КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/343 A61K31/5377 A61K31/7008 A61K35/76 A61K38/13 A61K9/00 A61P25/00 A61P43/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 64/418033, поданной 4 ноября 2016 г. Все содержание вышеупомянутой заявки включено в настоящий документ посредством ссылки, включая весь текст, таблицы, список последовательностей и чертежи.

ВВЕДЕНИЕ

[0002] Перенос генов получил в настоящее время широкое признание в качестве мощного инструмента для анализа биологических событий и патологических процессов как на клеточном, так и на молекулярном уровне. В последнее время значительное внимание уделяется применению генной терапии для лечения заболеваний человека, как наследственных (например, дефицит ADA), так и приобретенных (например, рак или инфекционное заболевание).

[0003] Традиционно генная терапия определяется как процедура, при которой терапевтический ген вводится в клетки млекопитающего для исправления врожденной генетической ошибки. Хотя в настоящее время более 4500 заболеваний человека классифицируются как генетические, для относительно немногих из этих заболеваний были выявлены специфические мутации в геноме человека. До недавнего времени эти редкие генетические заболевания представляли собой исключительную цель усилий генной терапии. Соответственно, большинство одобренных NIH протоколов генной терапии на сегодняшний день направлены на введение функциональной копии дефектного гена в соматические клетки индивидуума, имеющего известную врожденную генетическую ошибку. Только недавно исследователи и клиницисты начали понимать, что большинство человеческих раковых заболеваний, некоторые формы сердечно-сосудистых заболеваний и многие дегенеративные заболевания также имеют важные генетические компоненты, и для целей разработки новых методов генной терапии их следует рассматривать как "генетические нарушения". Поэтому в последнее время генная терапия получила широкое определение как коррекция фенотипа заболевания путем введения новой генетической информации в пораженный организм.

[0004] В генной терапии in vivo перенесенный ген вводится в клетки организма реципиента in situ то есть внутри реципиента. Генная терапия in vivo была исследована на нескольких животных моделях. В нескольких недавних публикациях сообщается о возможности прямого переноса генов in situ в органы и ткани, такие как мышцы, гемопоэтические стволовые клетки, артериальная стенка, нервная система и легкое. Также сообщалось, что прямая инъекция ДНК в скелетную мышцу, сердечную мышцу и инъекция ДНК-липидных комплексов в сосудистую сеть приводят к детектируемому уровню экспрессии вставленного генного продукта(ов) in vivo.

[0005] Лечение заболеваний центральной нервной системы, например наследственных генетических заболеваний головного мозга, остается неразрешимой проблемой. Примерами таких заболеваний являются лизосомные болезни накопления и болезнь Альцгеймера. В целом заболеваемость лизосомными болезнями накопления (LSD) составляет 1 на 10000 рождений во всем мире, и в 65% случаев отмечается значительное поражение центральной нервной системы (ЦНС). Белки, дефицитные при этих нарушениях, при внутривенной доставке не проникают через гематоэнцефалический барьер или при непосредственной доставке в головной мозг не распространяются широко. Таким образом, должны быть разработаны методы лечения дефицитов ЦНС.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Настоящее изобретение предлагает способы и применения лечения примата, имеющего лизосомную болезнь накопления (LSD). В одном варианте осуществления способ или применение включают в себя предоставление частиц AAV, содержащих капсидный белок AAV; нуклеиновую кислоту, вставленную между парой инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий лизосомной гидролазной активностью; и элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты; причем частицы AAV способны трансдуцировать клетки упомянутого млекопитающего и обеспечивать экспрессию упомянутого полипептида; и введение или доставку частиц AAV в ЦНС млекопитающего.

[0007] В одном варианте осуществления полипептид обладает активностью трипептидилпептидазы-1 (TPP1). В других вариантах осуществления полипептид содержит TPP1, ее профермент или ее ферментативно активный вариант. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует белок с активностью TPP1 и имеющий идентичность 80% или больше с человеческой TPP1, приведенной как SEQ ID NO:1. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует TPP1 млекопитающего (например, человека).

[0008] В дополнительных вариантах осуществления один или несколько ITR AAV содержат один или несколько ITR AAV2.

[0009] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит энхансер CMV.

[0010] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит промотор бета-актина.

[0011] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит промотор бета-актина кур.

[0012] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит энхансер CMV и промотор бета-актина кур.

[0013] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с энхансером CMV, приведенным в SEQ ID NO:3, и/или последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с промотором бета-актина кур, приведенным в SEQ ID NO:3.

[0014] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с SEQ ID NO:3.

[0015] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты, содержит SEQ ID NO:3.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0016] Фиг. 1A-1H показывает уровни фермента TPP1 для исследования дозирования в паренхиме головного мозга, СМЖ и периферических тканях. Сравнение рекомбинантного фермента TPP1 после инъекции AAV4CAGhTPP1 мышам CLN2^-/- с эндогенными уровнями (красная линия) животных CLN2^+/-. (Статистический анализ: не все группы прошли тест на нормальность. Был выполнен непараметрический анализ с помощью теста Краскела-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна. * P<0,05, ** P<0,01, **** P<0,0001).

[0017] Фиг. 2A показывает сравнительную экспрессию TPP1 в спинномозговой жидкости (СМЖ) после ростральной или каудальной инъекции.

[0018] Фиг. 2B показывает экспрессию TPP1 в стриатуме после ростральной или каудальной инъекции.

[0019] Фиг. 2C показывает экспрессию TPP1 в таламусе после ростральной или каудальной инъекции.

[0020] Фиг. 2D показывает экспрессию TPP1 в продолговатом мозге после ростральной или каудальной инъекции.

[0021] Фиг. 2E показывает экспрессию TPP1 в мозжечке после ростральной или каудальной инъекции.

[0022] Фиг. 2F показывает экспрессию TPP1 в затылочной коре после ростральной или каудальной инъекции.

[0023] Фиг. 2G показывает экспрессию TPP1 в префронтальной коре после ростральной или каудальной инъекции.

[0024] Фиг. 3A-3J показывает копии генома AAV4.CAGhTPP1 для исследования дозирования в головном мозге и периферических тканях CLN2^-/- через 5 недель после инъекции трех доз.

[0025] Фиг. 4A-4B показывает количественную оценку фенотипа тремора для исследования дозирования на 12-недельных мышах CLN2^-/- через 5 недель после инъекции трех доз AAV4.CAGhTPP1. A) Диаграмма спектра амплитуды тремора в децибел-вольтах (дБВ) при различных частотах тремора в герцах (Гц). (B) Площадь под кривой спектра тремора (из панели A) с последующим однофакторным ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки. * p<0,05, *** p<0,001).

[0026] Фиг. 5A-фиг. 5G показывают активность рекомбинантного фермента TPP1 из исследования стабильности после инъекции 5e10 в.г. AAV4.CAGhTPP1 мышам CLN2^-/-.

[0027] Фиг. 6 показывает уровни TPP1 (пмоль TPP1 на мг белка) в СМЖ отличных от человека приматов после односторонней инъекции вектора AAV2.CAGhTPP1 в желудочек головного мозга. Данные представляют уровни TPP1 с течением времени. День 0 представляет эндогенные уровни TPP1 перед инъекцией. N=3 животных.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0028] В настоящем документе предлагаются способы и применения для введения млекопитающему, нуждающемуся в способе, описанном в настоящем документе, у которого подозревают наличие, или у которого есть лизосомная болезнь накопления (LSD). В некоторых вариантах осуществления способ или применение, описанные в настоящем документе, применяют для лечения, предотвращения, ингибирования, снижения, уменьшения или задержки числа, тяжести, частоты, прогрессирования или начала одного или нескольких симптомов LSD.

[0029] Неограничивающие примеры LSD включают детский липофусциноз или позднедетский восковидный липофусциноз нейронов (LINCL), болезнь Гоше, юношескую болезнь Баттена, болезнь Фабри, MLD, болезнь Санфилиппо A, позднедетскую болезнь Баттена, болезнь Хантера, болезнь Краббе, болезнь Моркио, болезнь Помпе, болезнь Ниманна-Пика C, болезнь Тея-Сакса, болезнь Гурлер (MPS-I H), болезнь Санфилиппо B, болезнь Марото-Лами, болезнь Ниманна-Пика A, цистиноз, болезнь Гурлер-Шейе (MPS-I H/S), синдром Слая (MPS VII), болезнь Шейе (MPS-I S), детскую болезнь Баттена, GM1-ганглиозидоз, муколипидоз II/III типа или болезнь Сандхоффа.

[0030] LSD часто вызваны генетической аномалией (например, мутацией, делецией, вставкой) в гене, кодирующем фермент трипептидилпептидазу-1 (TPP1), что приводит к дефициту функциональной активности фермента TPP1. У людей TPP1 кодируется геном CLN2, иногда называемым геном TPP1 (смотри, например, SEQ ID NO:2). Например, познедетский восковидный липофусциноз нейронов (LINCL) является детским нейродегенеративным заболеванием, которое чаще всего вызывается дефицитом активности TPP1 из-за мутаций в CLN2. Развитие является нормальным до возраста 2-4 года, после чего проявления LINCL появляются в виде двигательного и умственного спада, судорожного расстройства и нарушений зрения. Смерть обычно происходит в течение первого десятилетия жизни. Большинство случаев LINCL связаны с мутациями в CLN2, которые вызывают дефицит растворимого лизосомного фермента трипептидилпептидазы-1 (TPP1). TPP1 синтезируется как манноза-6-фосфатный профермент и подобно другим растворимым лизосомным гидролазам профермент в значительной степени нацелен на лизосому, но также может высвобождаться из клетки по секреторному пути. Таким образом, может происходить клеточный захват теми же или соседними клетками и последующая лизосомная доставка и активация профермента в активную форму.

[0031] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предлагаются способы лечения млекопитающего, имеющего LSD или склонного к LSD, путем введения непосредственно в ткань или жидкость центральной нервной системы частиц AAV, которые направляют экспрессию полипептида, обладающего активностью TPP1 (называемых в настоящем документе частицами AAV-TPP1). В настоящем документе раскрыты данные, показывающие доставку/введение AAV в головной мозг и/или спинной мозг в модели лизосомной болезни накопления на животном.

[0032] В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в большую цистерну, внутрижелудочковое пространство, желудочек головного мозга, субарахноидальное пространство, интратекальное пространство и/или эпендиму упомянутого млекопитающего. В дополнительных вариантах осуществления, частицы AAV-TPP1 вводят в спинномозговую жидкость (СМЖ) упомянутого млекопитающего. В других вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в желудочковую систему. В других вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в ростральный боковой желудочек; и/или вводят в каудальный боковой желудочек; и/или вводят в правый боковой желудочек; и/или вводят в левый боковой желудочек; и/или вводят в правый ростральный боковой желудочек; и/или вводят в левый ростральный боковой желудочек; и/или вводят в правый каудальный боковой желудочек; и/или вводят в левый каудальный боковой желудочек.

[0033] В других дополнительных вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят так, что частицы AAV контактируют с эпендимальными клетками упомянутого млекопитающего. Такие эпендимальные клетки экспрессируют кодируемый полипептид, и, необязательно, полипептид экспрессируется клетками. В конкретных вариантах осуществления полипептид экспрессируется и/или распределяется в боковом желудочке, СМЖ, головном мозге (например, стриатуме, таламусе, медулле, мозжечке, затылочной коре и/или префронтальной коре) и/или ЦНС.

[0034] С помощью способа или применения, описанных в настоящем документе можно лечить любое подходящее млекопитающее. Неограничивающие примеры млекопитающих включают людей, отличных от человека приматов (например, обезьян, гиббонов, шимпанзе, орангутанов, мартышек, макак и т.п.), домашних животных (например, собак и кошек), сельскохозяйственных животных (например, лошадей, коров, коз, овец, свиней) и экспериментальных животных (например, мышей, крыс, кроликов, морских свинок). В некоторых вариантах осуществления млекопитающее является человеком. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой не являющееся грызуном млекопитающее (например, человека, свинью, козу, овцу, лошадь, собаку и т.п.). В некоторых вариантах осуществления не являющееся грызуном млекопитающее является человеком. Млекопитающее может быть любого возраста или на любой стадии развития (например, взрослым, подростком, ребенком, младенцем или млекопитающим в утробе). Млекопитающее может быть самцом или самкой. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой модель заболевания на животных, например модели на животных, используемые для исследования таких LSD, как LINCL.

[0035] Субъектами, которых лечат с помощью способа или композиции, описанных в настоящем документе, являются взрослые (18 лет и старше) и дети (младше 18 лет). Возраст детей лежит в диапазоне 1-2 года или 2-4, 4-6, 6-18, 8-10, 10-12, 12-15 и 15-18 лет. Дети также включают младенцев. Возраст младенцев обычно лежит в диапазоне 1-12 месяцев.

[0036] Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой непатогенный вирус семейства parvoviridae. К настоящему времени были идентифицированы многочисленные серологически различные AAV, и более десятка было выделено из людей или приматов. AAV отличается от других членов этого семейства своей зависимостью от вируса-помощника для репликации.

[0037] Было показано, что геномы AAV стабильно интегрируются в клеточные геномы хозяина; обладают широким кругом хозяев; трансдуцируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки in vitro и in vivo и поддерживают высокий уровень экспрессии трансдуцированных генов. Вирусные частицы AAV являются термостойкими, устойчивыми к растворителям, детергентам, изменениям pH, температуры, и могут быть сконцентрированы на градиентах CsCl или другими способами. Геном AAV содержит одноцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (оцДНК), или положительно, или отрицательно-полярную. В отсутствие вируса-помощника AAV может интегрироваться локус-специфическим образом, например в q-плечо хромосомы 19. Геном AAV размером приблизительно 5 т.п.о. состоит из одного сегмента одноцепочечной ДНК или с положительной, или с отрицательной полярностью. Концы генома представляют собой короткие инвертированные концевые повторы, которые могут складываться в шпилечные структуры и служить точкой начала репликации вирусной ДНК.

[0038] "Геном" AAV относится к рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, которая в конечном итоге упаковывается или инкапсулируется с образованием частицы AAV. Частица AAV часто содержит геном AAV. В случаях, когда для конструирования или производства рекомбинантных векторов используют рекомбинантные плазмиды, векторный геном не включает в себя часть "плазмиды", которая не соответствует последовательности векторного генома рекомбинантной плазмиды. Эта не соответствующая векторному геному часть рекомбинантной плазмиды называется "остов плазмиды", и она важна для клонирования и амплификации плазмиды, процесса, который необходим для размножения и продуцирования рекомбинантного вируса, но которая сама не упакована или инкапсулирована в частицы вируса (например, AAV). Таким образом, векторный "геном" относится к нуклеиновой кислоте, которая упакована или инкапсулирована вирусом (например, AAV).

