ВИРИОНЫ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА С ВАРИАНТНЫМ КАПСИДОМ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2017 года по МПК C12N7/01 A61K48/00 C07K14/75 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №61/478,355, поданной апреля 22, 2011, описание которой во всей полноте включено в настоящую заявку путем ссылки.

Заявление относительно федерально спонсируемого исследования

[0002] Это изобретение было сделано при государственной поддержке под Грантом № EY016994-02 и EY1018241, предоставленным Национальным офтальмологическим институтом Национального института здравоохранения. Государство обладает определенными правами на изобретение.

Уровень техники

[0003] Фоторецепторы являются первыми нейронами в сетчатке, которые получают и обрабатывают визуальную информацию, преобразовывая видимую электромагнитную радиацию в гиперполяризованные ответы через фототрансдукцию. Подавляющее большинство унаследованных ретинальных болезней приводит к потере этих клеток или непосредственно, например, в доминантных мутациях, которые влияют на укладку белка родопсина, или косвенно, например, в рецессивных мутациях, влияющих на ретинальные метаболические циклы в пигментном эпителии сетчатки (RPE).

[0004] AAV принадлежит семейству Parvoviridae и роду Dependovirus, представители которого требуют совместного инфицирования с вирусом-помощником, таким как аденовирус, для активирования репликации, AAV порождает латентную инфекцию в отсутствие помощника. Вирионы состоят из 25 нм икосаэдрического капсида, охватывающего одноцепочечную геномную ДНК, состоящую из 4,9 тысяч нуклеотидов, с двумя открытыми рамками считывания: rep и cap. Неструктурный ген rep кодирует четыре регуляторных белка, важных для вирусной репликации, тогда как cap кодирует три структурных белка (VP1-3), которые собираются в 60-мерную капсидную оболочку. Этот вирусный капсид содействует способности векторов AAV преодолевать многие биологические барьеры вирусной трансдукции, включая связывание рецепторов клеточной поверхности, эндоцитоз, внутриклеточную миграцию и распаковывание в ядре.

Литература

[0005] Патентная публикация США №2005/0053922; патентная публикация США №2009/0202490; Allocca et al. (2007) J. Virol. 81:11372; Boucas et al. (2009) J. Gene Med. 11:1103.

Сущность изобретения

[0006] Настоящее раскрытие обеспечивает вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с измененным капсидным белком, отличающийся тем, что вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность клетки сетчатки, когда вводятся путем интравитреальной инъекции, по сравнению с AAV дикого типа. Настоящее раскрытие также обеспечивает способы доставки генного продукта в клетку сетчатки индивидуума и способы лечения глазных болезней.

Краткое описание чертежей

[0007] На фигуре 1 представлена репрезентативная трехмерная модель AAV2, содержащего случайный гептамер после аминокислоты 587.

[0008] На фигуре 2 изображены более значительные уровни интравитреальной трансдукции вариантом 7М8 AAV2 (справа) относительно AAV2 (слева).

[0009] На фигуре 3 представлены репрезентативные флюоресцентные изображения криосрезов сетчатки, показывающие экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP), возникающую вследствие 7М8 переноса гена GFP под контролем убиквитарного промотора CAG (слева) или фоторецептор специфического промотора Rho (справа).

[0010] На фигуре 4 изображены фоторецепторные клетки GFP⁺ на миллион клеток сетчатки, как подсчитано поточной цитометрией, после трансдукции 7М8 или 7М8, несущих 4 тирозиновые мутации (7m8.4YF).

[0011] На фигуре 5 представлена аминокислотная последовательность VP1 AAV2 (SEQ ID №1).

[0012] На фигуре 6 представлены аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотам 570-610 AAV2 (фигура 5) капсидного белка VP1 AAV различных серотипов AAV.

[0013] На фигурах 7A-I изображены структурные улучшения в мышиной сетчатке Rs1h-/- после переноса гена.

[0014] На фигурах 8A-D изображено функциональное спасение волн А и В электроретинограммы после доставки гена RS1.

[0015] На фигурах 9А-Е изображены устойчивые улучшения толщины сетчатки, измеренной спустя 10 месяцев после лечения 7m8-rho-RS1.

[0016] На фигуре 10 представлена аминокислотная последовательность ретиношизина.

[0017] На фигуре 11 представлена аминокислотная последовательность нейротрофического фактора головного мозга.

[0018] На фигуре 12 представлена аминокислотная последовательность RPE65.

[0019] На фигурах 13А-С представлена нуклеотидная последовательность конструкта 7m8-rho-RS1.

[0020] На фигуре 14 представлена аминокислотная последовательность периферина-2.

[0021] На фигуре 15 представлена аминокислотная последовательность периферина.

[0022] На фигуре 16 представлена аминокислотная последовательность регуляторного взаимодействующего белка-1 ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки.

[0023] На фигурах 17А-С представлено выравнивание аминокислотных последовательностей участков петли IV капсидного белка AAV (петля GH). Сайты встраивания показаны жирным шрифтом и подчеркиванием.

[0024] На фигурах 18А-С представлено выравнивание аминокислотных последовательностей участков петли капсидного белка GH AAV с гетерологичными пептидными встраиваниями.

[0025] На фигуре 19 представлено флуоресцентное изображение дна, показывающее экспрессию GFP в центре сетчатки примата спустя 9 недель после введения 7m8, несущего GFP под управлением промотора коннексина-36.

Определения

[0026] Термин "ретинальная клетка" может относиться в настоящем документе к любому из клеточных типов, которые содержит сетчатка, такому как ретинальные клетки ганглия, амакринные клетки, горизонтальные клетки, биполярные клетки и клетки фоторецептора, включая палочки и колбочки, глиальные клетки Мюллера, клетки пигментного эпителия сетчатки.

[0027] "AAV" является аббревиатурой для аденоассоциированного вируса и может быть использована для обозначения самого вируса или его производных. Термин охватывает все подтипы и природного происхождения, и рекомбинантные формы, за исключением случаев, когда требуется иное. Аббревиатура "rAAV" относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу, также именуемого рекомбинантным вектором AAV (или "вектор rAAV"). Термин "AAV" включает AAV тип 1 (AAV-1), AAV тип 2 (AAV-2), AAV тип 3 (AAV-3), AAV тип 4 (AAV-4), AAV тип 5 (AAV-5), AAV тип 6 (AAV-6), AAV тип 7 (AAV-7), AAV тип 8 (AAV-8), птичий AAV, бычий AAV, псовый AAV, конский AAV, приматный AAV, неприматный AAV и овечий AAV. "Приматный AAV" относится к AAV, который инфицирует приматов, "неприматный AAV" относится к AAV, который инфицирует неприматных млекопитающих, "бычий AAV" относится к AAV, который инфицирует жвачных млекопитающих и пр.

[0028] Геномные последовательности различных серотипов AAV, также как и последовательности природных концевых повторов (TR), белков Rep и капсидных субъединиц известны из уровня техники. Такие последовательности могут быть найдены в литературе или общедоступных базах данных, таких как GenBank. Смотри, например, номера доступов GenBank NC_002077 (AAV-1), AF063497 (AAV-1), NC_001401 (AAV-2), AF043303 (AAV-2), NC_001729 (AAV-3). NC_001829 (AAV-4), U89790 (AAV-4), NC_006152 (AAV-5), AF513851 (AAV-7), AF513852 (AAV-8) и NC_006261 (AAV-8); сведения которых включены в настоящий документ путем ссылки касательно последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот AAV. Смотри также, например, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73:1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; международные патентные публикации WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; и патент США №6156303.

[0029] "Вектор rAAV", как использовано в настоящем документе, относится к вектору AAV, содержащему полинуклеотидную последовательность, которая происходит не от AAV (т.е., полинуклеотид, ксеногенный к AAV), обычно последовательность, представляющую интерес для генетической трансформации клетки. В основном, гетерологичный полинуклеотид является фланкированным, по меньшей мере, одной или обычно двумя последовательностями инвертированных концевых повторов AAV (ITR). Термин вектор rAAV охватывает как части вектора rAAV, так и векторные плазмиды rAAV. Вектор rAAV может быть либо одноцепочечным (ssAAV), либо самокомплементарным (scAAV).

[0030] "Вирус AAV" или "частица вируса AAV", или "частица вектора rAAV" относится к частице вируса, состоящей из, по меньшей мере, одного капсидного белка AAV (обычно всех капсидных белков AAV дикого типа) и инкапсулированного полинуклеотида вектора rAAV. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, не являющийся геномом AAV дикого типа, такой как трансген, который будет доставлен в клетку млекопитающего), обычно упоминается как "частица вектора rAAV" или просто "вектор rAAV". Таким образом, получение частицы rAAV обязательно включает получение вектора rAAV как такового, и вектор содержится в пределах частицы rAAV.

[0031] "Упаковывание" относится к серии внутриклеточных событий, которые приводят к сборке и инкапсулированию частицы AAV.

[0032] Гены "rep" и "cap" AAV относятся к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим репликацию и капсидирующие белки аденоассоциированного вируса. "Rep" и "cap" AAV именуются в настоящем документе как "упаковочные гены" AAV.

[0033] "Вирус-помощник" для AAV относится к вирусу, который позволяет AAV (например, AAV дикого типа) реплицироваться и упаковываться с помощью клетки млекопитающего. Ряд таких вирусов-помощников для AAV известны из уровня техники, включая аденовирусы, герпевирусы и проксивирусы, такие как вирус коровьей оспы. Аденовирусы охватывают много различных подгрупп, хотя обычно используется аденовирус 5 типа, подгруппы С. Известны многочисленные аденовирусы человека, нечеловеческих млекопитающих и птичьего происхождения и доступные из депозитариев, таких как АТСС. Вирусы семейства герпеса включают, например, вирусы герпеса простого (HSV) и вирусы Эпштейн-Барра (EBV), а также вирусы цитомегалии (CMV) и вирусы псевдобешенства (PRV); которые также доступны из депозитария АТСС.

[0034] "Хелперная вирусная функция(и) относится к функции(ям), закодированной в геноме вируса-помощника, который позволяет AAV реплицироваться и упаковываться (в сочетании с другими необходимыми условиями для репликации и упаковывания, описанными в настоящем документе). Как описано в настоящем документе, "хелперная вирусная функция" может обеспечивать ряд путей, включая обеспеченные вирусами-помощниками или обеспеченные, например, полинуклеотидными последовательностями, кодирующими необходимую функцию(и) в клетке-продуценте в пути. Например, плазмиду или другой вектор экспрессии, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие один или более аденовирусных белков, трансфектируют в клетку-продуцент вместе с вектором rAAV.

[0035] "Инфекционный" вирус или вирусная частица является вирусом, который содержит компетентно собранный вирусный капсид и способен доставить полинуклеотидный компонент в клетку, для которой вирусный вид является тропическим. Термин не обязательно подразумевает любую репликационную способность вируса. Методы подсчета инфекционных вирусных частиц описаны в другом разделе в этом описании и в уровне техники. Вирусная инфекционность может быть выражена как отношение инфекционных вирусных частиц ко всем вирусным частицам. Способы определения отношения инфекционных вирусных частиц ко всем вирусным частицам известны из уровня техники. Смотри, например, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11:S337 (описывающий анализ инфекционного титра TCID50); и Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. Смотри также Примеры.

[0036] "Репликационно компетентный" вирус (например, репликационно компетентный AAV) относится к фенотипичному вирусу дикого типа, который является инфекционным, а также способен реплицироваться в инфицированной клетке (то есть, в присутствии вируса-помощника или хелперных вирусных функций). В случае AAV, репликационная компетенция обычно требует присутствия функциональных упаковочных генов AAV. В целом, векторы rAAV, как описано в настоящем документе, являются репликационно некомпетентными в клетках млекопитающих (особенно в клетках человека) из-за отсутствия одного или более упаковочных генов AAV. Обычно, такие векторы rAAV испытывают недостаток в любых последовательностях упаковочных генов AAV, чтобы минимизировать возможность того, что репликационная компетенция AAV генерируется рекомбинацией между упаковочными генами AAV и поступающим вектором rAAV. Во многих вариантах осуществления изобретения препараты вектора rAAV, как описано в данном документе, являются такими, что почти не содержат репликационно компетентного AAV (rcAAV, также именуемый как RCA) (например, меньше, чем приблизительно 1 rcAAV на 10² частиц rAAV, меньше, чем приблизительно 1 rcAAV на 10⁴ частиц rAAV, меньше, чем приблизительно 1 rcAAV на 10⁸ частиц rAAV, меньше, чем приблизительно 1 rcAAV на 10¹² частиц rAAV или rcAAV отсутствует).

