиного-человеческого химерного антитела).

Для получения гуманизированного антитела CDR область мыши может быть встроена в человекую каркасную последовательность с использованием способов, известных в данной области (см. патент США № 5225539, выданный на имя Winter; патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные на имя Queen et al.; и Lo, Benny, K.C., ред., в Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004). Альтернативно, также можно использовать трансгенных животных, которые не могут продуцировать эндогенные иммуноглобулины после иммунизации, но могут продуцировать библиотеку интактных человеческих антител (см., например, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immunology 7:33; и Duchosal et al., 1992, Nature 355: 258; Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; WO02/43478). Другие способы гуманизации антител включают метод фагового дисплея (Hoogenboom et al., 1991, J.Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., J.Mol. Biol. 1991, 222: 581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14: 309).

В контексте настоящей заявки термин “степень гуманизации” является показателем для оценки количества нечеловеческих аминокислотных остатков в гуманизированном антителе. Степень гуманизации гуманизированного антитела можно предсказать, например, при помощи DomainGapAlign из веб-сайта IMGT для гомологии последовательностей вариабельных областей с человеческими V доменами.

В контексте настоящей заявки термин “специфически связывающийся” относится к неслучайной реакции связывания между двумя молекулами, такой как реакция между антителом и антигеном, против которого оно направлено. Сила или аффинность специфического связывающего взаимодействия может быть показана равновесной константой диссоциации (K_D) этого взаимодействия. В настоящей заявке термин “K_D” относится к равновесной константе диссоциации специфического взаимодействия антитело-антиген, которую используют для описания аффинности связывания между антителом и антигеном. Чем меньше равновесная константа диссоциации, тем сильнее связывание антитело-антиген и тем выше аффинность между антителом и антигеном. В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающееся с антигеном (или антитело, специфическое в отношении антигена) означает, что антитело связывается с антигеном с K_D меньше чем около 10^-8 M, например меньше чем около 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M или 10^-11 M или меньше. В некоторых вариантах осуществления, когда K_D ≤ 10 10^-8 M, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению считается специфически связывающимся с TSLP.

Свойства специфического связывания между двумя молекулами можно измерить с использованием методов, хорошо известных в данной области. Один из методов содержит измерение скорости образования и диссоциации комплексов антигенсвязывающий сайт/антиген. Как «константа скорости связывания» (ka или kon), так и «константа скорости диссоциации» (kdis или koff) могут быть рассчитаны по концентрации и фактическим скоростям ассоциации и диссоциации (см. Malmqvist M, Nature, 1993, 361: 186-187). Отношение kdis/kon равно константе диссоциации K_D (см. Davies et al., Annual Rev Biochem, 1990; 59: 439-473). Значения K_D, kon и kdis могут быть измерены любым эффективным методом. В некоторых вариантах осуществления константа диссоциации может быть измерена методом биолюминесцентной интерферометрии (например, анализ ForteBio Octet). Кроме того, константу диссоциации также можно измерить методом поверхностного плазмонного резонанса (например, Biacore) или Kinexa.

В контексте настоящей заявки термин «вектор» относится к носителю нуклеиновой кислоты, в который может быть встроен полинуклеотид. Когда он обеспечивает экспрессию белка, кодируемого встроенным полинуклеотидом, вектор называют вектором экспрессии. Векторы могут быть введены в клетки-хозяева посредством трансформации, трансдукции или трансфекции таким образом, чтобы переносимые элементы генетического материала могли экспрессироваться в клетках-хозяевах. Векторы хорошо известны специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь этим: плазмиды; фагмиды; космиды; искусственные хромосомы, такие как искусственные хромосомы дрожжей (YAC), искусственные хромосомы бактерий (BAC) или искусственные хромосомы, полученные из P1 (PAC); фаги, такие как фаг λ или фаг М13, и вирусы животных. Вирусы животных, которые можно использовать в качестве векторов, включают, но не ограничиваются этим, ретровирусы (включая лентивирусы), аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы (например, вирус простого герпеса), поксвирусы, бакуловирусы, папилломавирусы, паповавирусы (например, SV40). Вектор может содержать элементы, контролирующие экспрессию, включая, но не ограничиваясь этим, промоторную последовательность, последовательность инициации транскрипции, энхансерную последовательность, элемент селекции и репортерный ген. Кроме того, вектор может также содержать точку начала репликации.

В контексте настоящей заявки термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую может быть введен вектор, включая, но не ограничиваясь этим, прокариотические клетки, такие как Escherichia coli или Bacillus subtilis, клетки грибов, такие как клетки дрожжей или Aspergillus, клетки насекомых, такие как клетки S2 дрозофилы или Sf9, или клетки животных, такие как фибробласты, клетки CHO, клетки COS, клетки NSO, клетки HeLa, клетки BHK, клетки HEK 293 или клетки человека.

В контексте настоящей заявки термин «идентичность» используется для обозначения степени совпадения последовательностей между двумя полипептидами или двумя нуклеиновыми кислотами. Когда положение в двух последовательностях для сравнения занимает одна и та же мономерная субъединица основания или аминокислоты (например, положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), тогда молекулы идентичны в этом положении. «Процент идентичности» между двумя последовательностями является функцией количества совпадающих положений, общих для двух последовательностей, деленного на количество сравниваемых положений и умноженного на 100. Например, если шесть положений из десяти положений в двух последовательностях совпадают, то эти две последовательности идентичны на 60%. Например, последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT имеют идентичность 50% (совпадают 3 положении из 6 положений). Обычно две последовательности сравнивают и выравнивают для максимальной идентичности. Такое выравнивание может быть реализовано с использованием, например, метода Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, что удобно осуществить с использованием компьютерной программы, такой как программа Align (DNAstar, Inc). Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен при помощи алгоритма Нидлмана и Вунша (J Mol Biol. 48: 444-453 (1970)) в программе GAP, включенной в пакет программ GCG (доступен на сайте www.gcg.com), с использованием либо Blossum Matrix 62, либо PAM250, штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за удлинение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно также определить по алгоритму Э. Мейерса и У. Миллера (Computer. App. Biosci., 4: 11-17 (1988)).

В контексте настоящей заявки последовательность, имеющая «% идентичности», сохраняет важные биологические активности, такие как специфичность связывания антитела, последовательности, с которой она выровнена или из которой получена. Последовательность, имеющая замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию, сохраняет важные биологические активности, такие как специфичность связывания антитела, последовательности, с которой она выровнена или из которой получена. Нуклеотидная последовательность, имеющая «% идентичности» или отличающаяся не более чем на 3, 6, 15, 30 или 45 нуклеотидов, может проявлять функции, аналогичные нуклеотидной последовательности, с которой она выровнена илииз которой получена, например, все экспрессируемые белки могут специфически связываться с одним и тем же антигеном или молекулой.

В контексте настоящей заявки термин «консервативная замена» означает аминокислотную замену, которая не оказывает неблагоприятного воздействия или не изменяет ожидаемые свойства белка/полипептида, включающего аминокислотную последовательность. Например, консервативную замену можно ввести стандартными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативная аминокислотная замена содержит замену аминокислотного остатка аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь, например, остатком, который физически или функционально подобен соответствующему аминокислотному остатку (например, имеет аналогичный размер, форму, заряд, химическое свойство, в том числе способность образовывать ковалентные или водородные связи, и т.п.). В данной области определены семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты, имеющие щелочные боковые цепи (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поэтому предпочтительна замена соответствующего аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Способы идентификации консервативных замен аминокислот хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999) и Burks et al., Proc.Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997), которые включены в настоящую заявку посредством ссылки).

Компиляция двадцати стандартных аминокислот, охватываемых изобретением, следует общепринятому применению. См., например, Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), который включен в настоящую заявку в качестве ссылки. В настоящей заявке термины «полипептид» и «белок» имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо. Кроме того, в изобретении аминокислоты в основном представлены однобуквенными и трехбуквенными аббревиатурами, хорошо известными в данной области техники. Например, аланин может быть представлен как A или Ala; аргинин как R или Arg; глицин как G или Gly; глутамин как Q или Gln.

В контексте настоящей заявки термин «фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент» означает носитель и/или эксципиент, которые фармакологически и/или физиологически совместимы с субъектом и активным ингредиентом, которые хорошо известны в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, под редакцией Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) и включают, но не ограничиваются этим, модуляторы pH, поверхностно-активные вещества, адъюванты, усилители ионной силы, разбавители, реагенты для поддержания осмотического давления, реагенты для замедления абсорбции, консерванты. Например, модуляторы pH включают, но не ограничиваются этим, фосфатные буферы. Поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются этим, катионные, анионные или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Tween-80. Усилители ионной силы включают, но не ограничиваются этим, хлорид натрия. Консерванты включают, но не ограничиваются этим, различные антибактериальные и противогрибковые средства, такие как п-гидроксибензоат, трихлор-трет-бутиловый спирт, фенол, сорбиновая кислота и т.д. Реагенты, поддерживающие осмотическое давление, включают, но не ограничиваются этим, сахара, NaCl и т.п. Реагенты для замедления абсорбции включают, но не ограничиваются этим, моностеараты и желатин. Разбавители включают, но не ограничиваются этим, воду, водные буферы (например, буферный раствор), спирты и полиолы (например, глицерин) и т.д. Консерванты включают, но не ограничиваются этим, различные антибактериальные и противогрибковые средства, такие как тиомерсалат, 2-феноксиэтанол, п-гидроксибензоат, трихлор-трет-бутиловый спирт, фенол, сорбиновая кислота и т.д. Стабилизаторы имеют значение, обычно понятное специалистам в данной области, и могут стабилизировать желаемую активность активного ингредиента в лекарственном средстве, которые включают, но не ограничиваются этим, глутамат натрия, желатин, SPGA, сахара (такие как сорбит, маннит, крахмал, сахароза, лактоза, декстран или глюкоза), аминокислоты (такие как глутаминовая кислота, глицин), белки (такие как сухая сыворотка, альбумин или казеин) или продукты их разложения (такие как лактальбуминовый гидролизат).

В контексте настоящей заявки термин «профилактика» относится к процессу предотвращения или задержки начала заболевания, состояния или симптома (например, астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний) in vivo у субъекта. В контексте настоящей заявки термин «лечение» относится к процессу достижения полезного или желаемого клинического результата. Для целей изобретения благоприятный или желаемый клинический результат содержит, но не ограничивается этим, облегчение симптома, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную) симптомов, независимо от того, обнаруживаются они или нет. Кроме того, «лечение» также может означать пролонгирование выживания по сравнению с ожидаемым периодом выживания (в отсутствие лечения).

В контексте настоящей заявки термин «субъект» относится к млекопитающему, такому как примат, например отличный от человека примат или человек. В некоторых вариантах осуществления субъект (например, человек) страдает астмой, аллергическим воспалением, аллергической реакцией или аутоиммунным заболеванием или подвержен риску развития такого заболевания.