[0039] Вирион (частица) AAV представляет собой лишенную оболочки икосаэдрическую частицу диаметром приблизительно 25 нм. Частица AAV содержит капсид икосаэдрической симметрии, состоящий из трех родственных капсидных белков VP1, VP2 и VP3, которые взаимодействуют друг с другом, образуя капсид. Правая ORF часто кодирует капсидные белки VP1, VP2, и VP3. Эти белки часто находятся в соотношении 1:1:10 соответственно, но могут быть в различных соотношениях, и все они происходят от правой ORF. Капсидные белки отличаются друг от друга по использованию альтернативного сплайсинга и необычного старт-кодона. Анализ делеций показал, что удаление или изменение VP1, который транслируется с альтернативно сплайсированного транскрипта, приводит к уменьшенному выходу инфекционных частиц. Мутации в кодирующей области VP3 приводят к неспособности продуцировать одноцепочечную ДНК-потомок или инфекционные частицы. Частица AAV представляет собой вирусную частицу, содержащую капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления геном частицы AAV кодирует один, два или все полипептиды VP1, VP2 и VP3.

[0040] Геном большинства нативных AAV часто содержит две открытые рамки считывания (ORF), иногда называемые левой ORF и правой ORF. Левая ORF часто кодирует неструктурные белки Rep, Rep 40, Rep 52, Rep 68 и Rep 78, которые участвуют в регуляции репликации и транскрипции в дополнение к продукции одноцепочечных геномов-потомков. Два из белков Rep были связаны с преимущественной интеграцией геномов AAV в область q-плеча человеческой хромосомы 19. Было показано, что Rep68/78 обладают активностью связывания NTP, а также активностями ДНК- и РНК-хеликаз. Некоторые белки Rep содержат сигнал внутриядерной локализации, а также несколько потенциальных сайтов фосфорилирования. В некоторых вариантах осуществления геном AAV (например, rAAV) кодирует некоторые или все белки Rep. В некоторых вариантах осуществления геном AAV (например, rAAV) не кодирует белки Rep. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из белков Rep могут быть доставлены in trans и, следовательно, не включены в частицу AAV, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

[0041] Концы генома AAV содержат короткие инвертированные концевые повторы (ITR), которые могут складываться в T-образные шпилечные структуры, которые служат точкой начала репликации вирусной ДНК. Соответственно, геном AAV содержит одну или несколько (например, пару) последовательностей ITR, которые фланкируют его одноцепочечный вирусный ДНК-геном. Последовательности ITR часто содержат приблизительно по 145 оснований каждая. В области ITR были описаны два элемента, которые, как считается, играют центральную роль для функции ITR, мотив повтора GAGC и сайт концевого разрешения (trs). Показано, что мотив повтора связывает Rep, когда ITR находится или в линейной, или в шпилечной конформации. Полагают, что это связывание позиционирует Rep68/78 для расщепления в trs, которое происходит специфичным для сайта и нити образом. В дополнение к их роли в репликации, эти два элемента, по-видимому, играют центральную роль в вирусной интеграции. Внутри локуса интеграции хромосомы 19 находится сайт связывания Rep с прилегающим trs. Было показано, что эти элементы являются функциональными и необходимыми для локус-специфической интеграции.

[0042] В некоторых вариантах осуществления AAV (например, rAAV) содержит два ITR. В некоторых вариантах осуществления AAV (например, rAAV) содержит пару ITR. В некоторых вариантах осуществления AAV (например, rAAV) содержит пару ITR, которые фланкируют (т.е. находятся на 5'- и 3'-концах) полинуклеотид, который по меньшей мере кодирует полипептид, обладающий активностью фермента TPP1.

[0043] Термин "вектор" относится к небольшой молекуле-носителю нуклеиновой кислоты, плазмиде, вирусу (например, вектору AAV) или другому носителю, которым можно манипулировать путем вставки или включения нуклеиновой кислоты. Векторы, такие как AAV, можно использовать для введения/переноса полинуклеотидов в клетки, так что там полинуклеотид транскрибируется и впоследствии транслируется клетками.

[0044] "Вектор экспрессии" представляет собой специализированный вектор, который содержит ген или последовательность нуклеиновой кислоты с необходимыми регуляторными областями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине. Векторная последовательность нуклеиновой кислоты обычно содержит по меньшей мере точку начала репликации для размножения в клетке и, необязательно, дополнительные элементы, такие как гетерологичная полинуклеотидная последовательность, элемент контроля экспрессии (например, промотор, энхансер), интрон, ITR, сигнал полиаденилирования.

[0045] Вирусный вектор происходит или основан на одном или нескольких нуклеиновокислотных элементах, которые содержат вирусный геном. Конкретные вирусные векторы включают векторы аденоассоциированного вируса (AAV). Также предлагаются векторы (например, AAV), содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, вариант или подпоследовательность TPP1 (например, фрагмент полипептида, обладающий активностью фермента TPP1).

[0046] Термин "рекомбинантный" в качестве модификатора для вектора, такого как рекомбинантные вирусные, например ленти- или парвовирусные (например, AAV), векторы, а также модификатора для последовательностей, такого как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что эти композиции подвергались манипуляции (т.е. инженерии) таким образом, который обычно не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора, такого как вектор AAV, может служить случай, когда в вирусный геном вставлен полинуклеотид, который обычно не присутствует в геноме вируса (например, AAV) дикого типа. Примером рекомбинантного полинуклеотида может служить случай, когда нуклеиновую кислоту (например, ген), кодирующую полипептид TPP1, клонируют в вектор с областями 5', 3' и/или интронов, с которыми ген обычно ассоциирован внутри генома вируса (например, AAV), или без них. Хотя термин "рекомбинантный" не всегда используется в настоящем документе применительно к векторам, таким как вирусные и AAV-векторы, а также последовательностям, таким как полинуклеотиды, рекомбинантные формы, включая полинуклеотиды, явно включены, несмотря на любое такое опущение.

[0047] Рекомбинантный вирусный "вектор" или "вектор AAV" получают из генома дикого типа вируса, такого как AAV, используя молекулярные способы удаления генома дикого типа из вируса (например, AAV) и заменяя его на ненативную нуклеиновую кислоту, такую как кодирующая TPP1 последовательность нуклеиновой кислоты. Обычно для AAV одну или обе последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) генома AAV сохраняют в векторе AAV. "Рекомбинантный" вирусный вектор (например, rAAV) отличается от вирусного (например, AAV) генома, поскольку весь вирусный геном или его часть заменены на ненативную по отношению к вирусной (например, AAV) геномной нуклеиновой кислоте последовательность, такую как кодирующая TPP1 последовательность нуклеиновой кислоты. Следовательно, включение ненативной последовательности определяет вирусный вектор (например, AAV) как "рекомбинантный" вектор, который в случае AAV можно назвать "вектором rAAV".

[0048] Вектор AAV (например, вектор rAAV) может быть упакован и называется в настоящем документе "частицей AAV" для последующего инфицирования (трансдукции) клетки ex vivo, in vitro или in vivo. Если рекомбинантный вектор AAV инкапсулирован или упакован в частицу AAV, частица также может называться "частица rAAV". В некоторых вариантах осуществления частица AAV является частицей rAAV. Частица rAAV часто содержит вектор AAV или его часть. Частица rAAV может представлять собой одну или несколько частиц AAV (например, множество частиц AAV). Частицы rAAV обычно содержат белки, которые инкапсулируют или упаковывают геном вектора rAAV (например, капсидные белки).

[0049] Любую подходящую частицу AAV (например, частицу rAAV) можно использовать для способа или применения настоящего изобретения. Частица rAAV и/или содержащийся в ней геном могут происходить от любого подходящего серотипа или штамма AAV. Частица rAAV и/или содержащийся в ней геном могут происходить от двух или более серотипов или штаммов AAV. Соответственно, rAAV может содержать белки и/или нуклеиновые кислоты или их части любого серотипа или штамма AAV, причем частица AAV подходит для инфицирования и/или трансдукции клетки млекопитающего. Неограничивающие примеры серотипов AAV включают AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 или AAV-2i8. В некоторых вариантах осуществления множество частиц rAAV содержит частицы одного или происходящие от одного штамма или серотипа (или подгуппы или варианта). В некоторых вариантах осуществления множество частиц rAAV содержит смесь двух или более различных частиц rAAV (например, различных серотипов и/или штаммов).

[0050] Как используется в настоящем документе, термин "серотип" представляет собой отличительный признак, используемый для обозначения AAV, имеющего капсид, который серологически отличается от других серотипов AAV. Серологическую различимость определяют на основании отсутствия перекрестной реактивности между антителами к одному AAV по сравнению с другим AAV. Такие различия в перекрестной реактивности обычно вызваны различиями в последовательностях/антигенных детерминантах капсидных белков (например, различиями в последовательностях VP1, VP2, и/или VP3 серотипов AAV). Несмотря на возможность того, что варианты AAV, включая варианты капсида, могут не отличаться серологически от эталонного AAV или другого серотипа AAV, они отличаются по меньшей мере на один нуклеотид или аминокислотный остаток по сравнению с эталонным или другим серотипом AAV.

[0051] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV исключает определенные серотипы. В одном варианте осуществления частица rAAV не является частицей AAV4. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV антигенно или иммунологически отличается от AAV4. Различимость может быть определена стандартными способами. Например, для определения того, является ли вирусная частица антигенно или иммунологически отличной от AAV4, можно использовать ELISA и вестерн-блоттинг. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 сохраняет тканевой тропизм, отличный от AAV4.

[0052] В некоторых вариантах осуществления вектор rAAV, основанный на геноме первого серотипа, идентичен серотипу одного или нескольких капсидных белков, которые упаковывают вектор. В некоторых вариантах осуществления геном вектора rAAV может быть основан на геноме серотипа AAV (например, AAV2), отличном от серотипа одного или нескольких капсидных белков AAV, которые упаковывают вектор. Например, геном вектора rAAV может содержать происходящие от AAV2 нуклеиновые кислоты (например, ITR), тогда как по меньшей мере один или несколько из трех капсидных белков происходят от другого серотипа, например серотипа AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 или AAV-2i8 или их варианта.

[0053] Рекомбинантные векторы AAV, которые включают в себя полинуклеотид, который направляет экспрессию полипептида, могут быть получены с использованием подходящих рекомбинантных методов, известных в данной области техники (например, смотри Sambrook et al., 1989). Рекомбинантные векторы AAV обычно упаковывают в компетентные в отношении трансдукции частицы AAV и размножают с использованием системы упаковки вируса AAV. Компетентная в отношении трансдукции частица AAV способна связываться с клеткой млекопитающего и входить в нее, а затем доставлять груз нуклеиновой кислоты (например, гетерологичный ген) в ядро клетки. Таким образом, интактная частица AAV, которая компетентна в отношении трансдукции, сконфигурирована для трансдукции клетки млекопитающего. Частица AAV, сконфигурированная для трансдукции клетки млекопитающего, часто не является компетентной в отношении репликации и требует дополнительного белкового механизма для саморепликации. Таким образом, частица AAV, которая сконфигурирована для трансдукции клетки млекопитающего, сконструирована для связывания клетки млекопитающего и входа в нее и доставки нуклеиновой кислоты в клетку, причем нуклеиновая кислота для доставки часто расположена между парой ITR AAV в геноме AAV.

[0054] Подходящие клетки-хозяева для получения компетентных в отношении трансдукции частиц AAV, включают, но без ограничения, микроорганизмы, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих, которые могут быть использованы или были использованы в качестве реципиентов гетерологичных векторов rAAV. Можно использовать клетки из стабильной линии клеток человека 293 (легко доступны, например, в Американской коллекции типовых культур под номером доступа ATCC CRL1573). В некоторых вариантах осуществления для получения рекомбинантных частиц AAV используют линию модифицированных человеческих эмбриональных клеток почек (например, HEK293), которая трансформирована фрагментами ДНК аденовируса 5 типа и экспрессирует аденовирусные гены E1a и E1b. Модифицированную линию клеток HEK293 легко трансфицировать, и она обеспечивает особенно удобную платформу для получения частиц rAAV. Способы получения частиц AAV с высоким титром, способных трансдуцировать клетки млекопитающих, известны в данной области техники. Например, частица AAV может быть получена, как изложено в документах Wright, 2008, и Wright, 2009.

[0055] В некоторых вариантах осуществления вспомогательные функции AAV вводят в клетку-хозяина путем трансфекции клетки-хозяина вспомогательной конструкцией AAV или перед трансфекцией AAV-вектора экспрессии, или одновременно с ней. Таким образом, вспомогательные конструкции AAV иногда используют для обеспечения по меньшей мере временной экспрессии генов rep и/или cap AAV, чтобы дополнить отсутствующие функции AAV, необходимые для продуктивной трансдукции AAV. Во вспомогательных конструкциях AAV часто нет ITR AAV, и они не могут ни реплицировать, ни упаковывать сами себя. Эти конструкции могут иметь форму плазмиды, фага, транспозона, космиды, вируса или вириона. Описан ряд вспомогательных конструкций AAV, таких как обычно используемые плазмиды pAAV/Ad и pIM29+45, которые кодируют продукты экспрессии как Rep, так и Cap. Известен ряд других векторов, которые кодируют продукты экспрессии Rep и/или Cap.

[0056] В некоторых вариантах осуществления частица AAV или ее векторный геном, относящиеся к эталонному серотипу, содержат полинуклеотид, полипептид или их подпоследовательность, которые содержат или состоят из последовательности, по меньшей мере на 60% или больше (например, на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д.) идентичной с полинуклеотидом, полипептидом или подпоследовательностью частиц AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 или AAV-2i8. В конкретных вариантах осуществления частица AAV или ее векторный геном, относящиеся к эталонному серотипу, содержат последовательность капсида или ITR, которые содержат или состоят из последовательности, по меньшей мере на 60% или больше (например, на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д.) идентичной с последовательностью капсида или ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

[0057] В некоторых вариантах осуществления способ настоящего документа содержит применение частицы AAV2. В конкретном аспекте частица AAV2 представляет собой рекомбинантную частицу AAV2. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит капсид AAV2. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит один или несколько капсидных белков (например, VP1, VP2 и/или VP3), которые по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75% или больше идентичны, например на 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д. вплоть до 100% идентичны соответствующему капсидному белку нативной или дикого типа частицы AAV2. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит капсидные белки VP1, VP2 и VP3, которые по меньшей мере на 75% или больше идентичны, например на 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д. вплоть до 100% идентичны соответствующему капсидному белку нативной или дикого типа частицы AAV2. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 представляет собой вариант нативной или дикого типа частицы AAV2. В некоторых аспектах один или несколько капсидных белков варианта AAV2 содержат 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20 или более аминокислотных замен по сравнению с капсидным белком(ами) нативной или дикого типа частицы AAV2.

[0058] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 (например, капсид частицы AAV2) содержит полипептид VP1, имеющий идентичность по меньшей мере 60%, идентичность по меньшей мере 70%, идентичность по меньшей мере 75%, идентичность по меньшей мере 80%, идентичность по меньшей мере 85%, идентичность по меньшей мере 90%, идентичность по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98%, идентичность по меньшей мере 99% или даже идентичность 100% с капсидом VP1 AAV2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления частица AAV2 содержит полипептид VP1, который приблизительно на 63% или больше идентичен (например, на 63% идентичен) полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность капсидного белка VP1 AAV2. Капсидная последовательность AAV2 и капсидная последовательность AAV4 приблизительно на 60% идентичны. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV2 имеет последовательность, которая имеет по меньшей мере идентичность 65% с капсидом VP1 AAV2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV2 содержит капсид VP1 AAV2 дикого типа.