[0037] Термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, включая дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды или их аналоги. Полинуклеотиды могут содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, и могут быть прерванными ненуклеотидными компонентами. Если имеются, то модификации нуклеотидной структуре могут придаваться до или после сборки полимера. Термин полинуклеотид, как использовано в настоящем документе, относится взаимозаменяемо к дву- и одноцепочечным молекулам. Если не определено и не требуется иное, то любой вариант осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, которое является полинуклеотидом, охватывает как двуцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, известных или предсказанных для составления двуцепочечной формы.

[0038] Реакции гибридизации нуклеиновых кислот могут проводиться в условиях разной "жесткости". Условия, повышающие жесткость реакции гибридизации широко известны и опубликованы в уровне техники. Смотри, например, Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, включенный в настоящий документ путем ссылки. Например, смотри страницу 7.52 в Sambrook et al. Примеры соответствующих условий включают (в порядке повышающейся жесткости): температуры инкубации 25°С, 37°С, 50°С и 68°С; буферные концентрации 10 × SSC, 6 × SSC, 1 × SSC, 0,1 × SSC (где 1 × SSC является 0,15 М NaCl и 15 мМ цитратным буфером) и их эквиваленты с использованием других буферных систем; концентрации формамида 0%, 25%, 50% и 75%; время инкубирования от 5 минут до 24 часов; 1, 2 или более стадий отмывания; инкубационное время отмывки 1, 2 или 15 минут; и отмывочные растворы 6 × SSC, 1 × SSC, 0.1 × SSC или деионизированная вода. Примером жестких условий гибридизации является гибридизация при 50°С или выше и 0,1 × SSC (15 мМ хлорида натрия/1,5 мМ цитрата натрия). Другим примером жестких условий гибридизации является инкубирование в течение ночи при 42°С в растворе: 50% формамида, 1 × SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 × раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, расщепленной ДНК из молок лососевых, с последующим отмыванием фильтров в 0,1 × SSC при приблизительно 65°C. Как другой пример, жесткие условия гибридизации включают: предварительную гибридизацию в течение от 8 часов до ночи при 65°С в растворе, содержащем 6Х SSC (1X SSC является 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрата Na; рН 7,0), 5Х раствора Денхардта, 0,05% фосфата натрия и 100 мкг/мл ДНК спермы сельди; гибридизация в течение 18-20 часов при 65°С в растворе, содержащем 6Х SSC, 1X раствора Денхардта, 100 мкг/мл тРНК дрожжей и 0,05% фосфата натрия; отмывание фильтров при 65°С в течение одного часа в растворе, содержащем 0,2Х SSC и 0,1% SDS (додецилсульфата натрия).

[0039] Жесткие условия гибридизации являются условиями гибридизации, которые, по меньшей мере, столь же жесткие как представленные выше условия. Другие жесткие условия гибридизации известны из уровня техники и также могут быть применены для идентификации нуклеиновых кислот этого определенного варианта осуществления изобретения.

[0040] "T_m" является температурой в градусах Цельсия, при которой 50% полинуклеотидного дуплекса, образованного комплементарными нитями, соединенными водородными связями в антипараллельном направлении спариванием оснований Уотсона-Крика, диссоциирует в одиночную нить в условиях эксперимента. T_m может быть предсказана согласно стандартной формуле, такой как:

[0041] T_m=81,5+16,6 log[X⁺]+0,41 (% G/C)-0,61 (% F)-600/L

[0042] где [Х⁺] является концентрацией катионов (особенно ионов натрия, Na⁺ в моль/л; (% G/C) является количеством остатков G и С как процент всех остатков в дуплексе;

(% F) является процентным содержанием формамида в растворе (вес/об); и

L является количеством нуклеотидов в каждой нити дуплекса.

[0043] Полинуклеотид или полипептид имеют определенную процентную "идентичность последовательности" с другим полинуклеотидом или полипептидом, обозначающую что, при выравнивании этот процент оснований или аминокислот является таким же при сравнении этих двух последовательностей. Подобие последовательностей может быть определено многими различными способами. Для определения идентичности последовательностей последовательности могут выравниваться с использованием методов и компьютерных программ, включая BLAST, доступный из всемирной компьютерной сети с ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Другим алгоритмом выравнивания является FASTA, доступный из пакета Genetics Computing Group (GCG) из Madison, Wisconsin, USA, находящегося в полной собственности филиала Oxford Molecular Group, Inc. Другие методы выравнивания описаны в Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. Особенно интересными являются программы выравнивания, которые разрешают пропуски в последовательности. Алгоритм Смита-Уотермана является одним из типов алгоритма, который разрешает пропуски при выравнивании последовательностей. Смотри Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997). Также, программа GAP, использующая метод выравнивания Нидлмана-Вунша, может быть применена для выравнивания последовательностей. См. J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)

[0044] Представляющей интерес является программа BestFit, использующая алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана (Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), для определения идентичности последовательностей. Штраф за образование пропусков будет обычно заключаться в пределах от 1 до 5, обычно от 2 до 4 и во многих вариантах осуществления изобретения будет составлять 3. Штраф за продолжения пропуска будет обычно заключаться в пределах от приблизительно 0,01, до 0,20, и во многих случаях будет составлять 0,10. Программа содержит параметры, используемые по умолчанию, определенные с помощью последовательностей, введенных для сравнения. Предпочтительно, идентичность последовательностей определяется с помощью параметров по умолчанию, определенных программой. Эта программа доступна также из пакета Genetics Computing Group (GCG) из Madison, Wisconsin, USA.

[0045] Другой представляющей интерес программой является алгоритм FastDB. FastDB описан в Current Methods в Sequence Comparison и Analysis, Macromolecule Sequencing и Synthesis, Selected Methods и Applications, pp.127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc. Процент идентичности последовательностей рассчитывают с помощью FastDB, исходя из следующих параметров:

[0046] штраф за нарушение комплементарности: 1.00;

[0047] штраф за пропуск в последовательности: 1.00;

[0048] штраф за размер пропуска: 0.33; и

[0049] штраф за стыки: 30.0.

[0050] "Ген" относится к полинуклеотиду, содержащему, по меньшей мере, одну открытую рамку считывания, которая способна кодировать определенный белок после транскрипции и трансляции.

[0051] "Генный продукт" является молекулой, полученной в результате экспрессии определенного гена. Генные продукты включают, например, полипептид, аптамер, интерферирующую РНК, мРНК и т.п.

[0052] "Малые интерферирующие РНК" или "короткие интерферирующие РНК " или миРНК являются РНК-дуплексами нуклеотидов, которые ориентированы на представляющий интерес ген ("ген-мишень"). "РНК-дуплекс" относится к структуре, образованной комплементарным спариванием между двумя участками молекулы РНК. миРНК является "нацеленной" на ген, в котором нуклеотидная последовательность части дуплекса миРНК комплементарна нуклеотидной последовательности нацеленного гена. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина дуплекса миРНК составляет меньше чем 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения дуплекс может составлять 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения длина дуплекса составляет 19-25 нуклеотидов в длину. РНК-дуплексная часть миРНК может быть частью шпилькообразной структуры. В дополнение к дуплексной части шпилькообразная структура может содержать петлевую часть, находящуюся между двумя последовательностями, образующими дуплекс.Длина петли может меняться. В некоторых вариантах осуществления изобретения петля является в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13 нуклеотидов в длину. Шпилькообразная структура может также содержать 3' или 5' "липкие" части. В некоторых вариантах осуществления изобретения "липкий" конец является 3' или 5' концом 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов в длину.

[0053] "Короткая шпилечная РНК" или кшРНК является полинуклеотидным конструктом, который может быть получен для экспрессии интерферирующих РНК, таких как миРНК.

[0054] "Рекомбинант" в применении к полинуклеотиду означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций клонирования, этапов рестрикции или лигирования и других процедур, которые приводят к конструкту, который отличается от найденного в природе полинуклеотида. Рекомбинантный вирус является вирусной частицей, содержащей рекомбинантный полинуклеотид. Термины соответственно включают репликации оригинального полинуклеотидного конструкта и потомство оригинального вирусного конструкта.

[0055] "Регуляторный элемент" или "регуляторная последовательность" является нуклеотидной последовательностью, вовлеченной во взаимодействие молекул, которая способствует функциональному регулированию полинуклеотида, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию или деградацию полинуклеотида. Регулирование может влиять на частоту, скорость или специфику процесса и может быть улучшающим или ингибирующим по природе. Известные из уровня техники элементы включают, например, регулирующие транскрипцию последовательности, такие как промоторы и энхансеры. Промотор является участком ДНК, способным в определенных условиях к связыванию РНК-полимеразы и инициированию транскрипции кодирующей области, обычно располагаемой по ходу транскрипции (в направлении 3') от промотора.

[0056] "Функционально связанный" относится к непосредственному соседству генетических элементов, причем элементы находятся в контакте, позволяющем им работать ожидаемым способом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор помогает инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью, до тех пор, пока поддерживается эта функциональная связь, могут находиться интроны.

[0057] "Экспрессионный вектор" является вектором, содержащем область, которая кодирует целевой пептид и используется для осуществления экспрессии белка в намеченной клетке-мишени. Экспрессионный вектор также содержит регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей областью для облегчения экспрессии белка в клетке-мишени. Комбинацию регуляторных элементов и гена или генов, с которыми они функционально связаны для экспрессии, иногда называют "кассетой экспрессии", большое количество которых известно и доступно из уровня техники или может быть легко создано из компонентов, доступных из уровня техники.

[0058] "Гетерологичный" означает полученный из генотипно отличной единицы от той остальной единицы, с которой он сравнивается. Например, полинуклеотид, введенный генно-инженерным способом в плазмиду или вектор, полученный из разных видов, является гетерологичным полинуклеотидом. Промотор, удаленный из его природной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он в природе не связан, является гетерологичным промотором. Так, например, rAAV, который включает гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный генный продукт, является rAAV, включающим нуклеиновую кислоту, обычно не содержащуюся во встречающемся в природе вирусе, AAV дикого типа, и кодируемый гетерологичный генный продукт является генным продуктом, обычно некодируемым встречающимся в природе вирусом, AAV дикого типа.

[0059] Термины "генетическое изменение" и "генетическая модификация" (и их грамматические варианты) используются взаимозаменяемо в данном документе для обозначения процесса, при котором генетический элемент (например, полинуклеотид) вводят в клетку отличным от митоза или мейоза способом. Элемент может быть гетерологичным к клетке или может быть дополнительной копией или усовершенствованной версией элемента, уже существующего в клетке. Генетическое изменение может быть осуществлено, например, путем трасфектирования клетки рекомбинантной плазмидой или другим полинуклеотидом с помощью любого процесса, известного из уровня техники, такого как электропорация, кальций-фосфатная преципитация или контактирование с полинуклеотид-липосомным комплексом. Генетическое изменение также может быть осуществлено, например, путем трансдукции или инфекции вируса ДНК или РНК или вирусного вектора. Обычно генетический элемент вводится в хромосому или минихромосому в клетке; но любое изменение, изменяющее фенотип и/или генотип клетки и ее потомства, включено в этот термин.

[0060] Клетка является так называемой "стабильно" измененной, трансфектированной, генетически модифицированной или трансформированной генетической последовательностью, если последовательность доступна для выполнения ее функции во время продленной культуры клеток in vitro. Обычно такая клетка является «наследственно» измененной (генетически модифицированной) в том отношении, что вводится генетическое изменение, которое также наследуется потомством измененной клетки.

[0061] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Термины также охватывают модифицированный аминокислотный полимер, например, образованием дисульфидных связей, гликолизацией, липидизацией, фосфорилированием или конъюгацией с маркирующим компонентом. Полипептиды, такие как анти-ангиогенные полипептиды, нейропротекторные полипептиды и подобное, когда обсуждаются в контексте доставки генного продукта субъекту-млекопитающему, и их композиции, относятся, соответственно, к интактному полипептиду или любому его фрагменту или генно-инженерному производному, сохраняющему желаемую биохимическую функцию интактного белка. Подобным образом, указания на нуклеиновые кислоты, кодирующие анти-ангиогенные полипептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие нейропротекторные полипептиды, и другие такие нуклеиновые кислоты для использования в доставке генного продукта субъекту-млекопитающему (которые могут называться "трансгенами" и будут доставлены в клетку-реципиент), включают полинуклеотиды, кодирующие интактный полипептид или любой фрагмент или генно-инженерное производное, обладающие желаемой биохимической функцией.

