АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СВЯЗЫВАЕТСЯ С VEGF-A И ANG2, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/395 C07K16/22 C07K16/46 A61P27/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к антителам к VEGF-A/ANG2 и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ранее сообщалось о биспецифических антителах, связывающихся с VEGF и ANG2, и они были предложены для лечения глазных сосудистых заболеваний, таких как возрастная дегенерация желтого пятна. Фарицимаб (МНН), полноразмерное антитело IgG1, содержащее Fab-связывающее плечо, специфически связывающееся с VEGF, и второе Fab-связывающее плечо, специфически связывающееся с ANG2, является наиболее передовым биспецифическим терапевтическим средством, которое в настоящее время оценивается в клинических исследованиях III фазы для лечения ДМО и нВМД (Sharma, A., Kumar, N., Kuppermann, B.D. et al. Eye 34, 802-804 (2020)).

В последние годы были предложены дополнительные комбинированные способы лечения, нацеленные на VEGF и ANG2, для лечения глазных сосудистых заболеваний (например, WO 2016/122996 A1, WO 2018/037000 A1, WO 2019/200006 A2, US 2020/0102381 A1).

Мультиспецифические антитела, содержащие два паратопа в одной паре вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и вариабельного домена легкой цепи (VL), были описаны в WO 2008/027236; WO 2010/108127 и Bostrom, J., et al., Science 323 (2009) 1610-1614, а также в WO 2012/163520.

В WO 2012/163520 описываются биспецифические антитела, содержащие два паратопа в одной паре доменов VH и VL («DutaFabs»). Каждый паратоп биспецифического антитела из WO 2012/163520 содержит аминокислоты из CDR тяжелой цепи и из легкой цепи, причем CDR-H1 и CDR-H3 тяжелой цепи, а также CDR-L2 легкой цепи обеспечивают первый паратоп, a CDR-L1 и CDR-L3 легкой цепи, а также CDR-H2 тяжелой цепи обеспечивают второй паратоп. Моноспецифические антитела, содержащие отдельные паратопы, выделены независимо из различных Fab-библиотек, которые варьируют или в первом, или во втором паратопе. Аминокислотные последовательности указанных моноспецифических антител определены и объединены в бипаратопной паре VH и VL. Один типовой Fab-фрагмент, специфически связывающийся с VEGF и IL-6, раскрыт в WO 2012/163520.

Тем не менее существует потребность в улучшенных терапевтических антителах, которые связываются с VEGF и ANG2, например, за счет повышения эффективности по сравнению со стандартом лечения и за счет увеличения продолжительности действия и, в свою очередь, снижения частоты интравитральных инъекций, что приводит к меньшей нагрузке на пациента.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к VEGF-A/ANG2 и способам их применения.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратоп VEGF-А и паратоп ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем паратоп VEGF-A содержит аминокислотные остатки CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, при этом паратоп ANG2 содержит аминокислотные остатки CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратоп VEGF-А и паратоп ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домен VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домен VH), причем пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратоп VEGF-А и паратоп ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домен VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домен VH), причем антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF-A человека и с тем же эпитопом на ANG2 человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и вариабельным доменом легкой цепи SEQ ID NO: 20.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С или более, измеренной с помощью статического рассеяния света (SLS), в одном варианте осуществления, измеренной с помощью SLS, как описано в главе «Термическая стабильность» в разделе «Материалы и общие методы».

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью статического рассеяния света (SLS), в одном варианте осуществления, измеренной с помощью SLS, как описано в главе «Термическая стабильность» в разделе «Материалы и общие методы».

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 21 и (в) CDR-H3, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату. В одном варианте осуществления антитело содержит паратой VEGF-A, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66 и D95, и следующие аминокислотные остатки в домене VL 12, Y3, Y27, W27a, Е32, R92, Y93, Н94 и Р95; и паратоп ANG2, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, R94, V96, F98 и F99, и следующие аминокислотные остатки в домене VL Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57 и Y91.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, причем домен VH содержит аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, Y30, R66 и R94; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y3, L46, F49 и Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в одном или более положениях 1, 2, 4-25, 28, 35d-54, 59, 60, 67-93, 97, 101-113 SEQ ID NO: 19; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 1, 4-26, 27b-27d, 33-45, 47, 48, 51, 52, 58-90, 96-107 SEQ ID NO: 20, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, и содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 19 и последовательность VL SEQ ID NO: 20.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 25.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; и при этом Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С или более.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; и при этом Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С или более.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека (i) FR1, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащий аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; а Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем антитело содержит (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; и при этом 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

Один вариант осуществления изобретения относится к фрагменту антитела, который связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека. Один вариант осуществления изобретения относится к фрагменту биспецифического антитела, который связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека. В одном варианте осуществления фрагмент антитела выбран из Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ или одноцепочечных антител, полученных из них. Один вариант осуществления изобретения относится к Fab-фрагменту, который связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека. Один вариант осуществления изобретения относится к Fv-фрагменту, который связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека.

Один вариант осуществления изобретения относится к полноразмерному антителу IgG, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека.

В одном аспекте в изобретении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по изобретению.

В одном аспекте в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по изобретению. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является клеткой Е. coli.

В одном аспекте в изобретении предложен экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по изобретению.

В одном аспекте в изобретении предложен способ получения антитела, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, включающий культивирование клетки-хозяина по изобретению так, чтобы получить антитело.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, полученное способом по изобретению.

В одном аспекте в изобретении предложен фармацевтический состав, содержащий антитело по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте в изобретении предложен предварительно заполненный шприц, содержащий антитело по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте в изобретении предложен глазной имплант, содержащий антитело по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления изобретение включает порт-устройство доставки, содержащее антитело по изобретению.

В одном аспекте изобретения антитело или фармацевтический состав вводят посредством порт-устройства доставки.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело по изобретению для применения в качестве лекарственного средства, в одном варианте осуществления для применения в лечении сосудистого заболевания.

В одном аспекте в изобретении предложено применение антитела по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению в изготовлении лекарственного средства, в одном варианте осуществления лекарственного средства для лечения сосудистого заболевания.

В одном аспекте в изобретении предложен способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.

В одном аспекте в изобретении предложен способ ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для ингибирования ангиогенеза.

Согласно изобретению обеспечивается терапевтическое антитело к VEGF-A/ANG2, которое способно связываться с его целевыми антигенами независимо, даже когда обеспечивается в виде биспецифического Fab-фрагмента. Антитело по изобретению подходит для лечения сосудистых заболеваний глаз. Антитело по изобретению обеспечивает несколько ценных свойств, которые делают возможным его терапевтическое применение, таких как высокое сродство к обеим мишеням, поддерживающим низкую эффективную дозу, и высокая стабильность, полезная в течение длительного времени. По сравнению с подходами, не связанными с антителами, антитело по изобретению имеет тенденцию быть более приемлемым из-за его высокого уровня человеческих качеств и отсутствия искусственных доменов и линкеров. Антитело по изобретению выгодно представлять в виде высококонцентрированных жидких составов с вязкостью, подходящей для применения для глаз. Из-за возможности получения высоких концентраций лечение антителом по изобретению является более приемлемым для пациента, поскольку более высокая доза терапевтического средства может быть применена за одно лечение, что позволяет увеличить цикл лечения. Кроме того, при использовании в качестве биспецифического Fab-фрагмента для терапии антитело по изобретению допускает большее количество сайтов связывания на дозу по сравнению с биспецифическим полноразмерным антителом IgG.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Схематическое изображение Fab-фрагмента антитела к VEGF-A/ANG2 по изобретению. Показан вид сверху вниз родственной пары VH/VL, включающий расположение аминокислоты CDR (верхнее изображение). Домен VH показан серым, домен VL показан белым. Кроме того, указано пространственное расположение областей CDR. Области паратопа антитела по настоящему изобретению выделены (нижнее изображение), причем паратоп VEGF-A расположен в областях H-CDR2, L-CDR1 и L-CDR2, а паратоп ANG2 расположен в областях H-CDR1, H-CDR3 и L-CDR2.

Фиг. 2. Аминокислотные последовательности доменов VH типичных антител к VEGF-A/ANG2 по изобретению. Указана нумерация по Кабату положения аминокислот, а также областей CDR и FR. Выделены положения аминокислот, вносящие вклад в паратоп VEGF-A, а также паратоп ANG2, как определено в примере 13.

Фиг. 3. Аминокислотные последовательности доменов VL типичных антител к VEGF-A/ANG2 по изобретению. Указана нумерация по Кабату положения аминокислот, а также областей CDR и FR. Выделены положения аминокислот, вносящие вклад в паратоп VEGF-A, а также паратоп ANG2, как определено в примере 13.

Фиг. 4. Независимое антигенное связывание биспецифического антитела P1AD9820 с VEGF-А и ANG2 оценено с помощью ППР в соответствии с примером 5.

Фиг.5: Блокирующая активность VEGF-A121 и VEGF-A165 указанных антител, исследуемых в примере 11.

Фиг. 6. Блокирующая активность VEGF-A121 и VEGF-A165 указанных антител по изобретению и аналогов антител предшествующего уровня техники, исследуемых в примере 11.

Фиг. 7. Анализ гена-репортера (RGA) для анализа ингибирования VEGF-А указанными антителами по изобретению и аналогами антител предшествующего уровня техники, исследуемыми в примере 10.

Фиг. 8. Анализ гена-репортера-pTie2 для анализа ингибирования ANG2 указанными антителами по настоящему изобретению и аналогами антител предшествующего уровня техники, исследуемыми в примере 10.

Фиг. 9. Ингибирование ANG1, опосредованное P1AD9820, исследуемое в примере 12.

Фиг. 10. Вязкость, измеренная способом DLS с латексными шариками, Fab-фрагментов Р1АА0902 (вверху слева) и P1AD9820 (вверху справа), полученных в E.coli, и P1AD9820, полученных в СНО (посередине), исследуемыми в примере 8.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

Если иное не определено в данном документе, научные и технические термины, используемые в связи с данным изобретением, будут иметь значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать множественные формы, и термины во множественном числе будут включать единственное число. Способы и техники настоящего раскрытия в общем выполняются согласно обычным способам, хорошо известным в данной области техники. В общем, номенклатуры, используемые вместе с, и техники биохимии, ферментологии, молекулярной и клеточной биологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные в данном документе, являются хорошо известными и обычно используемыми в данной области техники.

Если иное не определено в данном документе, термин «содержащий» будет включать термин «состоящий из».

Термин «приблизительно» при использовании в данном документе в связи с конкретным значением (например, температурой, концентрацией, временем и другими) будет относиться к вариации +/- 1% конкретного значения, к которому относится термин «приблизительно».

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую антигенсвязывающую активность.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его природного окружения. В некоторых вариантах осуществления антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты, по определению, например, электрофоретическими (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографическими (например, ионообменная или обращенно-фазовая ВЭЖХ) методами. Обзор методов оценки чистоты антител смотрите, например, в Flatman et al., J. Chromatogr. В 848: 79-87 (2007).

В контексте данного документа термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих естественные мутации или возникающих при получении препарата моноклональных антител, причем такие варианты в целом присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональный» указывает на характеристику антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «полное антитело» используются взаимозаменяемо в данном документе для обозначения антитела, имеющего структуру, по сути сходную со структурой нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в данном документе.

«Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которые содержит его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В некоторых вариантах осуществления антитело является антителом изотипа IgG1 . В некоторых вариантах осуществления антитело является антителом изотипа IgG1 с мутацией P329G, L234A и L235A для снижения эффекторной функции Fc-области. В других вариантах осуществления антитело является антителом изотипа IgG2. В некоторых вариантах осуществления антитело является антителом изотипа IgG4 с мутацией S228P в шарнирной области для улучшения стабильности антитела IgG4. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

В данном документе термин «Fc-область» используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. В одном варианте осуществления Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR) (смотрите, например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). В антителе настоящего изобретения одна пара домена VH и домена VL, т.е. родственная пара VH/VL, специфически связывается с двумя его мишенями: VEGF-A и ANG2.

«DutaFab» представляет биспецифическое антитело, раскрытое в WO 2012/163520. В DutaFab одна пара домена VH и домена VL специфически связывается с двумя различными эпитопами, причем один паратоп содержит аминокислотные остатки CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3, а другой паратоп содержит аминокислотные остатки CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2. DutaFab содержат два неперекрывающихся паратопа в родственной паре VH/VL и могут одновременно связываться с двумя различными эпитопами. DutaFab и способы их получения путем просмотра библиотек, содержащих моноспецифические Fab-фрагменты, раскрыты в WO 2012/163520.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или полученного из отличного от человеческого источника, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Это определение человеческого антитела явным образом исключает гуманизированное антитело, содержащее отличные от человеческих антигенсвязывающие остатки. Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, считаются в данном документе человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.

«Консенсусная последовательность каркасной области человека» представляет собой каркасную область, которая представляет собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при выборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно набор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина получают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В общем случае подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу согласно Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), т. 1-3. В одном варианте осуществления для VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I по Кабату и соавт., выше. В одном варианте осуществления для VH подгруппа представляет собой подгруппу III по Кабату и соавт., выше.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂-фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

«Паратоп» или «антигенсвязывающий сайт», что используются взаимозаменяемо в данном документе, относится к части антитела, которая распознает и связывается с антигеном. Паратоп образован несколькими отдельными аминокислотными остатками из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела, расположенных в пространственной близости в третичной структуре Fv-области. Антитела по изобретению содержат два паратопа в одной родственной паре VH/VL.

Используемый в данном документе термин «паратоп VEGF-А» представляет собой паратоп или антигенсвязывающий сайт, который связывается с VEGF-A. Паратоп VEGF-A антитела по изобретению содержит аминокислотные остатки CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела.

При использовании в данном документе «паратоп ANG2» представляет собой паратоп или антигенсвязывающий сайт, который связывается с ANG2. Паратоп ANG2 антитела по изобретению содержит аминокислотные остатки CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела.

Используемый в данном документе термин «сосудистый эндотелиальный фактор роста», сокращенный как «VEGF», относится к любому нативному VEGF из любого источника, относящегося к позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Этот термин охватывает «полноразмерный» непроцессированный VEGF, а также любую форму VEGF, полученную в результате процессинга в клетке. Этот термин также охватывает варианты VEGF природного происхождения, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типового VEGF человека представлена в SEQ ID NO: 26.

Термины «антитело к VEGF-А» и «антитело, которое связывается с VEGF-А» относятся к антителу, которое способно связывать VEGF-A с достаточной аффинностью, так что это антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического средства в нацеливании на VEGF-А. В одном варианте осуществления степень связывания антитела к VEGF-А с неродственным белком, не относящимся к VEGF-A, составляет менее приблизительно 10% от связывания антитела с VEGF-A, измеренного, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с VEGF-А, имеет константу диссоциации (K_D) ≤1 нМ, ≤0,1 нМ или ≤0,01 нМ. Говорят, что антитело «специфически связывается» с VEGF, когда антитело имеет K_D 1 мкМ или менее.

Используемый в данном документе термин «ангиопоэтин-2», сокращенный как «ANG2», относится к любому нативному ANG2 из любого источника, относящегося к позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Данный термин охватывает «полноразмерный» непроцессированный ANG2, а также любую форму ANG2, полученную в результате процессинга в клетке. Данный термин также включает встречающиеся в природе варианты ANG2, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типового ANG2 человека изображена в SEQ ID NO: 27.

Термины «антитело к ANG2» и «антитело, которое связывается с ANG2» относятся к антителу, которое способно связывать ANG2 с достаточной аффинностью, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на ANG2. В одном варианте осуществления степень связывания антитела к ANG2 с неродственным, не являющимся ANG2 белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с ANG2, что измеряется, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ANG2, имеет константу диссоциации (K_D) ≤1 нМ, ≤0,1 нМ или ≤0,03 нМ. Говорят, что антитело «специфически связывается» с ANG2, когда антитело имеет K_D 1 мкМ или менее.

Антитело по изобретению «одновременно связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека», что означает, что (а) Fab-фрагмент антитела по изобретению, который связывается с ANG2 человека, (также) специфически связывается с VEGF-A человека, и (б) Fab-фрагмент антитела по изобретению, который связывается с VEGF-A человека, (также) специфически связывается с ANG2 человека. Одновременное связывание можно оценить с помощью способов, известных в данной области, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса, как описано в данном документе.