[0059] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит один или два ITR (например, пару ITR), которые по меньшей мере на 75% или больше идентичны, например на 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д. вплоть до 100% идентичны соответствующим ITR нативных или дикого типа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 или AAV-2i8, при условии, что они сохраняют одну или несколько желаемых функций ITR (например, способность образовывать шпильку, которая обеспечивает репликацию ДНК; интеграцию ДНК AAV в геном клетки-хозяина; и/или, если нужно, упаковку).

[0060] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит один или два ITR (например, пару ITR), которые по меньшей мере на 75% или больше идентичны, например на 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% и т.д. вплоть до 100% идентичны соответствующим ITR нативной или дикого типа частицы AAV2, при условии, что они сохраняют одну или несколько желаемых функций ITR (например, способность образовывать шпильку, которая обеспечивает репликацию ДНК; интеграцию ДНК AAV в геном клетки-хозяина; и/или, если нужно, упаковку).

[0061] Частица rAAV может содержать ITR, содержащий любое подходящее количество повторов "GAGC". В некоторых вариантах осуществления ITR частицы AAV2 содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более повторов "GAGC". В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит ITR, содержащий три повтора "GAGC". В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит ITR, который содержит менее четырех повторов "GAGC". В некоторых вариантах осуществления частица rAAV2 содержит ITR, который содержит более четырех повторов "GAGC". В некоторых вариантах осуществления ITR частицы rAAV2 содержит сайт связывания Rep, причем четвертым нуклеотидом в двух первых повторах "GAGC" является C, а не T.

[0062] В частицу AAV может быть введена ДНК любой подходящей длины. Подходящие молекулы ДНК для использования в векторах rAAV могут содержать приблизительно 5 тысяч пар оснований (т.п.о.), менее приблизительно 5 т.п.о., менее приблизительно 4,5 т.п.о., менее приблизительно 4 т.п.о., менее приблизительно 3,5 т.п.о., менее приблизительно 3 т.п.о. или менее приблизительно 2,5 т.п.о.

[0063] "Трансген" используется в настоящем документе как удобное обозначение нуклеиновой кислоты, которая предназначена для введения или была введена в клетку или организм. Трансгены включают любую нуклеиновую кислоту, такую как ген, который кодирует полипептид или белок (например, TPP1), и обычно гетерологичны по отношению к природным геномным последовательностям AAV.

[0064] В клетку, содержащую трансген, трансген часто вводят/переносят с помощью вектора, такого как частица rAAV. Введение трансгена в клетку с помощью частицы rAAV часто называют "трансдукцией" клетки. Термин "трансдуцировать" относится к введению молекулы, такой как нуклеиновая кислота, в клетку или организм-хозяин посредством вектора (например, частицы AAV). Трансген может быть интегрирован или не интегрирован в геномную нуклеиновую кислоту трансдуцированной клетки. Если введенная нуклеиновая кислота интегрируется в нуклеиновую кислоту (геномную ДНК) реципиентных клетки или организма, она может стабильно сохраняться в этих клетке или организме и далее передаваться или наследоваться клетками или организмами потомства реципиентных клетки или организма. Наконец, введенная нуклеиновая кислота может существовать в клетке-реципиенте или организме-хозяине вне хромосом или только временно. "Трансдуцированная клетка" представляет собой клетку, в которую был введен трансген посредством трансдукции. Таким образом, "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, в которую была введена нуклеиновая кислота, или ее потомство. Трансдуцированная клетка может размножаться, а введенный белок экспрессироваться, и нуклеиновая кислота транскрибироваться. Для применений способов генной терапии трансдуцированная клетка может принадлежать млекопитающему.

[0065] TPP1 представляет собой лизосомную сериновую протеазу, кодируемую геном CLN2 (ген TPP1). Аминокислотная последовательность человеческой TPP1 приведена как SEQ ID NO:1. Последовательность нуклеиновой кислоты человеческой TPP1 приведена как SEQ ID NO:2. Человеческая TPP1 обладает активностью трипептидилпептидазы I (активностью фермента TPP1). Активность TPP1 включает в себя неспецифическую активность лизосомной пептидазы, которая генерирует трипептиды из продуктов распада, продуцируемых лизосомными протеиназами. Исследования субстратной специфичности показывают, что TPP1 в первую очередь расщепляет трипептиды с незамещенных амино-концов в пептидах и белках. Эндогенно экспрессируемая TPP1 синтезируется как каталитически неактивный фермент. После нацеливания на лизосомы из-за кислой среды TPP1 автокаталитически процессируется в зрелый активный фермент. Активность TPP1 можно измерять и/или количественно определять in vitro с использованием известных способов. Смотри, например, Junaid et al., 1999.

[0066] Под полипептидом, обладающим активностью TPP1, понимается белок TPP1 млекопитающего или его часть, которые демонстрируют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или приблизительно 100% пептидазной активности человеческой TPP1 в соответствии с SEQ ID NO:1 по анализу с использованием подходящего пептидного субстрата, например по анализу с помощью способа Junaid et al., 1999, или другого сопоставимого способа. В некоторых вариантах осуществления под полипептидом, обладающим активностью TPP1, понимается белок TPP1 млекопитающего или его подпоследовательность или вариант, которые демонстрируют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или приблизительно 100% пептидазной активности человеческой TPP1 в соответствии с SEQ ID NO:1.

[0067] Полипептид, обладающий активностью TPP1, может содержать усеченную, мутированную, химерную или модифицированную форму полипептида TPP1, которая сохраняет по меньшей мере частичную активность TPP1. Полипептид, обладающий активностью TPP1, может содержать белок TPP1 или его часть, полученную от любого подходящего организма (например, от млекопитающего, от человека, от отличного от человека млекопитающего, например от собаки, свиньи, коровы и т.п.). В некоторых вариантах осуществления полипептид, обладающий активностью TPP1, имеет идентичность по меньшей мере 60%, идентичность по меньшей мере 70%, идентичность по меньшей мере 75%, идентичность по меньшей мере 80%, идентичность по меньшей мере 85%, идентичность по меньшей мере 90%, идентичность по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98% или идентичность 100% с белком TPP1, приведенным в SEQ ID NO:1.

[0068] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидный белок AAV и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий активностью TPP1. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидный белок AAV и нуклеиновую кислоту, которая направляет экспрессию и/или секрецию полипептида, обладающего активностью TPP1.

[0069] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидный белок AAV и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид TPP1 или его ферментативно активную часть. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидный белок AAV и нуклеиновую кислоту, которая направляет экспрессию и/или секрецию полипептида TPP1 или его ферментативно активной части. В некоторых вариантах осуществления вводимая нуклеиновая кислота кодирует TPP1, TPP1, который имеет существенную идентичность TPP1 с дикого типа, и/или вариант, мутант или фрагмент TPP1. В некоторых вариантах осуществления полипептид TPP1 имеет идентичность по меньшей мере 60%, идентичность по меньшей мере 70%, идентичность по меньшей мере 75%, идентичность по меньшей мере 80%, идентичность по меньшей мере 85%, идентичность по меньшей мере 90%, идентичность по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98% или идентичность 100% с белком, приведенным в SEQ ID NO:1.

[0070] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит нуклеиновую кислоту, имеющую идентичность по меньшей мере 50%, идентичность по меньшей мере 60%, идентичность по меньшей мере 70%, идентичность по меньшей мере 75%, идентичность по меньшей мере 80%, идентичность по меньшей мере 85%, идентичность по меньшей мере 90%, идентичность по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98% или идентичность 100% с нуклеиновой кислотой, приведенной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая активность TPP1 или кодирующая или направляющая экспрессию полипептида TPP1, представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую идентичность по меньшей мере 50%, идентичность по меньшей мере 60%, идентичность по меньшей мере 70%, идентичность по меньшей мере 75%, идентичность по меньшей мере 80%, идентичность по меньшей мере 85%, идентичность по меньшей мере 90%, идентичность по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98% или идентичность 100% с нуклеиновой кислотой, приведенной в SEQ ID NO:2.

[0071] Типичная аминокислотная последовательность человеческой TPP1 приведена в SEQ ID NO:1. Типичная последовательность нуклеиновой кислоты человеческой TPP1 приведена в SEQ ID NO:2.

[0072] В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение или доставку млекопитающему частиц AAV-TPP1 и, необязательно, введение млекопитающему одного или нескольких иммуносупрессивных средств. В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение или доставку млекопитающему частиц AAV-TPP1 и, необязательно, введение млекопитающему 2, 3, 4 или более иммуносупрессивных средств. В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение или доставку млекопитающему частиц AAV-TPP1 и, необязательно, введение млекопитающему двух иммуносупрессивных средств. В одном типичном варианте осуществления способ или применение лечения млекопитающего включает в себя введение или доставку млекопитающему частиц AAV-TPP1 и введение млекопитающему первого и второго иммуносупрессивных средств.

[0073] Если вводят два или более иммуносупрессивных средства, все иммуносупрессивные средства являются отличающимися и/или различными (например, все средства отличаются по структуре и/или механизму действия). В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство представляет собой противовоспалительное средство. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство представляет собой микофенолат или его производное. Примером такого производного микофенолата является микофенолата мофетил (MMF). В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство представляет собой циклоспорин или его производное. В некоторых вариантах осуществления первое иммуносупрессивное средство содержит циклоспорин, и второе иммуносупрессивное средство содержит микофенолат или его производное (например, MMF). В некоторых вариантах осуществления первое иммуносупрессивное средство содержит циклоспорин, и второе иммуносупрессивное средство содержит MMF.

[0074] В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство вводят до, во время и/или после введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство вводят одновременно с введением частиц AAV-TPP1 млекопитающему. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство вводят после введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему.

[0075] В некоторых вариантах осуществления первое иммуносупрессивное средство вводят млекопитающему по меньшей мере за от приблизительно 1 до приблизительно 7 дней до или за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель до введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему, и второе иммуносупрессивное средство вводят за от приблизительно 1 до приблизительно 7 дней до, за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель до, во время и/или в течение приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400 или приблизительно 500 дней после введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему. В некоторых вариантах осуществления циклоспорин вводят млекопитающему по меньшей мере за от приблизительно 1 до приблизительно 7 дней до или за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель до введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему, и микофенолат или его производное (например, MMF) вводят за от приблизительно 1 до приблизительно 7 дней до, за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель до, во время и/или в течение приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400 или приблизительно 500 дней после введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему. В некоторых вариантах осуществления циклоспорин вводят за от приблизительно 1 до приблизительно 7 дней до или за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель до введения частиц AAV-TPP1 и с регулярными интервалами после лечения, и микофенолат или его производное (например, MMF) вводят один раз за от приблизительно 1 до приблизительно 7 дней до, за приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 недель до, во время и/или в течение от приблизительно 10 до приблизительно 40 дней после введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему.

[0076] Иммуносупрессивное средство можно вводить в любой подходящей дозе. В некоторых вариантах осуществления циклоспорин вводят в дозировке от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг или от приблизительно 5 до приблизительно 10 мг/кг с частотой от одного раза, двух раз или трех раз в день до одного раза в два дня. В некоторых вариантах осуществления циклоспорин вводят по приблизительно 10 мг/кг два раза в день. В некоторых вариантах осуществления циклоспорин вводят по приблизительно 10 мг/кг два раза в день в течение по меньшей мере приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5 месяцев. В некоторых вариантах осуществления дозировку циклоспорина снижают до дозы менее приблизительно 5 мг/кг или менее приблизительно 2 мг/кг через от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев после введения или применения частиц AAV-TPP1 млекопитающему.

[0077] В некоторых вариантах осуществления микофенолат или его производное (например, MMF) вводят в дозировке от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 25 мг/кг или от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг с частотой от одного раза, двух раз или трех раз в день до одного раза в два дня. В некоторых вариантах осуществления микофенолат или его производное (например, MMF) вводят по от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг один раз в день. В некоторых вариантах осуществления дозировку микофенолата или его производного (например, MMF) снижают до дозы менее приблизительно 5 мг/кг или менее приблизительно 2 мг/кг через от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев после введения частиц AAV-TPP1 млекопитающему.

[0078] Частица rAAV и/или иммуносупрессивное средство могут быть составлены в виде любой подходящей композиции, подходящей для конкретного способа введения. Различные фармацевтически приемлемые композиции коммерчески доступны и могут быть получены практикующим врачом.

[0079] Частицу rAAV можно вводить любым подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение частиц AAV-TPP1 в центральную нервную систему (ЦНС) млекопитающего (например, млекопитающего, имеющего LSD). В некоторых вариантах осуществления центральная нервная система включает в себя головной мозг, спинной мозг и спинномозговую жидкость (СМЖ). В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение частиц AAV-TPP1 в головной мозг, или спинной мозг, или СМЖ млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в часть головного мозга или спинного мозга.

[0080] В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в один или несколько из большой цистерны, внутрижелудочкового пространства, желудочка головного мозга, субарахноидального пространства, интратекального пространства и/или эпендимы упомянутого млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в спинномозговую жидкость (СМЖ) упомянутого млекопитающего. В других вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в желудочковую систему. В других вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в один или несколько из рострального бокового желудочка, каудального бокового желудочка, правого бокового желудочка, левого бокового желудочка, правого рострального бокового желудочка, левого рострального бокового желудочка, правого каудального бокового желудочка и/или левого каудального бокового желудочка.

[0081] Иммуносупрессивное средство можно вводить любым подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления иммуносупрессивное средство вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления микофенолат или его производное, такое как микофенолата мофетил (MMF), вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления циклоспорин вводят перорально. Иммуносупрессивное средство можно также вводить парентерально (например, внутримышечно, внутривенно, подкожно) или вводить с помощью инъекции в головной мозг, спинной мозг или их часть (например, инъецировать в СМЖ).

[0082] В некоторых вариантах осуществления композицию, включающую в себя частицы AAV-TPP1 и, необязательно, иммуносупрессивное средство, вводят в одну или несколько больших цистерн млекопитающего и/или желудочек головного мозга, субарахноидальное пространство и/или интратекальное пространство и/или эпендиму млекопитающего. Например, частицы AAV-TPP1 могут быть доставлены непосредственно в большую цистерну, внутрижелудочковое пространство, желудочек головного мозга, субарахноидальное пространство, интратекальное пространство и/или эпендиму. В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение частиц AAV-TPP1 в эпендиму млекопитающего.

[0083] В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в одну или несколько клеток, которые контактируют с СМЖ у млекопитающего, например путем приведения клеток в контакт с частицами AAV-TPP1. Неограничивающие примеры клеток, которые контактируют с СМЖ, включают эпендимальные клетки, пиальные клетки, эндотелиальные клетки и/или менингеальные клетки. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 вводят в эпендимальные клетки. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 доставляют в эпендимальные клетки, например путем приведения эпендимальных клеток в контакт с частицами AAV-TPP1.