[0062] "Выделенная" плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, вирион, клетка-хозяин или другое вещество относится к получению вещества, лишенного, по меньшей мере, некоторых других компонентов, которые могут также присутствовать, откуда вещество или подобное вещество происходит или изначально получено. Так, например, выделенное вещество может быть получено с использованием методов очистки для его обогащения из исходной смеси. Обогащение может быть измерено на абсолютном базисе, таком как вес на объем раствора, или оно может быть измерено относительно второго, потенциально интерферирующего вещества, присутствующего в исходной смеси. Увеличивающиеся обогащения вариантов осуществления этого описания являются в возрастающей степени более выделенными. Выделенная плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, клетка-хозяин или другое вещество являются в некоторых вариантах осуществления изобретения очищенными, например, от приблизительно 80% до приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере, приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере, приблизительно 95% чистоты, по меньшей мере, приблизительно 98% чистоты или, по меньшей мере, приблизительно 99%, или более чистоты.

[0063] Как использовано в настоящем документе, термины "терапия", "лечение" или подобные относятся к получению желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения болезни или ее симптомов и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечивания от болезни и/или неблагоприятного воздействия, относящегося к болезни. "Лечение", как использовано в настоящем документе, охватывает любое лечение болезни у млекопитающего, особенно у человека, и включает: (а) препятствование возникновению болезни у субъекта, предрасположенного к заболеванию или с повышенным риском приобретения заболевания, но у которого болезнь еще не диагностирована; (b) ингибирование болезни, то есть, остановку ее развития; и (с) облегчение болезни, то есть, вызов регресса болезни.

[0064] Термины "индивидуум", "хозяин", "субъект" и "пациент" в настоящем документе используются взаимозаменяемо, относятся к млекопитающим, включая, человеческие и нечеловеческие приматы, включая человекообразных обезьян и людей; млекопитающих спортивных животных (например, лошади); млекопитающих сельскохозяйственных животных (например, овцы, козы и т.д.); млекопитающих домашних животных (собаки, кошки и т.д.); и грызуны (например, мыши, крысы, и т.д.), но не ограничиваются перечисленными.

[0065] Прежде чем дальше описывать настоящее изобретение следует понимать, что это изобретение не ограничивается описанными конкретными вариантами осуществления, и как таковые, они могут, конечно, изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления изобретения, а не для его ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только приложенной формулой.

[0066] В случаях, когда предусмотрен диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение, с точностью до десятой единицы нижнего предела, между верхним и нижним пределом такого диапазона или любое другое указанное или промежуточное значение в этом установленном диапазоне, охвачено изобретением, если контекст ясно не указывает иное. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны и также охватываться изобретением с учетом любого специально исключенного предела в установленном диапазоне. Когда установленный диапазон включает один или оба предела, то диапазоны, исключающие один из двух или оба эти указанные пределы, также включены в изобретение.

[0067] Если не указано иное, то все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют те же значения, как и обычно понятные для специалиста в области техники, к которой относится изобретение. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, могут также использоваться в практике или тестировании настоящего изобретения, теперь описаны предпочтительные методы и материалы. Все публикации, указанные в настоящем документе, включены в данную заявку путем ссылки для раскрытия и описания методов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации

[0068] Нужно отметить, что, как использовано в настоящем документе и в приложенной формуле, формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст ясно не указывает на иное. Так, например, ссылка на "вирион рекомбинантного AAV" включает ряд таких вирионов, а ссылка на "фоторецепторную клетку" включает ссылку на одну или более фоторецепторных клеток и их эквиваленты, известные специалисту в данной области техники, и т.д. Нужно дополнительно отметить, что формула может быть составлена так, чтобы исключить любой необязательный элемент. В таковом качестве это высказывание призвано служить ранее упомянутой основой для использования такой исключительной терминологии как "исключительно", "только" и т.п. в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием негативных признаков.

[0069] Следует принимать во внимание, что некоторые особенности изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, могут также предусматриваться в комбинации в единственном варианте осуществления. И наоборот, различные особенности изобретения, которые для краткости описаны в контексте единственного варианта осуществления, могут также предусматриваться отдельно или в любой пригодной субкомбинации. Все комбинации вариантов осуществления, относящиеся к изобретению, определенно охвачены данным изобретением и раскрыты в настоящем документе так же, как если бы каждая комбинация была в нем индивидуально и явно раскрыта. Кроме того, все субкомбинации различных вариантов осуществления изобретения и их элементов также определенно охвачены данным изобретением и раскрыты в настоящем документе так же, как если бы каждая такая подкомбинация была в нем индивидуально и явно раскрыта.

[0070] Публикации, рассмотренные в данном документе, предоставлены исключительно на момент их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данном документе не должно истолковываться как допуск, что данное изобретение не наделено правом предшествовать такой публикации по причине более раннего изобретения. Также даты предоставленных публикаций могут отличаться от фактических годов издания, которые, возможно, нуждаются в независимом подтверждении.

Подробное описание

[0071] В настоящем описании предложены вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с измененным (вариантным) капсидным белком, причем вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальной клетки, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа, когда вводятся интравитреальной инъекцией. В настоящем описании дополнительно предложены способы доставки генного продукта в ретинальную клетку у индивидуума и способы лечения болезни глаз.

[0072] Ретинальна клетка может быть фоторецептором (например, палочки; колбочки), ганглиозной клеткой сетчатки (RGC), клеткой Мюллера (глиальная клетка Мюллера), биполярной клеткой, амакринной клеткой, горизонтальной клеткой или клеткой пигментного эпителия сетчатки (RPE).

ВАРИАНТНЫЕ КАПСИДНЫХ БЕЛКИ AAV

[0073] В настоящем описании предложены вариантные капсидные белки AAV, отличающийся тем, что вариантный капсидный белок AAV содержит вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в сайте встраивания в петле GH капсидного белка или петле IV, по сравнению с соответствующим капсидным белком родительского AAV, и где вариантный капсидный белок, когда присутствует в вирионе AAV, предоставляет повышенную инфекционность ретинальной клетки по сравнению с инфекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV. В некоторых случаях ретинальная клетка является фоторецепторной клеткой (например, палочки; колбочки). В других случаях ретинальная клетка является RGC. В других случаях ретинальная клетка является клеткой RPE. В других случаях ретинальная клетка является клеткой Мюллера. Другие ретинальные клетки включают амакринные клетки, биполярные клетки и горизонтальные клетки. "Вставка из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот" также именуемая в настоящем документе как "пептидная вставка" (например, вставка гетерологичного пептида). "Соответствующий родительский капсидный белок AAV" относится к капсидному белку AAV того же серотипа AAV без пептидной вставки.

[0074] Сайт встраивания находится в петле GH или петле IV капсидного белка AAV, например, в доступной для растворителя части петли GH или петли IV капсидного белка AAV. Для петли GH/ петли IV капсида AAV, смотри, например, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; и Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955. Например, сайт встраивания может находиться в пределах аминокислот 411-650 капсидного белка AAV, как указано на фигурах 17А и 17B. Например, сайт встраивания может находиться в пределах аминокислот 570-611 из AAV2, в пределах аминокислот 571-612 из AAV1, в пределах аминокислот 560-601 из AAV5, в пределах аминокислот с 571 по 612 из AAV6, в пределах аминокислот с 572 по 613 из AAV7, в пределах аминокислот с 573 по 614 из AAV8, в пределах аминокислот с 571 по 612 из AAV9 или в пределах аминокислот с 573 по 614 из AAV 10, как указано на фигуре 6.

[0075] В некоторых случаях от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот вставляется в сайт встраивания в петле GH или петле IV капсидного белка относительно соответствующего родительского капсидного белка AAV. Например, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 587 и 588 AAV2 или соответствующими положениями капсидной субъединицы другого серотипа AAV. Следует заметить, что сайт встраивания 587/588 базируется на капсидном белке AAV2. От приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот может быть вставлено в соответствующий сайт другого серотипа AAV, отличного от AAV2 (например, AAV8, AAV9 и т.д.). Специалист в данной области техники знал бы, исходя из сравнения аминокислотных последовательностей капсидных белков различных серотипов AAV, где сайт встраивания "соответствующий аминокислотам 587-588 из AAV2" будет находиться в капсидном белке любого данного серотипа AAV. Последовательности, соответствующие аминокислотам 570-611 капсидного белка VP1 из AAV2 (смотри фигуру 5) в различных серотипах показаны на фигуре 6. Смотри, например, GenBank Accession No. NP_049542 для AAV1; GenBank Accession No. AAD13756 для AAV5; GenBank Accession No. AAB95459 для AAV6; GenBank Accession No. YP_077178 для AAV7; GenBank Accession No. YP_077180 для AAV8; GenBank Accession No. AAS99264 для AAV9 и GenBank Accession No. AAT46337 для AAV10.

[0076] В некоторых вариантах осуществления изобретения сайт встраивания является единственным местом вставки между двумя смежными аминокислотами, расположенными между аминокислотами 570-614 из VP1 любого серотипа AAV, например, место вставки между двумя смежными аминокислотами, расположенными в аминокислотах 570-610, аминокислотах 580-600, аминокислотах 570-575, аминокислотах 575-580, аминокислотах 580-585, аминокислотах 585-590, аминокислотах 590-600 или аминокислотах 600-614 VP1 любого серотипа AAV или варианта. Например, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 580 и 581, аминокислотами 581 и 582, аминокислотами 583 и 584, аминокислотами 584 и 585, аминокислотами 585 и 586, аминокислотами 586 и 587, аминокислотами 587 и 588, аминокислотами 588 и 589, или аминокислотами 589 и 590. Сайт встраивания может находиться между аминокислотами 575 и 576, аминокислотами 576 и 577, аминокислотами 577 и 578, аминокислотами 578 и 579 или аминокислотами 579 и 580. Сайт встраивания может находиться между аминокислотами 590 и 591, аминокислотами 591 и 592, аминокислотами 592 и 593, аминокислотами 593 и 594, аминокислотами 594 и 595, аминокислотами 595 и 596, аминокислотами 596 и 597, аминокислотами 597 и 598, аминокислотами 598 и 599 или аминокислотами 599 и 600.

[0077] Например, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 587 и 588 из AAV2, между аминокислотами 590 и 591 из AAV1, между аминокислотами 575 и 576 из AAV5, между аминокислотами 590 и 591 из AAV6, между аминокислотами 589 и 590 из AAV7, между аминокислотами 590 и 591 из AAV8, между аминокислотами 588 и 589 из AAV9 или между аминокислотами 588 и 589 из AAV10.

[0078] Как другой пример, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 450 и 460 капсидного белка AAV, как показано на фигуре 17А. Например, сайт встраивания может находиться у (например, непосредственно у N-конца) аминокислоты 453 из AAV2, у аминокислоты 454 из AAV1, у аминокислоты 454 из AAV6, у аминокислоты 456 из AAV7, у аминокислоты 456 из AAV8, у аминокислоты 454 из AAV9 или у аминокислоты 456 из AAV10, как показано на фигуре 17А.

[0079] В некоторых вариантах осуществления изобретения заявленный капсидный белок включает петлю GH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100% аминокислотную идентичность с аминокислотной последовательностью, указанной на фигуре 18А-С.

Инсерционные пептиды

[0080] Как указано выше, пептид из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в длину вставляют в петлю GH капсида AAV. Инсерционный пептид имеет длину в 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 8 аминокислот, 9 аминокислот, 10 аминокислот или 11 аминокислот.

[0081] Инсерционный пептид может содержать аминокислотную последовательность любой из указанных ниже формул.

[0082] Например, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу I:

[0083] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[0084] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, выбран из Leu, Asn и Lys;

Х₂ выбран из Gly, Glu, Ala и Asp;

Х₃ выбран из Glu, Thr, Gly и Pro;

Х₄ выбран из Thr, Ile, Gln и Lys;

Х₅ выбран из Thr и Ala;

Х₆ выбран из Arg, Asn и Thr;

Х₇, если присутствует, выбран из Pro и Asn.

[0085] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IIa:

[0086] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[0087] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

каждый X₁-Х₄ является любой аминокислотой;

X₅ является Thr;

Х₆ является Arg; и

Х₇ является Pro.

[0088] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IIb:

[0089] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[0090] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, выбран из Leu и Asn;

Х₂, если присутствует, выбран из Gly и Glu;

Х₃ выбран из Glu и Thr;

Х₄ выбран из Thr и Ile;

Х₅ является Thr;

Х₆ является Arg; и

Х₇ является Pro.

[0091] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу III:

[0092] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[0093] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, является Lys;

Х₂ выбран из Ala и Asp;

Х₃ выбран из Gly и Pro;

Х₄ выбран из Gln и Lys;

Х₅ выбран из Thr и Ala;

Х₆ выбран из Asn и Thr;

Х₇, если присутствует, является Asn.

[0094] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IV:

[0095] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[0096] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Leu, Asn, Arg, Ala, Ser и Lys;

Х₂ является заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Gly, Glu, Ala, Val, Thr и Asp;

Х₃ является заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Glu, Thr, Gly, Asp или Pro;

Х₄ выбран из Thr, Ile, Gly, Lys, Asp и Gln;

Х₅ является полярной аминокислотой, спиртом (аминокислота, имеющая свободные гидроксильные группы), или гидрофобной аминокислотой; или выбран из Thr, Ser, Val и Ala;

Х₆ является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Arg, Val, Lys, Pro, Thr и Asn; и

Х₇, если присутствует, является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Pro, Gly, Phe, Asn и Arg.