Используемый в данном документе термин «определяющие комплементарность области» или «CDR» относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и содержат контактирующие с антигеном остатки. В общем случае антитела содержат шесть CDR: три в домене VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три в домене VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Если не указано иное, остатки CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) пронумерованы в данном документе согласно системе нумерации по Кабату (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

«Каркасные области» или «FR» при использовании в данном документе относятся к аминокислотным остаткам вариабельного домена, отличным от остатков CDR. Каркасная область вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов каркасной области: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, аминокислотные последовательности CDR и FR обычно расположены в следующем порядке в (а) домене VH: FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3- CDR-H3-FR4; и (b) в домене VL: FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4.

Согласно системе нумерации по Кабату, как используется в данном документе, каркасные и CDR области расположены в следующих областях вариабельных доменов:

Положения аминокислот согласно системе нумерации по Кабату, упоминаемые в данном документе, показаны на фигурах 2 и 3 в соответствии с аминокислотными последовательностями антител по изобретению. Ссылки на аминокислоты в некотором положении в аминокислотной последовательности в данном документе сделаны, как хорошо известно в данной области, путем указания соответствующей аминокислоты и положения аминокислоты, например, «Е2» относится к остатку глутаминовой кислоты, расположенному в положении 2 по Кабату аминокислотной последовательности соответствующего домена антитела.

Термин «аффинность» относится к силе суммарных общих нековалентных взаимодействий между одиночным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в данном документе термин «аффинность связывания» относится к присущей молекуле аффинности связывания, отражающему взаимодействие между членами пары связывающихся компонентов (например, антителом и антигеном) при их соотношении 1: 1. Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y обычно может быть представлена константой диссоциации (K_D). Аффинность можно измерять с помощью общепринятых методов, известных в данной области техники, включая описанные в данном документе. Конкретные иллюстративные и типовые варианты осуществления для измерения аффинности связывания описаны в данном документе.

Термин «эпитоп» означает сайт на антигене, или белковый, или небелковый, с которым связывается антитело. Эпитопы могут быть образованы как из участков заменимых аминокислот (линейный эпитоп), так и содержать незаменимые аминокислоты (конформационный эпитоп), например, находятся в пространственной близости из-за сворачивания антигена, т.е. за счет третичного сворачивания белкового антигена. Линейные эпитопы обычно все еще связаны антителом после воздействия на белковый антиген денатурирующих средств, тогда как конформационные эпитопы обычно разрушаются при обработке денатурирующими средствами. Эпитоп содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

Отбор антител, связывающихся с конкретным эпитопом (т.е. тех, которые связываются с одним и тем же эпитопом), можно проводить с помощью способов, обычных для данной области, таких как, например, помимо прочего, аланиновое сканирование, пептидные блоты (смотрите Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), анализ расщепления пептидов, удаление эпитопа, экстракция эпитопа, химическая модификация антигенов (смотрите Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) и перекрестный конкурентный анализ (смотрите «Antibodies», Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

Профилирование антител на основании структуры антигена (ASAP), также известное как профилирование с помощью модификации (MAP), обеспечивает отбор множества моноклональных антител, специфически связывающихся с VEGF-A или ANG2, на основании профиля связывания каждого из антител из множества с поверхностью химически или ферментативно модифицированного антигена (смотрите, например, US 2004/0101920). Антитела в каждой группе связываются с одним и тем же эпитопом, который может быть уникальным эпитопом или явно отличающимся, или частично перекрывающимся с эпитопом, представленным другой группой.

Также конкурентное связывание можно использовать для легкого определения того, связывается ли антитело с одним и тем же эпитопом VEGF-А или ANG2, или конкурирует в отношении связывания с ним, что и эталонное антитело по изобретению. Например, «антитело, которое связывается с теми же эпитопами на VEGF-A и ANG2», что и эталонное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигенами в соответствующем конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в соответствующем конкурентном анализе на 50% или более. Также в качестве примера, для определения того, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, эталонному антителу позволяют связываться с VEGF-А или ANG2 при условиях насыщения. После удаления избытка эталонного антитела оценивают способность интересующего антитела связываться с VEGF-А или ANG2. Если интересующее антитело способно связываться с VEGF-A или ANG2 после насыщения соединения эталонного антитела, можно сделать вывод, что интересующее антитело связывается с другим эпитопом относительно эталонного антитела. Но если интересующее антитело не способно связываться с VEGF-A или ANG2 после насыщения соединения эталонного антитела, тогда интересующее антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, связываемый эталонным антителом. Для подтверждения того, связывается ли интересующее антитело с тем же эпитопом или только мешает связыванию по стерическим причинам, можно использовать рутинные эксперименты (например, анализы мутаций и связывания пептидов при помощи ИФА, РИА, поверхностного плазмонного резонанса, цитометрии в потоке или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного в данной области). Этот анализ можно проводить в двух установках, т.е. с обоими антителами, являющимися насыщающим антителом. Если в обеих установках только первое (насыщающее) антитело способно связываться с VEGF-A или ANG2, тогда можно сделать вывод, что интересующее антитело и эталонное антитело конкурируют в отношении связывания с VEGF-A или ANG2.

В некоторых вариантах осуществления два антитела, как считается, связываются с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами, если 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, меньшей мере на 75%, меньшей мере на 90% или даже 99% или более, что измерено в анализе конкурентного связывания (смотрите, например, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).

В некоторых вариантах осуществления два антитела, как считается, связываются с одним и тем же эпитопом, если по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или исключают связывание одного антитела, также снижают или исключают связывание с другим. Два антитела, как считается, имеют «перекрывающиеся эпитопы», если только подмножество аминокислотных мутаций, которые снижают или исключают связывание одного антитела, снижают или исключают связывание с другим.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей в целях выравнивания. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, которые известны в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) или программный пакет FASTA. Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В качестве альтернативы значения процента идентичности можно получить с помощью компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc., а исходный код был подан вместе с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под номером регистрации авторского права США TXU510087 и описан в WO 2000/005319.

Если не указано иное, для целей данного документа, однако, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с помощью программы ggsearch пакета FASTA версии 36.3.8 с или более поздней с матрицей сравнения BLOSUM50. Программный пакет FASTA был создан W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), «Improved Tools for Biological Sequence Analysis», PNAS 85: 2444-2448; W. R. Pearson (1996) «Effective protein sequence comparison)) Meth. Enzymol. 266: 227-258; и Pearson et al. (1997) Genomics 46: 24-36, и является общедоступным на www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml или www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta. В качестве альтернативы публичный сервер, доступный на fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi, можно использовать для сравнения последовательностей, используя программу ggsearch (global protein: protein) и параметры по умолчанию (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup =2) для обеспечения выполнения общего, а не местного выравнивания. Процент идентичности аминокислот дан в заголовке выходных данных выравнивания.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичными молекулами, включая без ограничения цитотоксическое средство.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» включает любое соединение и/или вещество, которое содержит полимер из нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из основания, в частности, пуринового или пиримидинового основания (т.е. цитозина (С), гуанина (G), аденина (А), тимина (Т) или урацила (U)), сахара (т.е. дезоксирибозы или рибозы) и фосфатной группы. Часто молекула нуклеиновой кислоты описана по последовательности оснований, причем указанные основания представляют первичную структуру (линейную структуру) молекулы нуклеиновой кислоты. Последовательность оснований, как правило, представлена от 5' к 3'. В данном документе термин молекула нуклеиновой кислоты охватывает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), включая, например, комплементарную ДНК (кДНК) и геномную ДНК, рибонуклеиновую кислоту (РНК), в частности, матричную РНК (мРНК), синтетические формы ДНК и РНК и смешанные полимеры, содержащие две или более из этих молекул. Молекула нуклеиновой кислоты может быть линейной или кольцевой. Кроме того, термин молекула нуклеиновой кислоты включает как смысловые, так и антисмысловые цепи, а также одноцепочечные и двухцепочечные формы. Помимо этого, описанная в данном документе молекула нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотиды природного и неприродного происхождения. Примеры нуклеотидов неприродного происхождения включают модифицированные нуклеотидные основания с дериватизированными сахарами, или фосфатными остовными связями, или химически модифицированными остатками. Молекулы нуклеиновых кислот также включают молекулы ДНК и РНК, подходящие в качестве вектора для управления экспрессией антитела по изобретению in vitro и/или in vivo, например, в организме хозяина или пациента. Такие ДНК (например, кДНК) или РНК (например, мРНК) векторы могут быть немодифицированными или модифицированными. Например, мРНК может быть химически модифицирована для повышения стабильности РНК-вектора и/или экспрессии кодируемой молекулы так, чтобы мРНК можно было вводить субъекту для генерации антител in vivo (смотрите, например, Stadler et al., Nature Medicine 2017, опубликованную онлайн 12 июня 2017 г., doi: 10.1038/nm.4356 или ЕР 2101823 В1).

«Выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу нуклеиновой кислоты, но при этом молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном положении, которое отличается от ее природного хромосомного положения.

«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело» относится к одной или более молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая молекулы нуклеиновых кислот в одном векторе или отдельных векторах и молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в одной или более локациях в клетке-хозяине.

Термин «вектор», как используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной увеличивать число копий другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Этот термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую его внесли. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «векторами экспрессии».

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внесена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство вне зависимости от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным исходной клетке по содержанию нуклеиновой кислоты и может содержать мутации. В данный документ включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, в отношении которых проводится скрининг или отбор изначально трансформированных клеток.

Термин «фармацевтическая композиция» или «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей эффективность биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительные компоненты, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому предполагается вводить фармацевтическую композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции или фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает без ограничения буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

«Эффективное количество» средства, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают без ограничения одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления индивидуум или субъект представляет собой человека.

Как используется в данном документе, термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить» или «осуществление лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения заболевания у индивидуума, которого лечат, и может проводиться как для профилактики, так и при течении клинической патологии. Необходимые эффекты лечения включают без ограничения предупреждение появления или повторного появления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению используют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

Термин «заболевание глаз» при использовании в данном документе включает любое заболевание глаз, связанное с патологическим ангиогенезом и/или атрофией. Заболевание глаз может характеризоваться измененной или нерегулируемой пролиферацией и/или инвазией новых кровеносных сосудов в структуры ткани глаза, такой как сетчатка или роговица. Заболевание глаз может характеризоваться атрофией ткани сетчатки (фоторецепторов и лежащего в основе пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и хориокапилляров). Неограничивающие заболевания глаз включают, например, ВМД (например, влажную ВМД, сухую ВМД, промежуточную ВМД, запущенную ВМД и географическую атрофию (ГА)), макулярную дегенерацию, макулярный отек, ДМО (например, фокальный, нецентральный ДМО и диффузный, с вовлечением центрального отдела сетчатки ДМО), ретинопатию, диабетическую ретинопатию (ДР) (например, пролиферативную ДР (ПДР), непролиферативную ДР (НПДР) и высотную ДР), другие связанные с ишемией ретинопатии, РН, окклюзию вены сетчатки (ОВС) (например, формы, связанные с центральной веной (ОЦВС) и ветвями вены (ОВВС)), ХНВ (например, миопическую ХНВ), неоваскуляризацию роговицы, заболевания, связанные с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, заболевания, связанные с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, центральную серозную ретинопатию (ЦСР), патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаза, СЭВРП, болезнь Коутса, болезнь Норри, нарушения сетчатки, связанные с синдромом остеопороза-псевдоглиомы (ОППГ), субконъюнктивальное кровоизлияние, покраснение радужки, неоваскулярное заболевание глаз, неоваскулярную глаукому, пигментный ретинит (ПР), гипертоническую ретинопатию, ангиоматозную пролиферацию сетчатки, макулярную телеангиэктазию, неоваскуляризацию радужной оболочки, внутриглазную неоваскуляризацию, дегенерацию сетчатки, кистозный макулярный отек (КМО), васкулит, отек диска зрительного нерва, ретинит, включая, помимо прочего, ЦМВ-ретинит, меланому глаз, бластому сетчатки, конъюнктивит (например, инфекционный конъюнктивит и неинфекционный (например, аллергический) конъюнктивит), наследственный амавроз Лебера (также известный как наследственный амавроз Лебера или НАЛ), увеит (включая инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидит (например, мультифокальный хориоидит), гистоплазмоз глаз, блефарит, синдром сухого глаза, травматическое повреждение глаз, болезнь Шегрена и другие офтальмологические заболевания, причем заболевание или болезнь связана с неоваскуляризацией глаз, транссудацией и/или отеком сетчатки или атрофией сетчатки. Дополнительные типовые заболевания глаз включают ретиношизис (аномальное расщепление нейросенсорных слоев сетчатки), заболевания, связанные с покраснением радужки (неоваскуляризация угла передней камеры), и заболевания, вызванные атипичной пролиферацией сосудисто-волокнистой или волокнистой ткани, включая все формы пролиферативной витреоретинопатии. Типовые заболевания, связанные с неоваскуляризацией роговицы, включают, помимо прочего, эпидемический кератоконъюнктивит, дефицит витамина А, чрезмерное ношение контактных линз, атопический кератит, верхний лимбальный кератит, сухой кератит крыловидной плевы, синдром Шегрена, розацею, фликтенулезный конъюнктивит, сифилис, микобактериальные инфекции, липидную дегенерацию, химические ожоги, бактериальные язвы, грибковые язвы, инфекции простого герпеса, инфекции опоясывающего герпеса, инфекции простейшими, саркому Капоши, язву Мурена, маргинальную дегенерацию Терриена, краевую дистрофию роговицы, ревматоидный артрит, системную волчанку, полиартериит, травму, саркоидоз Вегенера, склерит, синдром Стивенса-Джонсона, перифигоидную радиальную кератотомию и отторжение роговичного трансплантата. Типовые заболевания, связанные с хориоидальной неоваскуляризацией и дефектами в сосудистой системе сетчатки, включая повышенную транссудацию, аневризмы и капиллярную закупорку, включают, помимо прочего, диабетическую ретинопатию, макулярную дегенерацию, серповидноклеточную анемию, саркоид, сифилис, эластическую псевдоксантому, болезнь Педжета, окклюзию вены, окклюзию артерии, обструктивную болезнь сонной артерии, хронический увеит/витрит, микобактериальные инфекции, болезнь Лайма, системную красную волчанку, ретинопатию недоношенных, отек сетчатки (включая макулярный отек), болезнь Илза, болезнь Бехчета, инфекции, вызывающие ретинит или хориоидит (например, мультифокальный хориоидит), предполагаемый гистоплазмоз глаз, болезнь Беста (врожденную макулярную дегенерацию), миопию, ямки диска зрительного нерва, парспланит, отслоение сетчатки (например, хроническое отслоение сетчатки), синдром повышенной вязкости крови, токсоплазмоз, травму и осложнения после лазерной коррекции.

Типовые заболевания, связанные с атрофией тканей сетчатки (фоторецепторов и лежащего в основе ПЭС), включают, помимо прочего, атрофическую или неэкссудативную ВМД (например, географическую атрофию или запущенную сухую ВМД), атрофию желтого пятна (например, атрофию, связанную с неоваскуляризацией и/или географической атрофией), диабетическую ретинопатию, болезнь Штаргардта, дистрофию глазного дна Сорсби, ретиношизис и пигментный ретинит.

Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предостережениях относительно применения таких терапевтических продуктов.

2. Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения

В одном аспекте изобретение основано, отчасти, на обеспечении биспецифических антител для терапевтического применения. В некоторых аспектах предлагаются антитела, которые связываются с VEGF-A человека и ANG2 человека. Антитела по изобретению пригодны, например, для диагностики или лечения сосудистых заболеваний, например, сосудистых заболеваний глаз.

А. Типовые антитела, которые связываются с VEGF-A человека и ANG2 человека

В одном аспекте в изобретении предложены антитела, которые связываются с VEGF-A человека и ANG2 человека. В одном аспекте предлагаются выделенные антитела, которые связываются с VEGF-А человека и ANG2 человека. В одном аспекте в изобретении предложены антитела, которые специфически связываются с VEGF-A человека и ANG2 человека.

В некоторых аспектах предлагается антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит паратоп VEGF-A (т.е. антигенсвязывающий сайт, который связывается с VEGF-A) и паратоп ANG2 (т.е. антигенсвязывающий сайт, который связывается с ANG2) в одной родственной паре домена VL и домена VH, причем

• паратоп VEGF-A содержит аминокислотные остатки CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп ANG2 содержит аминокислотные остатки CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела; и/или

• пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека; и/или

• антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF-А человека и с тем же эпитопом на ANG2 человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и вариабельным доменом легкой цепи SEQ ID NO: 20; и/или

• Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С или более; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света; и/или

• 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату. В одном варианте осуществления антитело содержит паратоп VEGF-A, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66 и D95, и следующие аминокислотные остатки в домене VL 12, Y3, Y27, W27a, Е32, R92, Y93, Н94 и Р95; и паратоп ANG2, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, R94, V96, F98 и F99, и следующие аминокислотные остатки в домене VL Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57 и Y91.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, причем домен VH содержит аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, Y30, R66 и R94; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y3, L46, F49 и Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в одном или более положениях 1, 2, 4-25, 28, 35d-54, 59, 60, 67-93, 97, 101-113 SEQ ID NO: 19; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 1, 4-26, 27b-27d, 33-45, 47, 48, 51, 52, 58-90, 96-107 SEQ ID NO: 20, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен.