В контексте настоящей заявки термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желаемого эффекта. Например, эффективное количество для предотвращения заболевания (например, астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний) представляет собой количество, достаточное для предотвращения, остановки или отсрочки начала заболевания (например, астмы, аллергического воспаления, аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний); терапевтически эффективное количество относится к количеству, достаточному для излечения или, по меньшей мере, частичного предотвращения заболевания и его осложнений у пациента, который уже имеет заболевание. Определение такого эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов в данной области. Например, количество, эффективное для терапевтического применения, будет зависеть от тяжести заболевания, подлежащего лечению, общего состояния собственной иммунной системы пациента, общего состояния пациента, такого как возраст, масса тела и пол, способа введения, и других видов лечения, применяемых одновременно, и т.д.

В контексте настоящей заявки термин «иммунная клетка» содержит клетки, которые имеют гематопоэтическое происхождение и играют роль в иммунном ответе, например, лимфоциты, такие как В-клетки и Т-клетки; природные клетки-киллеры; миелоидные клетки, такие как моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и гранулоциты.

В контексте настоящей заявки термин «иммунный ответ» означает действие иммунных клеток (таких как лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки, фагоциты или гранулоциты) и растворимых макромолекул (включая антитела, цитокины и комплементы), продуцируемых иммунными клетками или печенью, что приводит к селективному повреждению, разрушению или удалению из организма человека инвазивных патогенов, инфицированных патогенами клеток или тканей, раковых клеток или нормальных клеток или тканей человека в случае аутоиммунного или патологического воспаления. В настоящей заявке термин «антиген-специфический Т-клеточный ответ» относится к иммунному ответу, генерируемому Т-клетками, когда Т-клетки стимулируются антигеном, специфическим для Т-клеток. Неограничивающие примеры ответов, генерируемых Т-клетками в ответ на антиген-специфическую стимуляцию, включают пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов (например, IL-2)

В контексте настоящей заявки термин «эффекторная функция» относится к тем биологическим активностям, которые способствуют Fc области антитела (Fc области природной последовательности или Fc области варианта аминокислотной последовательности) и варьируются в зависимости от изотипов антител.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что при правильном введении молекулы, фрагмента молекулы или композиции животному или человеку они не вызывают неблагоприятных, аллергических или других побочных реакций. Конкретные примеры веществ, которые можно использовать в качестве фармацевтически приемлемого носителя или его компонента, включают сахара (например, лактозу), крахмал, целлюлозу и их производные, растительные масла, желатин, полиолы (например, пропиленгликоль), альгиновую кислоту и т.п.

Полезные эффекты изобретения

По сравнению с предшествующим уровнем техники технические решения в соответствии с изобретением имеют следующие полезные эффекты:

(1) Антитело по изобретению может специфически распознавать/связывать TSLP с высокой аффинностью, ингибировать или блокировать связывание TSLP с TSLPR/IL7RR, ингибировать или блокировать TSLP-индуцированную пролиферацию Ba/F3 клеток in vitro/in vivo, и блокировать TSLP-индуцируемую активацию и секрецию цитокинов клетками PBMC. Таким образом, антитело по изобретению способно ингибировать или блокировать TSLP-индуцируемую активацию и/или пролиферацию мастоцитов, DC, NKT клеток, ингибируя или блокируя TSLP-индуцируемую экспрессию OX40L, секрецию остеопротегерина (OPG) или TSLP-индуцируемую секрецию Th2 цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5. Поэтому антитело по изобретению имеет потенциал для профилактики и/или лечения астмы, других аллергических реакций или аутоиммунных заболеваний.

(2) Антитело по изобретению имеет хорошую термостабильность, гидрофильность, изоэлектрическую точку и аффинность к FcRn.

(3) Некоторые из антител по изобретению являются полностью человеческими антителами и, таким образом, могут быть безопасными для введения субъекту, не инициируя где иммуногенный ответ. Поэтому антитело по изобретению имеет большое клиническое значение.

Аббревиатуры

CDR Определяющая комплементарность область в вариабельной области иммуноглобулина FR Каркасная область антитела: аминокислотные остатки в вариабельной области антитела за исключением CDR остатков VH Вариабельная область тяжелой цепи антитела VL Вариабельная область легкой цепи антитела IgG Иммуноглобулин G AbM Определения CDR по системе AbM взяты из исследования Martin (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9268-9272), которые имеют интегрированные части определений по Kabat и Chothia. Kabat Выравнивание и система нумерации иммуноглобулинов, предложенная Elvin A. Kabat (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutions of Health, Bethesda, Md., 1991). Chothia Система нумерации иммуноглобулинов, предложенная Chothia et al., которая представляет собой классическое правило для идентификации границ CDR области на основании расположения структурных кольцевых областей (см., например, Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883). IMGT Система нумерации на основании международной системы ImmunoGenetics information system® (IMGT), предложенной Lefranc et al., см. Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003. mAb Моноклональное антитело EC₅₀ Концентрация, которая обеспечивает 50% эффективность или связывание IC₅₀ Концентрация, которая обеспечивает 50% ингибирование ELISA Твердофазный иммуно-ферментный анализ ПЦР Полимеразная цепная реакция HRP Пероксидаза хрена TSLP Тимусный стромальный лимфопоэтин TSLPR Рецептор тимусного стромального лимфопоэтина IL7Rα Субъединица рецептора интерлейкина-7 альфа TARC Хемокин, регулируемый тимусом и активацией hFc Fc сегмент человеческого IgG антитела KD Равновесная константа диссоциации CDR-H1 Определяющая комплементарность область 1 в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CDR-H2 Определяющая комплементарность область 2 в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CDR-H3 Определяющая комплементарность область 3 в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина CDR-L1 Определяющая комплементарность область 1 в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CDR-L2 Определяющая комплементарность область 2 в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина CDR-L3 Определяющая комплементарность область 3 в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Детекция Ba/F3 клеточной линии, сверхэкспрессирующей оба человеческих TSLPR/IL7Rα гена.

Фиг. 2A: Определение ингибирующей активности химерного антитела 25A5C5 в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 2B: Определение ингибирующей активности химерных антител 27C2B6 и 37C2D10 в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 2C: Определение ингибирующей активности химерных антител 43B1A8 и 90H3H11 в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 3A: Определение аффинности связывания рекомбинантных полностью человеческих антител 25A5C5-hIgG, 27C2B6-hIgG и 37C2D10-hIgG с человеческим белком TSLP.

Фиг. 3B: Определение аффинности связывания рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG с человеческим белком TSLP.

Фиг. 4A: Определение ингибирующей активности рекомбинантных полностью человеческих антител 25A5C5-hIgG, 27C2B6-hIgG и 37C2D10-hIgG в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 4B: Определение ингибирующей активности рекомбинантного полностью человеческого антитела 43B1A8-hIgG в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 4C: Определение ингибирующей активности рекомбинантного полностью человеческого антитела 90H3H11-hIgG в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 5: Определение ингибирующей активности рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG в отношении секреции TARC клетками PBMC.

Фиг. 6: Определение термостабильности (Tm) рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG.

Фиг. 7A: Определение ингибирующей активности рекомбинантного полностью человеческого антитела 43B1-H2L2 в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 7B: Определение ингибирующей активности рекомбинантного полностью человеческого антитела 43B1-H6L1 в отношении пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Фиг. 8: Определение ингибирующей активности рекомбинантного полностью человеческого антитела 43B1-H2L2 в отношении секреции MDC цитокинов клетками PBMC.

Фиг. 9: Фармакокинетический анализ молекулы рекомбинантного полностью человеческого антитела 43B1-H2L2 у обезьян cynomolgus.

Информация о последовательностях

Информация о последовательностях, относящаяся к изобретению, представлена в следующей таблице.

SEQ ID NO. Описание SEQ ID NO. Описание 1 Вариабельная область тяжелой цепи антитела 25A5C5 39 AbM
37C2D10 CDR-L1 2 Вариабельная область легкой цепи антитела 25A5C5 40 Вариабельная область тяжелой цепи антитела 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1 3 IMGT
25A5C5 CDR-H1 41 Вариабельная область легкой цепи антитела 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1 4 IMGT
25A5C5 CDR-H2 42 IMGT
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H1 5 IMGT
25A5C5 CDR-H3 43 IMGT
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H2 6 IMGT
25A5C5 CDR-L1 44 IMGT
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H3 7 IMGT
25A5C5 CDR-L2 45 IMGT
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L1 8 IMGT/AbM
25A5C5 CDR-L3 46 IMGT
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L2 9 AbM
25A5C5 CDR-H1 47 IMGT/ AbM
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L3 10 AbM
25A5C5 CDR-H2 48 AbM
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H1 11 AbM
25A5C5 CDR-H3 49 AbM
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H2 12 AbM
25A5C5 CDR-L1 50 AbM
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H3 13 AbM
25A5C5 CDR-L2 51 AbM
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L1 14 Модифицированная константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 антитела 52 AbM
43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L2 15 Модифицированная константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 53 Вариабельная область тяжелой цепи антитела 90H3H11 16 Константная область легкой κ-цепи человека 54 Вариабельная область легкой цепи антитела 90H3H11 17 Вариабельная область тяжелой цепи антитела 27C2B6 55 IMGT
90H3H11 CDR-H1 18 Вариабельная область легкой цепи антитела 27C2B6 56 IMGT
90H3H11 CDR-H2 19 IMGT
27C2B6 CDR-H1 57 IMGT
90H3H11 CDR-H3 20 IMGT
27C2B6 CDR-H2 58 IMGT
90H3H11 CDR-L1 21 IMGT
27C2B6 CDR-H3 59 IMGT
90H3H11 CDR-L2 22 IMGT
27C2B6 CDR-L1 60 IMGT/ AbM
90H3H11 CDR-L3 23 IMGT
27C2B6 CDR-L2/
37C2D10 CDR-L2 61 AbM
90H3H11 CDR-H1 24 IMGT/AbM
27C2B6 CDR-L3/
IMGT/AbM
37C2D10 CDR-L3 62 AbM
90H3H11 CDR-H2 25 AbM
27C2B6 CDR-H1 63 AbM
90H3H11 CDR-H3 26 AbM
27C2B6 CDR-H2 64 AbM
90H3H11 CDR-L1 27 AbM
27C2B6 CDR-H3 65 AbM
90H3H11 CDR-L2 28 AbM
27C2B6 CDR-L1 66 Последовательность тяжелой цепи 43B1A8-hIgG 29 AbM
27C2B6 CDR-L2/
37C2D10 CDR-L2 67 Последовательность легкой цепи 43B1A8-hIgG/43B1-H6L1 30 Вариабельная область тяжелой цепи антитела 37C2D10 68 Вариабельная область тяжелой цепи антитела 43B1-H2L2 31 Вариабельная область легкой цепи антитела 37C2D10 69 Вариабельная область легкой цепи антитела 43B1-H2L2 32 IMGT
37C2D10 CDR-H1 70 Константная область тяжелой цепи модифицированного человеческого IgG4 33 IMGT
37C2D10 CDR-H2 71 Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 43B1-H2L2 34 IMGT
37C2D10 CDR-H3 72 Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 43B1-H2L2 35 IMGT
37C2D10 CDR-L1 73 Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 43B1-H6L1 36 AbM
37C2D10 CDR-H1 74 Константная область IgG1 человека 37 AbM
37C2D10 CDR-H2 75 Константная область тяжелой цепи IgG4 человека 38 AbM
37C2D10 CDR-H3

Подробное описание изобретения

Изобретение далее проиллюстрировано со ссылкой на следующие примеры, которые предназначены для иллюстрации, а не для ограничения изобретения.