[0097] В качестве неограничивающих примеров, инсерционный пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60).

[0098] В некоторых случаях инсерционный пептид имеет от 1 до 4 спейсерных аминокислот (Y₁-Y₄) у аминоконца и/или у карбоксильного конца любой из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59), и STGKVPN (SEQ ID №60). Пригодная спейсерная аминокислота включает лейцин, аланин, глицин и серии, но не ограничивается ими.

[0099] Например, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: LALGETTRPA (SEQ ID №45); LANETITRPA (SEQ ID №46), LAKAGQANNA (SEQ ID №47), LAKDPKTTNA (SEQ ID №48), LAKDTDTTRA (SEQ ID №61), LARAGGSVGA (SEQ ID №62), LAAVDTTKFA (SEQ ID №63) и LASTGKVPNA (SEQ ID №64). Как другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: AALGETTRPA (SEQ ID №49); AANETITRPA (SEQ ID №50), AAKAGQANNA (SEQ ID №51) и AAKDPKTTNA (SEQ ID №52). Как еще другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: GLGETTRPA (SEQ ID №53); GNETITRPA (SEQ ID №54), GKAGQANNA (SEQ ID №55) и GKDPKTTNA (SEQ ID №56). Как другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид содержит одну из KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60), фланкированную на С-конце с помощью АА и на N-конце с помощью А; или содержит одну из KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60) фланкированную на С-конце с помощью G и на N-конце с помощью А.

[00100] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсид AAV не включает никаких других аминокислотных замещений, вставок или делеций, кроме как вставки из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV. В других вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсид AAV включает от 1 до приблизительно 25 аминокислотных вставок, делеций или замещений по сравнению с родительским капсидным белком AAV, дополнительно к вставке из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с родительским капсидным белком AAV. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсид AAV включает от 1 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 15 до приблизительно 20 или от приблизительно 20 до приблизительно 25 аминокислотных вставок, делеций или замещений по сравнению с родительским капсидным белком AAV, дополнительно к вставке из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с родительским капсидным белком AAV.

[00101] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсидный полипептид не включает одно, два, три или четыре из следующих аминокислотных замещений: Y273F, Y444F, Y500F и Y730F.

[00102] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсидный полипептид содержит, дополнительно к инсерционному пептиду как описано выше, одно, два, три или четыре из следующих аминокислотных замещений: Y273F, Y444F, Y500F и Y730F.

[00103] В некоторых вариантах осуществления изобретения, вариантный капсидный полипептид AAV является химерным капсидом, например, капсид содержит часть капсида AAV первого серотипа AAV и часть капсида AAV второго серотипа; и содержит вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV.

[00104] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98% или, по меньшей мере, приблизительно 99% аминокислотную идентичность с аминокислотной последовательность, представленной на фигуре 5; и вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV.

[00105] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вариантный капсидный белок является выделенным, например, очищенным. В некоторых случаях заявленный вариантный капсидный белок включен в вектор AAV, который тоже предусмотрен. Как подробно описано ниже, заявленный вариантный капсидный белок может быть включенным в рекомбинантный вирион AAV.

ВИРИОН РЕКОМБИНАНТНОГО AAV

[00106] В настоящем описании предложен вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащий: а) вариантный капсидный белок AAV, причем вариантный капсидный белок AAV содержит вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в сайте встраивания в петле GH или петле IV капсидного белка по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV, и где вариантный капсидный белок демонстрирует большую инфекционность ретинальной клетки по сравнению с инфекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV; и b) гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт. В некоторых случаях ретинальная клетка является фоторецепторной клеткой (например, палочками и/или колбочками). В других случаях ретинальная клетка является клеткой RGC. В других случаях ретинальная клетка является клеткой RPE. В других случаях ретинальная клетка является клеткой Мюллера. В других случаях ретинальная клетка может включать амакринные клетки, биполярные клетки и горизонтальные клетки. "Вставка из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот" также именуется в настоящем документе как "пептидная вставка" (например, вставка гетерологичного пептида). "Соответствующий родительский капсидный белок AAV" относится к капсидному белку AAV того же серотипа AAV без пептидной вставки.

[00107] Сайт встраивания находится в петле GH или петле IV капсидного белка AAV, например, в доступной для растворителя части петли GH или петли IV капсидного белка AAV. Для петли GH, смотри, например, van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; и Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955. Например, сайт встраивания находится в пределах аминокислот 570-611 из AAV2, в пределах аминокислот 571-612 из AAV1, в пределах аминокислот 560-601 из AAV5, в пределах аминокислот от 571 до 612 из AAV6, в пределах аминокислот от 572 до 613 из AAV7, в пределах аминокислот от 573 до 614 из AAV8, в пределах аминокислот от 571 до 612 из AAV9 или в пределах аминокислот от 573 до 614 из AAV10.

[00108] От приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот вставляется в сайт встраивания в петле GH или петле IV капсидного протеина по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV. Например, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 587 и 588 из AAV2, или в соответствующих положениях капсидной субъединицы другого серотипа AAV. Следует заметить, что сайт встраивания 587/588 базируется на капсидном белке AAV2. От приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот может вставляться ответствующий сайт в другом серотипе AAV, отличном от AAV2 (например, AAV8, AAV9 и т.д.). Специалист в данной области техники знал бы, исходя из сравнения аминокислотных последовательностей капсидных белков различных серотипов AAV, где сайт встраивания, "соответствующий аминокислотам 587-588 из AAV2", будет находиться в капсидном белке любого данного серотипа AAV. Последовательности, соответствующие аминокислотам 570-611 капсидного белка VP1 из AAV2 (см. фигуру 5) в различных серотипах AAV, показаны на фигуре 6.

[00109] В некоторых вариантах осуществления изобретения, сайт встраивания является единственным местом вставки между двумя смежными аминокислотами, расположенными между аминокислотами 570-614 из VP1 любого серотипа AAV, например, сайт встраивания находится между двумя смежными аминокислотами, расположенными в аминокислотах 570-614, в аминокислотах 580-600, в аминокислотах 570-575, в аминокислотах 575-580, в аминокислотах 580-585, в аминокислотах 585-590, в аминокислотах 590-600 или в аминокислотах 600-610 из VP1 любого серотипа или варианта AAV. Например, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 580 и 581, аминокислотами 581 и 582, аминокислотами 583 и 584, аминокислотами 584 и 585, аминокислотами 585 и 586, аминокислотами 586 и 587, аминокислотами 587 и 588, аминокислотами 588 и 589 или аминокислотами 589 и 590. Сайт встраивания может находиться между аминокислотами 575 и 576, аминокислотами 576 и 577, аминокислотами 577 и 578, аминокислотами 578 и 579 или аминокислотами 579 и 580. Сайт встраивания может находиться между аминокислотами 590 и 591, аминокислотами 591 и 592, аминокислотами 592 и 593, аминокислотами 593 и 594, аминокислотами 594 и 595, аминокислотами 595 и 596, аминокислотами 596 и 597, аминокислотами 597 и 598, аминокислотами 598 и 599 или аминокислотами 599 и 600.

[00110] Например, сайт встраивания может находиться между аминокислотами 587 и 588 из AAV2, между аминокислотами 590 и 591 из AAV1, между аминокислотами 575 и 576 из AAV5, между аминокислотами 590 и 591 из AAV6, между аминокислотами 589 и 590 из AAV7, между аминокислотами 590 и 591 из AAV8, между аминокислотами 588 и 589 из AAV9 или между аминокислотами 589 и 590 из AAV10.

Инсерционные пептиды

[00111] Как отмечалось выше, заявленный вирион rAAV содержит пептид из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в длину, вставленный в петлю GH капсида AAV. Инсерционный пептид имеет длину в 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 8 аминокислот, 9 аминокислот, 10 аминокислот или 11 аминокислот.

[00112] Инсерционный пептид может содержать аминокислотную последовательность любой формулы, указанной ниже.

[00113] Например, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу I:

[00114] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00115] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, выбран из Leu, Asn и Lys;

Х₂ выбран из Gly, Glu, Ala и Asp;

Х₃ выбран из Glu, Thr, Gly и Pro;

Х₄ выбран из Thr, Ile, Gln и Lys;

Х₅ выбран из Thr и Ala;

Х₆ выбран из Arg, Asn и Thr;

Х₇, если присутствует, выбран из Pro и Asn.

[00116] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IIa:

[00117] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00118] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

каждый X₁-Х₄ является любой аминокислотой;

Х₅ является Thr;

Х₆ является Arg; и

Х₇ является Pro.

[00119] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IIb:

[00120] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00121] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, выбран из Leu и Asn;

Х₂, если присутствует, выбран из Gly и Glu;

Х₃ выбран из Glu и Thr;

Х₄ выбран из Thr и Ile;

Х₅ является Thr;

Х₆ является Arg; и

Х₇ является Pro.

[00122] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу III:

[00123] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00124] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, является Lys;

Х₂ выбран из Ala и Asp;

Х₃ выбран из Gly и Pro;

Х₄ выбран из Gln и Lys;

X₅ выбран из Thr и Ala;

Х₆ выбран из Asn и Thr;

Х₇, если присутствует, является Asn.

[00125] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IV:

[00126] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00127] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Leu, Asn, Arg, Ala, Ser и Lys;

Х₂ является заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Gly, Glu, Ala, Val, Thr и Asp;

Х₃ является заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Glu, Thr, Gly, Asp или Pro;

Х₄ выбран из Thr, Ile, Gly, Lys, Asp и Gln;

Х₅ является полярной аминокислотой, спиртом (аминокислотой, имеющей свободные гидроксильные группы), или гидрофобной аминокислотой; или выбран из Thr, Ser, Val и Ala;

Х₆ является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Arg, Val, Lys, Pro, Thr и Asn; и

Х₇, если присутствует, является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Pro, Gly, Phe, Asn и Arg.

[00128] В качестве неограничивающих примеров, инсерционный пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60).

[00129] В некоторых случаях инсерционный пептид имеет от 1 до 4 спейсерных аминокислот (Y₁-Y₄) у аминоконца и/или у карбоксильного конца любой из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60). Пригодная спейсерная аминокислота включает лейцин, аланин, глицин и серии, но не ограничивается ими.

[00130] Например, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: LALGETTRPA (SEQ ID №45); LANETITRPA (SEQ ID №46), LAKAGQANNA (SEQ ID №47), LAKDPKTTNA (SEQ ID №48), LAKDTDTTRA (SEQ ID №61), LARAGGSVGA (SEQ ID №62), LAAVDTTKFA (SEQ ID №63) и LASTGKVPNA (SEQ ID №64). Как другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: AALGETTRPA (SEQ ID №49); AANETITRPA (SEQ ID №50), AAKAGQANNA (SEQ ID №51) и AAKDPKTTNA (SEQ ID №52). Как еще другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: GLGETTRPA (SEQ ID №53); GNETITRPA (SEQ ID №54), GKAGQANNA (SEQ ID №55) и GKDPKTTNA (SEQ ID №56). Как другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид содержит одну из KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60), фланкированную на С-конце с помощью АА и на N-конце с помощью А; или содержит одну из KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60) фланкированную на С-конце с помощью G и на N-конце с помощью А.

[00131] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный капсид вириона rAAV не включает никаких других аминокислотных замещений, вставок или делеций, кроме как вставки из приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 10 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV. В других вариантах осуществления изобретения, заявленный капсид вириона rAAV включает от 1 до приблизительно 25 аминокислотных вставок, делеций или замещений по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV дополнительно к вставке из приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 10 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный капсид вириона rAAV включает от 1 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 15 до приблизительно 20 или от приблизительно 20 до приблизительно 25 аминокислотных вставок, делеций или замещений по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV дополнительно к вставке из приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 10 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV.

[00132] В некоторых вариантах осуществления изобретения заявленный капсид вириона rAAV не включает одно, два, три или четыре следующих аминокислотных замещения: Y273F, Y444F, Y500F и Y730F.

[00133] В некоторых вариантах осуществления изобретения заявленный вариантный капсидный полипептид содержит дополнительно к инсерционному пептиду, как описано выше, одно, два, три или четыре следующих аминокислотных замещения: Y273F, Y444F, Y500F и Y730F.

[00134] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный капсид вириона rAAV является химерным капсидом, например, капсид содержит часть капсида AAV первого серотипа AAV часть капсида AAV второго серотипа; и содержит вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV.

[00135] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV содержит капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98% или, по меньшей мере, приблизительно 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной на фигуре 5; и вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV.