В другом аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, и содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен.; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, с 1-15, 1-10 или 1-5 аминокислотных замен.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, имеющий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19. В некоторых аспектах последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции в сравнении с эталонной последовательностью, но антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с VEGF-A человека и ANG2 человека. В некоторых аспектах была проведена замена, вставка и/или делеция в общей сложности 1-10 аминокислот в SEQ ID NO: 19. В некоторых аспектах замены, вставки или делеции находятся в областях за пределами CDR (т.е. в FR). В конкретном аспекте VH содержит (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном аспекте в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VL, имеющий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20. В некоторых аспектах последовательность VL, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции в сравнении с эталонной последовательностью, но антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с VEGF-A человека и ANG2 человека. В определенных аспектах была проведена замена, вставка и/или делеция в общей сложности 1-10 аминокислот в SEQ ID NO: 20. В некоторых аспектах замены, вставки или делеции находятся в областях за пределами CDR (т.е. в FR). В конкретном аспекте VL содержит (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В другом аспекте предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, причем антитело содержит последовательность VH согласно любому из вышеприведенных аспектов и последовательность VL согласно любому из вышеприведенных аспектов. В одном аспекте антитело содержит последовательности VH и VL в SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей.

В другом аспекте предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, причем антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 25.

В другом аспекте предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, причем антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепь SEQ ID NO: 17 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 18.

В дополнительном аспекте в изобретении антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, согласно любому из вышеуказанных аспектов, является моноклональным антителом. В одном аспекте антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, является фрагментом антитела, например, фрагментом Fv, Fab, Fab', scFv, диателом или F(ab')₂. В другом аспекте антитело представляет собой полноразмерное антитело.

В дополнительном аспекте антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, согласно любому из вышеуказанных аспектов может включать любой из признаков, по отдельности или в комбинации, как описано в разделах 1-5 ниже.

1. Аффинность антител

В некоторых вариантах осуществления антитело, представленное в данном документе, связывается с VEGF-A с константой диссоциации (K_D) ≤1 нМ, ≤0,1 нМ или ≤0,01 нМ. В предпочтительном варианте осуществления антитело, представленное в данном документе, связывается с VEGF-А с константой диссоциации (K_D) ≤10 нМ, в предпочтительном варианте осуществления ≤5 нМ. В предпочтительном варианте осуществления антитело, представленное в данном документе, связывается с VEGFA-121 человека с константой диссоциации (K_D) ≤10 нМ, в предпочтительном варианте осуществления ≤5 нМ. В предпочтительном варианте осуществления антитело, представленное в данном документе, связывается с VEGFA-165 человека с константой диссоциации (K_D) ≤10 нМ, в предпочтительном варианте осуществления<5 нМ.

В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с ANG2, имеет константу диссоциации (K_D) ≤1 нМ, ≤0,1 нМ или ≤0,03 нМ. В предпочтительном варианте осуществления антитело, представленное в данном документе, связывается с ANG2 человека с константой диссоциации (K_D) ≤10 нМ, в предпочтительном варианте осуществления ≤5 нМ.

В одном аспекте K_D определяют, используя анализ методом поверхностного плазмонного резонанса BIACORE^®.

В другом аспекте K_D измеряют с использованием анализа KinExA. В одном варианте осуществления K_D измеряют с использованием анализа KinExA в условиях, описанных ниже в разделе «Материалы и общие методы», либо для обнаружения K_D связывания VEGF-A, либо для обнаружения K_D связывания ANG2.

Например, K_D связывания антител с VEGF-А измеряют в анализе с использованием прибора KinExA 3200 от Sapidyne Instruments (Бойсе, штат Айдахо), шарики из ПММА покрывают антигеном в соответствии с протоколом руководства KinExA (адсорбционное покрытие, Sapidyne) с использованием 30 мкг антитела к VEGF МАВ293 (R&D) в 1 мл ФСБ (рН 7,4). Равновесный анализ KinExA проводят при комнатной температуре с использованием ФСБ рН 7,4 с 0,01% БСА и 0,01% Твин20 в качестве рабочего буфера, образцы и гранулы получают в буфере LowCross (Candor Bioscience). Используется скорость потока 0,25 мл/мин. Постоянное количество VEGFA-121-His (50 пМ и во втором эксперименте 500 пМ) титруют исследуемым антителом, и уравновешенные смеси пропускают через колонку с шариками, связанными с антителом к VEGF (Mab293), в системе KinExA в объеме 750 мкл для 50 пМ постоянного VEGF и в объеме 125 мкл для 500 пМ постоянного VEGF. Обнаружение связанного VEGF А-121 проводят с использованием второго биотинилированного антитела к VEGF (BAF293) с концентрацией 250 нг/мл и последующей инъекции 250 нг/мл конъюгата Streptavidin Alexa Fluor™ 647 в буфере для образцов. K_D получают в нелинейном регрессионном анализе данных с использованием модели однородного связывания с одним сайтом, содержащейся в программном обеспечении KinExA (версия 4.0.11), с использованием способа «стандартного анализа». Программное обеспечение вычисляет K_D и определяет 95% доверительный интервал, подгоняя точки данных к теоретической кривой K_D-95% доверительный интервал задается как низкая K_D и высокая K_D.

Например, K_D связывания антител с ANG2 измеряют в анализе с использованием прибора KinExA 3200 от Sapidyne Instruments (Бойсе, штат Айдахо), шарики из ПММА покрывают антигеном в соответствии с протоколом руководства KinExA (адсорбционное покрытие, Sapidyne) с использованием 20 мкг антитела к Ang2 МАВ098 (R&D) в 1 мл ФСБ (рН 7,4). Равновесный анализ KinExA проводят при комнатной температуре с использованием ФСБ рН 7,4 с 0,01% БСА и 0,01% Твин20 в качестве рабочего буфера, образцы и гранулы получают в буфере (Candor Bioscience). Используется скорость потока 0,25 мл/мин. Постоянное количество Ang2-RBD-muFc (50 пМ и во втором эксперименте 500 пМ) титруют исследуемым антителом, и уравновешенные смеси пропускают через колонку с шариками, связанными с антителом к Anti-Ang2 (МАВ098), в системе KinExA в объеме 750 мкл для 50 пМ постоянного Ang2 и в объеме 188 мкл для 500 пМ постоянного Ang2. Обнаружение связанного Ang2 проводят с использованием второго биотинилированного антитела к Ang2 (ВАМ0981) с концентрацией 250 нг/мл и последующей инъекции 250 нг/мл конъюгата Streptavidin Alexa Fluor™ 647 в буфере для образцов. K_D получают в нелинейном регрессионном анализе данных с использованием модели однородного связывания с одним сайтом, содержащейся в программном обеспечении KinExA (версия 4.0.11), с использованием способа «стандартного анализа». Программное обеспечение вычисляет K_D и определяет 95% доверительный интервал, подгоняя точки данных к теоретической кривой K_D. 95% доверительный интервал задается как низкая K_D и высокая K_D.

2. Фрагменты антител

В некоторых аспектах антитело, обеспеченное в данном документе, представляет собой фрагмент антитела.

В одном аспекте фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab, Fab', Fab'-SH или F(ab')₂, в частности Fab-фрагмент. Расщепление интактных антител папаином позволяет получить два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый из которых содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи (VH и VL, соответственно) и также константный домен легкой цепи (CL) и первый константный домен тяжелой цепи (СН1). Таким образом, термин «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему легкую цепь, содержащую домен VL и домен CL, и фрагмент тяжелой цепи, содержащий домен VH и домен СН1. «Fab'-фрагменты» отличаются от Fab-фрагментов добавлением остатков на карбоксильном конце домена СН1, содержащих один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляют собой Fab'-фрагменты, в которых остаток(ки) цистеина константного(ых) домена(ов) несет(ут) свободную тиольную группу. Обработка пепсином приводит к получению F(ab')₂-фрагмента, который имеет два антигенсвязывающих сайта (два Fab-фрагмента) и часть Fc-области. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих повышенное время полужизни in vivo, смотрите в патенте США №5869046.

Фрагменты антител можно получать различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также рекомбинантную выработку рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli, СНО), как описано в данном документе.

В предпочтительном варианте осуществления предложенное в данном документе антитело представляет собой Fab-фрагмент.

В одном варианте осуществления домен VH предложенного в данном изобретении антитела содержит каркас VH3 человека.

В одном варианте осуществления домен VL предложенного в данном изобретении антитела содержит каркас Vкаппа1 человека.

В одном варианте осуществления домен CL предложенного в данном изобретении антитела представляет собой изотип каппа.

В одном варианте осуществления домен СН1 предложенного в данном изобретении антитела представляет собой изотип IgG1.

В предпочтительном варианте осуществления предложенное в данном документе антитело представляет собой Fab-фрагмент, содержащий домен CL изотипа каппа и домен СН1 изотипа IgG1 человека.

3. Термическая стабильность

Антитела, представленные в данном документе, характеризуются превосходной термической стабильностью. В некоторых вариантах осуществления предложенный в данном документе Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С или более. В некоторых вариантах осуществления предложенный в данном документе Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

4. Мультиспецифические антитела

В некоторых аспектах предложенное в данном документе антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. «Мультиспецифические антитела» представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания для по меньшей мере двух различных сайтов, т.е. различных эпитопов на различных антигенах или различных эпитопов на одном и том же антигене. В некоторых аспектах мультиспецифическое антитело имеет три или более специфичности связывания.

Мультиспецифические антитела с тремя или более специфичностями связывания, содержащие антитела, обеспеченные в данном документе, могут быть представлены в асимметричной форме с кроссовером доменов в одном или более связывающих плечах одной и той же специфичности к антигену, т.е. путем замены доменов VH/VL (смотрите, например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), доменов CH1/CL (смотрите, например, WO 2009/080253) или полных Fab-фрагментов (смотрите, например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, также смотрите Schaefer et al., PNAS, 108 (2011) 1187-1191, и Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Различные дополнительные молекулярные форматы для мультиспецифических антител известны в данной области техники и включены в данный документ (смотрите, например, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

5. Варианты антител

В некоторых аспектах предусмотрены варианты аминокислотной последовательности антител, представленных в данном документе. Например, может существовать потребность в изменении аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты антитела по аминокислотной последовательности можно получать путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или с помощью пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечного конструкта можно осуществлять любую комбинацию делеции, вставок и замен при условии, что конечный конструкт обладает необходимыми характеристиками, например, связывания антигена.

В некоторых аспектах предложены варианты антитела, содержащие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают CDR и FR. Консервативные замены показаны в таблице ниже под заголовком «предпочтительные замены». Более существенные изменения представлены в таблице 1 под заголовком «типовые замены», и как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислотных боковых цепей. Аминокислотные замены можно вносить в антитело, представляющее интерес, и проводить скрининг полученных продуктов в отношении необходимой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена, снижения иммуногенности или улучшения АЗКЦ или КЗЦ.

Аминокислоты можно разделить на группы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены подразумевают замену представителя одного из этих классов представителем другого класса.

Один из типов заместительного варианта включает замену одного или более остатков CDR родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) вариант(ы), выбранный(ые) для дальнейшего изучения, будет иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, сниженную иммуногенность) по сравнению с исходным антителом и/или будет иметь по сути сохраненные некоторые биологические свойства исходного антитела. Типовой заместительный вариант представляет собой антитело с созревшей аффинностью, которое удобно получать, например, используя методики созревания аффинности на основе фагового дисплея, такие как описанные в данном документе. Вкратце один или более аминокислотных остатков CDR подвергают мутации и вариантные антитела представляют на поверхности фага и проводят скрининг в отношении конкретного вида биологической активности (например, аффинности связывания).

В некоторых аспектах замены, вставки или делеции могут находиться в одной или более CDR при условии, что такие изменения по существу не снижают способность антитела связывать антиген. Например, в CDR можно проводить консервативные изменения (например, консервативные замены, предложенные в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут, например, находиться за пределами контактирующих с антигеном остатков в CDR. В некоторых вариантных последовательностях VH и VL, представленных выше, каждая CDR остается неизменной или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Удобный способ выявления остатков или областей антитела, которые могут быть мишенями для мутагенеза, называется «аланин-сканирующим мутагенезом», описанным Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. В этом способе остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для определения влияния на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно вносить в аминокислотные положения, демонстрирующие функциональную чувствительность к исходным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте для выявления точек контакта между антителом и антигеном можно использовать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело. Такие контактные остатки и соседние остатки можно использовать для нацеливания или удалять из кандидатов для замены. Можно проводить скрининг вариантов, чтобы определить, имеют ли они необходимые свойства.

Вставки аминокислотных последовательностей включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния с диапазоном длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или некоторого количества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионила. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или С-концом антитела с ферментом (например, для терапии ADEPT (антитело-направленной ферментной пролекарственной терапии)) или полипептидом, который увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки.

а) Варианты по гликозилированию

В некоторых аспектах антитело, предложенное в данном документе, изменяют с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы создать или удалить один или более сайтов гликозилирования.

Если антитело содержит Fc-область, можно изменять присоединенный к ней олигосахарид. Нативные антитела, вырабатываемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный биантеннарный олигосахарид, который обычно присоединен посредством N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области. Смотрите, например, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). Олигосахарид может содержать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантеннарной олигосахаридной структуры. В некоторых аспектах модификации олигосахарида в антителе по данному изобретению можно осуществлять с целью создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

В одном аспекте предлагаются варианты антител, содержащие нефукозилированный олигосахарид, т.е. олигосахаридную структуру с недостаточным количеством фукозы, присоединенной (непосредственно или косвенно) к Fc-области. Такой нефукозилированный олигосахарид (также называемый «афукозилированный» олигосахарид), в частности, представляет N-связанный олигосахарид с недостаточным количеством фукозного остатка, присоединенного к первой GlcNAc в основе биантенарной олигосахаридной структуры. В одном аспекте предлагаются варианты антитела, содержащие увеличенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с нативным или родительским антителом. Например, доля нефукозилированных олигосахаридов может составлять по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 80% или даже приблизительно 100% (т.е. нет фукозилированных олигосахаридов). Процент нефукозилированных олигосахаридов представляет (среднее) количество олигосахаридов без фукозных остатков относительно суммы всех олигосахаридов, присоединенных к Asn 297 (например, сложных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), согласно результатам измерения методом масс-спектрометрии ВП-МАЛДИ, например, как описано в WO 2006/082515. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному приблизительно в положении 297 в Fc-области (согласно EU-нумерации остатков Fc-области); при этом Asn297 также может быть расположен на приблизительно ±3 аминокислоты выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, вследствие незначительных вариаций последовательностей в антителах. Такие антитела, содержащие увеличенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области, могут иметь улучшенное связывание с рецептором FcγRIIIa и/или улучшенную эффекторную функцию, в частности, улучшенную функцию АЗКЦ. Смотрите, например, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

Примеры клеточных линий, способных производить антитела с уменьшенным дефукозилированием, включают клетки СНО Lecl3 с недостаточностью в отношении фукозилирования белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); US 2003/0157108 и WO 2004/056312, особенно в Примере 11), а также нокаутированные клеточные линии, таких как нокаутированные по гену альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки СНО (смотрите, например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680-688 (2006); и WO 2003/085107), или клетки со сниженной или аннулированной активностью синтеза GDP-фукозы или транспортного белка (смотрите, например, US 2004259150, US 2005031613, US 2004132140, US 2004110282).

В дополнительном аспекте предложены варианты антител с раздвоенными олигосахаридами, например, в которых биантеннарный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, разделен пополам GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь сниженный уровень фукозилирования и/или улучшенную функцию АЗКЦ, как описано выше. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

Также представлены варианты антител с по меньшей мере одним остатком галактозы в олигосахариде, прикрепленном к Fc-области. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию КЗЦ. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

б) Варианты по Fc-области

В некоторых аспектах одну или более аминокислотных модификаций можно вносить в Fc-область антитела, предложенного в данном документе, с получением, таким образом, варианта по Fc-области. Вариант по Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одной или более аминокислотных положениях.

Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение предусматривает вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для вариантов применения, в которых важен период полужизни антитела в условиях in vivo, но при этом определенные эффекторные функции (такие как комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ) и антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ)) не нужны или вредны. Цитотоксические анализы могут быть проведены in vitro и/или in vivo для подтверждения восстановления/ослабления активности КЗЦ и/или АЗКЦ. Например, исследования связывания рецептора Fc (FcR) могут быть проведены, чтобы убедиться в том, что антитело не способно к связыванию FcR (следовательно, вероятно, не обладает АЗКЦ-активностью), но сохраняет способность связывать FcRn. Первичные клетки для опосредования АЗКЦ, NK-клетки, экспрессируют только FcRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcRI, FcRII и FcRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках обобщенно описана в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Аппи. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991). Неограничивающие примеры методов in vitro анализа для оценки АЗКЦ-активности представляющей интерес молекулы, описаны в патенте США №5500362 (смотрите, например, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985); 5821337 (смотрите Bruggemann, M. et al., J. Exp.Med. 166: 1351-1361 (1987)). В качестве альтернативы можно использовать нерадиоактивные методы анализа (смотрите, например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (CellTechnology, Inc., Маунтин-Вью, Калифорния; и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Мадисон, Висконсин). Эффекторные клетки, подходящие для такого анализа, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте АЗКЦ-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как раскрыта в Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998). Также можно проводить анализ связывания Clq, чтобы подтвердить, что антитело не способно связывать Cq и, следовательно, у него отсутствует КЗЦ-активность. Смотрите, например, анализ связывания C1q и С3с в ELISA в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ КЗЦ (смотрите, например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004)). Определение связывания с FcRn и in vivo клиренса/времени полужизни также можно проводить, используя методы, известные в данной области техники (смотрите, например, Petkova, S.B. et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).

Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более остатков Fc-области 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патент США №6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутантов с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый Fc-мутант «DANA» с заменой остатков 265 и 297 аланином (патент США №7332581).

Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. (Смотрите, например, патент США №6737056, WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают АЗКЦ, например, с заменами в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (нумерация остатков EU).

В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcγR, например, с заменами в положениях 234 и 235 Fc-области (нумерация остатков EU). В одном аспекте замены представляют L234A и L235A (LALA). В некоторых аспектах вариант антитела дополнительно содержит D265A и/или P329G в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁. В одном аспекте замены представляют L234A, L235A и P329G (LALA-PG) в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁. (Смотрите, например, WO 2012/130831). В другом аспекте замены представляют L234A, L235A и D265A (LALA-DA) в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁.

В некоторых аспектах изменения сделаны в Fc области, что привело к изменению (то есть или к улучшению, или к ухудшению) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), например, как описано в патенте США №6194551, международной патентной заявке WO 99/51642 и публикации Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Антитела с увеличенным периодом полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), описаны в СГДА2005/0014934 (Hinton et al.). Эти антитела содержат Fc-домен с одной или более заменами, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Такие Fc-варианты включают варианты с заменами в одном или более остатках Fc-области: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замена остатка 434 Fc-области (смотрите, например, патент США №7371826; Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524).

Остатки Fc-области, важные для взаимодействия мышиного Fc-мышиного FcRn, были идентифицированы сайт-направленным мутагенезом (смотрите, например, Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Остатки 1253, H310, H433, N434 и H435 (нумерация согласно EU-индексу) вовлечены во взаимодействие (Medesan, С, et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). Остатки 1253, H310 и H435, как было обнаружено, важны для взаимодействия человеческого Fc с мышиным FcRn (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). Исследования комплекса человеческого Fc-человеческого FcRn показали, что остатки 1253, S254, Н435 и Y436 являются важными для взаимодействия (Firan, М., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). В Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) сообщали и исследовали различные мутанты остатков 248-259, и 301-317, и 376-382, и 424-437.

В некоторых вариантах осуществления вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcRn, например, с заменами в положениях 253, и/или 310, и/или 435 Fc-области (нумерация остатков EU). В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 253, 310 и 435. В одном аспекте замены представляют 1253А, Н310А и Н435А в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1 . Смотрите, например, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcRn, например, с заменами в положениях 310, и/или 433, и/или 436 Fc-области (нумерация остатков EU). В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 310, 433 и 436. В одном аспекте замены представляют Н310А, Н433А и Y436A в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1. (Смотрите, например, WO 2014/177460 А1).

В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают связывание с FcRn, например, с заменами в положениях 252, и/или 254, и/или 256 Fc-области (нумерация остатков EU). В некоторых аспектах вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 252, 254 и 256. В одном аспекте замены представляют M252Y, S254T и Т256Е в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG₁. Смотрите также Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821; и WO 94/29351 в отношении других примеров вариантов по Fc-области.

С-конец тяжелой цепи представленного в данном документе антитела может представлять собой полный С-конец, оканчивающийся аминокислотными остатками PGK. С-конец тяжелой цепи может представлять собой укороченный С-конец, в котором были удалены один или два С-концевых аминокислотных остатка. В одном предпочтительном аспекте С-конец тяжелой цепи представляет собой укороченный С-конец, оканчивающийся PG. В одном аспекте из всех представленных в данном документе аспектов антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую С-концевой СН3-домен, описанный в данном документе, содержит С-концевой глицин-лизиновый дипептид (G446 и К447, нумерация в соответствии с индексом EU положений аминокислот). В одном аспекте из всех представленных в данном документе аспектов антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую С-концевой СН3-домен, описанный в данном документе, содержит С-концевой остаток глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU положений аминокислот).

в) Цистеин-сконструированные варианты антител

В некоторых аспектах может быть желательно создавать антитела, сконструированные с использованием цистеина, например, антитела THIOAB™, в которых один или более остатков замещены остатками цистеина. В конкретных аспектах замещенные остатки находятся в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков цистеином реакционноспособные тиоловые группы располагаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как лекарственные фрагменты или фрагменты линкер-лекарственный препарат, для создания иммуноконъюгата, как дополнительно описано в данном документе. Антитела, сконструированные с использованием цистеина, можно получить, как описано, например, в патентах США №№7521541, 830930, 7855275, 9000130 или в заявке WO 2016040856.

6. Иммуноконъюгаты

В изобретении также предложены иммуноконъюгаты, содержащие предложенное в данном документе антитело, конъюгированное (химически связанное) с одним или более средствами, в одном варианте осуществления такими как цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, лекарственные средства, ингибиторы роста, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

В одном варианте осуществления в изобретении предложены иммуноконъюгаты, содержащие предложенное в данном документе антитело, конъюгированное с полимером. Используемый в данном документе термин «полимер» включает химические полимеры и белковые полимеры. В одном варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело по данному изобретению, конъюгированное с удлиненным рекомбинантным полипептидом (XTEN). «Удлиненные рекомбинантные полипептиды» известны в данной области техники и представляют собой, например, раскрытые в US 20190083577. В одном варианте осуществления иммуноконъюгат содержит XTEN (а), содержащий последовательность, выбранную из GGSPAGSCTSP, GASASCAPSTG, TAEAAGCGTAEAA и GPEPTCPAPSG. (б) имеет длину от 36 до 3000 L-аминокислотных остатков и/или (в), где сумма остатков глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р) составляют более 90% от общего количества аминокислотных остатков XTEN.

Б. Рекомбинантные методы и композиции

Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в US 4816567. Для этих способов представлена одна или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело.

В одном аспекте представлены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело настоящего изобретения.

В одном аспекте предложен способ получения антитела, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую предложенное выше антитело, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).

Для рекомбинантного получения антитела, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, например, как описано выше, являются выделенными и вставленными в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такие нуклеиновые кислоты легко выделять и секвенировать, используя традиционные процедуры (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела), или получать рекомбинантными методами, или получать химическим синтезом.

Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитела векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Например, антитела могут вырабатываться в бактериях, в частности, если не требуется гликозилирование и Fc-эффекторная функция. Касательно экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях смотрите, например, патенты US 5648237, US 5789199 и US 5840523. (Смотрите также Charlton, K.А., в: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антитела в Е. coli). После экспрессии антитело можно выделять из бактериальной клеточной пасты в растворимую фракцию и дополнительно очищать. В некоторых вариантах осуществления, клетка-хозяин представляет собой клетку E.coli.

Клетки позвоночных также можно использовать в качестве хозяев. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами применимых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (клетки 293 или 293Т, описанные, например, в Graham F.L.et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); клетки Сертоли мышей (клетки ТМ4, описанные, например, в Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK; клетки печени серой крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562); клетки TRI (как описано, например, в Mather, J.Р. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие подходящие линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), включая DHFR- клетки СНО (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для получения антител, смотрите, например, в Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol.248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

В одном аспекте клетка-хозяин является эукариотической, например клетка яичника китайского хомяка (СНО) или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NS0, Sp20). В одном предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО. Получение антител по изобретению в клетках СНО может улучшать возможность введения антитела через шприц.

В. Фармацевтические композиции

В дополнительном аспекте предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из предложенных в данном документе антител, например, для применения в любом из нижеприведенных терапевтических способов. В одном аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в данном документе антител и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в данном документе антител и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, как описано ниже.

Фармацевтические композиции описанного в данном документе антитела, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, получают путем смешивания такого антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители в общем случае являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях и включают, но не ограничиваются этим: буферы, такие как гистидин, фосфат, цитрат, ацетат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензил аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типовые фармацевтически приемлемые носители по данному документу дополнительно включают средства для диспергирования лекарственных препаратов в интерстициальном пространстве, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Halozyme, Inc.). Некоторые иллюстративные sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в патентных публикациях США №№2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP комбинируют с одной или более дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Типовые композиции лиофилизированных антител описаны в патенте США №6267958. Водные композиции антител включают описанные в патенте США №6171586 и WO 2006/044908, причем последние композиции содержат гистидин-ацетатный буфер.

Фармацевтическая композиция по данному документу также может содержать более одного активного ингредиента, если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно те, которые обладают дополняющими видами активности и не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты приемлемо присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулах, полученных, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах для доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Фармацевтические композиции для замедленного высвобождения можно получать. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул.

Фармацевтические композиции, предназначенные для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность можно легко обеспечить, например, посредством фильтрации через стерильные фильтровальные мембраны.

Г. Терапевтические способы и пути введения

Любое из антител, которые связываются с VEGF-А человека и ANG2 человека, представленные в данном документе, можно использовать в терапевтических способах.

В одном аспекте предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, для применения в качестве лекарственного средства. В дополнительных аспектах предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, для применения в лечении сосудистого заболевания. В некоторых аспектах предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, для применения в способе лечения. В некоторых аспектах в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, для применения в способе лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание, включающем введение индивидууму эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека. В одном таком аспекте способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства (например, одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дополнительных терапевтических средств), например, как описано ниже. В дополнительных аспектах в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-А человека и ANG2 человека, для применения в ингибировании ангиогенеза. В некоторых аспектах в изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, для применения в способе ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, для ингибирования ангиогенеза. «Индивидуум» в соответствии с любым из вышеприведенных аспектов предпочтительно является человеком.

В дополнительных аспектах предложено антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, для применения в лечении заболевания глаз. В одном варианте осуществления заболевание глаз выбрано из ВМД (в одном варианте осуществления влажной ВМД, сухой ВМД, промежуточной ВМД, запущенной ВМД и географической атрофии (ГА)), макулярной дегенерации, макулярного отека, ДМО (в одном варианте осуществления фокального, нецентрального ДМО и диффузного, с вовлечением центрального отдела сетчатки ДМО), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в одном варианте осуществления пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР) и высотной ДР), других связанных с ишемией ретинопатии, РН, окклюзии вены сетчатки (ОВС) (в одном варианте осуществления форм, связанных с центральной веной (ОЦВС) и ветвями вены (ОВВС)), ХНВ (в одном варианте осуществления миопической ХНВ), неоваскуляризации роговицы, заболеваний, связанных с неоваскуляризацией роговицы, неоваскуляризации сетчатки, заболеваний, связанных с неоваскуляризацией сетчатки/хориоидальной неоваскуляризацией, центральной серозной ретинопатии (ЦСР), патологической миопии, болезни Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаза, СЭВРП, болезни Коутса, болезни Норри, нарушений сетчатки, связанных с синдромом остеопороза-псевдоглиомы (ОППГ), субконъюнктивального кровоизлияния, покраснения радужки, неоваскулярного заболевания глаз, неоваскулярной глаукомы, пигментного ретинита (ПР), гипертонической ретинопатии, ангиоматозной пролиферации сетчатки, макулярной телеангиэктазии, неоваскуляризации радужной оболочки, внутриглазной неоваскуляризации, дегенерации сетчатки, кистозного макулярного отека (КМО), васкулита, отека диска зрительного нерва, ретинита, включая, помимо прочего, ЦМВ-ретинит, меланому глаз, бластому сетчатки, конъюнктивит (в одном варианте осуществления инфекционный конъюнктивит и неинфекционный (в одном варианте осуществления аллергический) конъюнктивит), наследственного амавроза Лебера (также известного как наследственный амавроз Лебера или НАЛ), увеита (включая инфекционный и неинфекционный увеит), хориоидита (в одном варианте осуществления мультифокального хориоидита), гистоплазмоза глаз, блефарита, синдрома сухого глаза, травматического повреждения глаз, болезни Шегрена и других офтальмологических заболеваний, причем заболевание или болезнь связана с глазной неоваскуляризацией, транссудацией и/или отеком сетчатки или атрофией сетчатки. В одном варианте осуществления заболевание глаз выбрано из ВМД (в одном варианте осуществления влажной ВМД, сухой ВМД, промежуточной ВМД, запущенной ВМД и географической атрофии (ГА)), макулярной дегенерации, макулярного отека, ДМО (в одном варианте осуществления фокального, нецентрального ДМО и диффузного, с вовлечением центрального отдела сетчатки ДМО), ретинопатии, диабетической ретинопатии (ДР) (в одном варианте осуществления пролиферативной ДР (ПДР), непролиферативной ДР (НПДР) и высотной ДР.

В дополнительном аспекте в изобретении предложено применение антитела, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, в производстве или получении лекарственного средства. В одном аспекте лекарственное средство предназначено для лечения сосудистого заболевания. В дополнительном аспекте лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения сосудистого заболевания, включающем введение индивидууму, имеющему сосудистое заболевание, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, как описано ниже.

В одном аспекте лекарственное средство предназначено для лечения заболевания глаз. В дополнительном аспекте лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания глаз, включающем введение индивидууму, имеющему заболевание глаз, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, например, как описано ниже.

В дополнительном аспекте в изобретении предложен способ лечения сосудистого заболевания. В одном аспекте способ включает введение индивидууму, имеющему такое сосудистое заболевание, эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, как описано ниже.

В дополнительном аспекте в изобретении предложен способ лечения заболевания глаз. В одном аспекте способ включает введение индивидууму, имеющему такое заболевание глаз, эффективного количества антитела, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека. В одном таком аспекте указанный способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, как описано ниже.

«Индивидуум» в соответствии с любым из вышеуказанных аспектов может быть человеком.

В дополнительном аспекте в изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие любое из предложенных в данном документе антител, которые связываются с VEGF-A человека и ANG2 человека, например, для применения в любом из вышеприведенных терапевтических способов. В одном аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в данном документе антител, которые связываются с VEGF-A человека и ANG2 человека, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте фармацевтическая композиция содержит любое из предложенных в данном документе антител, которые связываются с VEGF-А человека и ANG2 человека, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, описанное ниже.

Антитело по изобретению можно вводить путем интравитреального введения (например, интравитреальной инъекции) или с применением порт-устройства доставки. В одном варианте осуществления антитело по изобретению вводят с применением порт-устройства доставки в течение периода в шесть месяцев или более, в одном варианте осуществления 8 месяцев или более, в одном варианте осуществления 9 месяцев или более, в одном варианте осуществления 12 месяцев или более до заправки порт-устройства доставки. В одном варианте осуществления антитело по изобретению вводят с применением порт-устройства доставки, при этом антитело вводят в порт-устройство доставки в концентрации 150 мг/мл или более, в одном варианте осуществления в концентрации 200 мг/мл или более.

Антитела настоящего изобретения можно вводить по отдельности или использовать в комбинированной терапии. Например, комбинированная терапия содержит введение антитела настоящего изобретения и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства (например, одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дополнительных терапевтических средств).