Если не указано иное, молекулярно-биологические эксперименты и иммуноанализы, используемые в изобретении, в основном осуществляют со ссылкой на способы, описанные в J. J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989; и F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., John Wiley & Sons, Inc., 1995. Специалистам в данной области будет понятно, что примеры предназначены для иллюстрации изобретения, а не для ограничения объема изобретения.

Пример 1: получение антигенов

Человеческий TSLP или TSLP обезьяны экспрессировали в клетках Escherichia coli или клетках млекопитающего. Аминокислотная последовательность человеческого TSLP относится к NP_149024.1 в базе данных белков NCBI. Аминокислотная последовательность TSLP обезьяны cynomolgus (Macaca fascicularis) относится к XP_005557555.1 в базе данных белков NCBI. Антигены, используемые в настоящей заявке, включают TSLP, экспрессированный в модифицированной форме, такой как слияние 6 последовательных гистидинов в виде метки, слитой с C-концом последовательности TSLP (TSLP-His). Вышеуказанные последовательности TSLP человека и обезьяны были кодон-оптимизированы GenScript(Nanjing) Co., Ltd, синтезированы в векторе экспрессии (т.е. плазмиды, содержащие полную кодирующую последовательность человеческого TSLP), экспрессированы в клетках Escherichia coli или клетках млекопитающего HEK293F и очищены.

Природный рецептор TSLP представляет собой гетеродимер, который состоит из человеческого TSLPR и субъединицы человеческого IL7R альфа (IL7Rα). Последовательность человеческого TSLPR относится к Uniprot: Q9HC73.1; последовательность IL7Rα субъединицы человека относится к GenBank: AAR08908.1. Человеческий hIL7Rα-hTSLPR-hFc слитый белок состоял из внеклеточного домена человеческого IL7Rα (E21-D239), внеклеточного домена человеческого TSLPR рецептора (Q23-K231) и части кодирующей последовательности Fc области человеческого IgG1 (Шарнир-CH2-CH3) в тандеме. Его встраивали в вектор экспрессии pLVX после кодон-оптимизации. Стабильную экспрессирующую клеточную линию HEK293F устанавливали с использованием pLVX вектора и в завершение получали слитый белок hIL7Rα-hTSLPR-hFc путем очистки.

Пример 2: Конструирование и идентификация клеточной линии, сверхэкспрессирующей оба человеческих TSLPR/IL7Rα гена

2.1: Конструирование клеточной линии, сверхэкспрессирующей оба человеческих TSLPR/IL7Rα гена

Для подтверждения эффективности человеческого TSLP антитела для блокирования связывания человеческого TSLP с человеческим TSLPR/IL7Rα рецептором полная кодирующая аминокислоты последовательность человеческого TSLPR (Gene ID: UniProtKB/Swiss-Prot: Q9HC73.1, синтезированная GenScript(Nanjing) Co., Ltd), и полная кодирующая аминокислоты последовательность IL7R альфа субъединицы человека (Gene ID: GenBank: AAR08908.1, синтезированная GenScript(Nanjing) Co., Ltd) были кодон-оптимизированы GenScript(Nanjing) Co., Ltd и клонированы в лентивирусные векторы pLVX-IRES-puro и pLVX-IRES-zeocin, соответственно, и Ba/F3 клетки мышиной pro-B клеточной линии (приобратенной у COBIOER BIOSCIENCES CO.,LTD) инфицировали вирусом, полученным способом получения с использованием лентивирусной пакующей системы, описанной в Mohammadi Z et al., Mol Biotechnol. 2015 Sep; 57(9): 793-800, с последующим отбором с использованием пуромицина+блеомицина и скринингом отдельных клонов с получением моноклональной стабильной клеточной линии Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα.

2.2 Детекция Ba/F3 клеточной линии, сверхэкспрессирующей оба человеческих TSLPR/IL7Rα гена

Детекцию клеточной линии осуществляли методом проточной цитометрии (проточная цитометрия: Beckman, CytoFlex; детекторные антитела: APC-против человеческого TSLPR (Biolegend), APC-против человеческого IL7Rα (Biolegend)), чтобы определить, правильно ли моноклональные клетки экспрессируют человеческий TSLPR и человеческий IL7Rα. Как показано на Фиг. 1, результаты проточной цитометрии показали, что Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα представляла собой моноклональную клеточную линию, экспрессирующую оба гена (почти 100%) с хорошей гомогенностью, которую можно использовать для последующих экспериментов.

Пример 3: иммунизация мышей и слияние гибридом

3.1 Иммунизация мышей

Трансгенных мышей с полностью человеческими H2L2 (Harbour BioMed) иммунизировали несколько раз с использованием человеческого TSLP (NP_149024.1), экспрессированного Escherichia coli, человеческого TSLP (NP_149024.1), экспрессированного клетками млекопитающего, TSLP обезьяны (XP_005557555.1), экспрессированного клетками млекопитающего, и плазмид, содержащих полную кодирующую последовательность человеческого TSLP, соответственно. Бустер-иммунизацию осуществляли через каждые две недели в общей сложности 5-6 раз. Во время иммунизации сывороточный титр антител к человеческому TSLP определяли методом ELISA через каждые две недели (см. Пример 4.1), и после нескольких циклов иммунизации, в зависимости от титра, отбирали мышей, имеющих наилучший титр, для слияния для получения гибридомы.

3.2 Способ слияния

После смешивания суспензий отдельных клеток селезенки и лимфоузла добавляли клетки миеломы SP2/0 в эквивалентном количестве и равномерно смешивали. Смешанный раствор клеток промывали и ресуспендировали с использованием буфера для электрослияния, а после электрослияния с использованием устройства BTX-ECM2001 для электрослияния клеточную суспензию сразу же переносили из камеры для слияния в полную культуральную среду для слияния и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Клетки высевали в 96-луночный планшет при плотности 2×10⁴ клеток на лунку. После культивирования в течение 5 дней среду заменяли полной средой для слияния и через 7-10 дней супернатант собирали для скрининга гибридом.

Пример 4: Скрининг гибридом

4.1 ELISA скрининг связывания человеческого TSLP

Растворимый человеческий TSLP-His белок разбавляли до 1 мкг/мл в 1xCBS покрывающем буфере, затем добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 4°C. 96-луночные планшеты промывали PBST и блокировали блокирующим раствором (PBS+2% BSA) при 37°C в течение 2 часов. Гибридомный супернатант или такой же объем блокирующего раствора добавляли в планшеты и инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 2 часов. В 96-луночные планшеты добавляли козье анти-крысиное IgG-HRP и инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 1 часа, затем промывали и считывали OD при 450 нм.

4.2 ELISA скрининг связывания TSLP обезьяны

Обезьяний TSLP-His белок разбавляли до 1 мкг/мл в CBS покрывающем буфере, затем добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 4°C. 96-луночные планшеты промывали PBST и блокировали блокирующим раствором (PBS+2% BSA) при 37°C в течение 2 часов. Гибридомный супернатант или такой же объем блокирующего раствора добавляли в планшеты и инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 2 часов. В 96-луночные планшеты добавляли козье анти-крысиное IgG-HRP и инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 1 часа, затем промывали и считывали OD при 450 нм.

4.3 ELISA скрининг блокирования связывания человеческого TSLP-His с химерным рецептором IL7Rα-TSLPR-hFc

В соответствии со следующей схемой, гибридомный супернатант или очищенное антитело анализировали на блокирование связывания человеческого TSLP-His с химерным рецептором IL7Rα-TSLPR-hFc.

Растворимый hIL7Rα-hTSLPR-hFc белок разбавляли в 1xCBS покрывающем буфере, затем добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 4°C. 96-луночный планшет промывали PBST и блокировали блокирующим раствором (PBS+2% BSA) при 37°C в течение 2 часов. hTSLP-His белок (+/-), рекомбинантно экспрессированный клетками млекопитающего, добавляли в планшеты вместе с гибридомным супернатантом или таким же объемом блокирующего раствора и инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 2 часов. В 96-луночные планшеты добавляли мышиное анти-His-HRP и инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 1 часа, затем промывали и считывали OD при 450 нм. Гибридомы с высоким процентом ингибирования отбирали в качестве клонов-кандидатов.

В соответствии с активностями, определенными аффинным анализом ELISA и конкурентным анализом ELISA, описанными выше, положительные клоны отбирали и субклонировали методом ограниченного разведения с получением субклонов. В завершение, были получены субклоны гибридом, которые могут связываться с обоими человеческим TSLP-His и обезьяньим TSLP-His, а также блокировать связывание человеческого TSLP-His с химерным рецептором hIL7Rα-hTSLPR-hFc. Как показано в Таблице 1, пять отдельных клонов обладали сильной связывающей способностью как в отношении человеческого TSLP (hTSLP), так и TSLP обезьяны (cTSLP), а также блокировали способность связывания человеческого TSLP с его рецептором hIL7Rα-hTSLPR-hFc, с процентом ингибирования, превышающим 60%.

Таблица 1
Скрининг анти-TSLP субклона гибридом Клон Связывание hTSLP (OD450) Связывание cTSLP (OD450) Процент ингибирования hTSLP/hIL7Rα-hTSLPR-hFc (%) 25A5C5 2,4 0,12 95,9 27C2B6 1,4 1,11 69,8 37C2D10 1,1 1,12 81,0 43B1A8 1,92 1,11 80,7 90H3H11 0,7 1,02 87,0

Пример 5: Получение химерного анти-TSLP антитела

Экспрессия контрольного антитела: последовательность контрольного антитела относится к базе данных chEMBL (ID: CHEMBL3707229). Последовательности оснований тяжелой и легкой цепей контрольного антитела синтезировали в pTT5 векторе экспрессии и транзиентно трансфицировали и экспрессировали в клетках CHO-S (приобратенных у Thermo) с последующей аффинной очисткой с использованием белка A (MabSelect SuRe, GE) с получением контрольного антитела.

Отдельные клоны гибридом культивировали в бессывороточной среде с получением 50 мл супернатанта, затем осуществляли очистку с использованием Белка A (MabSelect SuRe, GE) с получением химерных антител из гибридом. Поскольку константная область мышиного антитела H2L2 была генетически модифицирована в крысиную константную область, полученное очищенное антитело представляло собой химерное антитело с полностью человеческими вариабельными областями, несущее крысиную Fc. Очищенные антитела подвергали количественному анализу методом спектрофотометрии с получением химерных антител 25A5C5, 27C2B6, 37C2D10, 43B1A8 и 90H3H11.

Пример 6: Определение аффинности химерных анти-TSLP антител в отношении TSLP методом ELISA

Аффинность химерных антител 25A5C5, 27C2B6, 37C2D10, 43B1A8 и 90H3H11 в отношении TSLP человека или обезьяны анализировали методом ELISA. Конкретный способ представлял собой следующий: покрытие 96-луночных планшетов человеческим или обезьяньим TSLP-His антигеном, после выдерживания в течение ночи при 4°C добавление антитела, разбавленного разными градиентами концентраций, соответственно, после инкубации в течение 2 часов добавление козьего анти-крысиного Fc-HRP вторичного антитела, и после инкубации в течение 1 часа считывание значения поглощения при длине волны 450 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов.