[00136] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV содержит капсидный белок, который включает петлю GH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной на фигуре 18А-С.

[00137] Заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или белее чем 50-кратное повышение инфекционности ретинальной клетки по сравнению с ифекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00138] В некоторых случаях заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное, повышение инфекционности ретинальной клетки, когда вводиться интравитреальной инъекцией по сравнению с инфекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00139] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности клетки фоторецептора (палочка или колбочка) по сравнению с инфекционностью фоторецепторной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00140] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности клетки фоторецептора (палочка или колбочка), когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью фоторецепторной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00141] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности RGC по сравнению с инфекционностью RGC вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00142] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное, повышение инфекционности RGC, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью RGC вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00143] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности клетки RPE по сравнению с инфекционностью клетки RPE вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00144] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности клетки RPE, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью клетки RPE вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00145] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности клетки Мюллера по сравнению с инфекционностью клетки Мюллера вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00146] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности клетки Мюллера, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью клетки Мюллера вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00147] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности биполярной клетки по сравнению с инфекционностью биполярной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00148] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности биполярной клетки, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью биполярной клетки вирионом AAV содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00149] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности амакринной клетки по сравнению с инфекционностью амакринной клетки вирионом AAV содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00150] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности амакринной клетки, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью амакринной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00151] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности горизонтальной клетки по сравнению с инфекционностью горизонтальной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV.

[00152] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности горизонтальной клетки, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью горизонтальной клетки вирионом AAV содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00153] В некоторых случаях заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение способности пересекать внутреннюю пограничную мембрану (ILM) по сравнению со способностью вириона AAV, содержащего соответствующий родительский капсидный белок AAV, to cross the ILM.

[00154] В некоторых случаях заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение способности, когда вводиться интравитреальной инъекцией, пересекать внутреннюю пограничную мембрану (ILM), по сравнению со способностью вириона AAV, содержащего соответствующий родительский капсидный белок AAV, пересекать ILM, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

[00155] Заявленный вирион rAAV может пересекать ILM, а также может пересекать слои клеток, включая клетки Мюллера, амакринные клетки и т.д., для достижения клеток фоторецептора и или клеток RPE. Например, заявленный вирион rAAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией, может пересекать ILM, а также может пересекать слои клеток, включая клетки Мюллера, амакринные клетки и т.д., для достижения фоторецепторных клеток или клеток RPE.

[00156] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV селективно инфицирует ретинальную клетку, например, заявленный вирион rAAV инфицирует ретинальную клетку с 10-кратной, 15-кратной, 20-кратной, 25-кратной, 50-кратной или более чем 50-кратной специфичностью, чем неретинальную клетку, например, клетку вне глаза. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV селективно инфицирует ретинальную клетку, например, заявленный вирион rAAV инфицирует фоторецепторную клетку с 10-кратной, 15-кратной, 20-кратной, 25-кратной, 50-кратной или более чем 50-кратной специфичностью, чем неретинальную клетку, например, клетку вне глаза.

[00157] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV селективно инфицирует фоторецепторную клетку, например, заявленный вирион rAAV инфицирует ретинальную клетку с 10-кратной, 15-кратной, 20-кратной, 25-кратной, 50-кратной или более чем 50-кратной специфичностью, чем неретинальную фоторецепторную клетку, присутствующую в глазе, например, ганглиозную клетку сетчатки, клетку Мюллера и т.д.

[00158] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное, по меньшей мере, 15-кратное, по меньшей мере, 20-кратное, по меньшей мере, 25-кратное, по меньшей мере, 50-кратное или более чем 50-кратное повышение инфекционности фоторецепторной клетки, когда вводиться интравитреальной инъекцией, по сравнению с инфекционностью фоторецепторной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV, когда вводиться интравитреальной инъекцией.

Генные продукты

[00159] Заявленный вирион rAAV содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт. В некоторых вариантах осуществления изобретения, генный продукт является интерферирующей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения генный продукт является аптамером. В некоторых вариантах осуществления изобретения генный продукт является полипептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения генный продукт является сайт-специфичной нуклеазой, которая обеспечивает сайт-специфический «нокдаун»

Интерферирующая РНК

[00160] Когда генным продуктом является интерферирующая РНК (РНКи), пригодные РНКи включают РНКи, которые уменьшают уровень апоптотического или ангиогенного фактора в клетке. Например, РНКи может быть миРНК или миРНК, которая снижает уровень генного продукта, который вызывает или способствует апоптозу в клетке. Гены, генные продукты которых вызывают или способствуют апоптозу, упомянуты в данном документе как "проапоптотические гены", а продукты таких генов (мРНК; белок) упомянуты как "проапоптотические генные продукты". Проапоптотические генные продукты включают, например, генные продукты Вах, Bid, Bak и Bad. Смотри, например, патент США №7846730.

[00161] Интерферирующие РНК также могут быть против ангиогенного продукта, например VEGF (например, Cand5; смотри, например, патентную публикацию США №2011/0143400; патентную публикацию США №2008/0188437; и Reich et al. (2003) Mol. Vis. 9:210), VEGFR1 (например, миРНК-027; смотри, например, Kaiser et al. (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33; и Shen et al. (2006) Gene Ther. 13:225), или VEGFR2 (Kou et al. (2005) Biochem. 44:15064). Смотри также, патенты США №6649596, 6399586, 5661135, 5639872 и 5639736; и патенты США №7947659 и 7919473.

Аптамеры

[00162] Когда генным продуктом является аптамер, представляющие интерес примерные аптамеры включают аптамер против сосудистого фактора эндотелиального роста (VEGF). Смотри, например, Ng et al. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123; и Lee et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18902. Например, аптамер VEGF может содержать нуклеотидную последовательность 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (SEQ ID №17). Также пригодным для использования является PDGF-специфический аптамер, например, Е10030; смотри, например, Ni и Hui (2009) Ophthalmologica 223:401; и Akiyama et al. (2006) J. Cell Physiol. 207:407).

Полипептиды

[00163] Когда генным продуктом является полипептид, полипептид является обычно полипептидом, улучшающим функцию ретинальной клетки, например, функцию палочковидной или колбочковидной фоторецепторной клетки, ретинальной клетки нервного узла, клетки Мюллера, биполярной клетки, амакринной клетки, горизонтальной клетки или ретинального пигментированного эпителиоцита. Примерные полипептиды включают нейропротекторные полипептиды (например, GDNF, CNTF, NT4, NGF и NTN); антиангиогенные полипептиды (например, растворимый рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); VEGF-связывающее антитело; фрагмент VEGF-связывающего антитела (например, одноцепочечное анти-VEGF антитело); эндостатин; тумстатин; ангиостатин; растворимый полипептид Fit (Lai et al. (2005) Mol. Ther. 12:659); слитый белок Fc, содержащий растворимы полипептид Flt (смотри, например, Pechan et al. (2009) Gene Ther. 16:10); фактор пигментного эпителия (PEDF); растворимый рецептор Tie-2; и т.д.; тканевый ингибитор металлопротеиназы-3 (TIMP-3); свето-реактивный опсин, например, родопсин; антиапоптозные полипептиды (например, Bcl-2, Bcl-Xl); и т.п. Пригодные полипептиды включают глиальный нейротрофический фактор (GDNF); фактор роста фибробластов 2; нейротурин (NTN); цилиарный нейротрофический фактор (CNTF); фактор роста нервов (NGF); нейротрофин -4 (NT4); нейротрофический фактор из тканей мозга (BDNF; например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100% идентичность последовательности аминокислот со смежным удлинением от приблизительно 200 аминокислот до 247 аминокислот аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 11 (SEQ ID №11)); эпидермальный фактор роста; родопсин; Х-сцепленный ингибитор апоптоза; и хеджехог-белок, но не ограничиваются ими.

[00164] Пригодные свето-реактивные опсины включают, например, свето-реактивный опсин, как описано в патентной публикации США №2007/0261127 (например, ChR2; Chop2); патентной публикации США №2001/0086421; патентной публикации США №2010/0015095; и Diester et al. (2011) Nat. Neurosci. 14:387.

[00165] Пригодные полипептиды также включают ретиношизин (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100%, идентичность последовательности аминокислот со смежным удлинением от приблизительно 200 аминокислот до 224 аминокислот аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 10 (SEQ ID №10). Пригодные полипептиды включают, например, (RGPR)-взаимодействующий белок-1 регулятора ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки (смотри, например, GenBank Accession № Q96KN7, Q9EPQ2, и Q9GLM3) (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100%, идентичность последовательности аминокислот со смежным удлинением от приблизительно 1150 аминокислот до приблизительно 1200 аминокислот или от приблизительно 1200 аминокислот до 1286 аминокислот аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 16 (SEQ ID №21); периферин-2 (Prph2) (смотри, например, GenBank Accession No. NP_000313 (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100% идентичность последовательности аминокислот со смежным удлинением от приблизительно 300 аминокислот до 346 аминокислот аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 14 (SEQ ID №19); и Travis et al. (1991) Genomics 10:733); периферии (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100% идентичность последовательности аминокислот со смежным удлинением от приблизительно 400 аминокислот до приблизительно 470 аминокислот аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 15 (SEQ ID №20); специфический к пигментному эпителию сетчатки протеин (RPE65), (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% или 100% идентичность последовательности аминокислот со смежным удлинением от приблизительно 200 аминокислот до 247 аминокислот аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 12 (SEQ ID №12)) (смотри, например, GenBank AAC39660; и Morimura et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3088); и т.п.

[00166] Пригодные полипептиды также включают: СНМ (хороидермия (Rab эскортный протеин 1)), полипептид, который, когда дефектный или дефицитный, вызывает хороидермию (смотри, например, Donnelly et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1017; и van Bokhoven et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1041); и гомолог Крамба 1 (CRB1), олигопептид, который, когда дефектный или дефицитный, вызывает амавроз Лебера и пигментный ретинит (смотри, например, den Hollander et al. (1999) Nat. Genet. 23:217; и GenBank Accession No. CAM23328).

[00167] Пригодные полипептиды также включают полипептиды, которые, когда дефектны или дефицитны, приводят к ахроматопсии, тогда такие полипептиды включают, например, субъединицу альфа ЦГМФ-зависимого канала колбочкового фоторецептора (CNGA3) смотри, например, GenBank Accession No. NP_001289; и Booij et al. (2011) Ophthalmology 118:160-167); бета-субъединицу ЦГМФ-зависимого ионного канала колбочкового фоторецептора (CNGB3) (смотри, например, Kohl et al. (2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302); гуаниновонуклеотидный связывающий белок (белок G), полипептид 2 альфа трансдуцирующей активности (GNAT2) (АСНМ4); и АСНМ5; и полипептиды, которые, когда дефектны или дефицитны, приводят к различным формам дальтонизма (например, L-опсин, М-опсин, и S-опсин). См. Mancuso et al. (2009) Nature 461(7265):784-787.

Сайт-специфичные эндонуклеазы

[00168] В некоторых случаях целевой генный продукт является сайт-специфичной эндонуклеазой, которая обеспечивает сайт-специфичный «нокдаун» генной функции, например, когда эндонуклеаза «нокаутирует» аллель, связанную с ретинальной болезнью. Например, в случаях, когда доминантная аллель кодирует дефектную копию гена, который, когда дикого типа, является ретинальным структурным белком и/или предусматривает нормальную ретинальную функцию, то сайт-специфичная эндонуклеаза может быть нацеленной на дефектную аллель и «нокаутирует» дефектную аллель.

[00169] В дополнение к «нокаутированию» дефектной аллели сайт-специфичная нуклеаза может также использоваться для стимулирования гомологичной рекомбинации с донором ДНК, который кодирует функциональную копию протеина, закодированного дефектной аллелью. Таким образом, например, заявленный вирион rAAV может использоваться для доставки сайт-специфичной эндонуклеазы, которая «нокаутирует» дефектную аллель, и может использоваться для доставки функциональной копии дефектной аллели, приводящей к восстановлению дефектной аллели, тем самым, обеспечивая продуцирование функционального ретинального протеина (например, функционального ретиношизина, функционального RPE65, функционального периферина и т.д.). Смотри, например, Li et al. (2011) Nature 475:217. В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленный вирион rAAV содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует сайт-специфичную эндонуклеазу; и гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональную копию дефектной аллели, где функциональная копия кодирует функциональный ретинальный протеин. Функциональные ретинальные протеины включают, например, ретиношизин, RPE65, (RGPR)-взаимодействующий белок-1 регулятора ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки, периферии, периферин -2 и т.п.