В некоторых вариантах осуществления согласно (или применительно к) любому из вышеуказанных вариантов осуществления глазное расстройство представляет внутриглазное неоваскуляризационное заболевание, выбранное из группы, состоящей из пролиферативных ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетической и других связанных с ишемией ретинопатии, диабетического макулярного отека, патологической миопии, болезни Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаз, окклюзии вены сетчатки (ОВС), включая ОЦВС и ОВВС, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки и ретинопатии недоношенных (РН).

В некоторых случаях представленное в данном документе антитело, которое связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека, можно вводить в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством для лечения глазного расстройства, например, глазного расстройства, описанного в данном документе (например, ВМД (например, влажной ВМД), ДМО, ДР, ОВС или ГА).

Любое подходящее терапевтическое средство от ВМД можно вводить как дополнительное терапевтическое средство в комбинации с представленным в данном документе антителом, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека, для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включая, помимо прочего, антагонист VEGF, например, антитело к VEGF (например, LUCENTIS® (ранибизумаб), RTH-258 (ранее ESBA-1008, одноцепочечный фрагмент антитела к VEGF; Novartis), или биспецифическое антитело к VEGF (например, биспецифическое антитело к VEGF/к ангиопоэтину 2, такое как фарицимаб; Roche)), растворимый слитый белок рецептора VEGF (например, EYLEA® (афлиберцепт)), DARPin® к VEGF (например, абиципар пегол; Molecular Partners AG/Allergan), или аптамер к VEGF (например, MACUGEN® (пегаптаниб натрия)); антагонист фактора роста, полученного из тромбоцитов (PDGF), например, антитело к PDGF, антитело к PDGFR (например, REGN2176-3), пегилированный аптамер к PDGF-BB (например, FOVISTA®; Ophthotech/Novartis), растворимый слитый белок рецептора PDGFR или двойной антагонист PDGF/VEGF (например, низкомолекулярный ингибитор (например, DE-120 (Santen) или Х-82 (TyrogeneX)) или биспецифическое антитело к PDGF/к VEGF)); VISUDYNE® (вертепорфин) в комбинации с фотодинамической терапией; антиоксидант; антагонист системы комплемента, например, антагонист фактора комплемента С5 (например, низкомолекулярный ингибитор (например, ARC-1905; Opthotech) или антитело к С5 (например, LFG-316; Novartis), антагонист пропердина (например, антитело к пропердину, например, CLG-561; Alcon), или антагонист фактора комплемента D (например, антитело к фактору комплемента D, например, лампализумаб; Roche)); С3-блокирующий пептид (например, APL-2, Appellis); модификатор цикла превращений родопсина (например, гидрохлорид эмиксустата); скваламин (например, OHR-102; Ohr Pharmaceutical); витаминные и минеральные добавки (например, описанные в исследовании 1 (AREDS1; цинк и/или антиоксиданты) и исследовании 2 возрастных заболеваний глаз (AREDS2; цинк, антиоксиданты, лютеин, зеаксантин и/или омега-3 жирные кислоты)); клеточную терапию, например, NT-501 (Renexus); РН-05206388 (Pfizer), трансплантацию клеток huCNS-SC (StemCells), CNTO-2476 (линия стволовых клеток пуповины; Janssen), OpRegen (суспензия клеток RPE; Cell Cure Neurosciences) или трансплантацию клеток MA09-hRPE (Ocata Therapeutics); антагонист тканевого фактора (например, hI-conI; Iconic Therapeutics); агонист альфа-адренергического рецептора (например, тартрат бримонидина; Allergan); пептидную вакцину (например, S-646240; Shionogi); антагонист амилоида-бета (например, моноклональное антитело к амилоиду-бета, например, GSK-933776); антагонист S1P (например, антитело к S1P, например, iSONEP™; Lpath Inc); антагонист ROBO4 (например, антитело к ROBO4, например, DS-7080а; Daiichi Sankyo); лентивирусный вектор, экспрессирующий эндостатин и ангиостатин (например, RetinoStat); и любую их комбинацию. В некоторых случаях терапевтические средства от ВМД (включая любые из предыдущих терапевтических средств от ВМД) могут быть совместно составленными. Например, антитело к PDGFR REGN2176-3 можно совместно составлять с афлиберцептом (EYLEA®). В некоторых случаях такой совместный состав можно вводить в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека, по изобретению. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ВМД (например, влажную ВМД).

Любое подходящее терапевтическое средство от ДМО и/или ДР можно вводить в комбинации с антителом, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека, по изобретению для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включая, помимо прочего, антагонист VEGF (например, LUCENTIS ROBO4 или EYLEA®), кортикостероид (например, кортикостероидный имплант (например, OZURDEX® (интравитреальный имплант дексаметазона) или ILUVIEN® (интравитреальный имплант ацетонида флуоцинолона)) или кортикостероид, составленный для введения интравитреальной инъекцией (например, ацетонид триамцинолона)), или их комбинации. В некоторых случаях глазное расстройство представляет собой ДМО и/или ДР.

Представленное в данном документе антитело, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека, можно вводить в комбинации с терапией или хирургической процедурой для лечения глазного расстройства (например, ВМД, ДМО, ДР, ОВС или ГА), включая, например, лазерную фотокоагуляцию (например, панретинальную фотокоагуляцию сетчатки (ПФС)), лазерную обработку друз, хирургию макулярной дыры, макулярную транслокационную хирургию, имплантируемые миниатюрные телескопические устройства, ангиографию PHI-motion (также известную как микролазерная терапия и лечение питающих сосудов), терапию протонным пучком, микростимуляционную терапию, хирургию отслоения сетчатки и стекловидного тела, пломбирование склеры, субмакулярную хирургию, транспупиллярную термотерапию, терапию с использованием фотосистемы I, использование РНК-интерференции (РНКи), экстракорпоральный реофорез (также известный как мембранная дифференциальная фильтрация и реотерапия), имплантацию микрочипа, терапию стволовыми клетками, генно-заместительную терапию, генную терапию с использованием рибозимов (включая генную терапию для восприимчивого к гипоксии элемента, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; и генную терапию PDEF, GenVec), трансплантацию фоторецепторов/клеток сетчатки (включая трансплантируемые эпителиальные клетки сетчатки, Diacrin, Inc.; трансплантат клеток сетчатки, например, Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, СНА Biotech), акупунктуру и их комбинации.

Такие виды комбинированной терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (при котором два или более терапевтических средств включены в один и тот же или отдельные препараты) и раздельное введение, и в этом случае введение антитела, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека, по изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства или средств. В одном варианте осуществления введение антитела, которое связывается с VEGF человека и ANG2 человека, по изобретению и введение дополнительного терапевтического средства может разделять приблизительно одного, двух, трех, четырех или пяти месяцев, или приблизительно одной, двух или трех недель, или приблизительно одних, двух, трех, четырех, пяти или шести суток.

Антитело по изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, если это необходимо для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение дозы можно проводить любым удобным способом, например путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или постоянным. В данном документе предложены различные схемы введения доз, включая без ограничения однократное или многократное введение в различные временные точки, болюсное введение и импульсную инфузию.

Антитела по настоящему изобретению составляют, дозируют и вводят способом, соответствующим надлежащей медицинской практике. Факторы, которые необходимо учитывать в этом контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место доставки средства, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело необязательно составляют с одним или более средствами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела, присутствующего в фармацевтической композиции, типа нарушения или лечения и других факторов, которые обсуждались выше. Другие средства обычно применяют в таких же дозировках и вводят путями, описанными в данном документе, или в дозировках, составляющих от приблизительно 1 до 99% дозировок, описанных в данном документе, или в любой дозировке и любым путем, которые эмпирически/клинически определены как подходящие.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела по настоящему изобретению (применяемого отдельно или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими средствами) зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, того, вводится ли антитело с профилактической или терапевтической целью, предыдущей терапии, истории болезни пациента и его ответа на антитело, а также решения лечащего врача. Антитело предпочтительно вводить пациенту за один раз или в течение серии курсов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания, начальная кандидатная дозировка антитела для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг-10 мг/кг), например, за одно или более отдельных введений или в виде непрерывной инфузии. Одна типичная суточная доза может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. В случае повторных введений в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение в общем случае проводят до достижения необходимой степени подавления симптомов заболевания. Одна типовая дозировка антитела находится в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить с интервалами, например, раз в неделю или раз в три недели (например, чтобы пациент получал от приблизительно двух до приблизительно двадцати или, например, приблизительно шести доз антитела). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или больше меньших доз. Эффективность такой терапии легко контролировать с помощью традиционных методик и анализов.

Д. Готовые изделия

В другом аспекте в изобретении предложено готовое изделие, содержащее материалы, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностики вышеуказанных нарушений. Готовое изделие содержит контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку на нем или связанные с ним. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры можно сформировать из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией эффективна для лечения, предупреждения и/или диагностики патологического состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой гиподермической иглой для инъекций). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой антитело по настоящему изобретению. На этикетке или на вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного патологического состояния.

Кроме того, готовое изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит антитело по настоящему изобретению; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Готовое изделие в этом аспекте настоящего изобретения может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, на котором указано, что композиции можно применять для лечения конкретного патологического состояния. В качестве альтернативы или в качестве дополнения готовое изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно также может содержать другие материалы, необходимые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы. Е. Устройства Антитело по изобретению можно вводить в глаз с применением глазного импланта, в одном варианте осуществления с применением порт-устройства доставки.

Порт-устройство доставки представляет собой имплантируемое многоразовое устройство, которое может высвобождать терапевтическое средств (например, антитело по изобретению) в течение нескольких месяцев (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более месяцев). Примеры порт-устройств доставки, которые могут быть использованы, включают в себя устройства от ForSight Labs, LLC и/или ForSight VISION4, например, описанные в публикациях международных патентных заявок №WO 2010/088548, WO 2015/085234, WO 2013/116061, WO 2012/ 019176, WO 2013/040247 и WO 2012/019047, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки.

Например, в изобретении предложены порт-устройства доставки, которые включают резервуары, содержащие любое из описанных в данном документе антител. Порт-устройство доставки может дополнительно включать проксимальную область, трубчатый корпус, соединенный с проксимальной областью и сообщающийся по текучей среде с резервуаром, и одно или более выпускных отверстий, сообщающихся по текучей среде с резервуаром и выполненных с возможностью выпуска композиции в глаз. Трубчатый корпус может иметь внешний диаметр, сконфигурированный для введения через разрез или отверстие в глазу, приблизительно 0,5 мм или меньше. Устройство может иметь длину от приблизительно 1 мм до приблизительно 15 мм (например, приблизительно 1 мм, приблизительно 2 мм, приблизительно 4 мм, приблизительно 5 мм, приблизительно 6 мм, приблизительно 7 мм, приблизительно 9 мм, приблизительно 11 мм, приблизительно 13 мм или приблизительно 15 мм в длину). Резервуар может иметь любой подходящий объем. В некоторых случаях резервуар имеет объем от приблизительно 1 мкл до приблизительно 100 мкл (например, приблизительно 1 мкл, приблизительно 5 мкл, приблизительно 10 мкл, приблизительно 20 мкл, приблизительно 50 мкл, приблизительно 75 мкл или приблизительно 100 мкл). Устройство или его составные части могут быть изготовлены из любого подходящего материала, например полиимида.

В некоторых случаях порт-устройство доставки включает резервуар, содержащий любое из описанных в данном документе антител и одно или более дополнительных соединений.

В некоторых случаях порт-устройство доставки включает любое из антител или конъюгатов антител, описанных в данном документе, и дополнительный антагонист VEGF.

3. Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения

Далее перечислены конкретные варианты осуществления настоящего изобретения.

1. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратой VEGF-A и паратой ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем паратоп VEGF-A содержит аминокислотные остатки CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп ANG2 содержит аминокислотные остатки CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела.

2. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратоп VEGF-A и паратоп ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домен VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домен VH), причем пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека.

3. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратоп VEGF-A и паратоп ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домен VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домен VH), причем антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF-A человека и с тем же эпитопом на ANG2 человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и вариабельным доменом легкой цепи SEQ ID NO: 20.

4. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее паратоп VEGF-A и паратоп ANG2 в одной родственной паре вариабельного домена легкой цепи (домена VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (домена VH), причем

• паратоп VEGF-A содержит аминокислотные остатки CDR-H2, CDR-L1 и CDR-L3 антитела, причем паратоп ANG2 содержит аминокислотные остатки CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 антитела; и/или

• пара вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи одновременно связывается с VEGF-A человека и ANG2 человека; и/или

• антитело связывается с тем же эпитопом на VEGF-А человека и с тем же эпитопом на ANG2 человека, что и антитело с вариабельным доменом тяжелой цепи SEQ ID NO: 19 и вариабельным доменом легкой цепи SEQ ID NO: 20; и/или

• Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более; и/или

• Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света; и/или

• 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

5. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

6. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

7. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации Кабату.

8. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (в) CDR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации Кабату.

9. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации Кабату.

10. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит аминокислотные остатки, содержащиеся в паратопе VEGF-A и в паратопе ANG2 антитела, имеющего домен VH SEQ ID NO: 19 и домен VL SEQ ID NO: 20.

11. Антитело по варианту осуществления 9 или 10, содержащее

- паратоп VEGF-A, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66 и D95, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: 12, Y3, Y27, W27a, Е32, R92, Y93, Н94 и Р95; и

- паратоп ANG2, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, R94, V96, F98 и F99, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57 и Y91.

12. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее домен VH, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

13. Антитело по варианту осуществления 12, содержащее

- паратоп VEGF-A, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66 и D95, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: 12, Y3, Y27, W27a, Е32, R92, Y93, Н94 и Р95; и

- паратоп ANG2, содержащий следующие аминокислотные остатки в домене VH: Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, R94, V96, F98 и F99, и следующие аминокислотные остатки в домене VL: Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57 и Y91.

14. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

15. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

16. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

17. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, причем домен VH содержит аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, R66 и R94; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, причем домен VL содержит аминокислотные остатки 12, Y3, L46, F49 и Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

18. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

19. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен.

20. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в одном или более положениях 1, 2, 4-25, 28, 35d-54, 59, 60, 67-93, 97, 101-113 SEQ ID NO: 19; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен, причем аминокислотные замены расположены в положениях 1, 4-26, 27b-27d, 33-45, 47, 48, 51, 52, 58-90, 96-107 SEQ ID NO: 20, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату.

21. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен.

22. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, и содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, содержащую до 15 аминокислотных замен; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, содержащую до 15 аминокислотных замен.

23. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 19 и последовательность VL SEQ ID NO: 20.

24. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 19 и последовательность VL SEQ ID NO: 20.

25. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 25.

26. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 25.

27. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 18.

28. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 18.

29. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

30. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-А121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

31. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

32. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

33. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-А121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

34. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; причем Fab-фрагмент антитела связывается (i) с VEGF-A121 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA, и (ii) с ANG2 человека с K_D менее 50 пМ, измеренной с помощью KinExA.

35. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более.

36. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более.

37. Антитело, которое связывается с VEGF-А человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более.

38. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более.

39. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более.

40. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (e) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой начала агрегации 70°С и более.

41. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

42. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

43. Антитело, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

44. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

45. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

46. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; причем Fab-фрагмент антитела характеризуется температурой плавления более 80°С, измеренной с помощью динамического рассеяния света.

47. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

48. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

49. Антитело, которое связывается с VEGF-А человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

50. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (г) каркас тяжелой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки НЗ, D26, F27, Е29 и Y30, (ii) FR3, содержащим аминокислотные остатки R66 и R94; и домен VL, содержащий (д) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (ж) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и (и) каркас легкой цепи человека с (i) FR1, содержащим аминокислотные остатки 12 и Y3, (ii) FR2, содержащим аминокислотные остатки L46 и F49, (iii) FR3, содержащим аминокислотный остаток Е57, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

51. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащее в одной паре домена VH и VL: (i) домен VH, содержащий аминокислотные остатки Н3, D26, F27, Е29, Y30, D35b, D35c, D55, Н56, K57, Y58, Т61, K62, F63, 164, G65, R66, R94, D95, V96, F98 и F99, и (ii) домен VL, содержащий аминокислотные остатки 12, Y3, Y27, W27a, Е32, L46, F49, D50, F53, K54, V55, Y56, Е57, Y91, R92, Y93, Н94 и Р95, при этом нумерация доменов VH и VL осуществляется в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

52. Антитело, которое специфически связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, причем антитело содержит домен VH, содержащий (а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и домен VL, содержащий (г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, содержащее (а) домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; и (б) домен VL, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20; причем 20 мМ раствор His/HisHCl с рН 6,0, содержащий 180 мг/мл Fab-фрагмента антитела, имеет вязкость менее 20 сП при 20°С, которая определяется с помощью динамического рассеяния света способом DLS с латексными шариками, описанном в примере 8.

53. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, являющееся моноклональным антителом.

54. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, являющееся фрагментом антитела, который связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека.

55. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело является биспецифическим.

56. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело является Fab-фрагментом.

57. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело является фрагментом биспецифического антитела.

58. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело является мультиспецифическим антителом.

59. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело специфически связывается с VEGF-A человека.

60. Антитело по любому из предыдущих вариантов осуществления, причем антитело специфически связывается с ANG2 человека.

61. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из вариантов осуществления 1-58.

62. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по варианту осуществления 59.

63. Экспрессионный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по варианту осуществления 61.

64. Способ получения антитела, которое связывается с VEGF-A человека и с ANG2 человека, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 60 так, чтобы получить антитело.

65. Способ по варианту осуществления 64, дополнительно включающий извлечение антитела из клетки-хозяина.

66. Способ по варианту осуществления 64 или 65, причем клеткой-хозяином является клетка Е. coli.

67. Способ по варианту осуществления 64 или 65, причем клеткой-хозяином является клетка СНО.

68. Антитело, полученное способом по варианту осуществления 64 или 65.

69. Фармацевтический состав, содержащий антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 и фармацевтически приемлемый носитель.

70. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 для применения в качестве лекарственного средства.

71. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 для применения в лечении сосудистого заболевания.

72. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 для применения в лечении сосудистого заболевания глаз.

73. Применение антитела по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 65 в производстве лекарственного средства.

74. Применение антитела по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтической композиции варианта осуществления 65 в производстве лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза.

75. Способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтического состава по варианту осуществления 69.

76. Способ лечения индивидуума, имеющего сосудистое заболевание глаз, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтического состава по варианту осуществления 69.

77. Способ ингибирования ангиогенеза у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтического состава по варианту осуществления 69 для ингибирования ангиогенеза.

78. Порт-устройство доставки, содержащее антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтический состав по варианту осуществления 69.

79. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтический состав по варианту осуществления 69 для глазного введения с помощью порт-устройства доставки.

80. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтический состав по варианту осуществления 69 для глазного введения с помощью порт-устройства доставки в соответствии с вариантом осуществления 79, причем введение осуществляют в течение периода в шесть месяцев или более, в одном варианте осуществления 8 месяцев или более, в одном варианте осуществления 9 месяцев или более до заправки порт-устройства доставки.

81. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-60 или фармацевтический состав по варианту осуществления 69 для применения в качестве медицинского средства путем введения антитела или фармацевтического состава с применением порт-устройства доставки, причем антитело вводят в порт-устройство доставки в концентрации 150 мг/мл или более, в одном варианте осуществления в концентрации 200 мг/мл или более.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены для помощи в понимании настоящего изобретения, подлинный объем которого указан в приложенной формуле изобретения. Следует понимать, что в изложенных процедурах можно осуществлять модификации, не отступая от сущности изобретения.

Материалы и общие методы

Аффинность VEGF-A121 человека в Kinexa.

• Инструменты и материалы.

Использовали прибор KinExA 3200 от Sapidyne Instruments (Boise, ID) с автоматическим пробоотборником. Шарики из полиметилметакрилата (ПММА) были приобретены у Sapidyne, антитела к VEGF были приобретены у R&D Systems (Mab293, BAF293). Конъюгат Streptavidin Alexa Fluor™ 647 был приобретен у компании Thermo Fisher Scientific (S21374). ФСБ (фосфатно-солевой буфер), БСА (фракция V бычьего сывороточного альбумина), VEGFA-121 (SEQ ID NO: 28) получали в компании (Roche).

• Получение шариков, покрытых антигеном

Гранулы ПММА покрывали в соответствии с протоколом KinExA Handbook (адсорбционное покрытие, Sapidyne). Сначала добавляли 30 мкг антитела к VEGF МАВ293 (R&D) в 1 мл ФСБ (рН 7,4) на флакон (200 мг) шариков для адсорбционного покрытия. После вращения в течение 2 ч при комнатной температуре надосадочную жидкость удаляли и добавляли 1 мл блокирующего раствора (10 мг/мл БСА в буфере) и перемешивали в течение 1 ч.

• KinExA анализ равновесия

Все эксперименты KinExA проводились при комнатной температуре (КТ) с использованием ФСБ рН 7,4 с 0,01% БСА и 0,01% Твин20 (BioRad, №161-0781) в качестве рабочего буфера. Образцы и шарики получали в буфере LowCross (Candor Bioscience) для уменьшения неспецифического связывания, наблюдаемого в предыдущих измерениях. Использовали скорость потока 0,25 мл/мин. Постоянное количество VEGFA-121-His (50 пМ и во втором эксперименте 500 пМ) титровали исследуемым антителом путем двукратного серийного разведения, начиная с 4 нМ (диапазон концентраций 1,95 пМ - 4000 пМ). Комплексы антиген-антитело инкубировали при КТ не менее 8 часов для достижения равновесия. Затем уравновешенные смеси пропускали через колонку с шариками, связанными с антителом к VEGF (Mab293), в системе KinExA в объеме 750 мкл для 50 пМ постоянного VEGF и в объеме 125 мкл для 500 пМ постоянного VEGF, что позволяло захватывать шариками несвязанные VEGFA-121, не нарушая равновесного состояния раствора. Связанный VEGFA-121 обнаруживали с использованием второго биотинилированного антитела к VEGF (BAF293) с концентрацией 250 нг/мл и последующей инъекции 250 нг/мл конъюгата Streptavidin Alexa Fluor™ 647 в буфер для образцов. Каждый образец измеряли в двух повторах для всех равновесных экспериментов. K_D получали в нелинейном регрессионном анализе данных с использованием модели однородного связывания с одним сайтом, содержащейся в программном обеспечении KinExA (версия 4.0.11), с использованием способа «стандартного анализа». Программное обеспечение вычисляет K_D и определяет 95% доверительный интервал, подгоняя точки данных к теоретической кривой K_D 95% доверительный интервал задается как низкая K_D и высокая K_D.

Для окончательного определения K_D было выполнено определение п-кривой двух измерений с различными постоянными концентрациями VEGFA-121. Анализ n-кривой можно использовать для анализа нескольких стандартных экспериментов с K_D на одной и той же оси, чтобы получить более точное определение K_D.

Аффинность ANG2 человека в Kinexa.

• Инструменты и материалы

Использовали прибор KinExA 3200 от Sapidyne Instruments (Boise, ID) с автоматическим пробоотборником. Шарики из полиметилметакрилата (ПММА) были приобретены у Sapidyne, антитела к Ang2 были приобретены у R&D Systems (МАВ098, ВАМ0981). Конъюгат Streptavidin Alexa Fluor™ 647 был приобретен у компании Thermo Fisher Scientific (S21374). ФСБ (фосфатно-солевой буфер), БСА (фракция V бычьего сывороточного альбумина), Ang2 (SEQ ID NO: 27) получали в компании (Roche).

• Получение шариков, покрытых антигеном

Гранулы ПММА покрывали в соответствии с протоколом KinExA Handbook (адсорбционное покрытие, Sapidyne). Сначала добавляли 20 мкг антитела к Ang2 МАВ098 (R&D) в 1 мл ФСБ (рН 7,4) на флакон (200 мг) шариков для адсорбционного покрытия. После вращения в течение 2 ч при комнатной температуре надосадочную жидкость удаляли и добавляли 1 мл блокирующего раствора (10 мг/мл БСА в буфере) и перемешивали в течение 1 ч.

• KinExA анализ равновесия

Все эксперименты KinExA проводились при комнатной температуре (КТ) с использованием ФСБ рН 7,4 с 0,01% БСА и 0,01% Твин20 (BioRad, №161-0781) в качестве рабочего буфера. Образцы и шарики получали в буфере LowCross (Candor Bioscience) для уменьшения неспецифического связывания, наблюдаемого в предыдущих измерениях. Использовали скорость потока 0,25 мл/мин. Постоянное количество Ang2-RBD-muFc (50 пМ и во втором эксперименте 500 пМ) титровали исследуемым антителом путем двукратного серийного разведения, начиная с 4 нМ (диапазон концентраций 1,95 пМ-4000 пМ). Комплексы антиген-антитело инкубировали при КТ не менее 8 часов для достижения равновесия. Затем уравновешенные смеси пропускали через колонку с шариками, связанными с антителом к Ang2 (МАВ098), в системе KinExA в объеме 750 мкл для 50 пМ постоянного Ang2 и в объеме 188 мкл для 500 пМ постоянного Ang2, что позволяло захватывать шариками несвязанные Ang2, не нарушая равновесного состояния раствора. Связанный Ang2 обнаруживали с использованием второго биотинилированного антитела к Ang2 (ВАМ0981) с концентрацией 250 нг/мл и последующей инъекции 250 нг/мл конъюгата Streptavidin Alexa Fluor™ 647 в буфер для образцов. Каждый образец измеряли в двух повторах для всех равновесных экспериментов. K_D получали в нелинейном регрессионном анализе данных с использованием модели однородного связывания с одним сайтом, содержащейся в программном обеспечении KinExA (версия 4.0.11), с использованием способа «стандартного анализа». Программное обеспечение вычисляет K_D и определяет 95% доверительный интервал, подгоняя точки данных к теоретической кривой KD. 95% доверительный интервал задается как низкая K_D и высокая K_D.

Для окончательного определения K_D было выполнено определение п-кривой двух измерений с различными постоянными концентрациями Ang2. Анализ n-кривой можно использовать для анализа нескольких стандартных экспериментов с K_D на одной и той же оси, чтобы получить более точное определение K_D.

Кинетика связывания VEGF-A человека, оцененная при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР).

Захватывающее антитело к His (GE Healthcare 28995056) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare BR100535), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 600 единиц резонанса (ЕР). В качестве рабочего буфера и буфера для разведения использовали HBS-P+(10 мМ ГЭПЭС, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20). VEGF-A121-His человека захватывался на поверхности с получением плотностей лигандов приблизительно 10 и 20 ЕР, соответственно. Последовательно вводили серийные разведения исследуемого антитела (3,7-300 нМ, разведение 1: 3) в течение 60 с каждое, диссоциацию отслеживали в течение 3600 с при скорости потока 30 мкл/мин (кинетика одного цикла). Поверхность регенерировали путем введения 10 мМ глицина с рН 1,5 в течение 60 с со скоростью потока 5 мкл/мин. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки без иммобилизованного VEGF-A121 человека. Аппроксимацию кривых проводили, используя 1: 1 модель связывания Ленгмюра в оценочном программном обеспечении Biacore.

Кинетика связывания VEGF-A, оцененная при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР) для исследования перекрестной реактивности.

Захватывающее антитело к His (GE Healthcare 28995056) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare BR100535), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 600 единиц резонанса (ЕР). В качестве рабочего буфера и буфера для разведения использовали HBS-P+(10 мМ ГЭПЭС, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20). VEGF-A121-His указанного вида захватывался на поверхности с получением плотностей лигандов приблизительно 10 и 20 ЕР, соответственно. Последовательно вводили серийные разведения исследуемого антитела (3,7-300 нМ, разведение 1: 3) в течение 60 с каждое, диссоциацию отслеживали в течение 3600 с при скорости потока 30 мкл/мин (кинетика одного цикла). Поверхность регенерировали путем введения 10 мМ глицина с рН 1,5 в течение 60 с со скоростью потока 5 мкл/мин. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной ячейки без иммобилизованного VEGF-A121. Аппроксимацию кривых проводили, используя 1: 1 модель связывания Ленгмюра в оценочном программном обеспечении Biacore.

Кинетика связывания ANG2 человека, оцененная при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР).

Захватывающее антитело к Fab (GE Healthcare 28958325) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare BR100535), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 800 единиц резонанса (ЕР). В качестве рабочего буфера и буфера для разбавления использовали HBS-P+ (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% поверхностно-активное вещество Р20), температура измерения 25°С. Исследуемое антитело захватывали путем введения раствора 50 нМ в течение 60 секунд при скорости потока 5 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем введения Ang2-RBD человека в различных концентрациях в растворе в течение 180 с при скорости потока 30 мкл/мин (0,07 нМ - 50 нМ, разведение 1:3). Фазу диссоциации отслеживали в течение до 900 с и инициировали путем переключения с раствора образца на рабочий буфер со скоростью потока 30 мкл/мин. Поверхность восстанавливали путем введения 10 мМ глицина, рН 2,1, в течение 60 с при скорости потока 30 мкл/мин. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от эталонной проточной ячейки без иммобилизованного исследуемого антитела. Аппроксимацию кривых проводили, используя 1: 1 модель связывания Ленгмюра в оценочном программном обеспечении Biacore.

Кинетика связывания ANG2, оцененная при помощи поверхностного плазмонного резонанса (ППР) для исследования перекрестной реактивности.

Захватывающее антитело к Fab (GE Healthcare 28958325) иммобилизировали на Sensor Chip С1 серии S (GE Healthcare BR100535), используя стандартную химию аминного связывания, что давало плотность поверхности приблизительно 800 единиц резонанса (ЕР). В качестве рабочего буфера и буфера для разбавления использовали HBS-P+ (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% поверхностно-активное вещество Р20), температура измерения 25°С. Исследуемое антитело захватывали путем введения раствора 50 нМ в течение 60 секунд при скорости потока 5 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем введения Ang2-RBD указанных видов в различных концентрациях в растворе в течение 180 с при скорости потока 30 мкл/мин (0,07 нМ-50 нМ, разведение 1:3). Фазу диссоциации отслеживали в течение до 600 с и инициировали путем переключения с раствора образца на рабочий буфер со скоростью потока 30 мкл/мин. Поверхность восстанавливали путем введения 10 мМ глицина, рН 2,1, в течение 60 с при скорости потока 30 мкл/мин. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от эталонной проточной ячейки без иммобилизованного антитела. Аппроксимацию кривых проводили, используя 1:1 модель связывания Ленгмюра в оценочном программном обеспечении Biacore.

Оценка независимого связывания с антигенами-мишенями с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР)

Приблизительно 5000 единиц резонанса (ЕР) системы захвата (антитело, захватывающее Fab (GE Healthcare 28958325)) связывали на чипе СМ5 (GE Healthcare BR100530) при рН 5,0 с использованием набора для связывания с амином, поставляемого GE Healthcare. Образец и системный буфер представляли собой HBS-P+ (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20). Температуру проточной кюветы устанавливали на 25°С, а блока образцов на 12°С. Перед захватом проточную кювету трижды заливали рабочим буфером.

Захват биспецифического Fab проводили посредством ввода 6,5 мкг/мл раствора в течение 60 с при скорости потока 5 мкл/мин. Независимое связывание каждого лиганда с биспецифическим Fab анализировали, определяя активную связывающую способность для каждого лиганда, добавленного последовательно или одновременно (поток 10 мкл/мин):

1) Введение VEGF А-121 человека в концентрации 1 мкг/мл в течение 60 сек (определяет однократное связывание антигена).

2) Введение Ang2 человека в концентрации 5 мкг/мл в течение 60 сек (определяет однократное связывание антигена).

3) Инъекция VEGFA-121 человека с концентрацией 1 мкг/мл в течение 60 с с последующей дополнительной инъекцией Ang2 человека с концентрацией 5 мкг/мл в течение 60 с (определяет связывание Ang2 в присутствии VEGF А-121).

4) Инъекция Ang2 человека с концентрацией 5 мкг/мл в течение 60 с с последующей дополнительной инъекцией VEGFA-121 человека с концентрацией 1 мкг/мл в течение 60 с (определяет связывание VEGFA-121 в присутствии Ang2).

5) Совместная инъекция VEGFA-121 человека с концентрацией 1 мкг/мл и Ang2 человека с концентрацией 5 мкг/мл в течение 60 с (определяет одновременное связывание VEGFA-121 и Ang2). Поверхность восстанавливали путем введения 10 мМ глицина, рН 2,1, в течение 60 с при скорости потока 30 мкл/мин. Объемную разницу показателя преломления корректировали путем вычитания контрольных введений и путем вычитания ответа, полученного от эталонной проточной ячейки без иммобилизованного биспецифического Fab. Биспецифическое антитело способно независимо связывать оба антигена, если результирующий конечный сигнал подходов 3, 4 и 5 равен сумме индивидуальных конечных сигналов подходов 1 и 2.