Результаты показаны в Таблице 2, где каждое из химерных антител 25A5C5 и 27C2B6 имело аффинность к человеческому TSLP, по существу сопоставимую с контрольным антителом, тогда как антитела 43B1A8 и 90H3H11 каждое имело более высокую аффинность к человеческому TSLP, чем у контрольного антитела. У антител 25A5C5 и 90H3H11 отсутствовало связывание с TSLP обезьяны; тогда как каждое из 37C2D10, 27C2B6 и 43B1A8 сильно связывалось с TSLP обезьяны.

Таблица 2
Аффинность химерного анти-TSLP антитела в отношении TSLP Антитело Связывание hTSLP
EC50 (нМ) Связывание cTSLP
EC50 (нМ) 25A5C5 0,208 Отсутствие связывания 27C2B6 0,221 0,216 37C2D10 0,300 0,495 43B1A8 0,115 0,568 90H3H11 0,139 >100 Контрольное антитело 0,233 0,336

Пример 7: Определение активности химерного анти-TSLP антитела, направленной на блокирование TSLP/hIL7Rα-hTSLPR-hFc связывания, конкурентным анализом ELISA

Человеческий TSLP связывается с человеческим hIL7Rα-hTSLPR-hFc гетеродимерным рецептором для активации нисходящих сигнальных путей. Конкурентный анализ ELISA применяли для анализа активности химерного антитела, направленной на блокирование связывания химерного рецептора hIL7Rα-hTSLPR-hFc с антигеном. Конкретные стадии относятся к Примеру 4.3, градиентно-разведенные химерные антитела добавляли в планшет. Результаты показаны в Таблице 3, где все 5 химерных антител эффективно блокировали связывание человеческого TSLP с человеческим hIL7Rα-hTSLPR-hFc гетеродимерным рецептором.

Таблица 3
Активность химерного анти-TSLP антитела, определенная конкурентным анализом ELISA Антитело 25A5C5 27C2B6 37C2D10 43B1A8 90H3H11 Контрольное антитело IC50 (нМ) 0,89 0,77 0,51 1,33 1,65 0,93

Пример 8: Ингибирующее действие химерного анти-TSLP антитела на пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток

Активность химерного анти-TSLP антитела определяли по ингибированию пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток. Рецепторные белки hTSLPR и hIL7Rα экспрессировали на клеточной поверхности Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα, где димер внеклеточных доменов этих двух рецепторных белков может связываться с человеческим TSLP, а их внутриклеточные домены могут осуществлять дальнейшую передачу сигнала для активации фосфорилирования внутриклеточного STAT5 и промотирования пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Конкретные стадии представляли собой следующие: взятие подходящего количества стабильной клеточной линии Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα для центрифугирования и промывки культуральной средой 1640+10% FBS 2 раза для удаления рекомбинантного мышиного IL3 в культуральной среде; инкубирование hTSLP-His (+/-) вместе с очищенным химерным анти-TSLP антителом/или контрольным анти-TSLP антителом (Контрольное антитело) в каждой лунке при комнатной температуре в течение 30 минут; добавление 1,5×10⁴ Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток на лунку и инкубирование в течение 3 дней; добавление CCK8 (RHINO BIO, QDY-003-D) в каждую лунку и считывание OD при 450 нм, экспортирование данных и анализ ингибирующего действия химерного антитела на клеточную пролиферацию с использованием программы Prism Graphpad.

Как показано на Фиг. 2A-2C и в Таблице 4, все 5 химерных антител явно ингибировали пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток.

Таблица 4
Анализ активности химерного антитела, направленной на блокирование индуцированной человеческим TSLP пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток Антитело 25A5C5 27C2B6 37C2D10 43B1A8 90H3H11 Контрольное антитело EC50 (нМ) 0,11 1,22 0,28 0,10 0,25 0,05

Пример 9: Амплификация вариабельных областей химерного анти-TSLP антитела

Гибридомные клетки культивировали до около 2×10⁶, лизировали с использованием реагента TRIzol (Thermo Fisher Sci. Cat # 15596026) для экстрагирования РНК, затем использовали набор для обратной транскрипции кДНК (Thermo Fisher Sci. Cat # 18080-200) для синтеза первой цепи кДНК. Со ссылкой на методы IMGT и AbM, а также на анализ последовательностей всех мышиных антител, несколько пар прямых праймеров для вариабельных областей были сконструированы путем выбора областей с высокой гомологией, обратные праймеры были сконструированы с использованием гомологичной последовательности CH1, и вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител были получены ПЦР-амплификацией с пулом праймеров, а продукт ПЦР был очищен с использованием набора для очистки ДНК (Qiagen, кат. № 28104) и клонирован в вектор pTT-5, было отобрано около 10 клонов для секвенирования в каждой реакции лигирования для получения последовательностей вариабельных областей, которые затем анализировали при помощи баз данных IMGT и AbM.

Таблица 5
Аминокислотные последовательности и NO вариабельных областей и CDR химерных антител против человеческого TSLP Клон 25A5C5 27C2B6 37C2D10 43B1A8 90H3H11 Вариабельная область тяжелой цепи 1 17 30 40 53 Вариабельная область легкой цепи 2 18 31 41 54 Система нумерации IMGT AbM IMGT AbM IMGT AbM IMGT AbM IMGT AbM CDR1 тяжелой цепи 3 9 19 25 32 36 42 48 55 61 CDR2 тяжелой цепи 4 10 20 26 33 37 43 49 56 62 CDR3 тяжелой цепи 5 11 21 27 34 38 44 50 57 63 CDR1 легкой цепи 6 12 22 28 35 39 45 51 58 64 CDR2 легкой цепи 7 13 23 29 23 29 46 52 59 65 CDR3 легкой цепи 8 8 24 24 24 24 47 47 60 60

Пример 10: Экспрессия, очистка и определение аффинности связывания рекомбинантного антитела

Аминокислотные последовательности вариабельных областей легких цепей 25A5C5, 27C2B6, 37C2D10, 43B1A8 и 90H3H11 сливали с аминокислотной последовательностью константной области легкой κ-цепи (SEQ ID NO:16), соответственно, и аминокислотные последовательности вариабельных областей их тяжелых цепей сливали с аминокислотной последовательностью константной области тяжелой цепи IgG1 (SEQ ID NO:14), соответственно, и нуклеотидные последовательности, соответствующие этим последовательностям, встраивали в векторы pTT5. Векторы pTT5, соответствующие тяжелым и легким цепям каждого рекомбинантного полностью человеческого антитела, одновременно трансфицировали в CHO-S (приобратенные у Thermo), супернатант очищали с использованием Белка A (MabSelect SuRe, GE), и очищенные рекомбинантные полностью человеческие антитела были названы как 25A5C5-hIgG, 27C2B6-hIgG, 37C2D10-hIgG, 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG, соответственно, где каждое подвергали количественному анализу методом спектрофотометрии для определения концентрации белка.

Определение аффинности рекомбинантных полностью человеческих анти-TSLP антител в отношении экспрессируемого млекопитающим рекомбинантного человеческого или обезьяньего TSLP-His. Конкретные экспериментaльные стадии можно кратно описать следующим образом: покрытие 96-луночных планшетов человеческим TSLP-His или обезьяньим TSLP-His антигеном, после выдерживания в течение ночи при 4°C добавление серийно разведенных антител, соответственно, после инкубации в течение 2 часов добавление HRP-меченного вторичного антитела, козьего против человеческого Fc, и после инкубации в течение 1 часа считывание при длине волны 450 нм.

Результаты показаны на Фиг. 3A-3B, где все 5 антител-кандидатов могут связываться с человеческим TSLP. Также, как показано в Таблице 6, 37C2D10-hIgG, 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG каждое имело более высокую аффинность к hTSLP, чем у контрольного антитела. 25A5C5-hIgG и 27C2B6-hIgG каждое имело аффинность к hTSLP, сопоставимую с контрольным антителом. 27C2B6-hIgG, 37C2D10-hIgG и 43B1A8-hIgG каждое имело аффинность к TSLP обезьяны, сопоставимую с контрольным антителом.

Таблица 6
Связывание рекомбинантных полностью человеческих антител с TSLP человека/обезьяны Антитело 25A5C5-hIgG 27C2B6-hIgG 37C2D10-hIgG 43B1A8-hIgG 90H3H11-hIgG Контрольное антитело Связывание hTSLP EC50 (нМ) 1,45 1,62 0,90 0,80 1,36 1,40 Связывание cTSLP EC50 (нМ) Отсутствие связывания 0,18 0,17 0,23 >100 0,19

Пример 11: Определение динамической аффинности анти-TSLP полностью человеческого антитела в отношении TSLP

Динамическую аффинность анти-TSLP полностью человеческого химерного антитела в отношении TSLP определяли с использованием Fortebio, обычно используемого устройства для определения динамической аффинности. Способ можно кратно описать следующим образом: осуществление серийных разведений человеческого или обезьяньего TSLP с использованием PBST с получением 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 мкМ, 6,25 нМ, 3,125 нМ, 1,5625 нМ и 0 нМ; предварительное смачивание ProA биосенсора (Pall Life Sciences) PBST буфером перед использованием; разведение рекомбинантного полностью человеческого антитела до 5мкг/мл с использованием PBST и иммобилизация на ProA сенсоре; затем помещение сенсора с иммобилизованным антителом в PBST буфер для уравновешивания в течение 60сек для получения исходного уровня и перенос в разведение антигена для связывания в течение 60сек, а затем диссоциация в PBST в течение 180сек; восстановление сенсора с использованием 10 мМ Gly (pH 1,5) после цикла анализа. Анализ данных, версия 11.0 (Pall), с моделью 1:1 использовали для определения константы скорости ассоциации (Ka) и константы скорости диссоциации (Kd), которые затем использовали для расчета равновесной константы диссоциации (KD).

Как показано в Таблице 7, KD значения связывания 25A5C5-hIgG, 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG с человеческим TSLP были меньше, чем у контрольного антитела, показывая более сильную аффинность, что согласовывалось с результатами аффинного анализа ELISA. Что касается связывания с TSLP обезьяны, 25A5C5-hIgG не обладало никакой аффинностью; тогда как каждое из 37C2D10-hIgG, 90H3H11-hIgG и 43B1A8-hIgGIt показало хорошее связывание с аффинностью порядка 10^-8 M - 10^-9 M.

Таблица 7
Анализ динамической аффинности полностью человеческих антител Антитело Аффинность к hTSLP
KD (M) Аффинность к cTSLP
KD (M) 25A5C5-hIgG 5,58E-10 Отсутствие связывания 37C2D10-hIgG 1,76E-09 2,01E-08 43B1A8-hIgG 5,81E-10 1,02E-09 90H3H11-hIgG 6,04E-10 1,08E-08 Контрольное антитело 8,00E-10 1,15E-09

Пример 12: Ингибирующее действие рекомбинантных полностью человеческих антител на пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7α клеток

Активность рекомбинантного полностью человеческого антитела оценивали способом ингибирования пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7α клеток. Этот способ относится к предшествующему Примеру 8.