[00170] Сайт-специфичные эндонуклеазы, пригодные для использования, включают, например, нуклеазы "цинковые пальцы" (ZFN); и подобные активатору транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN), когда такие сайт-специфичные эндонуклеазы не природного происхождения и модифицированы для нацеливания на специфичный ген. Такие сайт-специфичные эндонуклеазы могут быть сконструированы для сокращения определенных местоположений в геноме, а негомологичное соединение концов может затем восстановить разрыв при вставке или удалении нескольких нуклеотидов. Такие сайт-специфичные эндонуклеазы (также именуемый как "INDEL") затем выбрасывают белок из рамки и эффективно «нокаутируют» ген. Смотри, например, патентную публикацию США №2011/0301073.

Регуляторные последовательности

[00171] В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой генный продукт, функционально связана с конститутивным промотором. В других вариантах осуществления изобретения, нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой генный продукт, функционально связана с индуцибельным промотором. В некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой генный продукт, функционально связана с тканеспецифичным или клеточноспецифичным регуляторным элементом. Например, в некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой генный продукт, функционально связана с фоторецепторспецифичным регуляторным элементом (например, фоторецепторспецифичным промотором), например, регуляторным элементом, который обеспечивает селективную экспрессию функционально связанного гена в фоторецепторной клетке. Пригодные фоторецепторспецифичные регуляторные элементы включают, например, родопсиновый промотор; родопсинокиназный промотор (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076); промотор гена бета-фосфодиэстеразы (Nicoud et al. (2007) J. Gene Meet. 9:1015); промотор гена пигментного ретинита (Nicoud et al. (2007) выше); энхансер гена межфоторецепторного ретинол-связывающего белка (IRBP) (Nicoud et al. (2007) выше); промотор гена IRBP (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225).

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

[00172] В настоящем описании предложена фармацевтическая композиция, содержащая: а) заявленный вирион rAAV, как описано выше; и b) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или буфер. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или буфер является пригодным для использования у человека.

[00173] Такие эксципиенты, носители, разбавители и буферы включают любой фармацевтический агент, который может вводиться без неспецифичной токсичности. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этонол, но не ограничиваются ими. Фармацевтически приемлемые соли, включенные в настоящий документ, могут быть, например, солями минеральных кислот, такими как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; солями органических кислот, такими как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Кроме того, вспомогательные материалы, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН буферные вещества и т.п., могут присутствовать в таких наполнителях. Широкий спектр фармацевтически приемлемых эксципиентов известен из уровня техники и не требует детального обсуждения в настоящем документе. Фармацевтически приемлемые эксципиенты вполне достаточно описаны в различных публикациях, включая, например, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science и Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms и Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7^th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; и Handbook of Pharmaceutical Эксципиент S (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3^rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

СПОСОБЫ ДОСТАВКИ ГЕННОГО ПРОДУКТА В РЕТИНАЛЬНУЮ КЛЕТКУ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ

[00174] В настоящем описании предложен способ доставки генного продукта в ретинальную клетку индивидуума, способ, включающий введение индивидууму заявленного вириона rAAV, как описано выше. Генный продукт может быть полипептидом или интерферирующей РНК (например, кшРНК, миРНК и т.п.), аптамером или сайт-специфичной эндонуклеазой, как описано выше. Доставка генного продукта в ретинальную клетку может предусматриваться для лечения заболевания сетчатки. Ретинальная клетка может быть фоторецептором, ганглиозной клеткой сетчатки, клеткой Мюллера, биполярной клеткой, амакринной клеткой, горизонтальной клеткой или клеткой пигментного эпителия сетчатки. В некоторых случаях ретинальная клетка является фоторецепторной клеткой, например, палочковидной или колбочковидной клеткой.

[00175] В настоящем описании предложен способ лечения заболевания сетчатки, способ, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества заявленного вириона rAAV, как описано выше. Заявленный вирион rAAV может вводиться внутриглазной инъекцией, интравитреальной инъекцией, или любым другим удобным способом или путем введения. Другие удобные способы и пути введения включают, например, внутривенный, внутриназальный и так далее.

[00176] "Терапевтически эффективное количество" попадает в относительно широкий диапазон, который может быть определен посредством экспериментирования и/или клинических испытаний. Например, для in vivo инъекций, то есть, инъекций непосредственно в глаз, терапевтически эффективная доза будет порядка от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹⁵ вирионов rAAV, например, от приблизительно 10⁸ до 10¹² вирионов rAAV. Для in vitro трансдукции, эффективное количество вирионов rAAV, которые будут доставлены в лотки, будет порядка от приблизительно 10⁸ до приблизительно 10¹³ вирионов rAAV. Другие эффективные дозировки могут быть легко определены специалистом в данной области техники путем обычных испытаний, определяющих кривую зависимости "доза-эффект".

[00177] В некоторых вариантах осуществления изобретения более чем одно введение (например, два, три, четыре или более введений) может использоваться для достижения желаемого уровня экспрессии гена в течение различных интервалов, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно, и т.д.

[00178] Глазные заболевания, которые могут лечиться с помощью заявленного способа, включают острую макулярную нейроретинопатию; болезнь Бехсета; хориоидальную неоваскуляризацию; диабетический увеит; гистоплазмоз; дегенерацию желтого пятна, такую как острая дегенерация желтого пятна, неэксудативну возрастную макулярную дистрофию и эксудативну возрастную макулярную дистрофию; эдему, такую как макулярная эдема, кистозный макулярный отек и диабетический отек желтого пятна; многофокальный хориоидит; глазную травму, влияющую на заднее глазное место или местоположение; глазные опухоли; заболевания сетчатки, такие как окклюзия центральных вен сетчатки, диабетическая ретинопатия (включая пролиферативную диабетическую ретинопатию), пролиферативную витреоретинопатию (PVR), окклюзионное поражение артерий сетчатки, отслоение сетчатки, увеальную болезнь сетчатки; симпатическую офтальмию; синдром Фогта-Коянаги-Харада (VKH); увеальную диффузию; следующее глазное заболевание, вызванное лазерной терапией глаз или под влиянием лазерной терапии глаз; следующие глазные заболевания, вызванные фотодинамической терапией или под влиянием фотодинамической терапии; фото коагуляцию, радиационную ретинопатию; расстройства эпиретинальной мембраны; окклюзию ветки вены сетчатки; переднюю ишемическую оптическую нейропатию; неретинопатическую диабетическую дисфункцию сетчатки; ретиношизис, пигментный ретинит; глаукому; синдром Ушера, палочко-колбочковую дистрофию; болезнь Штаргардта (желтопятнистая абиотрофия сетчатки); унаследованную дегенерацию желтого пятна; хориоретинальную дегенерацию; амавроз Лебера; врожденную стационарную ночную слепоту; хороидеремию; синдром Барде-Бидля; макулярную телеангиэктазию; атрофию зрительного нерва Лебера; ретролентальную фиброплазияю и расстройства цветного зрения, включая ахроматопсию, протанопию, дейтеранопию и тританопию, но не ограничиваются перечисленными.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА

[00179] В настоящем описании предложена выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует заявленный вариантный капсидный белок аденоассоциированного вируса (AAV), как описано выше, где вариантный капсидный белок AAV содержит вставку из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в петле GH или петле IV по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV, и где вариантный капсидный белок, когда присутствует в вирионе AAV, обеспечивает повышенную инфекционность ретинальной клетки по сравнению с инфекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV. Заявленная выделенная нуклеиновая кислота может быть вектором AAV, например, рекомбинантным вектором AAV.

Инсерционные пептиды

[00180] Вариантный капсидный белок AAV, кодируемый заявленной нуклеиновой кислотой, имеет инсерционный пептид из приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 11 аминокислот в длину, вставленный в петлю GH капсида AAV. Инсерционный пептид имеет длину 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 8 аминокислот, 9 аминокислот, 10 аминокислот или 11 аминокислот.

[00181] Инсерционный пептид может содержать аминокислотную последовательность любой формулы, указанной ниже.

[00182] Например, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу I:

[00183] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00184] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, выбран из Leu, Asn и Lys;

Х₂ выбран из Gly, Glu, Ala и Asp;

Х₃ выбран из Glu, Thr, Gly и Pro;

Х₄ выбран из Thr, Ile, Gln и Lys;

Х₅ выбран из Thr и Ala;

Х₆ выбран из Arg, Asn и Thr;

Х₇, если присутствует, выбран из Pro и Asn.

[00185] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IIa:

[00186] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00187] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

каждый X₁-Х₄ является любой аминокислотой;

Х₅ является Thr;

Х₆ является Arg; и

Х₇ является Pro.

[00188] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IIb:

[00189] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00190] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, выбран из Leu и Asn;

Х₂, если присутствует, выбран из Gly и Glu;

Х₃ выбран из Glu и Thr;

Х₄ выбран из Thr и Ile;

Х₅ является Thr;

Х₆ является Arg; и

Х₇ является Pro.

[00191] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу III:

[00192] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00193] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, является Lys;

Х₂ выбран из Ala и Asp;

Х₃ выбран из Gly и Pro;

Х₄ выбран из Gln и Lys;

Х₅ выбран из Thr и Ala;

Х₆ выбран из Asn и Thr;

Х₇, если присутствует, является Asn.

[00194] Как другой пример, инсерционный пептид может быть пептидом из 5 до 11 аминокислот в длину, где инсерционный пептид имеет Формулу IV:

[00195] Y₁Y₂X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇Y₃Y₄

[00196] где:

каждый Y₁-Y₄, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser и Thr;

X₁, если присутствует, является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Leu, Asn, Arg, Ala, Ser и Lys;

Х₂ является заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Gly, Glu, Ala, Val, Thr и Asp;

Х₃ является заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Glu, Thr, Gly, Asp или Pro;

X₄ выбран из Thr, Ile, Gly, Lys, Asp и Gln;

X₅ является полярной аминокислотой, спиртом (аминокислота, имеющая свободные гидроксильные группы), или гидрофобной аминокислотой; или выбран из Thr, Ser, Val и Ala;

Х₆ является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Arg, Val, Lys, Pro, Thr и Asn; и

Х₇, если присутствует, является положительно заряженной аминокислотой или незаряженной аминокислотой; или выбран из Pro, Gly, Phe, Asn и Arg.

[00197] В качестве неограничивающих примеров, инсерционный пептид может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60).

[00198] В некоторых случаях инсерционный пептид имеет от 1 до 4 спейсерных аминокислот (Y₁-Y₄) у аминоконца и/или у карбоксильного конца любой из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59), и STGKVPN (SEQ ID №60). Пригодные спейсерные аминокислоты включают лейцин, аланин, глицин и серии, но не ограничиваются ими.

[00199] Например, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: LALGETTRPA (SEQ ID №45); LANETITRPA (SEQ ID №46), LAKAGQANNA (SEQ ID №47), LAKDPKTTNA (SEQ ID №48), LAKDTDTTRA (SEQ ID №61), LARAGGSVGA (SEQ ID №62), LAAVDTTKFA (SEQ ID №63) и LASTGKVPNA (SEQ ID №64). Как другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: AALGETTRPA (SEQ ID №49); AANETITRPA (SEQ ID №50), AAKAGQANNA (SEQ ID №51) и AAKDPKTTNA (SEQ ID №52). Как еще другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: GLGETTRPA (SEQ ID №53); GNETITRPA (SEQ ID №54), GKAGQANNA (SEQ ID №55) и GKDPKTTNA (SEQ ID №56). Как другой пример, в некоторых случаях инсерционный пептид содержит одну из KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60), фланкированную на С-конце с помощью АА и на N-конце с помощью А; или содержит одну из KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60) фланкированную на С-конце с помощью G и на N-конце с помощью А.

[00200] Заявленный рекомбинантный вектор AAV может использоваться для получения заявленного рекомбинантного вириона AAV, как описано выше. Таким образом, в настоящем описании предложен рекомбинантный вектор AAV, который, когда введен в пригодную клетку, может обеспечивать продуцирование заявленного рекомбинантного вириона AAV.

[00201] Данное изобретение дополнительно предусматривает клетки-хозяева, например, выделенные (генетически модифицированные) клетки-хозяева, содержащие заявленную нуклеиновую кислоту. Заявленная клетка-хозяин может быть выделенной клеткой, например, клеткой в in vitro культуре. Заявленная клетка-хозяин пригодна для продуцирования заявленного вириона rAAV, как описано ниже. Когда заявленная клетка-хозяин используется для продуцирования заявленного вириона rAAV, ее называют "пакующей клеткой". В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленная клетка-хозяин является стабильно генетически модифицированной заявленной нуклеиновой кислотой. В других вариантах осуществления изобретения, заявленная клетка-хозяин является временно генетически модифицированной заявленной нуклеиновой кислотой.

[00202] Заявленная нуклеиновая кислота является стабильно или временно введенной в клетку-хозяин с использованием отработанных технологий, включая электропорацию, кальций-фосфатную преципитацию, опосредованную липосомами трансфекцию и т.п., но не ограничивается указанными. Для стабильной трансфекции заявленная нуклеиновая кислота будет, как правило, дополнительно включать селектируемый маркер, например, любой из нескольких известных селектируемых маркеров, таких как резистентность к неомицину и т.п.