[0084] В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 доставляют локально. "Локальная доставка" относится к доставке активного средства непосредственно в целевой участок у млекопитающего (например, непосредственно в ткань или жидкость). Например, средство может быть доставлено локально путем непосредственной инъекции в орган, ткань или указанную анатомическую область. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 доставляют или вводят путем непосредственной инъекции в головной мозг, спинной мозг или их ткань или жидкость (например, в СМЖ, например в эпендимальные клетки, пиальные клетки, эндотелиальные клетки и/или менингеальные клетки). Например, частицы AAV-TPP1 могут быть непосредственно доставлены путем непосредственной инъекции в СМЖ, большую цистерну, внутрижелудочковое пространство, желудочек головного мозга, субарахноидальное пространство и/или интратекальное пространство и/или эпендиму. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 доставляют в ткань, жидкость или клетку головного мозга или спинного мозга путем непосредственной инъекции в ткань или жидкость головного мозга или спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 не доставляют системно путем, например, внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекции или внутривенной инфузии. В некоторых вариантах осуществления частицы AAV-TPP1 доставляют в ткань или жидкость головного мозга или спинного мозга путем стереотаксической инъекции.

[0085] В некоторых вариантах осуществления одну или несколько частиц AAV-TPP1 доставляют или вводят путем непосредственной инъекции частиц AAV-TPP1 в головной мозг, спинной мозг или их ткань или жидкость (например, в СМЖ, например, в эпендиму). В конкретном аспекте частицы AAV-TPP1 трансдуцируют эпендимальные клетки, пиальные клетки, эндотелиальные клетки и/или менингеальные клетки.

[0086] Эффективное количество частиц rAAV, таких как частицы AAV-TPP1, может быть определено эмпирически. Введение может быть осуществлено в одной или нескольких дозах, непрерывно или периодически в течение курса лечения. Эффективные дозы введения могут быть определены специалистами в данной области техники и могут варьироваться в соответствии с серотипом AAV, вирусным титром и весом, состоянием и видом млекопитающего, подвергаемого лечению. Однократное и многократное введение может быть выполнено в соответствии с выбранными лечащим врачом уровнем дозы, мишенью и режимом. Многократные дозы можно вводить, как требуется, например, для поддержания адекватной активности фермента.

[0087] В некоторых вариантах осуществления вводят множество частиц AAV-TPP1. Как используется в настоящем документе, множество частиц AAV относится к от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10¹⁸ частиц.

[0088] В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV, такие как частицы AAV-TPP1, вводят в дозе от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10¹⁶ в.г./мл в от приблизительно 1 до приблизительно 5 мл; в дозе от приблизительно 1 до приблизительно 3 мл от 1×10⁷ до приблизительно 1×10¹⁴ в.г./мл; или в дозе от приблизительно 1 до приблизительно 2 мл от 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹³ в.г./мл. В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV, такие как частицы AAV-TPP1, вводят в дозе от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹⁵ в.г. на кг веса тела млекопитающего, подвергаемого лечению. Например, частицы rAAV, такие как частицы AAV-TPP1, можно вводить в дозе от приблизительно 1×10⁸ в.г. на кг, приблизительно 5×10⁸ в.г. на кг, приблизительно 1×10⁹ в.г. на кг, приблизительно 5×10⁹ в.г. на кг, приблизительно 1×10¹⁰ в.г. на кг, приблизительно 5×10¹⁰ в.г. на кг, приблизительно 1×10¹¹ в.г. на кг, приблизительно 5×10¹¹ в.г. на кг, приблизительно 1×10¹² в.г. на кг, приблизительно 5×10¹² в.г. на кг, приблизительно 1×10¹³ в.г. на кг, приблизительно 5×10¹³ в.г. на кг, приблизительно 1×10¹⁴ в.г. на кг, приблизительно 5×10¹⁴ в.г. на кг, или приблизительно 1×10¹⁵ в.г. на кг веса тела млекопитающего, подвергаемого лечению.

[0089] Фармацевтические формы, подходящие для инъекции или инфузии частиц rAAV, таких как частицы AAV-TPP1, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии, которые приспособлены для экстемпорального получения стерильных инъекционных или инфузионных растворов или дисперсий, необязательно инкапсулированных в липосомы. Во всех случаях конечная форма должна представлять собой стерильную жидкость и быть стабильной в условиях производства, использования и хранения. Жидкий носитель или основа могут представлять собой растворитель или жидкую дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли и т.п.), растительные масла, нетоксичные эфиры глицерина и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем образования липосом, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или путем использования поверхностно-активных веществ. Могут быть включены изотонические средства, например сахара, буферы или соли (например, хлорид натрия). Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута путем использования в композициях средств, замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.

[0090] Растворы или суспензии частиц rAAV, таких как частицы AAV-TPP1, могут, необязательно, включать в себя следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, такой как фосфатный буферный солевой раствор (ФСБ), искусственную СМЖ, нелетучие масла, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), глицерин или другие синтетические растворители; антибактериальные и противогрибковые средства, такие как парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота и т.п.; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза.

[0091] Частицы rAAV, такие как частицы AAV-TPP1, и их композиции могут быть составлены в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и постоянства дозировки. Стандартная лекарственная форма, как используется в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для подлежащего лечению индивидуума; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Стандартные лекарственные формы зависят от количества частиц rAAV (например, частиц AAV-TPP1), которое считается необходимым для получения желаемого эффекта(ов). Необходимое количество может быть составлено в виде одной дозы или может быть составлено в виде нескольких единиц дозирования. Доза может быть доведена до подходящей концентрации частиц rAAV, необязательно в сочетании с противовоспалительным средством, и упакована для применения.

[0092] В одном варианте осуществления фармацевтические композиции включают в себя достаточный генетический материал (частицы rAAV) для получения терапевтически эффективного количества, т.е. количества, достаточного для уменьшения или ослабления симптомов рассматриваемого болезненного состояния, или количества, достаточного для получения желаемой пользы. Фармацевтические композиции обычно содержат фармацевтически приемлемый эксципиент. Такие эксципиенты включают любые фармацевтические средства, которые сами не вызывают производство антител, вредных для индивидуума, получающего композицию, и которые можно вводить без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но без ограничения, сорбит, твин 80 и жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Сюда могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства, pH-буферные вещества и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences, 1991.

[0093] Композиции, содержащие частицы rAAV, такие как частицы AAV-TPP1, содержат эффективное количество частиц rAAV в носителе, причем эффективное количество может быть легко определено специалистом в данной области техники. Частицы rAAV, такие как частицы AAV-TPP1, обычно могут составлять от приблизительно 1% до приблизительно 95% (вес/вес) композиции или в подходящем случае даже больше. Подлежащее введению количество зависит от таких факторов, как возраст, вес и физическое состояние млекопитающего или человека, рассматриваемого как субъект лечения. Эффективные дозировки могут быть определены средним специалистом в данной области техники посредством рутинных испытаний для определения кривых доза-ответ.

[0094] В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя введение множества частиц rAAV, таких как частицы AAV-TPP1, млекопитающему (например, млекопитающему, имеющему LSD, такую как LINCL), как приведено в настоящем документе, причем тяжесть, частота, прогрессирование или время начала одного или нескольких симптомов LSD уменьшены, снижены, предотвращены, ингибированы или отсрочены. Термин "время начала" относится к моменту времени после первого введения частиц AAV-TPP1, в который впервые наблюдается или обнаруживается симптом LSD. Неограничивающие симптомы LSD, у которых тяжесть, частота, прогрессирование или время начала одного или нескольких симптомов LSD уменьшены, снижены, предотвращены, ингибированы или отсрочены, включают проприоцептивный ответ, нистагм, угрозу, зрачковый световой рефлекс, мозжечковую атаксию и интенционный тремор. Тяжесть, частота, прогрессирование или время начала одного или нескольких симптомов LSD могут быть субъективно определены с помощью стандартизированного клинического неврологического обследования (например, смотри Lorenz et al., 2011).

[0095] Задержку времени начала симптома, связанного с LSD, можно определять путем сравнения времени начала симптома у млекопитающего, получавшего частицы AAV-TPP1, с одним или несколькими млекопитающими, не получавшими частиц AAV-TPP1. В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя введение множества частиц AAV-TPP1 в центральную нервную систему млекопитающего (например, млекопитающего, имеющего LSD) или ее часть, и тяжесть, частота, прогрессирование или время начала одного или нескольких симптомов LSD уменьшены, снижены, предотвращены, ингибированы или отсрочены по меньшей мере на от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 25, от приблизительно 25 до приблизительно 50 или от приблизительно 50 до приблизительно 100 дней.

[0096] В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение частиц rAAV в головной мозг или спинной мозг млекопитающего или их часть, причем частицы rAAV сконфигурированы для трансдукции клеток млекопитающего и направления экспрессии полипептида, обладающего активностью TPP1, у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления полипептид экспрессируется и/или детектируется в одном или нескольких периферических органах (например, в селезенке и/или сердце).

[0097] В некоторых вариантах осуществления способ или применение включают в себя введение частиц rAAV в головной мозг или спинной мозг млекопитающего или их часть, причем частицы rAAV сконфигурированы для трансдукции клеток головного мозга или спинного мозга млекопитающего и направления экспрессии полипептида, обладающего активностью TPP1, в головном мозге или спинном мозге млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления полипептид экспрессируется и/или детектируется в ткани центральной нервной системы (например, в головном мозге, например в стриатуме, таламусе, медулле, мозжечке, затылочной коре, префронтальной коре) дистально от места введения. В некоторых вариантах осуществления полипептид присутствует или широко детектируется в ткани центральной нервной системы (например, в головном мозге, например в стриатуме, таламусе, медулле, мозжечке, затылочной коре и/или префронтальной коре), что отражает распределение вдали от места введения и, необязательно, по всей ткани центральной нервной системы (например, в головном мозге, например в стриатуме, таламусе, медулле, мозжечке, затылочной коре и/или префронтальной коре).

[0098] Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК) и их полимеры. Полинуклеотиды включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, и сплайсированную или не сплайсированную мРНК, рРНК, тРНК и ингибирующую ДНК или РНК (РНКи, например, малую или короткую шпилечную (кш)РНК, микроРНК (миРНК), малую или короткую интерферирующую (ки)РНК транс-сплайсинговую РНК или антисмысловую РНК). Полинуклеотиды могут включать природные, синтетические и намеренно модифицированные или измененные полинуклеотиды (например, вариантную нуклеиновую кислоту). Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или триплексными, линейными или кольцевыми и могут иметь любую подходящую длину. При рассмотрении полинуклеотидов последовательность или структура конкретного полинуклеотида может быть описана в настоящем документе в соответствии с соглашением о предоставлении последовательностей в направлении от 5' к 3'.

[0099] Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, часто содержит открытую рамку считывания, которая кодирует полипептид. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также включает вырожденные замены кодонов.

[0100] Нуклеиновые кислоты могут включать в себя один или несколько элементов контроля экспрессии или регуляторных элементов, функционально связанных с открытой рамкой считывания, причем один или несколько регуляторных элементов сконфигурированы для направления транскрипции и трансляции полипептида, кодируемого открытой рамкой считывания, в клетке млекопитающего. Неограничивающие примеры элементов контроля экспрессии/регуляторных элементов включают в себя последовательности инициации транскрипции (например, промоторы, энхансеры, TATA-бокс и т.п.), последовательности инициации трансляции, последовательности стабильности мРНК, поли-A последовательности, секреторные последовательности и т.п. Элементы контроля экспрессии/регуляторные элементы могут быть получены из генома любого подходящего организма. Неограничивающие примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мышей; главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как промотор области немедленно-ранних генов CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промоторы pol II, промоторы pol III, синтетические промоторы, гибридные промоторы и т.п. Кроме того, последовательности, происходящие от невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также находят применение в настоящем документе. Типичные конститутивные промоторы включают промоторы для следующих генов, которые кодируют определенные конститутивные или жизненно-важные функции: промоторы гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), дигидрофолатредуктазы (DHFR), аденозиндеаминазы, фосфоглицеролкиназы (PGK), пируваткиназы, фосфоглицеромутазы, актина и другие конститутивные промоторы, известные специалистам в данной области техники. Кроме того, многие вирусные промоторы функционируют конститутивно в эукариотических клетках. К ним относятся, помимо прочих: ранний и поздний промоторы SV40; длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкемии Молони и других ретровирусов; и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. Соответственно, любой из упомянутых выше конститутивных промоторов можно использовать для контроля транскрипции вставки гетерологичного гена.

[0101] Гены под контролем индуцируемых промоторов экспрессируются только или в большей степени в присутствии индуцирующего средства (например, транскрипция под контролем промотора металлотионеина значительно увеличивается в присутствии ионов некоторых металлов). Индуцибельные промоторы включают чувствительные элементы (RE), которые стимулируют транскрипцию при связывании их индуцирующих факторов. Например, существуют RE для сывороточных факторов, стероидных гормонов, ретиноевой кислоты и циклического АМФ. Для того чтобы получить индуцибельный ответ, могут быть выбраны промоторы, содержащие конкретный RE, и в некоторых случаях сам RE может быть присоединен к другому промотору, что придает индуцибельность рекомбинантному гену. Таким образом, путем выбора подходящего промотора (конститутивного или индуцибельного; сильного или слабого) можно контролировать как наличие, так и уровень экспрессии полипептида в генетически модифицированной клетке. Если ген, кодирующий полипептид, находится под контролем индуцибельного промотора, доставка полипептида in situ запускается путем воздействия на генетически модифицированную клетку in situ условий, обеспечивающих транскрипцию полипептида, например, путем внутрибрюшинной инъекции специфических индукторов индуцибельных промоторов, которые управляют транскрипцией средства. Например, экспрессия in situ генетически модифицированными клетками полипептида, кодируемого геном под контролем металлотионеинового промотора, усиливается при контакте генетически модифицированных клеток с раствором, содержащим соответствующие (т.е., индуцирующие) металлические ионы in situ.

[0102] Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, или нуклеиновая кислота, направляющая экспрессию полипептида TPP1 (например, полипептида, обладающего активностью TPP1), могут включать в себя индуцибельный промотор или тканеспецифичный промотор для контроля транскрипции кодируемого полипептида.

[0103] В некоторых вариантах осуществления в способах, описанных в настоящем документе, используют ЦНС-специфичные или индуцибельные промоторы, энхансеры и т.п. Неограничивающие примеры ЦНС-специфичных промоторов включают выделенные из генов основного белка миелина (MBP), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и нейронспецифической енолазы (NSE). Неограничивающие примеры индуцибельных промоторов включают элементы ДНК, чувствительные к экдизону, тетрациклину, гипоксии и IFN.

[0104] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит энхансер CMV. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит промотор бета-актина. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит промотор бета-актина кур. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит энхансер CMV и промотор бета-актина кур.

[0105] В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с энхансером CMV, приведенным в SEQ ID NO:3, и/или последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с промотором бета-актина кур, приведенным в SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления элемент контроля экспрессии содержит SEQ ID NO:3.