Результаты показаны в Таблице 8, где 27C2B6-hIgG и 37C2D10-hIgG могут ингибировать индуцированную человеческим TSLP пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток; 25A5C5-hIgG и 90H3H11-hIgG были по существу сопоставимы с контрольным антителом, что касается ингибирования индуцированной человеческим TSLP пролиферации Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток; тогда как 43B1A8-hIgG имело значительно более сильную (примерно в 0,25 раз) ингибиторную активность, чем у контрольного антитела, как показано на Фиг. 4A-C.

Таблица 8
Ингибирующее действие рекомбинантных полностью человеческих антител на пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток Антитело hTSLP
EC50(нМ) 25A5C5-hIgG 0,044 27C2B6-hIgG 0,064 37C2D10-hIgG 0,060 43B1A8-hIgG 0,031 90H3H11-hIgG 0,050 Контрольное антитело 0,041

Пример 13: Определение ингибирующей активности рекомбинантного полностью человеческого антитела в отношении индуцированной человеческим TSLP секреции клетками PBMC хемокинов, регулируемых тимусом и активацией (TARC).

Функциональную активность полностью человеческого анти-TSLP антитела в первичных клетках оценивали по ингибированию индуцированной человеческим TSLP секреции TARC (Th2-подобный цитокин) человеческими клетками PBMC. CD11+ DC клетки содержались в клетка PBMC и исследования показали, что TSLP может связываться с рецептором TSLPR/IL7Rα и активировать CD11⁺ DC клетки, положительно регулировать OX40L и промотировать CD11⁺ DC клетки для секреции Th2-подобных цитокинов (например, TARC и CCL22). Анти-TSLP антитела могут блокировать связывание TSLP с TSLPR/IL7Rα на поверхности DC клеток, таким образом блокируя активацию DC клеток и секрецию Th2-подобных цитокинов DC клетками.

Способ можно кратно описать следующим образом: выделение PBMC периферической крови человека с использованием раствора для Ficoll-разделения (GE), инкубирование hTSLP-His (+/-) вместе с рекомбинантными полностью человеческими антителами или контрольным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре, и добавление 2×10⁵ PBMC клеток на ячейку, инкубирование в течение 48 часов. Супернатант собирали и анализировали методом ELISA на человеческий TARC, и анализировали ингибирующее действие гибридомного супернатанта или очищенного антитела на секрецию TARC. TARC ELISA набор (Sino Biological) использовали для определения уровня TARC в супернатанте.

Результаты показаны в Таблице 9 и на Фиг. 5, где EC50 значения полностью человеческих антител 43B1A8-hIgG и 90H3H11-hIgG были ниже, чем у контрольного антитела, показывая, что их активность ингибирования TSLP-индуцированной секреции TARC клетками PBMC была более высокой, чем у контрольного антитела.

Таблица 9
Ингибирующее действие рекомбинантного полностью человеческого антитела на индуцированную человеческим TSLP секрецию TARC клетками PBMC Антитело 43B1A8-hIgG 90H3H11-hIgG Контрольное антитело EC50(нМ) 0,44 0,42 0,51

Пример 14: Анализ значения Т.пл. рекомбинантного полностью человеческого антитела

Значение Т.пл. анти-TSLP антитела измеряли методом DSF (дифференциальной сканирующей флуорометрии). Конкретные экспериментaльные стадии представляли собой следующие: смешивание 12,5 мкл 40× SYPRO Оранжевого красителя (Life Technologies Co., Ltd., Cat No. 56651), 5мкл 1 мг/мл полностью человеческого анти-TSLP антитела (разведение в PBS) и 7,5мкл стерильной воды в EP пробирке, добавление смеси образца в Q-ПЦР систему (AB Applied Biosystems ABI, 7500) для реакции, установка параметров Q-ПЦР: Мишень (ROX), программа (25°C, 3 мин; скорость 1%, 95°C; 95°C, 2 мин). Результаты вводили в программу Graph Prism для расчета V50 значения. Как показано на Фиг. 6 и в Таблице 10, значения Т.пл. 43B1A8-hIgG (74,72°C) и 90H3H11-hIgG (72,58°C) были выше, чем у контрольного антитела (66,47°C), ясно показывая, что полностью человеческие антитела, полученные в соответствии с изобретением, имели лучшую термостабильность.

Таблица 10
Значение Т.пл. рекомбинантного полностью человеческого анти-TSLP антитела Антитело Контрольное антитело 43B1A8-hIgG 90H3H11-hIgG Т.пл.(°C) 66,47 74,72 72,58

Пример 15: Анализ гидрофобности рекомбинантного полностью человеческого антитела

Сравнение гидрофобности осуществляли на системе ВЭЖХ Agilent 1260, объединенной с хроматографической колонкой TOSOH Tskgel Buty-NPR (2.5). Для сравнения разницы в гидрофобности трех антител эти три антитела непосредственно загружали для анализа. Подвижная фаза A: 1,5M (NH₄)₂SO₄; подвижная фаза B: 25мМ Na₂HPO₄ (pH7,0) +25% IPA. Время удерживания для трех антител показано в Таблице 11, где большее время удерживания означает более сильную гидрофобность антитела, 90H3H11-hIgG имело гидрофильность, сопоставимую с гидрофильностью контрольного антитела; 43B1A8-hIgG имело лучшую гидрофильность по сравнению с контрольным антителом, и это означает, что развитие процесса и агрегация антител будут лучше, чем в случае контрольного антитела.

Таблица 11
Определение гидрофобности рекомбинантного полностью человеческого антитела Антитело Контрольное антитело 43B1A8-hIgG 90H3H11-hIgG Время удерживания (минуты) 13,93 12,2 13,61

Пример 16: Получение рекомбинантных модифицированных полностью человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2

Период полужизни антитела in vivo тесно связан с его изоэлектрической точкой, аффинностью к FcRn, модификацией гликозилирования и иммуногенностью. Для продления периода полужизни антитела 43B1A8-hIgG повышали аффинность к FcRn путем модификации аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи антитела.

Схема модификации 1: hIgG1 Fc (SEQ ID NO:14) заменяли на IgG4 (SEQ ID NO:70), содержащий 2 аминокислотные мутации, из которых одна представляла собой мутацию из N в A в аминокислотном положении 434 (система нумерации ЕС), а другая из S в P в аминокислотном положении 228 (система нумерации ЕС) IgG4.

Схема модификации 2: N заменяли на A в аминокислотном положении 434 (система нумерации ЕС) hIgG1 Fc (SEQ ID NO:14) с получением SEQ ID NO:15; и мутация R в G в положении 16 (система нумерации Chothia) FR1 тяжелой цепи 43B1A8-hIgG; и мутация R в Q в положении 79 (система нумерации Chothia) FR3 легкой цепи 43B1A8-hIgG.

Антитела, полученные в соответствии с описанными выше схемами модификаций 1 и 2, были названы 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2, соответственно.

Последовательность вариабельной области тяжелой цепи 43B1-H2L2 представляет собой SEQ ID NO:68; последовательность константной области тяжелой цепи указанного антитела представляет собой SEQ ID NO:15; последовательность вариабельной области легкой цепи указанного антитела представляет собой SEQ ID NO:69; и последовательность константной области легкой цепи указанного антитела представляет собой SEQ ID NO:16.

Последовательность вариабельной области тяжелой цепи 43B1-H6L1 представляет собой SEQ ID NO:40; последовательность константной области тяжелой цепи указанного антитела представляет собой SEQ ID NO:70; последовательность вариабельной области легкой цепи указанного антитела представляет собой SEQ ID NO:41; и последовательность константной области легкой цепи указанного антитела представляет собой SEQ ID NO:16.

Таблица 12
Аминокислотные последовательностиантител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 и NO (SEQ ID NO) Антитело Тяжелая цепь Вариабельная область тяжелой
цепи Константная область тяжелой цепи Легкая цепь Вариабельная область легкой цепи Константная область легкой цепи 43B1A8-hIgG 66 40 14 67 41 16 43B1-H2L2 71 68 15 72 69 16 43B1-H6L1 73 40 70 67 41 16

Тяжелые и легкие цепи вышеуказанных двух модифицированных молекул 43B1-H2L2 и 43B1-H6L1 встраивали в векторы экспрессии pTT5, соответственно, и после извлечения плазмид их трансфицировали в CHO-S клетки (приобратенные у Thermo), после культивирования примерно в течение 10 дней клеточный супернатант очищали с использованием Белка A (MabSelect SuRe, GE) и очищенные рекомбинантные полностью человеческие антитела подвергали количественному анализу методом спектрофотометрии для определения содержания белка.

Пример 17: Анализ динамической аффинности рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 в отношении TSLP

Динамическую аффинность полностью человеческого анти-TSLP антитела в отношении TSLP определяли при помощи Fortebio. Способ относится к предшествующему Примеру 11. Результаты показаны в Таблице 13, где каждая из молекул человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 имела динамическую аффинность в отношении hTSLP не ниже, чем у контрольного антитела.

Таблица 13
Анализ динамической аффинности молекул модифицированных полностью человеческих антител Антитело Аффинность к hTSLP
KD (M) 43B1-H2L2 2,33E-10 43B1-H6L1 4,19E-10 Контрольное антитело 3,73E-10

Пример 18: Анализ изоэлектрических точек (PI) рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2

Изоэлектрические точки 43B1-H6L1, 43B1-H2L2 и 43B1A8-hIgG антител определяли методом изоэлектрического фокусирования, который можно кратно описать следующим образом: Для анализа использовали систему изоэлектрического фокусирования Maurice (ProteinSimple), объединенную с картриджем для капиллярного электрофореза. Для сравнения разницы изоэлектрических точек трех антитела эти три антитела разбавляли водой и создавали градиент pH с использованием амфолита 3-10 (GE) при конечной концентрации 4% в системе детекции. Результаты показаны в Таблице 14, где изоэлектрические точки 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 были ниже, чем у 43B1A8-hIgG на 1,3 и 0,4, соответственно, показывая, что схемы модификации были успешными.

Таблица 14
Сравнение изоэлектрических точек (PI) рекомбинантных полностью человеческих антител Антитело 43B1-H2L2 43B1-H6L1 43B1A8-hIgG Изоэлектрическая точка 8,2 7,3 8,6

Пример 19: Анализ динамической аффинности рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 в отношении FcRn

Динамическую аффинность модифицированных полностью человеческих анти-TSLP антител в отношении FcRn определяли при помощи Fortebio. Способ можно кратно описать следующим образом: осуществление серийных разведений анти-TSLP антитела с использованием PBST (pH 6,0) с получением 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 мкМ, 6,25 нМ, 3,125 нМ и 1,5625 нМ и 0 нМ; предварительное смачивание SA биосенсора (Pall Life Sciences) PBST (pH 6,0) буфером перед использованием; разведение биотин-меченного FcRn до 2,3 мкг/мл и иммобилизация на SA сенсоре; затем помещение сенсора с иммобилизованным FcRn в PBST (pH 6,0) буфер для уравновешивания в течение 60сек с получением исходного уровня и перенос в содержащий антитело разбавитель для связывания в течение 60сек и затем диссоциации в PBST (pH 6,0) в течение 60сек; восстановление сенсора с использованием PBST (pH 7,4) после цикла анализа. Анализ данных, версия 11.0 (Pall), с использованием 1:1 модели использовали для определения константы скорости ассоциации (Ka) и константы скорости диссоциации (Kd), которые затем использовали для расчета равновесной константы диссоциации (KD).