[00203] Заявленную клетку-хозяин получают путем введения заявленной нуклеиновой кислоты в любую из многочисленных клеток, например клеток млекопитающих, включая, например, мышиные клетки и клетки приматов (например, клетки человека). Пригодные клетки млекопитающих включают эмбриональные клетки и клеточные линии, где пригодные клеточные линии включают клетки 293, клетки COS, клетки HeLa, клетки Веро, 3Т3 мышиные фибробласты, фибробласты С3Н10Т1/2, клетки ЯКХ и т.п., но не ограничиваются указанными. Неограничивающие примеры пригодных клеток-хозяев включают, клетки HeLa (например, CCL-2 - номер Американская коллекция типовых культур (АТСС)), клетки ЯКХ (например, АТСС № CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки 293 (например, АТСС № CRL-1573), клетки Веро, клетки NIH 3Т3 (например, АТСС № CRL-1658), клетки Huh-7, клетки BHK (например, АТСС № CCL10), клетки РС12 (АТСС № CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (ATCC № CRL1651), клетки RAT1, мышиные L клетки (АТСС № CCLI.3), человеческие эмбриональные клетки почек (HEK) (АТСС № CRL1573), клетки HLHepG2 и т.п. заявленная клетка-хозяин может также быть получена с использованием бакуловируса для инфицирования клеток насекомых, таких как клетки Sf9, которые продуцируют AAV (смотри, например, патент США №7271002; патентную публикацию США №12/297,958)

[00204] В некоторых вариантах осуществления изобретения, заявленная генетически-модифицированная клетка-хозяин включает кроме нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую вариантный капсидный белок AAV, как описано выше, нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более «рэп»-белков AAV. В других вариантах осуществления изобретения заявленная клетка-хозяин дополнительно содержит вектор rAAV. Вирион rAAV может быть получен с использованием заявленной клетки-хозяина. Способы получения вириона rAAV описаны, например, в патентной публикации США №2005/0053922 и патентной публикации США №2009/0202490.

Примеры

[00205] Следующие примеры использованы для того, чтобы обеспечить специалиста в данной области техники полным раскрытием и описанием того, как получить и использовать настоящее изобретение, и не предназначаются для ограничения объема того, что изобретатели расценивают как их изобретение, и при этом они не означают, что приведенные ниже эксперименты представляют собой все или единственные выполняемые эксперименты. Были приняты меры для того, чтобы сохранить точность относительно используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и допущения должны быть учтены. Если не указано иное, то части являются частями по весу, молекулярный вес является средневесовым молекулярным весом, температура является градусами Цельсия, а давление является атмосферным или почти атмосферным. Могут использоваться стандартные аббревиатуры, например, п.о., пара оснований; т.п.н., тысяча пар оснований; пл, пиколитр(ы); с., секунда(ы); мин, минута(ы); ч., час(ы); ак, аминокислота(ы); нт, нуклеотид(ы); в/м, внутримышечно; в/б, внутрибрюшинно; п/к, подкожно и т.п.

Пример 1. Вариант AAV с повышенной трансдукцией ретинальных клеток

[00206] Используемый подход должен был создать библиотеку пептидного дисплея путем введения уникального сайта AvrII в геном AAV2 дикого типа между аминокислотой 587 и 588 с помощью мутагенеза полимеразной цепной реакции (ПЦР). Случайную нуклеотидную вставку 21, 7mer For, использовали для синтеза вставок дцДНК вместе с антисмысловым праймером 7mer Rev. Полученные вставки дцДНК клонировали в сайт AvrII генома после расщепления с NheI, продуцируя многообразную 7mer библиотеку, которую затем упаковали (Perabo et al., 2003; Muller et al., 2003). Вирус получали таким образом, что каждый вирусный геном упаковывался или инкапсулировался в тот вариант капсидного белка, который закодирован геномом. В связи с этим функциональные усовершенствования, идентифицированные посредством селекции, могут быть связаны с последовательностью генома, кодирующего эту усовершенствованную функцию, содержащуюся в вирусном капсиде

[00207] Эту библиотеку подвергли положительному отбору на мышах rho-GFP (Wensel et al. (2005) Vision Res. 45:3445). Кратко, в одном этапе отбора взрослых мышей rho-GFP интравитреально инъецировали 2 мкл диализированного забуференного фосфатом физиологического раствора, очищенной йодиксанолом библиотекой с геномным титром приблизительно 1×10¹² вирусных геномов (вг)/мл. Сверхтонкую 30 1/2-калиберную одноразовую иглу вводили через склеру глаза животного возле экватора рядом с роговицей в стекловидную полость. Инъекцию 2 мкл вируса проводили с непосредственным наблюдением иглы в центре стекловидной полости. Спустя неделю после инъекции глаза энуклеировали, а сетчатку разделяли с использованием света, обработкой папаинпротеазой, после чего выделяли фоторецепторные популяции клеточным сортером с активацией (FACS). Эффективные вирионы затем амплифицировали с помощью ПЦР из последующих геномных экстракций и дополнительно клонировали и перепаковывали для инъекции.

[00208] Дальнейшие повторы этого отбора выполнялись, сужая пул вариантов до субпопуляции с более пермиссивными мутациями. После трех повторов, проводили этап ПЦР с внесением ошибок для создания дополнительного поколения вариантов для отбора. В целом, этот процесс повторяли для двух поколений. В результате этот процесс направленного развития создал фоторецептор-пермиссивные варианты AAV при применении положительного отбора и вызванного мутагенеза, подобно процессу природного развития.

[00209] Затем кэп-гены пятидесяти вариантов секвенировали для определения самых значительных и успешных вариантов для обладания премассивными мутациями для интравитреальной трансдукции фоторецепторов. Из 50 клонов 46 дали удобочитаемые последовательности вставки 7mer. Существенно, почти две трети клонов содержали тот же отличительный мотив 7mer (~⁵⁸⁸LGETTRP~; SEQ ID №13). Что интересно, следующий самый значительный вариант (~⁵⁸⁸NETITRP~; SEQ ID №14) также содержал похожий фланкирующий мотив, состоящий из положительно заряженного остатка аргинина между остатками полярного треонина и неполярного пролина (TRP).

[00210] Таблица 1. Секвенирование выделенных вариантов из направленного развития показывает высокую степень сходимости в вирусных библиотеках. Все варианты получены из 7mer библиотеки AAV2 с приблизительно 64% вариантов, содержащих тот же мотив 7mer (~⁵⁸⁸LGETTRP- (SEQ ID №13)).

[00211] Среди 7mer-вставок последовательностей были умеренные предпочтения в определенных положениях, например, положительно заряженная аминокислота в положении 1; отрицательно заряженная аминокислота в положении 2; спирт (например, аминокислота, имеющая спиртовую группу (свободную гидроксильную группу), такую как Thr или Ser) в положении 5.

[00212] 7mer-вставки были фланкированы спейсерами, как показано в таблице 2:

[00213] Фигура 1. Представлена трехмерная модель капсида вируса AAV2, содержащего случайный гептамер (показанный оранжевым) после аминокислоты 587. Эта область капсида вируса AAV2, вероятно, участвует в связывании рецептора клеточной поверхности.

[00214] В свете высокой степени сходимости библиотеки из вышеописанного отбора, рекомбинантную форму AAV2 ~⁵⁸⁸LGETTRP~ (SEQ ID №13; названную 7М8) клонировали и упаковывали вектор с трансгеном scCAG-GFP для визуализации его профиля трансдукции. Спустя три недели после интравитреальной инъекции у взрослых мышей наблюдалась сильная экспрессия многочисленных клеточных типов, включая ганглиозные клетки сетчатки (RGC) и клетки Мюллера. Важно, наблюдалась трансдукция фоторецепторов в сетчатках, инъецированных 7М8, после проверки экспрессии GFP в ядрах внешнего ядерного слоя (ONL) (красные стрелки) и во внешних сегментах (фигура 2, голубая стрелка), тогда как AAV2 не показал видимой экспрессии фоторецепторов.

[00215] Фигура 2 7М8-вариант AAV2 (справа) демонстрирует большие уровни интравитреальной трансдукции фоторецептора относительно AAV2 (слева). Конфокальная микроскопия поперечных срезов сетчатки спустя три недели после интравитреальной инъекции 2 мкл 1×10¹² вг/мл AAV2 7М8 и AAV2 scCAG GFP у взрослых мышей. Красные стрелки (верх) указывают на ядра фоторецепторов, а голубая стрелка (верх) указывает на внешние сегменты фоторецептора.

[00216] Учитывая усиление трансдукции клеток сетчатки, была предпринята попытка для повышения специфичности экспрессии с помощью трансгена ssRho-eGFP, содержащего фоторецептор-специфичный родопсиновый промотор для повышения разрешения эффективности трансдукции конкретно в фоторецепторах (фигура 3). Действительно, использование фоторецептор-специфичного промотора Rho ограничило экспрессию фоторецепторами GFP. Была предпринята попытка для улучшения эффективности трансдукции 7М8 путем комбинирования рационального конструктивного подхода с предыдущим подходом направленного развития. Для этого четыре поверхностно экспонированные остатки тирозина были мутагенизированы до фенилаланинов на капсиде 7М8 (Y273F, Y444F, Y500F и Y730F), который прежде был показан для повышения фоторецепторной инфекционности фоторецепторов (Petrs-Silva et al., 2009). Интересно, добавление мутаций сократило количество трансдуцированных фоторецепторов по сравнению с оригинальным вирусом, как показано FAC-сортингом фоторецепторов GFP(+) из инфицированных 7m8 или 7m8-4YF сетчаток (фигура 4).

[00217] Фигура 3. Представлены флуоресцентные изображения криосрезов сетчатки, показывающие экспрессию GFP, обусловленную 7m8, несущим ген GFP под контролем универсального промотора CAG (слева) или фоторецептор-специфичного промотора Rho (справа).

[00218] Фигура 4. Фоторецепторные клетки GFP(+) на миллион клеток сетчатки, как посчитано с помощью проточной цитометрии. 7m8 преобразовывает больше чем 2х количество фоторецепторов по сравнению с 7m8, несущим 4 тирозиновые мутации (верх).

Пример 2 Лечение ретиношизиса

[00219] Используя экспрессирующий конструкт 7m8-rho-RS1, функциональный белок ретиношизина (RS1) был доставлен ретиношизин-дефицитным мышам (Rs1h-дефицитные мыши; Rs1h является мышиным гомологом человеческого RS1). Вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный белок ретиношизина под транскрипционным контролем родопсинового промотора. Смотри фигуры 13А-С, где выделенная жирным шрифтом и подчеркиванием нуклеотидная последовательность (нуклеотиды 4013-4851) является родопсиновым промотором; а нуклеотиды 4866-5540 (со стартовой atg и стоп tga последовательностями, показано жирным шрифтом) кодируют протеин RS1 человека.

[00220] Конструкт 7m8-rho-RS1 вводили интравитреально мышам Rs1h-/- при Р15. Мыши Rs1h-/- были получены направленным разрушением экзона 3 гена Rs1h, как описано (Weber et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6222). Мыши Rs1h-/- являются дефицитными по белковому продукту Rs1h, имеют электроотрицательный ERG (например, сниженная b-волна с относительным сохранением a-волны) и расслоение слоев сетчатки, подобно тому, что наблюдается у пациентов-людей с ретиношизисом. Инъекция вектора 7m8-rho-RS1 в Rs1h-/- ведет к высоким уровням экспрессии панретинального RS1 из фоторецепторов в сетчатке. Экспрессия RS1 ведет к усовершенствованной морфологии сетчатки с уменьшением в количестве и размере полостей в сетчатке, как показано на изображении, созданном оптической когерентной томографией в спектральной области (SD-OCT) (фигуры 7A-I), спасению b-волны ERG (фигуры 8A-D) и длительному структурному сохранению сетчатки (фигуры 9А-Е).

[00221] Фигуры 7A-I. Представляют SD-OCT-изображения сетчаток с высокой разрешающей способностью, инъецированных 7m8-rho-GFP (левая колонка), 7m8-rho-RS1 (средняя колонка или) или неинъецированных животных WT (правая колонка). Изображения дна были взяты через внутренний ядерный слой верхней сетчатки и исключают другие слои (а-с). Поперечные изображения верхней (d-f) и нижней (g-i) сетчатки были взяты с использованием соска зрительного нерва в качестве ориентира.