[0106] Полипептид может быть нацелен на доставку во внеклеточное, внутриклеточное или мембранное местоположение. Генный продукт, секретируемый из клеток, обычно содержит "сигнал" секреции для секреции из клеток во внеклеточную среду. Вектор экспрессии также может быть сконструирован так, чтобы включать в себя "сигнал" секреции. Генный продукт также может сохраняться в клетке. Аналогичным образом, генный продукт может включать в себя, или вектор экспрессии может быть сконструирован так, чтобы он включал в себя сигнальные последовательности "ударживания" для закрепления полипептида в клеточной плазматической мембране. Например, мембранные белки имеют гидрофобные трансмембранные области, которые удерживают белок в мембране.

[0107] Как используется в настоящем документе, термины "модифицировать" или "вариант" и их грамматические варианты означают, что нуклеиновая кислота, полипептид или их подпоследовательность отклоняются от эталонной последовательности. Таким образом, модифицированные и вариантные последовательности могут иметь по существу одинаковую, большую или меньшую экспрессию, активность или функцию, чем эталонная последовательность, но сохраняют по меньшей мере частичную активность или функцию эталонной последовательности. Конкретным типом варианта является мутантный белок, т.е. белок, кодируемый геном, имеющим мутацию, например миссенс или нонсенс-мутацию в TPP1.

[0108] Вариант "нуклеиновой кислоты" или "полинуклеотида" относится к модифицированной последовательности, которая была генетически изменена по сравнению с диким типом. Последовательность может быть генетически модифицирована без изменения кодируемой последовательности белка. Альтернативно, последовательность может быть генетически модифицирована для кодирования вариантного белка, например вариантного белка TPP1. Вариант нуклеиновой кислоты или полинуклеотида может также относиться к комбинированной последовательности, у которой были модифицированы кодоны для кодирования белка, который продолжает сохранять по меньшей мере частичную идентичность последовательности с эталонной последовательностью, такой как последовательность белка дикого типа, а также у которой были модифицированы кодоны для кодирования вариантного белка. Например, заменяют некоторые кодоны такого варианта нуклеиновой кислоты без изменения кодируемых ими аминокислот белка TPP1, и заменяют некоторые кодоны варианта нуклеиновой кислоты, которые в свою очередь изменяют кодируемые ими аминокислоты белка TPP1.

[0109] Термин "полипептид", как используется в настоящем документе, относится к полимеру аминокислот и включает полноразмерные белки и их фрагменты. Таким образом, термины "белок" и "полипептид" часто используются в настоящем документе взаимозаменяемо. "Полипептиды", кодируемые "нуклеиновокислотной" или "полинуклеотидной" последовательностью, раскрытой в настоящем документе, включают неполноразмерные или полноразмерные нативные последовательности TPP1, такие как природные дикого типа и функциональные полиморфные белки, их функциональные подпоследовательности (фрагменты) и их модифицированные формы или варианты последовательности, при условии, что полипептид сохраняет некоторую степень активности фермента TPP1. Соответственно, в способах настоящего изобретения такие полипептиды, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, могут быть, но не обязательно, идентичны эндогенному белку TPP1, который является дефектным, или недостаток или дефицит экспрессии которого имеет место у подвергаемого лечению млекопитающего.

[0110] Аминокислотные замены в полипептиде могут быть получены путем изменения кодонов соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты. Такие полипептиды могут быть получены на основе замены определенных аминокислот на другие аминокислоты в структуре полипептида для модификации или улучшения биологической активности. Например, путем замены альтернативных аминокислот полипептиду могут быть приданы небольшие конформационные изменения, что приводит к повышению активности. Альтернативно, аминокислотные замены в некоторых полипептидах можно использовать для получения остатков, которые затем могут быть связаны с другими молекулами для получения конъюгатов пептид-молекула, которые сохраняют достаточные свойства исходного полипептида для использования в других целях.

[0111] Для придания интерактивной биологической функции полипептиду можно использовать гидропатический индекс аминокислот, причем было обнаружено, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющий имеющими близкие гидропатические индексы, при сохранении схожей биологической активности. Альтернативно, замена аналогичных аминокислот может быть осуществлена на основе гидрофильности, особенно если предполагается использование желаемой биологической функции генерируемого полипептида в иммунологических вариантах осуществления. Наибольшая локальная средняя гидрофильность "белка", определяемая гидрофильностью его соседних аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью. Соответственно, следует отметить, что замены могут быть сделаны на основе гидрофильности, присвоенной каждой аминокислоте.

[0112] При использовании или индекса гидрофильности, или гидропатического индекса, которые присваивают значения каждой аминокислоте, проводят замены аминокислот, когда эти значения составляют ±2, обычно ±1 и, наиболее типично для замен, ±0,5.

[0113] Неограничивающие примеры модификаций включают одну или несколько нуклеотидных или аминокислотных замен (например, от приблизительно 1 до приблизительно 3, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 15 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 25, от приблизительно 25 до приблизительно 30, от приблизительно 30 до приблизительно 40, от приблизительно 40 до приблизительно 50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 150, от приблизительно 150 до приблизительно 200, от приблизительно 200 до приблизительно 250, от приблизительно 250 до приблизительно 500, от приблизительно 500 до приблизительно 750, от приблизительно 750 до приблизительно 1000 или более нуклеотидов или остатков). Одним неограничивающим примером модификации нуклеиновой кислоты является оптимизация кодонов.

[0114] Примером аминокислотной модификации является консервативная аминокислотная замена или делеция. В конкретных вариантах осуществления модифицированная или вариантная последовательность (например, TPP1) сохраняет по меньшей мере часть функции или активности немодифицированной последовательности (например, TPP1 дикого типа).

[0115] "Фрагмент нуклеиновой кислоты" представляет собой часть указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) в большинстве организмов является генетическим материалом, тогда как рибонуклеиновая кислота (РНК) участвует в передаче информации, содержащейся в ДНК, в белки. Фрагменты и варианты раскрытых нуклеотидных последовательностей и белков или неполноразмерных белков, кодируемый ими, также включены в настоящее изобретение. Под "фрагментом" или "частью" понимается полноразмерная или менее чем полноразмерная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид или белок, или их аминокислотная последовательность. В некоторых вариантах осуществления фрагмент или часть является биологически функциональной (т.е. сохраняет 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% ферментативной активности TPP1 дикого типа).

[0116] "Вариантом" молекулы является последовательность, которая по существу аналогична последовательности нативной молекулы. Для нуклеотидных последовательностей варианты включают последовательности, которые из-за вырожденности генетического кода кодируют идентичные аминокислотные последовательности нативного белка. Природные аллельные варианты, такие как эти, могут быть идентифицированы с использованием методов молекулярной биологии, например с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методов гибридизации. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, такие как полученные, например, с использованием сайт-направленного мутагенеза, которые кодируют нативный белок, а также те, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотные замены. Как правило, варианты нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения обладают идентичностью последовательности по меньшей мере 40%, 50%, 60%, до 70%, например 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, до 79%, обычно по меньшей мере 80%, например 81%-84%, по меньшей мере 85%, например 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, до 98%, с нативной (эндогенной) нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант является биологически функциональным (т.е. сохраняет 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% ферментативной активности TPP1 дикого типа).

[0117] "Консервативно модифицированные варианты" конкретной последовательности нуклеиновой кислоты относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода любой заданный полипептид кодирует большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны CGT, CGC, CGA, CGG, AGA и AGG кодируют аминокислоту аргинин. Таким образом, в каждой позиции, где аргинин указан кодоном, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого белка. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются "молчащими вариантами", которые являются одним из видов "консервативно модифицированных вариантов". Каждая описанная в настоящем документе последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает все возможные молчащие варианты, если не указано иное. Специалисту в данной области техники будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (кроме ATG, который который обычно является единственным кодоном для метионина) может быть модифицирован стандартными методами для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, в каждой описанной последовательности подразумевается каждый "молчащий вариант" нуклеиновой кислоты, который кодирует полипептид.

[0118] Термин "существенная идентичность" полинуклеотидных последовательностей означает, что полинуклеотид содержит последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% или 79%, или по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89%, или по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93% или 94%, или даже по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по сравнению с эталонной последовательностью по данным одной из программ выравнивания при использовании стандартных параметров. Специалисту в данной области техники будет понятно, что эти значения могут быть соответствующим образом скорректированы для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, путем учета вырожденности кодонов, сходства аминокислот, положения рамки считывания и т.п. Существенная идентичность аминокислотных последовательностей для этих целей обычно означает идентичность последовательностей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, 90% или даже по меньшей мере 95%.

[0119] Термин "существенная идентичность" в контексте полипептида указывает на то, что полипептид содержит последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% или 79%, или 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89%, или по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93% или 94%, или даже 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с эталонной последовательностью в указанном окне сравнения. Признаком того, что две полипептидные последовательности по существу идентичны, является то, что один полипептид является иммунологически реактивным с антителами против второго полипептида. Таким образом, полипептид по существу идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативной заменой.

[0120] Термин "приблизительно", как используется в настоящем документе, относится к значениям в пределах 10% (плюс или минус) от заданного значения.

[0121] Термины "лечить" и "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, причем целью является предотвращение или уменьшение нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как развитие или распространение рака. Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения, ослабление симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение или прогрессирование) симптома или состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или смягчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), детектируемые или недетектируемые. "Лечение" также может означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью без лечения. Нуждающиеся в лечение включают тех, у кого уже есть состояние или нарушение, а также тех, кто склонен к состоянию или нарушению, или тех, у которых состояние или нарушение должно быть предотвращено.

[0122] Термины в единственном числе в контексте описания настоящего изобретения следует понимать как охватывающие как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или если это явно не противоречит контексту. Таким образом, например, ссылка на "вектор" включает в себя множество таких векторов, ссылка на "вирус" или "частицу" включает в себя множество таких вирионов/частиц, и ссылка на частицу "AAV или rAAV" включает в себя множество таких частиц AAV или rAAV.

[0123] Термины "содержащий", "имеющий" и "включающий в себя" следует понимать как открытые термины (т.е. означающие "включающий в себя, но без ограничения"), если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в настоящем документе предназначено только для того, чтобы служить кратким способом отдельной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если иное не указано в настоящем документе, и каждое отдельное значение включено в описание изобретения, как если бы оно было отдельно приведено в настоящем документе.

[0124] Все заявки, публикации, патенты и другие ссылки, упоминания GenBank и упоминания ATCC, приведенные в настоящем документе, включены посредством ссылки во всей полноте. В случае конфликта преимущество имеет описание изоретения, включая определения.

[0125] Все способы, описанные в настоящем документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе, или иное явно не противоречит контексту. Использование любого и всех примеров или типичных формулировок (например, "такой как"), предлагаемых в настоящем документе, предназначено только для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакие формулировки в описании изобретения не следует понимать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для осуществления изобретения на практике.

[0126] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно использовать в практическом применении или тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе.

[0127] Все признаки, раскрытые в настоящем документе, могут быть объединены в любой комбинации. Каждый признак, раскрытый в описании изобретения, может быть заменен альтернативным признаком, служащим той же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если прямо не указано иное, раскрытые признаки являются примером класса эквивалентных или сходных признаков.

[0128] Все числовые значения или числовые диапазоны включают в себя целые числа в пределах таких диапазонов и доли значений или целых чисел в пределах диапазонов, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на идентичность 80% или больше включает в себя идентичность 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% и т.д., а также 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д. и т.п.

[0129] Ссылка на более (больше) или менее чем целое число включает в себя любое число, большее или меньшее, чем указанное число, соответственно. Таким образом, например, ссылка на менее чем 100 включает в себя 99, 98, 97 и т.д. вплоть до числа один (1); и менее чем 10 включает в себя 9, 8, 7 и т.д. вплоть до числа один (1).

[0130] Как используется в настоящем документе, все числовые значения или диапазоны включают в себя доли значений и целых чисел в пределах таких диапазонов и доли целых чисел в пределах таких диапазонов, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на числовой диапазон, такой как 1-10, включает в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., и т.п. Ссылка на диапазон 1-50, следовательно, включает в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д. вплоть до и включая 50, а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д. и т.п.

[0131] Ссылка на ряд диапазонов включает в себя диапазоны, которые объединяют значения границ различных диапазонов в пределах ряда. Таким образом, для иллюстрации ссылки на ряд диапазонов, например, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000, включают в себя диапазоны 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000 и т.д.

[0132] Настоящее изобретение в целом раскрыто в настоящем документе с использованием для описания различных вариантов осуществления и аспектов утвердительных формулировок. Настоящее изобретение при этом также включает в себя варианты осуществления, в которых исключается конкретный объект, полностью или частично, такой как вещества или материалы, этапы и условия способа, протоколы или процедуры. Например, в некоторых вариантах осуществления или аспектах настоящего изобретения исключены материалы и/или этапы способа. Таким образом, даже при том, что изобретение в целом выражено в настоящем документе не через то, что изобретение не включает в себя, аспекты, которые явно не исключены из изобретения, при этом раскрыты в настоящем документе.

[0133] В настоящем документе описаны варианты осуществления настоящего изобретения. Изменения этих вариантов осуществления могут после прочтения предшествующего описания стать очевидны для средних специалистов в данной области техники. Авторы изобретения ожидают, что специалисты в данной области техники будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы изобретения предполагают, что изобретение может быть реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты предмета изобретения, перечисленные в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено применяемым законодательством. Более того, любая комбинация элементов во всех их возможных вариантах охватывается изобретением, если иное не указано в настоящем документе или это явно не противоречит контексту. Соответственно, нижеследующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения объема заявленного изобретения.

ПРИМЕР 1

[0134] Последовательности человеческой TPP1

Последовательность человеческого белка TPP1 (SEQ ID NO:1): MGLQACLLGLFALILSGKCSYSPEPDQRRTLPPGWVSLGRADPEEELSLTFALRQQNVERLSELVQAVSDPSSPQYGKYLTLENVADLVRPSPLTLHTVQKWLLAAGAQKCHSVITQDFLTCWLSIRQAELLLPGAEFHHYVGGPTETHVVRSPHPYQLPQALAPHVDFVGGLHHFPPTSSLRQRPEPQVTGTVGLHLGVTPSVIRKRYNLTSQDVGSGTSNNSQACAQFLEQYFHDSDLAQFMRLFGGNFAHQASVARVVGQQGRGRAGIEASLDVQYLMSAGANISTWVYSSPGRHEGQEPFLQWLMLLSNESALPHVHTVSYGDDEDSLSSAYIQRVNTELMKAAARGLTLLFASGDSGAGCWSVSGRHQFRPTFPASSPYVTTVGGTSFQEPFLITNEIVDYISGGGFSNVFPRPSYQEEAVTKFLSSSPHLPPSSYFNASGRAYPDVAALSDGYWVVSNRVPIPWVSGTSASTPVFGGILSLINEHRILSGRPPLGFLNPRLYQQHGAGLFDYTRGCHESCLDEEVEGQGFCSGPGWDPVTGWGTPNFPALLKTLLNP

Последовательность нуклеиновой кислоты человеческой TPP1 (SEQ ID NO:2):

[0135] Получение вектора AAV: Рекомбинантные векторы AAV4, экспрессирующие человеческую TPP1 под контролем раннего энхансера CMV/промотора β-актина кур (CAG), получали с использованием стандартных способов тройной трансфекции и очистки с помощью центрифугирования в градиенте CsCl (Wright, 2008; Wright, 2009). Титры определяли количественно по окраске серебром после гель-электрофореза (ДСН-ПААГ) и ПЦР (Wright, 2008; Wright, 2009).