Термическая стабильность:

Образцы Fab-фрагмента биспецифического антитела получали в концентрации 1 мг/мл в 20 мМ гистидин/хлорид гистидина, 140 мМ NaCl, рН 6,0 и переносили в массив микрокювет объемом 10 мкл. Данные статического рассеяния света, а также данные флуоресценции при возбуждении лазером с длиной волны 266 нм регистрируют с помощью прибора UNcle (Unchained Labs), при этом образцы нагревают со скоростью 0,1°С/мин от 30°С до 90°С. Образцы измеряли в трех повторностях.

Оценку начальных температур проводили с помощью программного обеспечения для анализа UNcle. Температуру начала агрегации определяют, как температуру, при которой начинала повышаться интенсивность рассеянного излучения. Денатурацию белка контролировали по приходу барицентрического среднего (ВСМ) флуоресцентного сигнала по сравнению с температурой. Температуру плавления определяют как точку перегиба кривой ВСМ (нм) в зависимости от температуры.

Физико-химическая стабильность.

Образцы антител составляли в 20 мМ His/HisCl, 140 мМ NaCl, рН 6,0, и делили на три аликвоты: одну аликвоту повторно буферизовали в ФСБ, соответственно, и две аликвоты сохраняли в исходном составе. Аликвоту в ФСБ и одну аликвоту в His/HisCl инкубировали в течение 2 недель (2 недели) при 40°С (His/NaCl) или 37°С (ФСБ) в 1 мг/мл, образец в ФСБ инкубировали дополнительно всего в течение 4 недель (4недели). Третий образец контрольной аликвоты хранили при -80°С. После окончания инкубации образцы анализировали на относительную концентрацию активного вещества (Biacore; концентрация активного вещества обоих подвергнутых обработке аликвот каждого связующего нормализовали до не подвергнутой обработке аликвоты при 4°С), агрегацию (SEC) и фрагментирование (капиллярный электрофорез или ДСН-ПААГ, КЭ-ДСН) и сравнивали с необработанным контролем.

Кинетика связывания VEGF-A человека и ANG2 человека, оцененная с помощью ППР для исследования функциональной стабильности

VEGFA-121 (собственного производителя), белок A (Pierce/Thermo Scientific 21181) и захватывающее антитело к Fab человека (GE Healthcare 28958325), иммобилизовали на различных проточных кюветах на сенсорном чипе серии S СМ5 (GE Healthcare 29104988), используя стандартную химию аминного связывания, с получением поверхностной плотности 3000 для hVEGFA-121 и белка А и 12000 единиц резонанса (ЕР) для захватывающего антитела к Fab человека. В качестве рабочего буфера и буфера для разбавления использовали HBS-N (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4, GE Healthcare). Образец и рабочий буфер для следующих измерений концентрации представляли собой HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,05% поверхностно активного вещества Р20; GE Healthcare). Температуру проточных кювет устанавливали на 25°С, а блока образцов на 12°С. Перед измерением концентрации проточную кювету дважды заливали рабочим буфером. Сначала димер Ang2-RBD-hFc человека был захвачен путем инъекции раствора 10 мкг/мл в течение 120 секунд при скорости потока 10 мкл/мин. Исследуемые антитела вводили в растворе в течение 60 с со скоростью потока 5 мкл/мин в концентрации 1 мкг/мл. Фазу диссоциации отслеживали в течение до 30 с и инициировали путем переключения с раствора образца на рабочий буфер.

Поверхности hVEGFA-121 восстанавливали посредством 30 с промывки 10 мМ раствором глицина, рН 2,0, при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхности белка А восстанавливали посредством 30 с промывки 10 мМ раствором глицина, рН 1,5, при скорости потока 30 мкл/мин. Наконец, поверхности антител к Fab человека регенерировали путем 60 с промывки 10 мМ раствором глицина рН 2,1 при скорости потока 30 мкл/мин.

Различия в общем показателе преломления скорректировали путем вычитания отклика, полученного от пустой поверхности. Для оценки брали реакцию связывания.

Относительную концентрацию активного вещества рассчитывали путем привязки каждого образца, подвергшегося обработке при температуре, к соответствующему образцу, не подвергавшемуся обработке.

Для нормализации сигнала связывания антигенов, связывание hVEGF-А121 и связывание Ang2 нормализовали к связыванию образца антитела к Fab:

Пример 1.

Создание Fab-фрагмента биспецифического антитела к VEGF-A/ANG2

Fab-фрагмент биспецифического антитела к VEGF-A/ANG2 получали путем независимого скрининга моно специфических антител, которые связываются с VEGF-A и ANG2, с неперекрывающимися паратопами и последующего слияния аминокислотных последовательностей в бипаратопной паре HC/LC, которая связывается с VEGF-A и ANG2, способом, описанным ранее, например, в WO 2012/163520.

Использовали две отдельные библиотеки фаговых дисплеев синтетических Fab-фрагментов, причем в первой библиотеке фаговых дисплеев остатки в областях CDR-H1, CDR-H3 и CDR-L2 Fab-фрагментов были различными, и причем во второй библиотеке фаговых дисплеев остатки в областях CDR-L1, CDR-L3 и CDR-H2 Fab-фрагментов были различными. В каждой библиотеке другие три области CDR поддерживали недиверсифицированными как инвариантная фиктивная последовательность. В обеих библиотеках домен СН1 Fab-фрагментов был слит посредством линкера с усеченным белком гена-Ш для облегчения фагового дисплея.

Первая библиотека была обогащена связующими против ANG2 человека, а вторая библиотека была обогащена связующими против VEGF-A человека, путем пэннинга фаговой библиотеки. После пэннинга минипрепараты плазмид получали для обоих обогащенных пулов фагемидных векторов. Минипрепараты усваивались рестрикционным ферментом для удаления области, кодирующей усеченный белок гена-Ш, и повторно циркулировались путем сшивания с получением пулов экспрессионных векторов, кодирующих растворимые Fab-фрагменты, которые были обогащены связующими ANG2 или связующими VEGF-A, соответственно. Эти пулы векторов превращали в клетки TG1 E.coli, и отдельные колонии выбирали и культивировали для растворимой экспрессии отдельных Fab-клонов на титрационном микропланшете. Супернатанты, содержащие растворимые Fab-фрагменты, отбирали для связывания с ANG2 или VEGF-А, используя стандартные методы ИФА, и клоны TG1, дающие специфические связующие, подвергали действию препаратов плазмид ДНК и секвенированию с получением пар последовательностей VH и VL, специфически связывающихся или с ANG2, или с VEGF-A, соответственно.

Пару последовательностей VH и VL биспецифического антитела к VEGF-A/ANG2 разрабатывали in silico путем (1) замены неподходящих остатков VH 52b-65 в последовательности VH специфического к ANG2 Fab на выбранные остатки VH 52b-65 специфического к VEGF-A Fab, таким образом замещая остатки CDR-H2, потенциально являющиеся частью специфического к VEGF-A паратопа, на тяжелую цепь связующего ANG2, и (2) замены неподходящих остатков VL 49-57 в последовательности VL специфического к VEGF-A Fab на выбранные остатки VL 49-57 специфического к ANG2 Fab, таким образом замещая остатки CDR-L2, потенциально являющиеся частью специфического к ANG2 паратопа, на легкую цепь связующего VEGF-A.

Пример 2.

Экспрессия Fab-фрагмента биспецифического антитела Р1АА8906 к VEGF-A/ANG2

Полученную разработанную пару последовательностей VH и VL биспецифического антитела к VEGF-A/ANG2 синтезировали и клонировали в экспрессионном векторе E.coli в рамке с генными последовательностями, кодирующими домены СН1 и С-каппа. Вектор превращался в клетки TGI E.coli, и отдельную колонию культивировали для растворимой экспрессии Fab-фрагмента биспецифического антитела. Биспецифическое антитело очищали от супернатанта культуры TG1 путем аффинной хроматографии, и проверяли специфическое связывание как с ANG2, так и VEGF-A.

Биспецифическое антитело «Р1АА8906» к VEGF-A/ANG2 выбирали, и оно характеризовалось тяжелой цепью SEQ ID NO: 9 и легкой цепью SEQ ID NO: 10.

Для дальнейших анализов антитела к VEGF-A/ANG2 по изобретению превращали в и экспрессировали из клеток СНО стандартными рекомбинантными способами.

Пример 3.

Определение характеристик Fab-фрагмента биспецифического антитела Р1АА8906 к VEGF-A/ANG2

Аффинность связывания биспецифического антитела Р1АА8906 оценивали с помощью ППР и KinexA, описанных выше в разделе «Материалы и общие методы».

Анализ KinExA был проведен в следующих условиях: концентрация VEGF-A-121: 100 пМ / 1000 пМ (СВР), Р1АА8906 4 нМ - 0 пМ (разведение 1: 2, 12х), время предварительной инкубации ~8 ч при КТ.

Анализ KinExA был проведен в следующих условиях: концентрация VEGF-A-121: 100 пМ / 1000 пМ (СВР), Р1АА8906 4 нМ - 0 пМ (разведение 1: 2, 12х), время предварительной инкубации ~8 ч при КТ.

Термическую стабильность биспецифического антитела Р1АА8906 оценивали как описано выше в разделе «Материалы и общие методы».

Физико-химическую стабильность биспецифического антитела Р1АА8906 оценивали как описано выше в разделе «Материалы и общие методы».

Пример 4.

Улучшение Fab-фрагмента биспецифического антитела Р1АА8906 к VEGF-A/ANG2

Как показано выше, Р1АА8906, демонстрируя высокую тепловую стабильность и выгодное сродство к VEGF-A, демонстрирует сродство к ANG2 в наномолярном диапазоне, а также тенденцию образовывать примеси с высокой молекулярной массой, которая увеличивается при стрессе. Для лечения сосудистых заболеваний глаз, которые требуют инъекции терапевтического средства в глаз, желательно обеспечивать терапевтическое средство с высокой аффинностью к целевому антигену и в очень высоких концентрациях для увеличения длительности терапевтического эффекта и для минимизации неудобств для пациента. Поэтому для предполагаемой цели желательно повысить аффинность и улучшить физико-химическую стабильность.

Следовательно, для клинического применения антитело требовало дополнительного улучшения, например, в отношении связывания с ANG2 (в частности, путем увеличения скорости диссоциации) и снижения восприимчивости к стрессу. Несколько кругов созревания проводили путем введения отдельных аминокислотных замен в домен VH и VL. При созреваниях кандидантные антитела, полученные из антитела Р1АА8906, отбирали и выбирали на основе их желаемых свойств относительно выхода, аффинности, одновременного связывания с антигеном, гидрофильности, стабильности, вязкости и других параметров.

Улучшенное кандидантное антитело Р1АА0902 выбирали из множества исследованных молекул кандидатных антител. Начиная с этой молекулы, были выполнены дальнейшие раунды оптимизации, опять же путем введения различных аминокислотных замен в домене VH и VL. Отбор кандидатов основывался на его желаемых свойствах, в частности, улучшении связывания Ang2 и обеспечении возможности введения через шприц при высоких концентрациях, сохраняя при этом другие выгодные характеристики, например, аффинность VEGF-A, одновременное связывание антигена и термическую стабильность.

Дальнейшее улучшение кандидатного антитела P1AD9820 выбирали из множества исследованных молекул кандидатных антител.

Фигуры 2 и 3 показывают выравнивание вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи полученных фрагментов биспецифического антитела. Нумерация положений аминокислот в доменах VH и VL представлена согласно системе нумерации по Кабату. Для простоты нумерация включена на фигуре, дополнительно показывая скелет и положения аминокислот CDR.

Кандидатные антитела экспрессировали, как описано в примере 2.

Пример 5.

Кинетика связывания с антигеном улучшенных Fab-фрагментов биспецифического антитела к VEGF-A/ANG2

Кинетика связывания с VEGF-A человека и ANG2 человека для кандидатных антител оценивали, как описано выше с использованием указанных Fab-фрагментов (аминокислотная последовательность, как показано в таблице 4). Чтобы сравнить кинетику связывания антигена с антителами по изобретению с молекулами фарицимаба предшествующего уровня техники (МНН, ранее также называемой RG7716), связующего VEGF афлиберцепта (МНН) и бролуцизумаба (МНН) и связующего Ang2 несвакумаба (МНН) вышеупомянутые антитела к APT из предшествующего уровня техники получали рекомбинантной экспрессией идентичных аминокислотных последовательностей, раскрытых в их соответствующем МНН. Эталонные молекулы в данном документе также называются «аналогами», чтобы подчеркнуть, что их получали в компании.

Независимое связывание кандидатных антител с VEGF-A человека и ANG2 человека было проанализировано с помощью ППР, как описано выше в разделе «Материалы и общие методы».

Перекрестная реактивность к VEGF-A и ANG2 от других видов оценивалась, как описано выше в разделе «Материалы и общие методы».

Пример 6.

Термическая стабильность улучшенных Fab-фрагментов антитела к VEGF-A/ANG2

Термическую стабильность указанных биспецифических антител оценивали, как описано выше в разделе «Материалы и общие методы», и в тех же условиях, что и для примера 3.

Пример 7.

Биофизические свойства улучшенных Fab-фрагментов биспецифических антител к VEGF-A/ANG2 (стабильность)

Физико-химическая стабильность указанных биспецифических антител оценивали, как описано выше в разделе «Материалы и общие методы», и в тех же условиях, что и для примера 3.

Пример 8.

Биофизические свойства улучшенных биспецифических Fab-фрагментов антитела к VEGF-A/ANG2 (оценка вязкости методом динамического рассеяния света (DLS))

Fab-фрагменты Р1АА0902 и P1AD9820, как описано выше, экспрессировали в клетках E.coli стандартными способами.

Вязкость измеряли при помощи метода с латексным шариком DLS, как описано ранее (Не F et al.; Anal Biochem. 2010 Apr 1;399(1): 141-3). В частности, с использованием указанных материалов следовали следующему протоколу.

Оценка вязкости.

Инструменты и материалы

• Планшет-ридер Wyatt DLS с микропланшетом Greiner Bio-One

• Стандарты размера Nanosphere™ серии 3000 (кат.№3300А Thermofisher)

• Твин 20 (Roche, кат.№11332465001) и силиконовое масло, например (Alfa Aesar кат.№А12728)

• УФ-фотометр для определения концентрации (например, Nanodrop 8000).

Получение образца

Образцы антител повторно забуферивали и разводили в 20 мМ His/HCl, рН 6,0 (буфер) и 0,02% Твин 20 (конечная концентрация). Добавляли гранулы с концентрацией твердых веществ 0,03%. Было получено не менее четырех различных концентраций, по возможности самая высокая концентрация составляла около 200 мг/мл. В качестве контролей, не содержащих антител, требовались два пустых образца: один содержал гранулы Nanosphere, ресуспендированные в воде, а другой содержал гранулы Nanosphere, ресуспендированные в буфере. Образцы переносили в микропланшет и каждую лунку покрывали силиконовым маслом.

Измерения с помощью планшета-ридера Wyatt DLS

Все образцы и холостые анализы анализировали при различных температурах от 15 до 35°С с шагом 5°С. Время сбора данных составляло 30 с, а количество измерений составляло 40 на образец и температуру.

Анализ данных

Необработанные данные Dapp (кажущиеся радиусы) в нм были показаны в обзоре программного шаблона (Microsoft Dynamics 7.0 или выше). Вязкость рассчитывали по формуле (ηreal=Dapp * ηН2O / Dreal). Dreal представляет собой измеренный размер шариков в холостой пробе, равный размеру шариков (300 нм). Рассчитанная вязкость была показана на кривых Excel. С помощью подгонки кривой Муни (в Excel) можно экстраполировать вязкость при заданной концентрации. В данном документе была рассчитана максимальная концентрация белка, при которой вязкость превышает 20 сП.

Максимальная концентрация указанных антител для достижения вязкости 20 сП при 20°С указана ниже. Результаты также показаны на Фиг. 10.

Результаты показывают, что антитела по изобретению можно составлять в высоких концентрациях, содержащих вязкость ниже приемлемого предела вязкости для введения с помощью шприца. Хотя оба исследуемых антитела показали сильную концентрируемость, эффект более очевиден для антитела P1AD9820.

Следовательно, антитела по изобретению являются очень подходящими для глазного применения, поскольку они обеспечивают высокую молярную дозу в ограниченном объеме инъекции, что в сочетании с высокой активностью приводит к продолжительному сроку годности и, следовательно, сниженной частоте дозирования, которая желательна для снижения сложностей со стороны пациента.

В другой серии экспериментов анализировали вязкость P1AD9820, полученного в клетках СНО в соответствии со стандартными рекомбинантными способами, как описано выше.