Как показано в Таблице 15, 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 каждое имело динамическую аффинность (KD) к FcRn меньше, чем у контрольного антитела, показывая разницу в аффинности к FcRn примерно в 2 раза по сравнению с контрольным антителом.

Таблица 15
Анализ динамической аффинности модифицированного полностью человеческого антитела в отношении FcRn Антитело Аффинность к FcRn
KD(M) 43B1-H2L2 5,25E-09 43B1-H6L1 4,23E-09 Контрольное антитело 1,12E-08

Пример 20: Анализ ингибирующего действия рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 на пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток

Активность рекомбинантных полностью человеческих антител 43B1-H6L1 и 43B1-H2L2 определялм способом ингибирования пролифераци Ba/F3 клеток. Способ относится к предшествующему Примеру 8, и активность EC50 антитела анализировали на основании полученных данных. Результаты показаны в Таблице 16 и на Фиг. 7A и 7B, которые показывают, что 43B1-H2L2 и 43B1-H6L1 могут ингибировать индуцированную человеческим TSLP пролиферацию Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα клеток, и их EC50 значения сопоставимы со значением контрольного антитела, показывая, что каждое из полностью человеческих антител 43B1-H2L2 и 43B1-H6L1 имело сопоставимую способность ингибирования клеточной активности TSLP.

Таблица 16
Ингибирующее действие рекомбинантного полностью человеческого антитела на пролиферацию клеток Ba/F3-hTSLPR-hIL7Rα 43B1-H2L2 43B1-H6L1 Контрольное антитело hTSLP
EC50 (нМ) 0,64 0,46 0,57

Пример 21: Определение ингибирующего действия рекомбинантного полностью человеческого антитела на индуцированную человеческим TSLP секрецию макрофагальных хемокинов (MDC) клетками PBMC.

Функциональную активность полностью человеческих анти-TSLP антител в первичных клетках оценивали по ингибированию индуцированной человеческим TSLP секреции MDC человеческими клетками PBMC. PBMC включают DC клетки. Исследования показали, что TSLP может связываться с рецептором TSLPR/IL7Rα на клеточной поверхности и активировать DC клетки, положительно регулировать OX40L и промотировать DC клетки для секреции Th2-подобных цитокинов (например, TARC и MDC). Анти-TSLP антитела могут блокировать связывание TSLP с TSLPR/IL7Rα на поверхности DC клеток, блокируя таким образом активацию DC клеток и секрецию Th2-подобных цитокинов клетками DC.

Способ можно кратно описать следующим образом: выделение PBMC клеток периферической крови человека с использованием раствора для Ficoll-разделения (GE), инкубирование hTSLP-His (+/-)вместе с рекомбинантными полностью человеческими антителами или контрольным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре, и добавление 2×10⁵ PBMC клеток на ячейку и инкубирование в течение 120 часов. Супернатант собирали и анализировали методом ELISA на продукцию человеческих MDC, и измеряли ингибирование антителом секреции MDC. MDC ELISA набор (Raybiotech) использовали для определения TARC уровня в супернатанте.

Результаты показаны в Таблице 17 и на Фиг. 8, которые показывают, что 43B1-H2L2 и контрольное антитело могут существенно ингибировать TSLP-индуцированную продукцию MDC, с EC50 значениями 7,84 пМ и 5,63 пМ, соответственно.

Таблица 17
Ингибирующее действие рекомбинантного полностью человеческого антитела на индуцированную человеческим TSLP секрецию MDC клетками PBMC Антитело 43B1-H2L2 Контрольное антитело EC50 (пМ) 7,84 5,63

Пример 22: Фармакокинетический анализ in vivo рекомбинантного полностью человеческого антитела у обезьяны cynomolgus

Последовательность молекулы-кандидата 43B1-H2L2 по настоящему изобретению содержит N434A мутацию для влияния на ее аффинность к FcRn, тем самым продлевая период ее полужизни при метаболизме лекарственного средства in vivo. Поэтому в этом примере фармакокинетику 43B1-H2L2 молекулы у обезьяны cynomolgus in vivo исследовали при введении путем подкожной инъекции и сравнивали с контрольным антителом. Способы и результаты представляли собой следующие: отбирали четырех обезьян cynomolgus (Macaca fascicularis, приобретенные у Hainan Jingang Biotech Co., Ltd.) и делили на две группы, по одной мужской и одной женской особи на группу. Доза подкожной инъекции составляла 5 мг/кг. Образцы крови собирали в момент времени ноль, через 5 минут, 30 минут, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 35 дней, 42 дня, 49 дней и 56 дней после введения, оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа до коагуляции и центрифугировали с получением образцов сыворотки для исследования, которые затем замораживали при -80°C. Концентрацию антитела в сыворотке определяли методом ELISA и результаты анализировали как описано далее: фармакокинетические параметры и кривые однократного подкожного введения показаны в Таблице 18 и на Фиг. 9. Эти результаты показали, что 43B1-H2L2 антитело имело больший период полужизни, а также более высокую AUC концентрации в крови, почти в два раза, по сравнению с контрольным антителом.

Таблица 18
Фармакокинетическое исследование рекомбинантного полностью человеческого антитела у обезьяны cynomolgus при подкожном введении PK параметры t_1/2(ч) T_max (ч) C_max (нг/мл) AUC_(0-t) (ч*нг/мл) 43B1-H2L2 549,3731 48 67373,4 47271741 Контрольное антитело 267,3537 72 75870,56 25600470

Хотя были подробно описаны конкретные варианты осуществления изобретения, специалистам в данной области должно быть понятно, что возможны различные модификации и изменения деталей в соответствии со всеми опубликованными руководствами, которые также включены в объем изобретения. Объем защиты изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СЫЧУАНЬ КЭЛУНЬ-БАЙОТЕК БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.

ХАРБОР БАЙОМЕД (СУЧЖОУ) КО., ЛТД.

<120> Анти-TSLP антитело и его применение

<130> P2020TC1327

<150> CN201911278628.7

<151> 2019-12-13

<160> 75

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела 25A5C5

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Val Val Gly Ala Pro Asp Thr Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела 25A5C5

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 25A5C5 CDR-H1

<400> 3

Arg Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 25A5C5 CDR-H2

<400> 4

Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys

1 5

<210> 5

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 25A5C5 CDR-H3

<400> 5

Ala Arg Asp Arg Val Val Gly Ala Pro Asp Thr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 6

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 25A5C5 CDR-L1

<400> 6

Gln Asp Ile Ser Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 25A5C5 CDR-L2

<400> 7

Asp Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT/ AbM 25A5C5 CDR-L3

<400> 8

Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 25A5C5 CDR-H1

<400> 9

Arg Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Met Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 25A5C5 CDR-H2

<400> 10

Asn Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 25A5C5 CDR-H3

<400> 11

Asp Arg Val Val Gly Ala Pro Asp Thr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 25A5C5 CDR-L1

<400> 12

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 25A5C5 CDR-L2

<400> 13

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1 5

<210> 14

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированная константная область тяжелой цепи IgG1 человека

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 15

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированная константная область тяжелой цепи IgG1 человека

<400> 15

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 16

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область κ легкой цепи

<400> 16

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 17

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела 27C2B6

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Asp His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела 27C2B6

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Cys Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 27C2B6 CDR-H1

<400> 19

Gly Asp Ser Ile Ser Asn Tyr Asn Trp

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 27C2B6 CDR-H2

<400> 20

Ile Tyr His Ser Gly Arg Thr

1 5

<210> 21

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 27C2B6 CDR-H3

<400> 21

Ala Arg Asp Ala Pro Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Asp His

1 5 10 15

<210> 22

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 27C2B6 CDR-L1

<400> 22

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 27C2B6 CDR-L2/37C2D10 CDR-L2

<400> 23

Leu Gly Ser

1

<210> 24

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT/AbM 27C2B6 CDR-L3 / IMGT/AbM 37C2D10 CDR-L3

<400> 24

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 27C2B6 CDR-H1

<400> 25

Gly Asp Ser Ile Ser Asn Tyr Asn Trp Trp Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 27C2B6 CDR-H2

<400> 26

Glu Ile Tyr His Ser Gly Arg Thr Asn

1 5

<210> 27

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 27C2B6 CDR-H3

<400> 27

Asp Ala Pro Ser Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Asp His

1 5 10

<210> 28

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 27C2B6 CDR-L1

<400> 28

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 29

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 27C2B6 CDR-L2/37C2D10 CDR-L2

<400> 29

Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser

1 5

<210> 30

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела 37C2D10

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Asp

20 25 30

Asn Trp Trp Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Phe His Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Pro Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела 37C2D10

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Glu Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asp Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 37C2D10 CDR-H1

<400> 32

Gly Asp Ser Ile Ser Ser Asp Asn Trp

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 37C2D10 CDR-H2

<400> 33

Ile Phe His Ser Gly Arg Thr

1 5

<210> 34

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 37C2D10 CDR-H3

<400> 34

Ala Arg Asp Ala Pro Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 37C2D10 CDR-L1

<400> 35

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Glu Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 37C2D10 CDR-H1

<400> 36

Gly Asp Ser Ile Ser Ser Asp Asn Trp Trp Asn

1 5 10

<210> 37

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 37C2D10 CDR-H2

<400> 37

Glu Ile Phe His Ser Gly Arg Thr Asn

1 5

<210> 38

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 37C2D10 CDR-H3

<400> 38

Asp Ala Pro Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 37C2D10 CDR-L1

<400> 39

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Glu Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 40

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела

43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1

<400> 40

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела

43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1

<400> 41

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H1

<400> 42

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Asp

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H2

<400> 43

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu

1 5

<210> 44

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H3

<400> 44

Ala Arg Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 45

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L1

<400> 45

Gln Ser Val Ser Ser Asn

1 5

<210> 46

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L2

<400> 46

Gly Ala Ser

1

<210> 47

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT/ AbM 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L3

<400> 47

Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 48

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H1

<400> 48

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Asp Met His

1 5 10

<210> 49

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H2

<400> 49

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asn

1 5 10

<210> 50

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-H3

<400> 50

Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 51

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L1

<400> 51

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 52

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 43B1A8/43B1A8-hIgG/43B1-H6L1/43B1-H2L2 CDR-L2

<400> 52

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 53

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи антитела 90H3H11

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn His

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Ala Asp Tyr Val Tyr Phe His His Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела 90H3H11

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 90H3H11 CDR-H1

<400> 55

Gly Phe Thr Ile Ser Asn His Asp

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 90H3H11 CDR-H2

<400> 56

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln

1 5

<210> 57

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 90H3H11 CDR-H3

<400> 57

Ala Arg Asp Asp Tyr Ala Asp Tyr Val Tyr Phe His His

1 5 10

<210> 58

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 90H3H11 CDR-L1

<400> 58

Gln Asn Ile Asn Ser Tyr

1 5

<210> 59

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT 90H3H11 CDR-L2

<400> 59

Ala Ala Ser

1

<210> 60

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IMGT/ AbM 90H3H11 CDR-L3

<400> 60

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 61

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 90H3H11 CDR-H1

<400> 61

Gly Phe Thr Ile Ser Asn His Asp Ile His

1 5 10

<210> 62

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 90H3H11 CDR-H2

<400> 62

Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 90H3H11 CDR-H3

<400> 63

Asp Asp Tyr Ala Asp Tyr Val Tyr Phe His His

1 5 10

<210> 64

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 90H3H11 CDR-L1

<400> 64

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 65

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> AbM 90H3H11 CDR-L2

<400> 65

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 66

<211> 453

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь 43B1A8-hIgG

<400> 66

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240

Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 67

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь 43B1A8-hIgG/43B1-H6L1

<400> 67

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 68

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH 43B1-H2L2

<400> 68

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL 43B1-H2L2

<400> 69

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 70

<211> 327

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная константная область тяжелой цепи IgG4 человека