Последовательность промотора CAG (SEQ ID NO:3):

Тип Начало Конец Описание misc_feature 1 1672 /note=промотор CAG регуляторный 22 327 /note=энхансер CMV промотор 328 605 /note=промотор бета-актина кур интрон 607 1624 /note=химерный интрон /note=химера между интронами из бета-актина кур и кроличьего бета-глобина регуляторный 1528 1672 /note=прогнозируемые сайты транскрипционных факторов регуляторный 1575 1672 /note=прогнозируемый iowa сайт связывания фактора транскрипции

ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAA

ПРИМЕР 2

[0136] Активность TPPI в образцах тканей. Активность TPP1 оценивали с использованием модифицированного способа, описанного ранее (Sohar, I., et al. 2000. Clin Chem, 46: 1005-8). Кратко говоря, образцы гомогенизировали с помощью лабораторного гомогенизатора (P200; Pro Scientific, Oxford, CT) в 200 мкл ледяного буфера для гомогенизации, 0,1% Triton X-100 в нормальном солевом растворе со смесью ингибиторов протеаз Complete (Roche, Mannheim, Германия). Нерастворимый материал удаляли из гомогената центрифугированием при ОЦС 21×10³ при 4°C 15 минут, и содержание белка в супернатанте определяли количественно с помощью DC Protein Assay (Biorad, Hercules, CA). Белок (10 мкл) добавляли в лунки 96-луночного планшета с черными стенками, содержащего 90 мкл 100 мМ натрий-цитратного буфера, 150 мМ NaCl и 0,1% triton X-100 (pH 4,0) с субстратом фермента (250 мкмоль/л Ala-Ala-Phe-7-амидо-4-метилкумарина в натрий-цитратном буфере, pH 4,0). Планшеты количественно анализировали с использованием устройства для считывания микропланшетов SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) при 37°C с длиной волны возбуждения 355±9 нм и длиной волны излучения 460±15 нм. В качестве стандарта использовали очищенную рекомбинантную человеческую TPP1 (щедрый подарок от P. Lobel, State University of New Jersey, NJ).

[0137] Активность TPPI в спинномозговой жидкости (СМЖ). Профермент TPP1 активировали, как описано (Tian, Y., et al. 2006. J Biol Chem, 281: 6559-72). СМЖ от животных одной группы исследования объединяли и инкубировали с одинаковым объемом 100 мМ ацетатного буфера, 150 мМ NaCl и 0,1% triton X-100 (pH 4,0) в течение ночи при комнатной температуре. Активированную TPP1 количественно определяли, как в образцах тканей.

[0138] Внутрижелудочковое введение вектора AAV. Животные были полностью обезболены. Место инъекции было выбрито, мышей помещали в стереотаксическую установку Kopf, и они продолжали получать смесь 2% изофлуран/кислород через носовой контур. Перед разрезом подкожно вводили анальгетик (мелоксикам, 1-10 мг/кг). Местно применяли офтальмологическую мазь для предотвращения высыхания глаз во время операции. Шприц Гамильтона объемом 10 или 25 мкл с иглой Гамильтона 0,4" 33GA подготавливали путем всасывания и выталкивания образца тестируемого препарата 20 раз; этот образец тестируемого препарата утилизировали. В шприц загружали свежий образец тестируемого препарата, и затем вводили его в инжектор (Stoelting Company). Место разреза очищали. Место инъекции рассчитывали от брегмы (+0,3 мм вперед, -1,0 мм вбок), затем в черепе делали трепанационное отверстие. Затем иглу с образцом тестируемого препарата опускали на глубину -2,0 мм от поверхности головного мозга, образец тестируемого препарата вводили со скоростью 200 нл/мин, и иглу после введения оставляли до вынимания на 5 минут. Разрез закрывали с использованием нерассасывающихся швов. Для уменьшения боли и дискомфорта после операции перед пробуждением от анестезии местно применяли анальгетик (Bupivicaine HCl, 0,5%).

[0139] Анализ тремора. Наблюдали различия в амплитуде тремора между нормальными и CLN2^-/- мышами, что может быть предотвращено с помощью ферментной заместительной терапии (Chang, M., et al. 2008. Mol Ther, 16: 649-56; Chen, Y. H., et al. 2009. Nat Med, 15: 1215-8). Для текущего исследования анализ тремора проводили на животных через 5 недель после инъекции. Включенные в исследование мыши дикого типа и мыши CLN2^-/-, не получавшие инъекций, служили в качестве контроля. Анализ тремора проводили с помощью системы мониторинга тремора (San Diego Instruments, San Diego, CA). Система мониторинга тремора представляет собой шкаф, который обеспечивает шумоподавление и визуальную изоляцию, оборудованный закрытым цилиндром, установленным на платформе с пьезоэлектрическим датчиком. Этот датчик преобразует тремор животных в электрический ток. Сигнал усиливается в приборном отсеке монитора тремора и отправляется на компьютер для записи. Записи были сделаны при условии 128 опросов в секунду и усилении 200-206 мВ. После 3 минут привыкания тремор животных регистрировали в течение 5 минут. Сигнал тремора количественно определяли как амплитуду (дБВ) относительно частоты (Гц). Статистический анализ состоял из двухфакторного ANOVA с последующим тестом множественного сравнения Сидака в качестве ретроспективного теста.

[0140] Сбор СМЖ. Животных помещали в индукционную камеру с изофлураном и подвергали воздействию смеси 2,5% изофлуран/кислород до полного обезболивания и отсутствия реакции ног. Место инъекции выбривали, мышей помещали в стереотаксическую установку RWD Life Science (Shenzhen, Китай), и они продолжали получать смесь 2% изофлуран/кислород через носовой контур. Мембрану над большой цистерной открывали с помощью разреза вдоль шеи, и отделяли кожу и мышцы шеи. В большую цистерну вставляли стеклянный капилляр и собирали СМЖ с помощью капиллярной силы в течение 20 минут.

[0141] После сбора СМЖ животных усыпляли смесью 5% изофлуран/кислород перед и во время умерщвления транскардиальной префузией с помощью 20 мл ледяного ФСБ до тех пор, пока печень не приобретала светло-кофейный цвет. Ткани собирали для анализа после вскрытия. Все образцы тканей мгновенно замораживали непосредственно после сбора и хранили при -80°C.

[0142] Биораспределение вектора AAV. Геномную ДНК собирали из мгновенно замороженных тканей головного мозга и периферических тканей с использованием набора для выделения ДНК Qiagen (Qiagen, Valencia, CA). Определяли количество копий AAV4 на мг ДНК с помощью кПЦР вектор-специфических последовательностей для каждого образца в трех повторностях. Последовательность прямого праймера-зонда (5'-FAM/ATTGTCCAA/ZEN/GCTGGTACAGGCTGT/3IABkFQ) и последовательность обратного праймера-зонда (CTTTCTCAACCCAAGGCTCTA) были синтезированы Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Реакцию в объеме 10 мкл (5,5 мкл мастер-микса+4,5 мкл образца) проводили в CFX384 Real-Time System (BioRad, Hercules, CA) при 95°C в течение 10 минут с последующими 39 циклами при 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Количество копий генома AAV4 из образцов рассчитывали с использованием стандартной кривой, полученной по ДНК плазмиды AAV4 с человеческой TPP1 (10e3-10e10 копий на мл). Итоговое количество копий генома AAV4 (в.г.) на мг ДНК в образцах рассчитывали по формуле:

копии генома AAV4 (в.г.) на мг ДНК=2 * (копии AAV4 на мл)_{образец}/(мг ДНК на мл)_{образец}

[0143] Корректирующий коэффициент 2 в предыдущей формуле служит для коррекции преобразования из плазмиды с дцДНК, использованной для стандартной кривой, в оцДНК в векторах AAV4.

ПРИМЕР 3

[0144] Исследования дозовой зависимости и стабильности проводили с использованием модели на мышах с нокаутом CLN2 (CLN^-/-), которые не экспрессируют TPP1. В исследование дозовой зависимости было включено 30 мышей (16 самок, 14 самцов) в возрасте от 5 до 8 недель на момент инъекции. В исследование стабильности было включено 14 мышей (7 самок, 7 самцов) в возрасте от 6 до 8 недель на момент инъекции.

Таблица 1: Дизайн исследования дозовой зависимости

Доза (в.г.) N
(самки; самцы) Недель после инъекции 1e10 12 (6♀; 6♂) 5 5e10 9 (6♀; 3♂) 5 1e11 10 (5♀; 5♂) 5

Таблица 2: Дизайн исследования стабильности

Доза (в.г.) N
(самки; самцы) Недель после инъекции 5e10 4 (2♀; 2♂) 3 5e10 5 (3♀; 2♂) 9 5e10 5 (1♀; 4♂) 12

[0145] Мышам инъецировали AAV4.CAGhTPP1 в дозах 1e10, 5e10 или 1e11 в ростральный аспект правого бокового желудочка, как описано выше. Инъекции выполняли, используя стереотаксическую раму для мышей, и координаты инъекции от точки брегмы фиксировали на +0,3 мм вперед, -1 мм вбок, -2 мм в глубину от мягкой мозговой оболочки с использованием The sterotaxic mouse brain atlas, G. Paxinos and K.B.J. Franklin (2^nd edition, Academic Press, 2001). Инъекцию в эту точку назвали "ростральной инъекцией" (фиг. 1A-1H и 2A-2G).

[0146] Для исследования дозирования тестируемый препарат инъецировали в возрастающих дозах 1e10 в.г. в 10 мкл, 5e10 в.г. в 10 мкл (RVC302) и 1e11 в.г. в 15 мкл; мышей выдерживали 5 недель после инъекции. Для исследования стабильности всем животным инъецировали 5e10 в.г., и умерщвляли их через 3, 9 или 12 недель после инъекции.

[0147] Тестируемый препарат оттаивали и разбавляли эксципиентом непосредственно перед внутрижелудочковыми инъекциями. Эксципиент представлял собой PBS180-F69, pH 7,4 (0,01 М Na₂HPO₄, 0,18 М NaCl, 0,001% плюроник F-68).

[0148] В исследовании дозирования мышей анализировали в отношении проявлений тремора перед умерщвлением. Для обоих исследованиий спинномозговую жидкость (СМЖ) собирали и объединяли в группы перед внутрисердечной перфузией ледяным ФСБ. Ткань головного мозга (стриатум, таламус, медуллу, мозжечок, затылочную кору и префронтальную кору), сердце, селезенку, печень и почки собирали для молекулярного анализа. Образцы тканей и СМЖ использовали для количественной оценки ферментативной активности и/или анализа биораспределения.

[0149] Через пять недель после инъекции для обоих исследований животных анестезировали и собирали спинномозговую жидкость (СМЖ) из большой цистерны.

[0150] После умерщвления кровь очищали внутрисердечной перфузией ледяным ФСБ, и собирали различные участки головного мозга (СМЖ, стриатум, таламус, продолговатый мозг, мозжечок, затылочную и префронтальную кору, фигуры 1A-1H и 2A-2G) из обоих полушарий для количественной оценки TPP1 с помощью анализа активности TPP1 и анализа биораспределения AAV4 с помощью кПЦР.

[0151] Для анализа улучшения трансдукции в эпендиме из-за изменения координат 5e10 в.г. AAV4.CAG hTPP1 вводили в боковой желудочек в более каудальной точке (от брегмы; -2,18 мм вперед, -2,9 мм вбок, -3,5 мм в глубину от кости). Образцы от этих животных помечали как "каудальная инъекция". Образцы собирали, как описано выше для количественной оценки TPP1 с помощью анализа активности TPP1.

[0152] Экспрессия TPP1 в различных областях мозга для каудальной и ростральной инъекций (СМЖ, стриатум, таламус, продолговатый мозг, мозжечок, затылочная и префронтальная кора) показана на фигурах 2A-2G.

ПРИМЕР 4

[0153] Краткое описание исследования дозирования. Анализ ферментативной активности человеческой TPP1 (hTPP1) проводили на образцах СМЖ, головного мозга и периферических. СМЖ собирали у всех животных во всех группах лечения. Результаты показывают четкую дозовую зависимость относительно уровней эндогенной мышиной TPP1 (0,34 пмоль на мг белка; фигура 3). Уровни рекомбинантной TPP1 составили 0,83, 12,66 и 63,70 пмоль TPP1 на мг белка для доз 1e10, 5e10 и 1e11 в.г., соответственно.

[0154] В большинстве проанализированных областей головного мозга уровни рекомбинантной TPP1 были выше, чем эндогенной мышиной TPP1, и паренхимные концентрации возрастали доза-зависимым образом. Однако префронтальная кора не продемонстрировала доза-зависимого возрастания. Префронтальная кора представляет собой область головного мозга, наиболее удаленную от места инъекции, и в ней отсутствуют эпендимальные клетки. За исключением префронтальной коры, все животные с высокой дозой имели уровни рекомбинантной TPP1 значительно выше уровней эндогенной TPP1.

[0155] Посмертный анализ биораспределения выявил вирусные геномы AAV4 в паренхимных пункциях, которые содержали эпендимальные клетки. У четырех животных с высокой дозой были вирусные геномы в областях коры. Вирусные геномы были также обнаружены в эпендимальных клетках с четвертом желудочке. Широкое распределение вирусного вектора по всему головному мозгу может быть связано с высоким отношением объема инъекции к объему желудочка. Для понимания контекста, желудочковая система мыши имеет объем 15 мкл (фигура 1), а объем инъекции составил 10 мкл для низкой и средней дозы и 15 мкл в группах высокой дозы.

[0156] Посмертный анализ биораспределения вируса в периферических тканях показал геномы AAV4 преимущественно в селезенке в группах низкой и высокой доз (фигура 4). Вирусные геномы были обнаружены с более низкими уровнями в почках обеих групп и в сердцах группы высокой дозы. В периферических тканях группы средней дозы вирусные геномы AAV4 не были обнаружены.

[0157] У мышей CLN2^-/- повышенная активность тремора обнаруживается начиная с 12 недель и прогрессирует с ходом заболевания (Chang, M., J. D. Cooper, D. E. Sleat, S. H. Cheng, J. C. Dodge, M. A. Passini, P. Lobel, and B. L. Davidson. 2008. Mol Ther, 16: 649-56). Через пять недель после лечения AAV4CAGhTPP1 (возраст 10-13 недель) эта характерная активность тремора снижалась, причем в группе высокой дозы полностью (фигура 5).

[0158] Краткое описание исследования стабильности. Стабильную экспрессию рекомбинантной TPP1 получали с помощью 5e10 в.г. AAV4CAGhTPP1 во всех проверенных областях головного мозга до окончания исследования (12 недель после инъекции). Важно отметить, что средняя продолжительность жизни не получавших лечение мышей CLN2^-/- составляет 16 недель. Все мыши в группе 12 недель после инъекции жили дольше, чем не получавшие лечение мыши CLN2^-/-, пока не были умерщвлены в возрасте 19 недель.