[00222] Необработанная сетчатка RS1 увеличивается по всей толщине, если мерить от внутренней пограничной мембраны (ILM) до фоторецепторов, в силу того, что патология прогрессирует из-за шизисного расслаивания внутренней сетчатки. Этот процесс отличается от наблюдаемого при большинстве ретинальных дегенеративных заболеваний (RDD), которые не образуют шизис, но демонстрируют прогрессирующую гибель фоторецепторных клеток в INL и сопутствующее истончение сетчатки и потерю амплитуды ERG. В RS1 утончаются ONL, поскольку из-за болезни гибнут рецепторы, но это отличается от полного изменения толщины сетчатки. Обычно считается, что успешная терапия для RS1 возвратила бы полную толщину сетчатки к дикому типу и снизила интенсивность потери фоторецепторов в ONL. В большинстве RDD, отличных от Rs1, потеря фоторецепторов, отмеченных утончением ONL, равняется снижению физиологической мощности сетчатки, как измерено с помощью амплитуды ERG. RS1 является одним из очень немногих примеров заболеваний сетчатки, при котором патология увеличивает толщину сетчатки с сопутствующей потерей амплитуды электроретинографии. Таким образом, восстановление генного продукта RS1, внеклеточного ретинального клея, утончает сетчатку назад к толщине дикого типа и возвращает амплитуду электроретинографии к почти нормальным уровням, поскольку рассасывается шизис.

[00223] Фигура 8а демонстрирует сравнение функционального восстановления необработанных Rs1-/- глаз с глазами, инъецированными AAV2-rho-RS1, 7m8-rho-GFP и 7m8-rho-RS1, спустя один месяц (слева) и 4 месяца (справа) после инъекции. Спустя один месяц после инъекции 7m8-rho-RS1 приводил к значительному спасению амплитуды b-волны ERG, тогда как AAV2-rho.RS1 был статистически неотличим от необработанных глаз.

[00224] Спустя 4 месяца, 7m8-rho-RS1 амплитуда далее увеличивалась к амплитуде дикого типа (справа). Фигура 8b показывает репрезентативные следы ERG от 7m8-rho-RS1-инъецированных глаз, демонстрирующие улучшенную амплитуду a-волны и b-волны и форму волны, близкую к глазам дикого типа, по сравнению с 7m8-rho-GFP-инъецированными глазами. Фигура 8с показывает амплитуду полной области скотопической b-волны, возникающей вследствие высокой интенсивности (1 log cd × с/м²), стимул регистрировали ежемесячно, начиная с одного месяца после инъекции в Р15 для каждого состояния. Были зарегистрированы три ответа и усреднены для каждого глаза в каждый момент времени.

[00225] Средние амплитуды b-волны ERG были нанесены на график как функция постинъеционного времени. n=7 использовали для обоих условиях. Фигура 8d показывает анализ ответов ERG, скотопические (верхние следы, диапазон от -3 до 1 log cd × с/м2) и фотопические (нижние следы, диапазон от -0,9 до 1,4 log cd × с/м2) условия указывают улучшенную функцию палочек и колбочек в диапазоне интенсивности стимулов.

[00226] Фигуры 9А-Е. Длительные улучшения толщины сетчатки, измеренные спустя 10 месяцев после лечения 7m8-rho-RS1. Репрезентативные поперечные изображения SD-OCT обработанных а) 7m8-rho-RS1 или b) 7m8-rho-GFP сетчаток спустя 10 месяцев после инъекций сосредоточены на соске зрительного нерва. Измерения с) толщины сетчатки, d) толщины ONL и е) и толщины внутреннего и внешнего сегментов показаны на графике как функция расстояния от соска зрительного нерва.

Пример 3. Вариант AAV, использованный для доставки белка в клетки сетчатки макаки

[0001] Был получен вирион рекомбинантного AAV2 (7m8, несущий GFP под управлением промотора коннексина36). Вирион рекомбинантного AAV2 включал капсидный вариант AAV2 с вставкой пептида LALGETTRPA между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и GFP под транскрипционным контролем промотора коннексина36, который экспрессируется в промежуточных нейронах. Вирион rAAV2 инъецировали интравитреально в глаз макаки. Данные показаны на фигуре 18.

[0002] Фигура 18 обеспечивает флуоресцентное изображение дна, демонстрирующее экспрессию GFP позади сетчатки спустя 9 недель после введения 7m8, несущего GFP под управлением промотора коннексина36. По сравнению с родительским серотипом AAV2 (Yin et al, IOVS 52(5); 2775), повышенный уровень экспрессии был замечен в фовеальном кольце, а видимая флуоресценция была замечена в центральной сетчатке вне фовеа.

REFERENCES

[0003] Daiger SP, Bowne SJ, Sullivan LS (2007) Perspective on genes и mutations causing retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol 125:151-158.

[0004] Dalkara D, Kolstad KD, Caporale N, Visel M, Klimczak RR, et al. (2009) Inner Limiting Membrane Barriers to AAV Mediated Retinal Transduction from the Vitreous. Mol Ther.

[0005] den Hollander Al, Roepman R, Koenekoop RK, Cremers FP (2008) Leber congenital amaurosis: genes, proteins и disease mechanisms. Prog Retin Eye Res 27:391-419.

[0006] Gruter O, Kostic С, Crippa SV, Perez MT, Zografos L, et al. (2005) Lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mouse photoreceptors is impaired by the presence of a physical barrier. Gene Ther 12:942-947.

[0007] Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Jr., Mingozzi F, et al. (2008) Safety и efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358:2240-2248.

[0008] Mancuso K, Hauswirth WW, Li Q, Connor ТВ, Kuchenbecker JA, et al. (2009) Gene therapy for red-green colour blindness in adult primates. Nature 461:784-787.

[0009] McGee Sanftner LH, Abel H, Hauswirth WW, Flannery JG (2001) Glial cell line derived neurotrophic factor delays photoreceptor degeneration in a transgenic rat model of retinitis pigmentosa. Mol Ther 4:622-629.

[0010] Muller OJ, Kaul F, Weitzman MD, Pasqualini R, Arap W, et al. (2003) Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat Biotechnol 21:1040-1046.

[0011] Nakazawa Т. et al. (2007) Attenuated glial reactions и photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein и vimentin. Invest Ophthamol Vis Sci 48:2760-8.

[0012] Nakazawa Т. et al. (2006) Characterization of cytokine responses to retinal detachment in rats. Mol Vis 12:867-78.

[0013] Perabo L, Buning H, Kofler DM, Ried MU, Girod A, et al. (2003) In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther 8:151-157.

[0014] Petrs-Silva H, Dinculescu A, Li Q, Min SH, Chiodo V, et al. (2009) High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther 17:463-471.

[0015] Reme СЕ, Grimm С, Hafezi F, Wenzel A, Williams TP (2000) Apoptosis in the Retina: The Silent Death of Vision. News Physiol Sci 15:120-124.

[0016] Rolling F (2004) Recombinant AAV-mediated gene transfer to the retina: gene therapy perspectives. Gene Ther 11 Suppl 1:S26-32.

[0017] Wensel TG, Gross AK, Chan F, Sykoudis K, Wilson JH (2005) Rhodopsin-EGFP knock-ins for imaging quantal gene alterations. Vision Res 45:3445-3453.

[0018] Zhong L, Li B, Mah CS, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, et al. (2008) Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA 105:7827-7832.

[0019] Несмотря на то, что настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что могут осуществляться разные изменения и эквивалентные замещения без отклонения от истинной сущности и объема изобретения. Кроме того, могут быть осуществлены многие модификации для того, чтобы приспособить конкретную ситуацию, материал, композицию вещества, процесса, технологической операции или операций к цели, сущности и объему настоящего изобретения. Все такие модификации предназначены быть охваченными объемом прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложены вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальной клетки, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа. Также описаны способы доставки генного продукта в ретинальную клетку индивидуума и способы лечения глазных болезней. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 25 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV для доставки генного продукта в ретинальную клетку, содержащий:

a) вариантный капсидный белок аденоассоциированного вируса AAV, который содержит вставку пептида в петле GH капсидного белка по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком аденоассоциированного вируса AAV, где пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60), где участок вставки находится в пределах аминокислот 570-611 капсидного белка AAV2, изложенного в SEQ ID №1, или соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и где вариантный капсидный белок обеспечивает повышенную инфекционность вириона rAAV в ретинальной клетке по сравнению с инфекционностью вириона AAV, содержащего соответствующий родительский капсидный белок AAV; и

b) гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт.

2. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что вставка включает аминокислотную последовательность LGETTRP (SEQ ID №13).

3. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что ретинальная клетка является фоторецептором, ганглиозной клеткой сетчатки, клеткой Мюллера, биполярной клеткой, амакринной клеткой, горизонтальной клеткой или клеткой пигментного эпителия сетчатки.

4. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что сайт встраивания находится между аминокислотами 587 и 588 из AAV2, между аминокислотами 590 и 591 из AAV1, между аминокислотами 575 и 576 из AAV5, между аминокислотами 590 и 591 из AAV6, между аминокислотами 589 и 590 из AAV7, между аминокислотами 590 и 591 из AAV8, между аминокислотами 588 и 589 из AAV9 или между аминокислотами 588 и 589 из AAV10.

5. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что он демонстрирует, по меньшей мере, 10-кратное повышение инфекционности в ретинальной клетке по сравнению с инфекционностью вириона AAV, содержащего соответствующий родительский капсидный белок AAV.

6. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что он демонстрирует, по меньшей мере, 50-кратное повышение инфекционности в ретинальной клетке по сравнению с инфекционностью вириона AAV, содержащего соответствующий родительский капсидный белок AAV.

7. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что генный продукт является интерферирующей РНК или аптамером.

8. Вирион rAAV по п. 1, отличающийся тем, что генный продукт является полипептидом.

9. Вирион rAAV по п. 8, отличающийся тем, что полипептид является нейропротекторным полипептидом, анти-ангиогенным полипептидом или полипептидом, который повышает функцию ретинальной клетки.

10. Вирион rAAV по п. 8, отличающийся тем, что полипептид выбирают из группы, состоящей из глиального нейротрофического фактора, фактора роста фибробластов 2, нейротурина, цилиарного нейротрофического фактора, фактора роста нервов, нейротрофического фактора из тканей мозга, эпидермального фактора роста, родопсина, Х-сцепленного ингибитора апоптоза, ретиношизина, RPE65, взаимодействующего белка-1 регулятора ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки, периферина, периферина-2, родопсина или хеджехог-белка.

11. Фармацевтическая композиция для доставки генного продукта в ретинальную клетку, содержащая:

a) вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV по п. 1; и

b) фармацевтически приемлемый эксципиент.

12. Способ доставки генного продукта в ретинальную клетку индивидуума, который включает введение индивидууму вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV по п. 1.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что генный продукт является короткой интерферирующей РНК или аптамером.

14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что генный продукт является полипептидом.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что полипептид является нейропротекторным полипептидом, анти-ангиогенным полипептидом, анти-апоптическим фактором или полипептидом, который повышает функцию ретинальной клетки.

16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что полипептид является глиальным нейротрофическим фактором, фактором роста фибробластов 2, нейротурином, цилиарным нейротрофическим фактором, фактор роста нервов, нейротрофическим фактором из тканей мозга, эпидермальным фактором роста, родопсином, Х-сцепленным ингибитором апоптоза, ретиношизином, RPE65, взаимодействующим белком-1 регулятора ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки, периферином, периферином-2, родопсином или хеджехог-белком.

17. Способ лечения заболевания сетчатки, который включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV по п. 1.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанное введение является внутриглазной инъекцией.

19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанное введение является интравитреальной инъекцией.

20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что глазная болезнь является глаукомой, пигментной дистрофией сетчатки, макулярной дегенерацией, ретиношизисом, врожденным амаврозом Лебера, диабетической ретинопатией, ахроматопсией или дальтонизмом.

21. Вариантный капсидный белок аденоассоциированного вируса AAV для доставки генного продукта в ретинальную клетку, который содержит вставку пептида в петле GH капсидного белка по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV, где пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из числа LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60), где участок вставки находится в пределах аминокислот 570-611 капсидного белка AAV2 изложенного в SEQ ID №1, или соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и где вариантный капсидный белок, когда присутствует в вирионе AAV, обеспечивает повышенную инфекционность вириона AAV в ретинальной клетке.

22. Вариантный капсидный белок AAV по п. 21, отличающийся тем, что вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из LGETTRP (SEQ ID №13), NETITRP (SEQ ID №14), KAGQANN (SEQ ID №15), KDPKTTN (SEQ ID №16), KDTDTTR (SEQ ID №57), RAGGSVG (SEQ ID №58), AVDTTKF (SEQ ID №59) и STGKVPN (SEQ ID №60).

23. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариантный капсидный белок аденоассоциированного вируса AAV по п. 21 или 22.

24. Выделенная генетически модифицированная клетка-хозяин, экспрессирующая капсидный белок аденоассоциированного вируса AAV по п. 21 или 22, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 23.