<400> 70

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 71

<211> 453

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь 43B1-H2L2

<400> 71

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240

Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 72

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь 43B1-H2L2

<400> 72

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 73

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь 43B1-H6L1

<400> 73

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Leu Trp Tyr Gly Glu Pro Asp Asp Ala Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

195 200 205

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

210 215 220

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 74

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область IgG1 человека

<400> 74

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 75

<211> 327

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи IgG4 человека

<400> 75

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое связывается с тимусным стромальным лимфопоэтином (TSLP), к конъюгату, биспецифическому антителу, фармацевтической композиции и набору, его содержащим, а также к способу его получения. Также раскрыты выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанное антитело, а также клетка и вектор, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения или профилактики аллергического воспаления или аутоиммунного заболевания у больного, а также для детекции наличия или уровня TSLP в образце. 19 н. и 28 з.п. ф-лы, 9 ил., 18 табл., 22 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с тимусным стромальным лимфопоэтином (TSLP), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), как определено согласно системе нумерации IMGT:

(1a) VН содержит

определяющую комплементарность область (CDR)-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 42,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 43 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 44; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 45,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 46 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 47;

(1b) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 55,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 56 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 57; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 58,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 59 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 60;

(1с) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 3,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 4 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 5; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 6,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 7 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 8;

(1d) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 19,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 20 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 21; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 22,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 23 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 24; или

(1e) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 32,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 33 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 34; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 35,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 23 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 24; или

(2) VH и VL, как определено согласно системе нумерации AbM:

(2a) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 48,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 49 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 50; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 51,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 52 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 47;

(2b) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 61,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 62 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 63; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 64,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 65 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 60;

(2с) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 9,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 10 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 11; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 12,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 13 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 8;

(2d) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 25,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 26 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 27; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 28,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 29 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 24; или

(2e) VН содержит

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 36,

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID NO: 37 и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID NO: 38; и

VL содержит

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 39,

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID NO: 29 и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID NO: 24.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с TSLP человека и/или TSLP обезьяны.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(a) VH с последовательностью SEQ ID NO: 40 и

VL с последовательностью SEQ ID NO: 41;

(b) VH с последовательностью SEQ ID NO: 68 и

VL с последовательностью SEQ ID NO: 69;

(c) VH с последовательностью SEQ ID NO: 53 и

VL с последовательностью SEQ ID NO: 54;

(d) VH с последовательностью SEQ ID NO: 1 и

VL с последовательностью SEQ ID NO: 2;

(e) VH с последовательностью SEQ ID NO: 17 и

VL с последовательностью SEQ ID NO: 18;

(f) VH с последовательностью SEQ ID NO: 30 и

VL с последовательностью SEQ ID NO: 31;

(g) VH и VL, где VH имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с и/или VL имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с VH и VL в любом из (a)-(f); или

(h) VH и VL, где

VH имеет замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию; и/или

VL имеет замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот, или любую их комбинацию по сравнению с VH и VL в любом из (a)-(f);

где замена представляет собой консервативную замену.4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(a) константную область тяжелой цепи (CH) человеческого иммуноглобулина или ее вариант; и/или (b) константную область легкой цепи (CL) человеческого иммуноглобулина или ее вариант,

где вариант имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью дикого типа, из которой он происходит; альтернативно, вариант имеет замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот или любую их комбинацию по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой он происходит;

где замена представляет собой консервативную замену.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, где константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG, такую как константная область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5 или 6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 5-7, где константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа или лямбда легкой цепи.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 5-8, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область каппа легкой цепи человека.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 5-9, где константная область тяжелой цепи или ее вариант содержит:

(1) константную область тяжелой цепи IgG1 человека или ее вариант,

где вариант является мутированным по меньшей мере в одном из положений 234, 235, 237, 265, 297, 331, 329 и 434 в соответствии с системой нумерации ЕС, или

где вариант содержит по меньшей мере одну из следующих мутаций: L234A, L235A, D265A, N297A, L234F, L235E, P331S, P329G, N434A, N434Y, N434F, N434W, N434S, N434G, N434H и N434Q, или

где вариант содержит по меньшей мере одну из следующих мутаций: L234A, L235A, G237A и N434A; или

где IgG1 вариант содержит мутации L234A, L235A и G237A; или

где IgG1 вариант содержит мутации L234A, L235A, G237A и N434A; или (2) CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, или ее вариант,

где вариант содержит консервативные замены до 20 аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 14, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO:14; или

вариант содержит N297A и/или N434A в соответствии с системой нумерации ЕС, или

где вариант содержит N434A;

(3) CH с последовательностью SEQ ID NO: 15, или ее вариант,

где вариант содержит консервативные замены до 20 аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 15, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO: 15; или

(4) константную область тяжелой цепи IgG4 человека или ее вариант,

где вариант является мутированным по меньшей мере в одном из положений 228 и 434 в соответствии с системой нумерации ЕС; или

где вариант содержит S228P и/или N434A; илигде вариант содержит S228P и N434A; или

(5) CH с последовательностью SEQ ID NO: 70, или ее вариант,

где вариант содержит консервативные замены до 20 аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 70, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO: 70; и/или

где константная область легкой цепи, или ее вариант, содержит:

(6) константную область каппа легкой цепи; или

(7) константную область легкой цепи (CL) с последовательностью SEQ ID NO: 16, или ее вариант,

где вариант содержит консервативные замены до 20 аминокислот по сравнению с SEQ ID NO: 16, или имеющий идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с SEQ ID NO: 16; или

где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (CH) с последовательностью SEQ ID NO: 14 и константную область легкой цепи (CL) с последовательностью SEQ ID NO: 16; или

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (CH) с последовательностью SEQ ID NO: 15 и константную область легкой цепи (CL) с последовательностью SEQ ID NO: 16; или

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (CH) с последовательностью SEQ ID NO: 70 и константную область легкой цепи (CL) с последовательностью SEQ ID NO: 16; или

где мутация или замена придает антителу или его антигенсвязывающему фрагменту такое свойство, что они лишены ADCP, ADCC и/или CDC активности или имеют пониженную ADCP, ADCC и/или CDC активность по сравнению с соответствующим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, не содержащим указанную мутацию или замену.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, где антитело содержит:

(a) тяжелую цепь, содержащую VH с последовательностью SEQ ID NO: 40 и CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, 15 или 70, и

легкую цепь, содержащую VL с последовательностью SEQ ID NO: 41 и CL с последовательностью SEQ ID NO: 16;

(b) тяжелую цепь, содержащую VH с последовательностью SEQ ID NO: 68 и CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, 15 или 70, и

легкую цепь, содержащую VL с последовательностью SEQ ID NO: 69 и CL с последовательностью SEQ ID NO: 16;

(c) тяжелую цепь, содержащую VH с последовательностью SEQ ID NO: 53 и CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, 15 или 70, и

легкую цепь, содержащую VL с последовательностью SEQ ID NO: 54 и CL с последовательностью SEQ ID NO: 16;

(d) тяжелую цепь, содержащую VH с последовательностью SEQ ID NO: 1 и CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, 15 или 70, и

легкую цепь, содержащую VL с последовательностью SEQ ID NO: 2 и CL с последовательностью SEQ ID NO: 16;

(e) тяжелую цепь, содержащую VH с последовательностью SEQ ID NO: 17 и CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, 15 или 70, и

легкую цепь, содержащую VL с последовательностью SEQ ID NO: 18 и CL с последовательностью SEQ ID NO: 16;

(f) тяжелую цепь, содержащую VH с последовательностью SEQ ID NO: 30 и CH с последовательностью SEQ ID NO: 14, 15 или 70, и

легкую цепь, содержащую VL с последовательностью SEQ ID NO: 31 и CL с последовательностью SEQ ID NO: 16; или

(g) тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с и/или легкая цепь имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с тяжелой цепью и легкой цепью в любом из (a)-(f).

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(a) тяжелую цепь и легкую цепь,

где тяжелая цепь содержит:

(i) последовательность SEQ ID NO: 66 или 73;

(ii) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот или любую их комбинацию по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

легкая цепь содержит:

(i) последовательность с SEQ ID NO: 67;

(ii) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот или любую их комбинацию по сравнению с последовательностью в (i); или

(vi) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i);

(b) тяжелую цепь и легкую цепь,

где тяжелая цепь содержит:

(i) последовательность с SEQ ID NO: 71;

(ii) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот или любую их комбинацию по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i); и

легкая цепь содержит:

(i) последовательность с SEQ ID NO: 72;

(ii) последовательность, имеющую замену, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот или любую их комбинацию по сравнению с последовательностью в (i); или

(iii) последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью в (i);

где замена выше представляет собой консервативную замену.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv фрагментов, дисульфидсвязанного Fv и диатела.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-13, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент демонстрирует по меньшей мере одну из следующих характеристик:

(a) связывание с TSLP с K_D меньше чем около 50 нМ, например меньше чем около 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 1 пМ, 0,1 пМ или меньше, где KD измеряют методом Fortebio или ELISA;

(b) связывание с TSLP с EC50 меньше чем около 50 нМ, например меньше чем около 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 1 пМ, 0,1 пМ или меньше, где EC50 измеряют методом проточной цитометрии или ELISA;

(c) ингибирование связывания TSLP с IL7Rα/TSLPR с IC50 меньше чем около 50 нМ, например около 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 1 пМ, 0,1 пМ или меньше, где IC50 измеряют методом ELISA;

(d) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток;

(e) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной экспрессии OX40L;

(f) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG);

(g) ингибирование или блокирование TSLP-индуцированной секреции Th2 цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5;

(h) имеет хорошую аффинность связывания с FcRn;

(i) имеет изоэлектрическую точку (PI) от около 6,5 до около 8,5, такую как около 6,5, около 7,0, около 7,1, около 7,2, около 7,3, около 7,4, около 7,5, около 7,7, около 7,9, около 8,0, около 8,2 или около 8,5.

15. Конъюгат, который связывается с TSLP, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-13 и маркер.

16. Конъюгат по п. 15, где маркер представляет собой детектируемый маркер, такой как фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.

17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14.

18. Клонирующий вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17.

19. Вектор экспрессии, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17.

20. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмент по любому из пп. 1-14, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17 или вектор по п. 19.

21. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмент по любому из пп. 1-14, включающий:

культивирование клетки-хозяина по п. 20 в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и

выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры, содержащей культивированные клетки-хозяева.