ПРИМЕР 5

Выводы

[0159] Исследование дозирования. Уровни рекомбинантной TPP1 в СМЖ демонстрировали дозовую зависимость через пять недель после инъекции AAV4CAGhTPP1.

[0160] Зрелую рекомбинантную TPP1 детектировали во всем головном мозге. Сверхэндогенные уровни hTPP1 были количественно определены в областях головного мозга вдоль желудочков доза-зависимым образом в трех экспериментальных группах. Все дозы достигли эндогенных уровней в областях головного мозга пространственно удаленных от места введения.

[0161] Вектор AAV4CAGhTPP1 был преимущественно локализован в пункциях паренхимной ткани, содержащих эпендимальные клетки. Однако было обнаружено, что небольшое количество вирусных частиц трансдуцируют сердце и селезенку.

[0162] Поведенческие измерения показали полное предотвращение фенотипа тремора у животных, инъецированных высокой дозой, и частичное избавление от фенотипа тремора в группах низкой и средней доз.

[0163] Исследование стабильности. Сверхэндогенные уровни профермента hTPP1 сохранялись вплоть до 12 недель после инъекции у мышей CLN2^-/-, получавших 5e10 в.г. Неожиданным, но приятным результатом оказалось увеличение продолжительности жизни этих мышей.

[0164] В итоге можно сказать, что AAV4CAGhTPP1 широко экспрессируется в головном мозге мышей CLN2^-/- доза-зависимым образом. AAV4CAGhTPP1 хорошо переносится и поддерживает стабильные уровни экспрессии через 12 недель после инъекции и, кроме того, увеличивает нормальную продолжительность жизни мышей CLN2^-/-.

ПРИМЕР 6

Посмертный анализ

[0165] Исследование дозирования. Все группы лечения экспрессировали более высокие уровни профермента hTPP1 в СМЖ, чем эндогенные уровни у животных CLN2^+/- (фигура 1). Наблюдалась значительная линейная корреляция (r²=0,91) для трех групп лечения, что указывает на сильную дозовую зависимость. У мышей CLN2^-/-, получивших инъекцию высокой дозы AAV4CAGhTPP1 (1e11 в.г.), было ~187-кратное увеличение экспрессии профермента. При средней дозе (5e10 в.г.) было ~37-кратное увеличение по сравнению с эндогенными уровнями. Что наиболее важно, при низкой дозе (1e10 в.г.) также получали более высокие уровни профермента TPP1, чем эндогенные уровни (~2,4-кратное увеличение).

[0166] Пункции паренхимной ткани из разных областей головного мозга анализировали в отношении экспрессии hTPP1. В целом, пункции из ткани, непосредственно прилегающей к желудочковой системе (стриатуму, таламусу, мозжечку, продолговатому мозгу), экспресировали более высокие уровни hTPP1 по сравнению с пункциями из затылочной и префронтальной коры. Существенно, что во всех проанализированных областях головного мозга из всех групп лечения экспрессия TPP1 была по меньшей мере эквивалентна эндогенным уровням у мышей CLN2^+/-. Это указывает на то, что низкой дозы 1e10 в.г. AAV4.CAGhTPP1 достаточно для обеспечения адекватных уровней TPP1 в паренхиме головного мозга (фигура 1). Линейная регрессия для каждой из этих областей привела к статистически положительному наклону, подтверждающему дозовую зависимость. Мозжечок и продолговатый мозг оказались наиболее заметными областями с r²=0,82 и 0,58 соответственно. Эти данные показывают накопление профермента hTPP1 в IV желудочке с лучшим проникновением в паренхиму мозжечка, чем в продолговатый мозг. При высокой дозе (1e11 в.г.) наблюдали статистически значимое повышение уровней hTPP1 по сравнению с эндогенными уровнями в стриатуме, таламусе, мозжечке, продолговатом мозге и затылочной коре. При средней дозе (5e10 в.г.) также было статистически значимое увеличение уровней hTPP1 в стриатуме, мозжечке и продолговатом мозге.

[0167] Периферические ткани, включая сердце, печень, почки и селезенку, анализировали в отношении присутствия рекомбинантной TPP1. Во всех группах лечения были низкие, но детектируемые уровни TPP1 в селезенке (фигура 1H). Анализ привел к статистической положительной линейной регрессии по экспериментальным группам (r²=0,54), отражающей положительную дозовую зависимость. У девяти мышей в группе высокой дозы был рекомбинантный фермент в сердце с низкой концентрацией (менее 0,06 пмоль TPP1 на мг белка).

[0168] Исследование стабильности. Стабильную экспрессию рекомбинантной TPP1 получали с помощью 5e10 в.г. AAV4.CAGhTPP1 во всех проверенных областях головного мозга до окончания исследования (12 недель после инъекции; фигура 5). Важно отметить, что средняя продолжительность жизни не получавших лечение мышей CLN2^-/- составляет 16 недель. Однако все мыши в исследовании стабильности, получавшие 5e10 в.г., доживали до умерщвления в возрасте 19 недель. Эти данные показывают, что лечение AAV4.CAGhTPP1, очевидно, также увеличивает продолжительность жизни мышей LINCL.

Анализ биораспределения

[0169] Исследование дозирования. Для анализа биораспределения вируса проводили кПЦР с использованием AAV4CAGhTPP1-специфического зонда. Высокие концентрации вирусных геномов AAV4 были локализованы в паренхимных пункциях, которые содержали эпендимальные клетки. Хотя у животных была обнаружена изменчивость, была тенденция к экспрессии высоких уровней вирусных частиц в мозжечке и продолговатом мозге. Обе области связаны с IV желудочком, который расположен дистально от точки инъекции. Эти результаты указывают на то, что вирусные геномы (в.г.) транспортируются из места инъекции в IV желудочек быстрым потоком СМЖ (фигура 3).

[0170] При сравнении экспериментальных групп в головном мозге не было обнаружено никакой дозовой зависимости. Неожиданно не было обнаружено различий между группами средней и высокой дозы. Напротив, меньшее количество вирусных геномов было обнаружено в периферических тканях группы средней дозы, что позволяет предположить, что большая часть вирусных частиц при этой дозе осталась в головном мозге. В селезенке было наибольшее количество вирусных геномов периферических тканей. Интересно, что во всех образцах сердца с высокой дозой были детектированы схожие уровни AAV4.CAGhTPP1.

Анализ тремора

[0171] Исследование дозирования. Не получавшие лечения мыши CLN2-/- в возрасте 12 недель проявляли повышенную активность тремора. У мышей CLN2^-/- соответствующего возраста, которые получали 1e10 или 5e10 AAV4CAGhTPP1, было значительное снижение амплитуды тремора на частотах 14-48 Гц (фигура 4). Высокая (5e10) доза AAV4CAGhTPP1 полностью предотвращала фенотип заболевания, поскольку отсутствовали различия в амплитуде тремора у группы высокой дозы по сравнению с контрольными мышами CLN2^+/-.

ПРИМЕР 7

[0172] Было проведено исследование на макаках-резус для оценки профиля экспрессии TPP1 в СМЖ со временем после внутрижелудочкового введения одной дозы векторов AAV, экспрессирующих hTPP1. Для этого 4 мл, содержащие 3e13 в.г. AAV2.CAGhTPP1, вводили с одной стороны в правый затылочный рог бокового желудочка трех макак-резус. Образцы СМЖ собирали до инъекции (день 0) и каждые 7 дней. Животных умерщвляли через 6 недель после инъекции.

[0173] Уровни TPP1 в спинномозговой жидкости (СМЖ) количественно определяли с помощью ферментативного анализа и нормализовывали на мг общего белка. Концентрацию TPP1 постепенно увеличивали до 9-20-кратной по сравнению с исходными уровнями к концу исследования у всех животных. Эти результаты показывают, что одна инъекция AAV2.CAGhTPP1 вызывает устойчивое повышение уровня TPP1 в СМЖ макак-резус.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> THE CHILDREN'S HOSPITAL OF PHILADELPHIA

DAVIDSON, Beverly

CHEN, Yong Hong

TECEDOR, Luis

<120> КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

<130> 074659-0454982

<140> PCT/US2017/059986

<141> 2017-11-03

<150> 62/418,033

<151> 2016-11-04

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 563

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gly Leu Gln Ala Cys Leu Leu Gly Leu Phe Ala Leu Ile Leu Ser

1 5 10 15

Gly Lys Cys Ser Tyr Ser Pro Glu Pro Asp Gln Arg Arg Thr Leu Pro

20 25 30

Pro Gly Trp Val Ser Leu Gly Arg Ala Asp Pro Glu Glu Glu Leu Ser

35 40 45

Leu Thr Phe Ala Leu Arg Gln Gln Asn Val Glu Arg Leu Ser Glu Leu

50 55 60

Val Gln Ala Val Ser Asp Pro Ser Ser Pro Gln Tyr Gly Lys Tyr Leu

65 70 75 80

Thr Leu Glu Asn Val Ala Asp Leu Val Arg Pro Ser Pro Leu Thr Leu

85 90 95

His Thr Val Gln Lys Trp Leu Leu Ala Ala Gly Ala Gln Lys Cys His

100 105 110

Ser Val Ile Thr Gln Asp Phe Leu Thr Cys Trp Leu Ser Ile Arg Gln

115 120 125

Ala Glu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Glu Phe His His Tyr Val Gly Gly

130 135 140

Pro Thr Glu Thr His Val Val Arg Ser Pro His Pro Tyr Gln Leu Pro

145 150 155 160

Gln Ala Leu Ala Pro His Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His His Phe

165 170 175

Pro Pro Thr Ser Ser Leu Arg Gln Arg Pro Glu Pro Gln Val Thr Gly

180 185 190

Thr Val Gly Leu His Leu Gly Val Thr Pro Ser Val Ile Arg Lys Arg

195 200 205

Tyr Asn Leu Thr Ser Gln Asp Val Gly Ser Gly Thr Ser Asn Asn Ser

210 215 220

Gln Ala Cys Ala Gln Phe Leu Glu Gln Tyr Phe His Asp Ser Asp Leu

225 230 235 240

Ala Gln Phe Met Arg Leu Phe Gly Gly Asn Phe Ala His Gln Ala Ser

245 250 255

Val Ala Arg Val Val Gly Gln Gln Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile Glu

260 265 270

Ala Ser Leu Asp Val Gln Tyr Leu Met Ser Ala Gly Ala Asn Ile Ser

275 280 285

Thr Trp Val Tyr Ser Ser Pro Gly Arg His Glu Gly Gln Glu Pro Phe

290 295 300

Leu Gln Trp Leu Met Leu Leu Ser Asn Glu Ser Ala Leu Pro His Val

305 310 315 320

His Thr Val Ser Tyr Gly Asp Asp Glu Asp Ser Leu Ser Ser Ala Tyr

325 330 335

Ile Gln Arg Val Asn Thr Glu Leu Met Lys Ala Ala Ala Arg Gly Leu

340 345 350

Thr Leu Leu Phe Ala Ser Gly Asp Ser Gly Ala Gly Cys Trp Ser Val

355 360 365

Ser Gly Arg His Gln Phe Arg Pro Thr Phe Pro Ala Ser Ser Pro Tyr

370 375 380

Val Thr Thr Val Gly Gly Thr Ser Phe Gln Glu Pro Phe Leu Ile Thr

385 390 395 400

Asn Glu Ile Val Asp Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe

405 410 415

Pro Arg Pro Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Val Thr Lys Phe Leu Ser Ser

420 425 430

Ser Pro His Leu Pro Pro Ser Ser Tyr Phe Asn Ala Ser Gly Arg Ala

435 440 445

Tyr Pro Asp Val Ala Ala Leu Ser Asp Gly Tyr Trp Val Val Ser Asn

450 455 460

Arg Val Pro Ile Pro Trp Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser Thr Pro Val

465 470 475 480

Phe Gly Gly Ile Leu Ser Leu Ile Asn Glu His Arg Ile Leu Ser Gly

485 490 495

Arg Pro Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Arg Leu Tyr Gln Gln His Gly

500 505 510

Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Thr Arg Gly Cys His Glu Ser Cys Leu Asp