Максимальная концентрация указанных антител для достижения вязкости 20 сП при 20°С указана ниже. Результаты также показаны на Фиг. 10.

Пример 9.

Функциональная стабильность улучшенных Fab-фрагментов антитела к VEGF-A/ANG2

Fab-фрагмент P1AD9820 обрабатывали в различных стрессовых условиях, как описано выше в разделе «Материалы и общие методы» (Физико-химическая стабильность). Связывание антигена полученных подвергнутых стрессу образцов антител анализировали, как описано выше (раздел «Материалы и общие методы»: Кинетика связывания VEGF-A человека и ANG2 человека, оцененная с помощью ППР для исследования функциональной стабильности).

Пример 10.

Функциональная характеристика улучшенных Fab-фрагментов антитела к VEGF-A/ANG2

Ингибирование ANG2 и VEGF-A кандидатных антител оценивали в клеточных анализах:

ингибирование ANG2: анализ pTie2

Кандидатные антитела и выбранные эталонные молекулы (аналог несвакумаба, полученный в домашних условиях путем рекомбинантной экспрессии в соответствии SEQ ID NO: 29 и 30) предварительно инкубировали в 11 концентрациях в диапазоне от 250 нМ до 0,14 нМ в среде МЕМ-альфа. Трехкратно концентрированное антитело к Ang2 в 40 мкл смешивали с 40 мкл Ang-2 при трехкратной концентрации с=3,9 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин в клеточном инкубаторе. Затем добавляли 40 мкл/лунку клеток Hek.293_HOMSA-Tie2-Clone22_В11, суспендированных в среде FreeStyle без селекции при плотности 40000 клеток на лунку, на 10 минут при комнатной температуре. Затем фосфорилирование Ang2 останавливали добавлением холодного лизирующего буфера с ингибиторами протеазы. Антитело к Tie2, связанное с планшетом maxisorp, затем иммобилизовало Tie2 из клеточного лизата на 90 минут при КТ при встряхивании. После шага промывки в ФСБ, 0,05% Твин20, добавляли биотинилированное антитело, специфичное к фосфорилированному Tie2, на 1 час при КТ до конечной концентрации 3 мкг/мл. После трех стадий промывки добавляли стрепавидин, связанный с HRP, до конечной концентрации 100 мЕд/мл, которая преобразовывала POD в течение 30 минут при КТ для окончательной колориметрической оценки конечной точки после остановки с помощью 1М H2S02 при 405/690 нм с использованием планшета-ридера Tecan Sunrise. Результаты приведены ниже на Фиг. 8.

Ингибирование VEGF-A. Анализ гена-репортера (RGA) Для анализа 37,5 мкл четырехкратно концентрированного исследуемого антитела или эталонной молекулы предварительно инкубировали с 37,5 мкл четырехкратно концентрированного VEGF-A121 (R&D, с=100 мкг/мл) в течение 15 минут при КТ. Затем смесь добавляли к 75 мкл/лунку клеток Hek NFAT KDR Luc при плотности 40000 клеток/лунку и инкубировали в течение 5 часов в клеточном инкубаторе. Наконец, после добавления 100 мкл реагента BioGlo на лунку оценивали люминесценцию с использованием планшета-ридера Infinite Pro (Tecan). Результаты приведены ниже на Фиг. 7.

Пример 11.

Блокирующая активность hVEGF-A121 и hVEGF-A165 (исходный анализ VEGF)

96-луночные планшеты Maxisorp (ThermoScientific №442404) покрывали 50 мкл/лунку hVEGFR-1-Fc в 200 мМ NaHCO₃, рН 9,4, в конечной концентрации 1 мкг/мл в течение 1 часа при комнатной температуре. Указанные кандидатные Fab-фрагменты разводили до концентрации 409,6 нМ в 280 мкл ФСБТ-1% БСА. Для двукратного серийного разведения 140 мкл этого разведенного образца Fab смешивали со 140 мкл ФСБТ-1% БСА и перемешивали 7 раз путем осторожного пипетирования. Эту стадию двукратного разбавления повторяли еще 9 раз. Круглодонные 96-луночные планшеты предварительно заполняли 50 мкл/лунку 2 нМ VEGF-A121 или 2 нМ VEGF-A165 в ФСБТ-1% БСА. 50 мкл разведений Fab добавляли в планшеты с VEGF, перемешивали 6 раз и инкубировали в течение 1,5 часов. Затем планшеты maxisorp дважды промывали ФСБТ перед добавлением 200 мкл 2% MPBST с последующей инкубацией в течение 45 минут при комнатной температуре. После этого планшет дважды промывали ФСБТ. 50 мкл премикса Fab-VEGF переносили на планшет Maxisorp и инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре. После этого планшеты дважды промывали ФСБТ и добавляли 50 мкл антитела к VEGF-bio (разведение 1: 2000 в ФСБТ) и SA-HRP (разведение 1: 2000 в ФСБТ) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали 6 раз ФСБТ, добавляли 50 мкл раствора субстрата ТМВ и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Наконец, добавьте 50 мкл 1 н. серной кислоты, чтобы остановить реакцию, и измерьте оптическую плотность при 450 нм. Результаты приведены на Фиг. 5 и 6.

Пример 12.

Селективное связывание ANG2 с ANG1

Селективность Ang-2 по сравнению с Ang-1 может быть критическим атрибутом для глазной безопасности: Ингибирование Fab ANG1 P1AD9820 оценивали в клеточном анализе.

ANG-1 является слабым индуктором жизнеспособности HUVEC, выращенных в условиях голодания. Следовательно, жизнеспособность можно ингибировать с помощью нейтрализующего антитела ANG-1. Антитело R05314196 (ранее LC-08 Thomas М, Kienast Y, Scheuer W, et al. A novel angiopoietin-2 selective fully human antibody with potent anti-tumoral and anti-angiogenic efficacy and superior side effect profile compared to Pan-Angiopoietin-1/-2 inhibitors. PLoS One. 2013; 8(2): e54923. doi: 10.1371/journal.pone.0054923) ингибирует жизнеспособность HUVEC путем нейтрализации ANG-1 и использовалось в качестве положительного контроля для анализа. Колбы Т162 для культивирования клеток от Corning (кат. №3151), покрытые AF (фактор прикрепления) от Gibco (кат.№S-006-100), использовали для поддержания HUVEC до пассажа 5. Для анализа жизнеспособности HUVEC открепляли с помощью Accutase® с последующей стадией промывки ФСБ-/-. После этого клетки высевали в ЕВМ-2 с 0,5% ФБС на покрытые фибронектином 96-луночные планшеты при плотности клеток 10000 клеток/лунку в 100 мкл. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% CO2. На следующий день P1AD9820 или положительный контроль связывания Ang-1 R05314196 разводили в ЕВМ/0,5% ФБС до 10-кратной рабочей концентрации. Начальная концентрация составляла 1000 мкг/мл, после чего следовала серия 3-кратных 8-точечных разведений, заканчивающаяся на уровне 457,2 мкг/мл. ANG-1 был настроен на 20-кратную рабочую концентрацию, соответствующую 2400 нг/мл. Затем к клеткам добавляли 10 мкл предварительно разбавленного в 10 раз раствора P1AD9820, а затем 5 мкл разбавленного в 20 раз раствора ANG-1 в четырех лунках на планшет.В каждый экспериментальный день каждое условие выполняли в двух планшетах. Клетки инкубировали при 37°С с 5% CO2 в течение 72 часов. Для анализа в каждую лунку добавляли 11 мкл alamarBlue®, а затем инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе для клеточных культур. Поглощение измеряли при 570 нм относительно эталонной длины волны 600 нм.

Для каждого эксперимента условия дублировались с использованием двух аналитических планшетов, на которых каждое условие выполнялось в четырех повторностях. Фоновый сигнал нестимулированных клеток вычитали из экспериментальных лунок и рассчитывали средний сигнал для каждого условия. Уровень 100% ответа рассчитывали для клеток, стимулированных ANG-1 (120 нг/мл) без дополнительной обработки, а сигнал от лунок, обработанных антителами, выражали в виде процентного ингибирования 100% ответа. Для P1AD9820 и R05314196 процентное ингибирование для обработки каждым антителом измеряли в n=4 независимых экспериментах и рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. Значения IC₅₀ рассчитывали из средних данных для каждой концентрации антитела с использованием программного обеспечения ExcelXLfit (IDBS). Кривые концентрация-реакция были подобраны с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием логистической модели с 5 параметрами (A+((BA)/(1+((C/x)^D)))), рассчитанной относительно базовой и максимальной ингибирующей активности.

Клеточный анализ не выявил ингибирования ANG1, опосредованного P1AD9820.

Пример 13.

Структурный анализ Fab-фрагмента P1AD9820

Структурный анализ Fab P1AD9820 проводили с помощью рентгеновской кристаллографии следующим образом:

комплексообразование и очистка тройного комплекса ангиопоэтин 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820. Для образования комплекса Fab P1AD9820 и VEGF-A121 человека (Peprotech) смешивали в мольном отношении 1,1:1. После инкубации в течение 45 минут при 4°С добавляли ангиопоэтин2-RBD в мольном отношении P1AD9820, равном 1,25: 1, с последующими дополнительными 60 минутами при 4°С. Полученный тройной комплекс дополнительно дегликозилировали с помощью PNGaseF (NEB) в течение 13 часов при 37°С и на последней стадии очищали гель-фильтрационной хроматографией на колонке Superdex200 (16/600). Фракции, содержащие тройной комплекс, объединяли и концентрировали до 3,55 мг/мл.

Кристаллизация тройного ангиопоэтина 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820. Первоначальные испытания кристаллизации проводили в установках для диффузии паров сидячей капли при 21°С и концентрации белка 14,5 мг/мл. Кристаллы появлялись в течение 1 дня из 35% MPD, 0,1 М фосфата Na/K, рН 6,2. Пластинчатые кристаллы вырастали в течение недели до конечного размера 100x80x30 мкм. Кристаллы непосредственно собирали с планшета для отбора без каких-либо дополнительных шагов оптимизации.

Получение данных и определение структуры. Для сбора данных кристаллы мгновенно охлаждали при 100 К в растворе осадителя без дополнительного криопротектора. Данные дифракции собирали при длине волны 1,0000 А с помощью детектора PILATUS 6М при канале пучка X10SA Swiss Light Source (Villigen, Швейцария). Данные обрабатывали с помощью XDS (Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)) и наносили на шкалу SADABS (BRUKER). Кристаллы относятся к пространственной группе С2 с осями ячейки а=165,74 , b=90,27 , с=127,89 , β=112,05° и преломляются для разрешения 2,08 . Структуру определяли путем молекулярной замены с помощью PHASER (McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)) с использованием координат родственной внутренней структуры тройного комплекса Ang2-VEGF-Fab в качестве модели поиска. Программы из комплекта ССР4 (Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)) и Buster (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C, Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C, Womack, Т.О. (2011). Версию Buster 2.9.5 Кембридж, Великобритания: Global Phasing Ltd) использовали для последующего уточнения данных. Ручное восстановление белка с использованием разности электронной плотности проводили с помощью COOT (Emsley, P., Lohkamp, В., Scott, W.G. and Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)). Статистика сбора и уточнения данных для обеих структур представлена в таблице 23. Все графические представления получали с помощью PYMOL (DeLano Scientific, Palo Alto, CA, 2002).

Аминокислотные остатки, контактирующие с соответствующими антигенами, VEGF-A и ANG2, идентифицировали по кристаллической структуре тройного комплекса ангиопоэтин 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820. Иллюстрация положения аминокислотных остатков паратопа в доменах VH и VL изображена на фигуре 2 и фигуре 3.

Аминокислотные остатки, определенные как участвующие в связывании антигена, идентифицированы в таблице 24 (для аминокислотных остатков вариабельного домена тяжелой цепи) и таблице 25 (для аминокислотных остатков вариабельного домена легкой цепи). Положения аминокислот представлены согласно номерам в системе нумерации по Кабату (такую же нумерацию используют на фигуре 2 и 3). Положения аминокислот, вовлеченных в связывание антигена, идентифицированы по их положению по Кабату в домене VH или VL (смотрите также нумерацию на фигуре 2 и 3).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОША АГ

<120> АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СВЯЗЫВАЕТСЯ С VEGF-A И ANG2, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> P36370

<150> EP20194610.0

<151> 2020-09-04

<150> EP20209591.5

<151> 2020-11-24

<160> 30

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH P1AA8906

<400> 1

Asp Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Glu Phe Glu Tyr Asp Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL P1AA8906

<400> 2

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Ala Arg Trp Leu Val His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR1 P1AA8906, P1AA0902 и P1AD9820

<400> 3

Asp Asp Met Ser

1

<210> 4

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR2 P1AA8906

<400> 4

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR3 P1AA8906

<400> 5

Asp Val Gly Phe Phe Asp Met

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR1 P1AA8906

<400> 6

His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR2 P1AA8906

<400> 7

Asp Ala Arg Trp Leu Val His

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR3 P1AA8906, P1AA0902 и P1AD9820

<400> 8

Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 223

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента P1AA8906

<400> 9

Asp Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Glu Phe Glu Tyr Asp Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 10

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь Fab-фрагмента P1AA8906

<400> 10

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Ala Arg Trp Leu Val His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH P1AA0902

<400> 11

Asp Asp His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL P1AA0902

<400> 12

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR2 P1AA0902

<400> 13

Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR3 P1AA0902 и P1AD9820

<400> 14

Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp

1 5

<210> 15

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR1 P1AA0902

<400> 15

His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu Leu Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR2 P1AA0902

<400> 16

Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe

1 5

<210> 17

<211> 223

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента P1AA0902

<400> 17

Asp Asp His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 18

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь Fab-фрагмента P1AA0902

<400> 18

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VH P1AD9820

<400> 19

Ser Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен VL P1AD9820

<400> 20

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H-CDR2 P1AD9820

<400> 21

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR1 P1AD9820

<400> 22

His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu Val Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> L-CDR2 P1AD9820

<400> 23

Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr

1 5

<210> 24

<211> 223

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь Fab-фрагмента P1AD9820

<400> 24

Ser Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

<210> 25

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь Fab-фрагмента P1AD9820

<400> 25

Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 26

<211> 232

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 26

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp

165 170 175

Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

180 185 190

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

195 200 205

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

210 215 220

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

225 230

<210> 27

<211> 496

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 27

Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys

20 25 30

Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro

35 40 45

Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala

50 55 60

Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu

65 70 75 80

Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys

85 90 95

Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile

100 105 110

Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly

115 120 125

Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp

130 135 140

Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu

145 150 155 160

Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp

165 170 175

Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu

180 185 190

Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser

195 200 205

Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn

210 215 220

Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn

225 230 235 240

Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn

245 250 255

Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr

260 265 270

Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe

275 280 285

Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn

290 295 300

Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly

305 310 315 320

Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln

325 330 335

Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu

340 345 350

Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg

355 360 365

Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr

370 375 380

Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg

385 390 395 400

Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile

405 410 415

Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys

420 425 430

Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp

435 440 445

Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln

450 455 460

Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser

465 470 475 480

Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe

485 490 495

<210> 28

<211> 147

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 28

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys

130 135 140

Pro Arg Arg

145

<210> 29

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LC Mab Несвакумаба

<400> 29

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 30

<211> 452

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HC Mab Несвакумаба

<400> 30

Ala Val Gln Leu Val Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с VEGF-A человека и с ANG2 человека. Также раскрыта выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, клетка-хозяин, предназначенная для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Изобретение также относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с VEGF-A человека и с ANG2 человека, и к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в качестве лекарственного средства, ингибирующего ангиогенез. Изобретение обеспечивает улучшенное терапевтическое антитело, которое связывается с VEGF и ANG2, за счет повышения эффективности по сравнению со стандартом лечения и за счет увеличения продолжительности действия и, в свою очередь, снижения частоты интравитреальных инъекций, что приводит к меньшей нагрузке на пациента. 6 н. и 3 з.п. ф-лы, 10 ил., 28 табл., 13 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с VEGF-A человека и с ANG2 человека, содержащие последовательность VH SEQ ID NO: 19 и последовательность VL SEQ ID NO:20.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab-фрагмент.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, включающие аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:24 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:25.

4. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3.

5. Клетка-хозяин, предназначенная для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3, и содержащая нуклеиновую кислоту по п. 4.

6. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с VEGF-A человека и с ANG2 человека, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 5 так, чтобы получить антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

7. Способ по п. 6, в котором клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.

8. Фармацевтический состав для ингибирования ангиогенеза, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве лекарственного средства, ингибирующего ангиогенез.