22. Биспецифическое антитело, которое связывается с TSLP, отличающееся тем, что содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с TSLP, по любому из пп. 1-14 и дополнительное антитело или его фрагмент или миметик антитела.

23. Конъюгат, который связывается с TSLP, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14 и связывающий компонент, где связывающий компонент представляет собой детектируемый маркер, такой как радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, окрашенное вещество или фермент, или связывающий компонент представляет собой терапевтическое средство.

24. Фармацевтическая композиция по меньшей мере для одного из следующего:

(a) ингибирование или блокирование связывания тимусного стромального лимфопоэтина с IL7Rα-TSLPR,

(b) понижающая регуляция или устранение активности тимусного стромального лимфопоэтина,

(c) отрицательная регуляция или блокирование экспрессии OX40L,

(d) ингибирование или блокирование активации, индуцированной тимусным стромальным лимфопоэтином, и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток,

(e) ингибирование или блокирование секреции остеопротегерина (OPG), индуцированной тимусным стромальным лимфопоэтином,

(f) ингибирование или блокирование секреции Th2 цитокинов, индуцированной тимусным стромальным лимфопоэтином, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5,

где композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14, биспецифическое антитело по п. 22 и/или конъюгат по пп. 15, 16 и 23 и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

25. Набор для детекции наличия или уровня TSLP в образце, отличающийся тем, что набор содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14, биспецифическое антитело по п. 22 и/или конъюгат по пп. 15, 16, 23 или фармацевтическую композицию по п. 24.

26. Набор по п. 25, где набор содержит инструкцию по применению.

27. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14, биспецифического антитела по п. 22, конъюгата по пп. 15, 16, 23 или фармацевтической композиции по п. 24 для получения лекарственного средства для профилактики аллергического воспаления или аутоиммунного заболевания.

28. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14, биспецифического антитела по п. 22, конъюгата по пп. 15, 16, 23 или фармацевтической композиции по п. 24 для получения лекарственного средства для лечения аллергического воспаления или аутоиммунного заболевания.

29. Применение по п. 27 или 28, где аллергическое воспаление выбрано по меньшей мере из одного из группы, состоящей из: астмы, идиопатического фиброза легких, атопического дерматита (AD), аллергического конъюнктивита, аллергического ринита (AR), синдрома Незертона, эозинофильного эзофагита (EOE), пищевой аллергии, аллергической диареи, эозинофильного гастроэнтерита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза (ABPA), аллергического грибкового синусита, ревматоидного артрита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), системного склероза, келоида, язвенного колита, хронического синусита (CRS) и назальных полипов, хронической эозинофильной пневмонии, эозинофильного бронхита; синдрома Чарга-Стросса, эозинофилии, эозинофильной гранулемы с полиангиитом, воспалительного заболевания кишечника, крапивницы, системного мастоцитоза, кожного мастоцитоза и рецидивирующего идиопатического ангионевротического отека.

30. Применение по любому из пп. 27-29, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из: диабета, тяжелой миастении, гастрита, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, рассеянного склероза, волчанки, колита, ревматоидных заболеваний, псориаза и заболеваний щитовидной железы.

31. Применение по любому из пп. 27-30, где применение содержит введение лекарственного средства в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, выбранными без ограничения из: иммуносупрессантов, бронходилататоров, других антагонистов цитокинов или цитокиновых рецепторов или антител, антибиотиков, лучевой терапии, антагонистов лейкотриенов, ингибиторов PDE4, антигистаминов или противокашлевых лекарственных средств.

32. Применение по любому из пп. 27-31, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят последовательно или одновременно с дополнительным терапевтическим средством.

33. Способ in vivo/in vitro для:

(a) ингибирования или блокирования связывания тимического стромального лимфопоэтина с IL7Rα-TSLPR;

(b) отрицательной регуляции или устранения активности TSLP;

(c) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной активации и/или пролиферации мастоцитов, DC, NKT клеток;

(d) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции остеопротегерина (OPG);

(e) ингибирования или блокирования TSLP-индуцированной секреции Th2 цитокинов, таких как TARC, CCL22, IL-4, IL-13 или IL-5,

где способ включает:

введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14, биспецифического антитела по п. 22, конъюгата по пп. 15, 16, 23 или фармацевтической композиции по п. 24.

34. Способ in vivo/in vitro для отрицательной регуляции или блокирования экспрессии OX40L, где способ включает

введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14, биспецифического антитела по п. 22, конъюгата по пп. 15, 16, 23 или фармацевтической композиции по п. 24.

35. Способ по п. 33 или 34, где дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно с введением, до или после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, биспецифического антитела, конъюгата или фармацевтической композиции.

36. Способ профилактики аллергического воспаления или аутоиммунного заболевания у больного, включающий

введение больному эффективного количества фармацевтической композиции по п. 24, где больным является млекопитающее.

37. Способ по п. 36, где млекопитающим является человек.

38. Способ лечения аллергического воспаления или аутоиммунного заболевания у больного, включающий введение больному эффективного количества фармацевтической композиции по п. 24, где больным является млекопитающее.

39. Способ по п. 38, где млекопитающим является человек.

40. Способ по любому из пп. 36-39, где дополнительное терапевтическое средство вводят одновременно с введением, до или после введения фармацевтической композиции.

41. Способ по любому из пп. 36-40, где аллергическое воспаление выбрано по меньшей мере из одного из группы, состоящей из: астмы, идиопатического фиброза легких, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического ринита, синдрома Незертона, эозинофильного эзофагита, пищевой аллергии, аллергической диареи, эозинофильного гастроэнтерита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, аллергического грибкового синусита, ревматоидного артрита, хронической обструктивной болезни легких, системного склероза, келоида, язвенного колита, хронического синусита и назальных полипов, хронической эозинофильной пневмонии, эозинофильного бронхита; синдрома Чарга-Стросса, эозинофилии, эозинофильной гранулемы с полиангиитом, воспалительного заболевания кишечника, крапивницы, системного мастоцитоза, кожного мастоцитоза и рецидивирующего идиопатического ангионевротического отека.

42. Способ по любому из пп. 36-41, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из: диабета, тяжелой миастении, гастрита, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, рассеянного склероза, волчанки, колита, ревматоидных заболеваний, псориаза и заболеваний щитовидной железы.

43. Способ по п. 40, где дополнительное терапевтическое средство выбрано без ограничения из: иммуносупрессантов, бронходилататоров, других антагонистов цитокинов или цитокиновых рецепторов или антител, антибиотиков, лучевой терапии, антагонистов лейкотриенов, ингибиторов PDE4, антигистаминов или противокашлевых лекарственных средств.

44. Способ детекции наличия или уровня TSLP в образце, включающий

приведение в контакт образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-14 в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и TSLP, и

обнаружение образования или уровня TSLP комплекса.

45. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14, биспецифичекого антитела по п. 22, конъюгата по пп. 15, 16, 23 или фармацевтической композиции по п. 24 для получения лекарственного средства или набора для диагностики аллергического воспаления или аутоиммунного заболевания.

46. Применение по п. 45, где аллергическое воспаление выбрано из по меньшей мере одного из группы, состоящей из: астмы, идиопатического фиброза легких, атопического дерматита (AD), аллергического конъюнктивита, аллергического ринита (AR), синдрома Незертона, эозинофильного эзофагита (EOE), пищевой аллергии, аллергической диареи, эозинофильного гастроэнтерита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза (ABPA), аллергического грибкового синусита, ревматоидного артрита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), системного склероза, келоида, язвенного колита, хронического синусита (CRS) и назальных полипов, хронической эозинофильной пневмонии, эозинофильного бронхита; синдрома Чарга-Стросса, эозинофилии, эозинофильной гранулемы с полиангиитом, воспалительного заболевания кишечника, крапивницы, системного мастоцитоза, кожного мастоцитоза и рецидивирующего идиопатического ангионевротического отека.

47. Применение по п. 45 или 46, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из диабета, тяжелой миастении, гастрита, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, рассеянного склероза, волчанки, колита, ревматоидных заболеваний, псориаза и заболеваний щитовидной железы.

название	год	авторы	номер документа
Антитела к TSLP человека и их применение	2021	Чжан Сюэпин Лю Чжиган Чжоу Сяовэй Ху Цзюньцзе Хао Сяобо Лю Юйлань	RU2825460C1
АНТИТЕЛО К CLDN-18.2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2021	Чжоу, Юэхуа Чжан, Цзин Лю, Хой Лю, Хунчуань У, Хай Яо, Цзянь Хуан, Ланьцин	RU2829997C1
АНТИТЕЛО ПРОТИВ СТОЛБНЯЧНОГО ТОКСИНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2020	Лю Чжиган Чжоу Сяовэй Лю Юйлань Хао Сяобо Ху Цзюньцзе	RU2815280C1
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ БЕЛОК	2019	Цао Чжосяо Ло Сяо Хэ Нин Ху Циюэ Чжан Ляньшань Тао Вэйкан	RU2784486C1
БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ CD3E/BCMA И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Лю Чжиган Вань Шунань Лю Юйлань Хао Сяобо Ху Цзюньцзе Гуо Цзинцзин	RU2800164C2
АНТИТЕЛО К B7-H4, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Бао Жуди Хуа Хайцин Лю Суся Чжан Фуцзюнь Ван Тин	RU2792748C2
АНТИТЕЛО, СПОСОБНОЕ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ТИМИЧЕСКИМ СТРОМАЛЬНЫМ ЛИМФОПОЭТИНОМ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2020	Ши Цзиньпин Ин Хуа Ли Тинтин Ван Ифан Ян Гуймэй Гэ Ху Тао Вэйкан	RU2825304C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛА К PD-L1 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ	2018	Янь, Чжэнь Ян, Цзяньцзянь Янь, Сяодань У, Шань Лю, Сюнь	RU2766590C2
СООТВЕТСТВУЮЩАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОЗИРУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ	2021	Лю Цзюньлин Фань Сюэмэй Гэн Янь Ли Линь	RU2830698C1
АНТИТЕЛО ПРОТИВ КЛАУДИНА 18A2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2020	Ян, Инин Ли, Гао Ван, Яньин Ань, Чжэньмин Чжао, Шуюн Лю, Юйсюэ Лю, Шицун Чжан, Мэйцзюань Цзян, Цзиньцзинь	RU2811431C2

WO 2009035577 A1, 19.03.2009
WO 2007096149 A1, 30.08.2007
GAIL M
GAUVREAU, PH.D
et al., Effects of an Anti-TSLP Antibody on Allergen-Induced Asthmatic Responses, New England Journal of Medicine, 2014, 370(22), 2102-2110, doi:10.1056/nejmoa1402895
WO 2011056772 A1, 12.05.2011
НОВОЕ АНТИТЕЛО К TSLP-РЕЦЕПТОРУ ЧЕЛОВЕКА	2014	Сато Хирому Ямадзуку Дайсуке Араи Кадзунори Огино Мако	RU2689528C2

АНТИ-TSLP АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/24 C12N15/13 A61K39/395 A61P11/06 A61P29/00 A61P37/02

Описание патента на изобретение RU2834227C1

Похожие патенты RU2834227C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 834 227 C1

Реферат патента 2025 года АНТИ-TSLP АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Формула изобретения RU 2 834 227 C1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2025 года RU2834227C1

RU 2 834 227 C1