515 520 525

Glu Glu Val Glu Gly Gln Gly Phe Cys Ser Gly Pro Gly Trp Asp Pro

530 535 540

Val Thr Gly Trp Gly Thr Pro Asn Phe Pro Ala Leu Leu Lys Thr Leu

545 550 555 560

Leu Asn Pro

<210> 2

<211> 3487

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

cgcggaaggg cagaatggga ctccaagcct gcctcctagg gctctttgcc ctcatcctct 60

ctggcaaatg cagttacagc ccggagcccg accagcggag gacgctgccc ccaggctggg 120

tgtccctggg ccgtgcggac cctgaggaag agctgagtct cacctttgcc ctgagacagc 180

agaatgtgga aagactctcg gagctggtgc aggctgtgtc ggatcccagc tctcctcaat 240

acggaaaata cctgacccta gagaatgtgg ctgatctggt gaggccatcc ccactgaccc 300

tccacacggt gcaaaaatgg ctcttggcag ccggagccca gaagtgccat tctgtgatca 360

cacaggactt tctgacttgc tggctgagca tccgacaagc agagctgctg ctccctgggg 420

ctgagtttca tcactatgtg ggaggaccta cggaaaccca tgttgtaagg tccccacatc 480

cctaccagct tccacaggcc ttggcccccc atgtggactt tgtgggggga ctgcaccatt 540

ttcccccaac atcatccctg aggcaacgtc ctgagccgca ggtgacaggg actgtaggcc 600

tgcatctggg ggtaaccccc tctgtgatcc gtaagcgata caacttgacc tcacaagacg 660

tgggctctgg caccagcaat aacagccaag cctgtgccca gttcctggag cagtatttcc 720

atgactcaga cctggctcag ttcatgcgcc tcttcggtgg caactttgca catcaggcat 780

cagtagcccg tgtggttgga caacagggcc ggggccgggc cgggattgag gccagtctag 840

atgtgcagta cctgatgagt gctggtgcca acatctccac ctgggtctac agtagccctg 900

gccggcatga gggacaggag cccttcctgc agtggctcat gctgctcagt aatgagtcag 960

ccctgccaca tgtgcatact gtgagctatg gagatgatga ggactccctc agcagcgcct 1020

acatccagcg ggtcaacact gagctcatga aggctgctgc tcggggtctc accctgctct 1080

tcgcctcagg tgacagtggg gccgggtgtt ggtctgtctc tggaagacac cagttccgcc 1140

ctaccttccc tgcctccagc ccctatgtca ccacagtggg aggcacatcc ttccaggaac 1200

ctttcctcat cacaaatgaa attgttgact atatcagtgg tggtggcttc agcaatgtgt 1260

tcccacggcc ttcataccag gaggaagctg taacgaagtt cctgagctct agcccccacc 1320

tgccaccatc cagttacttc aatgccagtg gccgtgccta cccagatgtg gctgcacttt 1380

ctgatggcta ctgggtggtc agcaacagag tgcccattcc atgggtgtcc ggaacctcgg 1440

cctctactcc agtgtttggg gggatcctat ccttgatcaa tgagcacagg atccttagtg 1500

gccgcccccc tcttggcttt ctcaacccaa ggctctacca gcagcatggg gcaggactct 1560

ttgatgtaac ccgtggctgc catgagtcct gtctggatga agaggtagag ggccagggtt 1620

tctgctctgg tcctggctgg gatcctgtaa caggctgggg aacacccaac ttcccagctt 1680

tgctgaagac tctactcaac ccctgaccct ttcctatcag gagagatggc ttgtcccctg 1740

ccctgaagct ggcagttcag tcccttattc tgccctgttg gaagccctgc tgaaccctca 1800

actattgact gctgcagaca gcttatctcc ctaaccctga aatgctgtga gcttgacttg 1860

actcccaacc ctaccatgct ccatcatact caggtctccc tactcctgcc ttagattcct 1920

caataagatg ctgtaactag cattttttga atgcctctcc ctccgcatct catctttctc 1980

ttttcaatca ggcttttcca aagggttgta tacagactct gtgcactatt tcacttgata 2040

ttcattcccc aattcactgc aaggagacct ctactgtcac cgtttactct ttcctaccct 2100

gacatccaga aacaatggcc tccagtgcat acttctcaat ctttgcttta tggcctttcc 2160

atcatagttg cccactccct ctccttactt agcttccagg tcttaacttc tctgactact 2220

cttgtcttcc tctctcatca atttctgctt cttcatggaa tgctgacctt cattgctcca 2280

tttgtagatt tttgctcttc tcagtttact cattgtcccc tggaacaaat cactgacatc 2340

tacaaccatt accatctcac taaataagac tttctatcca ataatgattg atacctcaaa 2400

tgtaagatgc gtgatactca acatttcatc gtccaccttc ccaaccccaa acaattccat 2460

ctcgtttctt cttggtaaat gatgctatgc tttttccaac caagccagaa acctgtgtca 2520

tcttttcacc ccaccttcaa tcaacaagtc ctcaatcaac aagtcctact gactgcacat 2580

cttaaatata tctttatcag tccacaagtc cttccaatta tatttcccaa gtatatctag 2640

aacttatcca cttatatccc cactgctact accttagttt agggctatat tctcttgaaa 2700

aaaagtgtcc ttacttcctg ccaatcccca agtcatcttc cagagtaaaa tgcaaatccc 2760

atcaggccac ttggatgaaa acccttcaag gattactgga tagaattcag gctttcccct 2820

ccagccccca atcatagctc acaaaccttc cttgctattt gttcttaagt aaaaaatcat 2880

ttttcctcct ccctccccaa accccaagga actctcactc ttgctcaagc tgttccgtcc 2940

ccttaccacc cctgatacaa ctgccaggtt aatttccaga attcttgcaa gactcagttc 3000

agaagtcacc ttctttcgtg aatgttttga ttccctgagg ctactttatt ttggtatggc 3060

tgaaaaatcc tagattttct aaacaaaacc tgtttgaatc ttggttctga tatggactag 3120

gagagagact gggtcaagta agcttatctc cctgaggctg tttcctcgtc tgttaagtgt 3180

gaatatcaat acctgccttt cataatcacc agggaataaa gtggaataat gttgataaca 3240

gtgcttggca cctggaagta ggtggcagat gttaacgccc ttcctccctt gcactgcgcc 3300

ccctgtgcct acctctagca ttgtaacgac cacatagtat tgaaatggcc agtttacttg 3360

tctgccttcc tttccaagac cgttggtgcc tagaggacta gaatcgtgtc ctatttaact 3420

ttgtgttccc aggtcctagc tcaggagttg gcaaataaga attaaatgtc tgctacaccg 3480

aaacaaa 3487

<210> 3

<211> 1672

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Промотор CAG

<400> 3

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 60

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 120

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 180

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 240

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 300

acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 360

ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 420

cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 480

ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 540

agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 600

gggcggggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg 660

ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc 720

ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct 780

gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg 840

tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg 900

tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc 960

ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg 1020

gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc 1080

cctgcacccc cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac 1140

ggggcgtggc gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg 1200

cggggcgggg ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag 1260

cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga 1320

gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg 1380

ccgcaccccc tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg 1440

cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg 1500

ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg 1560

gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 1620

acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aa 1672

<210> 4

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер-зонд

<400> 4

gctggtacag gctgt 15

<210> 5

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер-зонд

<400> 5

ctttctcaac ccaaggctct a 21

<---

Изобретение относится к области медицины, а именно к генной терапии, и предназначено для лечения лизосомной болезни накопления (LSD). Способ лечения млекопитающего, имеющего лизосомную болезнь накопления (LSD), включает введение в ростральный боковой желудочек или каудальный боковой желудочек млекопитающего множества частиц AAV. Указанные частицы AAV содержат (i) капсидный белок AAV; (ii) нуклеиновую кислоту, вставленную между парой инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, причем упомянутая нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий лизосомной гидролазной активностью; и (iii) элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты. Указанные частицы AAV способны трансдуцировать клетки упомянутого млекопитающего и обеспечивать экспрессию упомянутого полипептида, где упомянутый полипептид содержит трипептидилпептидазу-1 (TPP1), профермент или ее ферментативно активный вариант. Использование изобретения позволяет лечить заболевания, ассоциированные с лизосомной болезнью накопления. 55 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 7 пр.

1. Способ лечения млекопитающего, имеющего лизосомную болезнь накопления (LSD), причем упомянутый способ содержит этапы:

введения в ростральный боковой желудочек или каудальный боковой желудочек млекопитающего множества частиц AAV,

причем упомянутые частицы AAV содержат

(i) капсидный белок AAV;

(ii) нуклеиновую кислоту, вставленную между парой инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, причем упомянутая нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий лизосомной гидролазной активностью;

(iii) элемент контроля экспрессии, управляющий экспрессией упомянутой нуклеиновой кислоты; и причем

упомянутые частицы AAV способны трансдуцировать клетки упомянутого млекопитающего и обеспечивать экспрессию упомянутого полипептида, где упомянутый полипептид содержит трипептидилпептидазу-1 (TPP1), профермент или ее ферментативно активный вариант.

2. Способ по п. 1, в котором один или несколько ITR AAV содержат один или несколько ITR AAV2.

3. Способ по п. 1, в котором полипептид представляет собой TPP1 млекопитающего.

4. Способ по п. 1, в котором полипептид представляет собой человеческую TPP1.

5. Способ по п. 1, в котором полипептид представляет собой белок с активностью TPP1 и имеющий идентичность 80% или больше с человеческой TPP1, приведенной как SEQ ID NO:1.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит энхансер CMV.

7. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит промотор бета-актина.

8. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит промотор бета-актина кур.

9. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит энхансер CMV и промотор бета-актина кур.

10. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с энхансером CMV, приведенным в SEQ ID NO:3, и/или последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с промотором бета-актина кур, приведенным в SEQ ID NO:3.

11. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит последовательность, имеющую идентичность 80% или больше с SEQ ID NO:3.

12. Способ по любому из пп. 1-5, в котором элемент контроля экспрессии содержит SEQ ID NO:3.

13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, VP2 и/или VP3, имеющую идентичность 70% или больше с последовательностями VP1, VP2 и/или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

14. Способ по любому из пп. 1-12, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, имеющую идентичность 80% или больше с AAV2, причем в данной капсидной последовательности тирозин в положениях 444, 500 и/или 730 замещен на аминокислоту, отличную от тирозина.

15. Способ по любому из пп. 1-12, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, имеющую идентичность 90% или больше с AAV2, причем в данной капсидной последовательности тирозин в положениях 444, 500 и/или 730 замещен на фенилаланин.

16. Способ по любому из пп. 1-12, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1 AAV2, в которой тирозин в положениях 444, 500 и/или 730 замещен на фенилаланин.

17. Способ по любому из пп. 1-12, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, VP2 или VP3, выбранную из любого из серотипов AAV AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

18. Способ по любому из пп. 1-17, содержащий введение множества частиц AAV в ростральный боковой желудочек.

19. Способ по любому из пп. 1-17, содержащий введение множества частиц AAV в каудальный боковой желудочек.

20. Способ по любому из пп. 1-17, содержащий введение множества частиц AAV в правый и/или левый ростральный боковой желудочек.

21. Способ по любому из пп. 1-17, содержащий введение множества частиц AAV в правый и/или левый каудальный боковой желудочек.

22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором упомянутые частицы AAV контактируют с эпендимальными клетками упомянутого млекопитающего.

23. Способ по любому из пп. 1-22, дополнительно содержащий введение упомянутому млекопитающему первого иммуносупрессивного средства.

24. Способ по п. 23, дополнительно содержащий введение упомянутому млекопитающему второго иммуносупрессивного средства.

25. Способ по п. 23 или 24, в котором по меньшей мере одно из упомянутого первого иммуносупрессивного средства и упомянутого второго иммуносупрессивного средства вводят упомянутому млекопитающему перед введением упомянутых частиц AAV.

26. Способ по п. 23 или 24, в котором упомянутое первое иммуносупрессивное средство вводят перед введением упомянутых частиц AAV, а упомянутое второе иммуносупрессивное средство вводят перед, одновременно или после введения упомянутых частиц AAV.

27. Способ по любому из пп. 23-26, в котором упомянутое первое иммуносупрессивное средство содержит циклоспорин.

28. Способ по п. 27, в котором упомянутый циклоспорин вводят в дозировке приблизительно 5-20 мг/кг два раза в день в течение по меньшей мере 3 месяцев.

29. Способ по п. 27, в котором вводимую дозу упомянутого циклоспорина снижают через 1-2 месяца после введения упомянутых частиц AAV.

30. Способ по любому из пп. 23-29, в котором упомянутое второе иммуносупрессивное средство содержит микофенолат или его производное.

31. Способ по п. 30, в котором упомянутое производное микофенолата представляет собой микофенолата мофетил (MMF).

32. Способ по любому из пп. 23-31, в котором (i) упомянутое первое иммуносупрессивное средство вводят по меньшей мере приблизительно за две недели до введения упомянутых частиц AAV, и (ii) упомянутое второе иммуносупрессивное средство вводят приблизительно за две недели до или в течение 60 дней после введения упомянутых частиц AAV.

33. Способ по любому из пп. 30-32, в котором упомянутые микофенолат или его производное вводят в дозировке приблизительно 5-20 мг/кг в день.

34. Способ по любому из пп. 1-33, в котором упомянутые частицы AAV вводят в дозе от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 1×10¹⁵ в.г. на кг.

35. Способ по любому из пп. 1-33, в котором клетки, содержащие спинномозговую жидкость (СМЖ) упомянутого млекопитающего, трансдуцируют упомянутыми частицами AAV.

36. Способ по любому из пп. 1-35, в котором упомянутые частицы AAV трансдуцируют эпендимальные клетки упомянутого млекопитающего.

37. Способ по любому из пп. 1-36, в котором клетки, трансдуцированные упомянутыми частицами AAV, экспрессируют и секретируют упомянутый полипептид в СМЖ упомянутого млекопитающего.

38. Способ по любому из пп. 1-37, в котором активность трипептидилпептидазы-1 (TPP1) в спинномозговой жидкости упомянутого млекопитающего детектируют на уровне по меньшей мере 5 пмоль TPP1 на мг белка через 20 дней после инъекции, необязательно в течение более 350 дней.

39. Способ по любому из пп. 1-38, в котором упомянутое млекопитающее представляет собой не являющееся грызуном млекопитающее.

40. Способ по п. 39, в котором упомянутое не являющееся грызуном млекопитающее является приматом.

41. Способ по п. 39, в котором упомянутое не являющееся грызуном млекопитающее является человеком.

42. Способ по п. 41, в котором упомянутый человек является ребенком.

43. Способ по п. 42, в котором возраст упомянутого ребенка составляет от приблизительно 1 до приблизительно 4 лет.

44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором упомянутая LSD представляет собой детский или позднедетский восковидные липофусцинозы (LINCL), нейронопатическую болезнь Гоше, юношескую болезнь Баттена, болезнь Фабри, MLD, болезнь Санфилиппо A, болезнь Хантера, болезнь Краббе, болезнь Моркио, болезнь Помпе, болезнь Ниманна-Пика C, болезнь Тея-Сакса, болезнь Гурлер (MPS-I H), болезнь Санфилиппо B, болезнь Марото-Лами, болезнь Ниманна-Пика A, цистиноз, болезнь Гурлер-Шейе (MPS-I H/S), синдром Слая (MPS VII), болезнь Шейе (MPS-I S), детскую болезнь Баттена, GM1-ганглиозидоз, муколипидоз II/III типа или болезнь Сандхоффа.

45. Способ по любому из пп. 1-44, в котором введение упомянутых частиц AAV содержит инъекцию упомянутых частиц AAV.

46. Способ по любому из пп. 1-45, в котором начало симптома, связанного с упомянутой LSD, задерживают на 5-10, 10-25, 25-50 или 50-100 дней.

47. Способ по п. 46, в котором упомянутый симптом выбирают из группы, состоящей из проприоцептивного ответа, нистагма, угрозы, зрачкового светового рефлекса, мозжечковой атаксии и интенционного тремора.

48. Способ по любому из пп. 1-47, в котором измеримую утрату когнитивной функции, связанной с упомянутой LSD, задерживают на 5-10, 10-25, 25-50 или 50-100 дней.

49. Способ по любому из пп. 1-48, в котором продолжительность жизни млекопитающего, имеющего упомянутую LSD, увеличивается на 5-10, 10-25, 25-50 или 50-100 дней.

50. Способ по любому из пп. 1-49, в котором упомянутый полипептид экспрессируется в селезенке или сердце упомянутого млекопитающего.

51. Способ по любому из пп. 1-50, в котором упомянутый полипептид экспрессируется в стриатуме, таламусе, медулле, мозжечке, большом мозге, затылочной коре или префронтальной коре упомянутого млекопитающего.

52. Способ по любому из пп. 1-51, в котором упомянутый элемент контроля экспрессии обеспечивает приблизительно в 1-2 раза большую экспрессию упомянутой нуклеиновой кислоты или полипептида, чем промотор CMV в одном или нескольких из стриатума, таламуса, медуллы, мозжечка, большого мозга, затылочной коры или префронтальной коры упомянутого млекопитающего.

53. Способ по любому из пп. 1-52, в котором упомянутые частицы AAV выбирают из группы, состоящей из частиц AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 и AAV-2i8.

54. Способ по любому из пп. 1-53, в котором один или несколько из упомянутых ITR выбирают из группы, состоящей из ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74 и AAV-rh10.

55. Способ по любому из пп. 1-54, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, VP2 и/или VP3, имеющую идентичность 90% или больше с последовательностями VP1, VP2 и/или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.

56. Способ по любому из пп. 1-55, в котором капсидная последовательность содержит капсидную последовательность VP1, VP2 или VP3, выбранную из любого из серотипов AAV AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV-2i8.